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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von hochreinem,
virusinaktiviertem Komplex von Faktor VIII und von-Willebrand-Faktor mittels Anionenaustauscher-Chromatographie aus
Kryopräzipitat.
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In
der
EP-A-0 238 701 wird
ein Verfahren zur Herstellung eines hochreinen, nichtinfektiösen Antihämophiliefaktors
beschrieben, wobei das Kryopräzipitat
mittels Ethanolfällung
von Fibrinogen, Globulinen, Albuminen und anderen störenden Bestandteilen
befreit wird. Die Anreicherung aus dem Kryopräzipitat ist notwendig, da Faktor
VIII nur in äußerst geringen
Mengen in dem Material enthalten ist. Dieser Anreicherungsschritt
beeinträchtigt
jedoch den Gehalt an AHF im Endprodukt. Die bisher bekannten Verfahren
zur Herstellung von Faktor VIII ergeben nur geringe Mengen an wirksamer
Substanz. Bei der Applikation des auf herkömmlichem Wege hergestellten
Faktors VIII belastet man den Patienten daher mit großen Mengen
antigener Substanzen. Diese Verfahrensweise ist nicht unbedenklich.
Es hat daher nicht an Versuchen gefehlt, den Faktor VIII durch Trennungsoperationen
weiter anzureichern. So wurde versucht, mittels Affinitätschromatographie mit
gegen Faktor VIII gerichteten tierischen Antikörpern Produkte mit höherer spezifischer
Aktivität
zu erhalten. Diese Technik ist jedoch sehr aufwendig und kostenintensiv.
Zum anderen ist sie auch deshalb nicht unbedenklich, da stets eine
gewisse Menge tierischen Eiweißes
bei jeder chromatographischen Trennung aus der Säule gewaschen wird.
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Die
EP-A-343 275 beschreibt
ein Verfahren zur Herstellung eines hochreinen, virusfreien Antihämophiliefaktors,
wobei ein Faktor VIII umfassendes Kryopräzipitat mit Aluminiumhydroxid
und biokompatiblen organischen Lösungsmitteln/Detergentien
behandelt wird, worauf in einer bevorzugten Ausführungsform eine weitere Gelpermeationschromatographie
an Ionenaustauschermaterialien durchgeführt wird.
EP-A-0 367 840 beschreibt
ein Chromatographiematerial auf Basis von Copolymerisaten aus Oligoethylenglycolen,
Glycidylmethacrylaten und Pentaerythritoldimethacrylaten als besonders
gut geeignet zur Herstellung eines hochreinen virusfreien Faktors
VIII.
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WO 90/14886 beschreibt ein
Medium zur Trennung von Proteinen. Das dort offenbarte Material
beschreibt eine wasserunlösliche
Matrix, die eine Vielzahl von Polyamin-Struktureinheiten trägt, wobei
die Polyamin-Struktureinheiten wenigstens 3 basische Stickstoffatome
umfassen und die Stickstoffatome durch eine Kette von wenigstens
zwei dazwischen befindlichen Kohlenstoffatomen voneinander getrennt
sind, wobei in dem Fall, dass jede Polyamingruppe insgesamt 3 Stickstoffatome
aufweist, wenigstens 5 solche Kohlenstoffatome vorhanden sind. Dieses
Trennmedium ist wenigstens für
eine partielle Reinigung von Faktor VIII geeignet.
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EP-A-0 416 983 beschreibt
ein Verfahren zur Herstellung des Komplexes von Faktor VIII/von-Willebrand-Faktor
mittels Anionenaustauscher-Chromatographie ausgehend von humanem
Blutplasma.
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Die
EP 0 343 275 A1 bezieht
sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines hochreinen Antihämophiliefaktors
(AHF oder Faktor VIII), der bei der Reinigung eines Kryopräzipitats
durch Behandlung mit biokompatiblen organischen Lösungsmitteln/Detergentien
virusfrei gemacht wurde. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
dass das Kryopräzipitat
vor der Entfernung der Viren aufgetaut wird, mit Wasser, das 1 bis
3 E/ml Heparin mit pH 6,5–7,5
enthält,
extrahiert wird, dann mit einer Aluminiumhydroxidsuspension gemischt
wird und nach dem Abkühlen
auf 10 °C
bis 18 °C
und Einstellen des pH-Werts auf 6 bis 7 einer Zentrifugation und Filtration
unterzogen und dann in einer an sich bekannten Weise weiterverarbeitet
wird. Besonders vorteilhaft ist, dass die Probe nach der Entfernung
der Viren einer Gelpermeationschromatographie auf Ionenaustauschermaterialien
unterzogen wird.
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Zwar
wird durch das in der
EP-A-0
343 275 beschriebene Verfahren eine Ausbeutesteigerung
an Faktor VIII verzeichnet, jedoch ist die Ausbeute an biologisch
aktivem Faktor VIII nach wie vor nicht optimal.
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Das
der Erfindung zugrunde liegende technische Problem ist also die
Bereitstellung eines Verfahrens, mit dem sich die Gewinnung von
biologisch aktivem Faktor VIII aus der Quelle Kryopräzipitat
verbessern lässt und
eine wirtschaftlichere Arbeitsweise gewährleistet ist.
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Überraschenderweise
wird dieses Problem gelöst
durch ein Verfahren gemäß den Merkmalen
des Anspruchs 1. Die Unteransprüche
betreffen bevorzugte Ausführungsformen
des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Die
gemäß der Erfindung
zu verwendenden Trennmaterialien bestehen aus Trägerteilchen, wie sie in der
EP-A-0 337 144 offenbart
werden. Dies sind Trägerteilchen
mit Hydroxylgruppen, auf die über
die Kohlenstoffatome in den α-Positionen bezüglich der
Hydroxylgruppen ein polymeres Material aufgepfropft ist. Als Trägerteilchen
kommen alle allgemein bekannten porösen und unporösen Chromatographieträger, die
primäre oder
sekundäre,
aliphatische Hydroxylfunktionen an der Oberfläche aufweisen, in Frage. Von
diesen sind hydrophile Polymere auf Acrylat- und Methacrylatbasis,
Polymere auf Polyvinylalkohol-Basis, diolsubstituierte Kieselgele,
Polysaccharide auf Agarose-Basis, Cellulose, Cellulosederivate oder
Polymere auf Dextran-Basis bevorzugt. Es können aber selbstverständlich auch
andere Polymere oder Copolymere auf der Grundlage von Monomeren
wie Vinylverbindungen, Acrylamid, (Meth)Acrylsäureestern oder (Meth)Acrylnitril
in hydroxylierter Form eingesetzt werden.
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Das
polymere Material der Formel I gemäß Anspruch 1, das über die
Kohlenstoffatome in den α-Positionen
bezüglich
der Hydroxylgruppen an die Trägerteilchen
gebunden ist, basiert auf den Monomeren der Formeln II und/oder
III, wobei die Substituenten wie folgt definiert sind.
CR7R8=CR1–Y II
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Diese
Monomere stellen (Meth)Acrylsäure
(Y = -COOH), (Meth)Acrylsäurederivate
Allylamine (Y = -CH
2NH
2, -CH
2NR
2R
3),
(Meth)Acrylnitrile (Y = -CN), Acroleine (Y = -CHO), Vinylcarboxylate
(Y = -OCOCHR
5R
6)
oder Vinylencarbonate der Formel III dar.
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Alle
diese Monomere stellen in wässriger
Lösung
radikalisch polymerisierbare Substanzen mit reversibel bindenden
Gruppen dar, die neutral, sauer oder basisch sein können.
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Werden
Vinylencarbonate der Formel III oder Vinylcarboxylate CR7R8=CR1-OCOCHR5R6 der Formel II eingesetzt, so wird vorzugsweise
das erhaltene Produkt anschließend
in ein Trennmaterial mit Hydroxylgruppen überführt. Diese Überführung in eine Hydroxyl-Phase
wird durch eine an sich bekannte milde alkalische oder saure Verseifung
erreicht. Beispielsweise kann die Reaktion mit methanolischer K2CO3-Lösung bei Raumtemperatur,
beschrieben z.B. von Y. Tezuka et al. in Macromol. Chem. 186, 685–694 (1985),
durchgeführt
werden.
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In
den Formeln I (vgl. Anspruch 1), II und III bedeutet R1 vorzugsweise
Wasserstoff, d.h. die Acrylsäurederivate
sind bevorzugt.
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Y
in Formel II bedeutet vorzugsweise
-CH
2NH
2, -CH
2NR
2R
3.
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X
bedeutet sowohl in Formel I als auch in Formel II -NR2R3.
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Bevorzugt
sind dabei Verbindungen, in denen X -NR2R3 bedeutet und einer der Reste R2 und
R3 H ist.
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Die
Reste R2 und/oder R3 bedeuten
jeweils eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkylphenylgruppe, wobei die Alkyl-
und/oder die Phenylgruppe ein- oder mehrfach substituiert sein kann
mit Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Trialkylammonium- und ein-
oder mehrfach, vorzugsweise ein- oder zweifach und besonders bevorzugt
einfach substituiert sein kann mit einer Alkoxy-, Cyano-, Carboxyl-,
Sulfonsäure-,
Acetoxy- oder Acetamino-Gruppe.
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Die
Reste R2 und/oder R3 bedeuten
bevorzugt Alkyl, Alkoxyalkyl, Cyanoalkyl, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkylaminoalkyl,
Trialkylammoniumalkyl, Carboxyalkyl mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen,
bevorzugt bis zu 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere bevorzugt bis
zu 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylgruppe, die linear oder verzweigt
sein kann. R2 und/oder R3 bedeuten
demnach bevorzugt Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Methoxymethyl,
Ethoxymethyl, 2-Methoxyethyl, 2-, 3- oder 4-Oxapentyl, 2-, 3-, 4-
oder 5-Oxahexyl, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-Oxaheptyl, Isopropyl, 2-Butyl, Isobutyl,
2-Methylbutyl, Isopentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 2-Oxa-3-methylbutyl,
3-Oxa-4-methylbutyl, 2-Methyl-3-oxapentyl,
2-Methyl-3-oxahexyl, ferner auch Heptyl, Octyl, Nonyl oder Decyl.
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Ferner
bevorzugt sind auch Alkylgruppen, die durch eine Cyano-, Carboxy-
oder Sulfonsäuregruppe substituiert
vorliegen. Demnach bedeuten R2 und/oder
R3 bevorzugt Cyanomethyl, Cyanoethyl, Cyanopropyl, Cyanobutyl,
Cyanopentyl, Cyanohexyl, 2-Cyanopropyl, 2-Cyanobutyl, Carboxylmethyl,
Carboxylethyl, Carboxylpropyl, Carboxylisopropyl, Carboxylbutyl,
Carboxylpentyl, Carboxylhexyl, Carboxyl-2-methylpropyl, Carboxyl-2-methylbutyl,
Sulfonsäuremethyl,
Sulfonsäureethyl,
Sulfonsäurepropyl,
Sulfonsäurebutyl,
Sulfonsäurepentyl,
Sulfonsäurehexyl,
Sulfonsäure-2-methylpropyl,
Sulfonsäure-2-methylbutyl,
Sulfonsäure-3-methylbutyl, Sulfonsäure-2-methylpentyl,
Sulfonsäure-3-methylhexyl
oder Sulfonsäure-2-ethylpentyl.
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Ferner
sind die Alkylgruppen bevorzugt einfach substituiert mit einer Amino-,
Mono- oder Dialkylamino- oder Trialkylammoniumgruppe. Die Alkylgruppen
können
dabei gleich oder verschieden sein und bis zu 10, vorzugsweise bis
zu 6 Kohlenstoffatome und insbesondere bevorzugt bis zu 4 Kohlenstoffatome
besitzen. Sie bedeuten demnach vorzugsweise Dimethylaminoethyl,
Diethylaminoethyl, Methylaminoethyl, Methylaminopropyl, Dimethylaminopropyl,
Ethylaminoethyl, Propylaminoethyl, Propylaminopropyl, Dipropylaminoethyl,
Dipropylaminobutyl, Diethylaminoethyl, Trimethylammoniumethyl, Trimethylammoniumpropyl,
Trimethylammoniumbutyl, Triethylammoniumethyl, Triethylammoniumpropyl,
Triethylammoniumethyl, Aminoethyl, Aminopropyl, Aminobutyl oder
Aminopentyl. Alle diese Alkyl- und substituierten Alkylgruppen sind
ebenfalls als Substituenten an der Phenylgruppe bevorzugt.
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Bevorzugt
für R2 und/oder R3 ist
auch ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH2)-SO2-(CH2)n-S-(CH2)OH mit n = 2, 3, 4, 5 oder 6, vorzugsweise
2, 3 oder 4.
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Vorzugsweise
hat R2 und/oder R3 auch
die Bedeutung einer Phenylgruppe, die vorzugsweise einfach substituiert
ist mit Cyano, Cyanoalkyl, Amino, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkylamino,
Alkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Mono- oder Dialkylaminoalkyl, Trialkylammonium-
oder Trialkylammoniumalkyl, Carboxy, Carboxyalkyl, Sulfonsäure oder
Sulfonsäurealkyl.
Die bevorzugten Bedeutungen dieser Substituenten entsprechen den
vorstehend angegebenen bevorzugten Alkylgruppen und substituierten
Alkylgruppen. Der Substituent an der Phenylgruppe sitzt vorzugsweise
in p-Stellung.
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p-Acetoxyphenyl,
p-Aminophenyl oder p-Acetaminophenyl sind ebenfalls bevorzugte Bedeutungen
für R2 und/oder R3. Bevorzugt
für R2 und/oder R3 ist
ferner eine Alkylphenyl- oder Phenylalkylgruppe, wobei ebenfalls
die angegebenen bevorzugten Bedeutungen für die Alkyl-, substituierten
Alkyl- oder substituierten Phenylgruppen gelten sollen.
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Demnach
gelten folgende substituierte Phenylgruppen beispielsweise als besonders
bevorzugt: 4-Cyanophenyl, 4-Alkylphenyl, 4-(N,N-Dimethylamino)phenyl, 4-(N,N-Dialkylaminoethyl)phenyl,
4-Ethoxyphenyl, 4-Ethoxyethylphenyl, 4-Trialkylammoniumphenyl, 4-Carboxylphenyl,
4-Sulfonsäurephenyl,
Phenylethyl, 4-(N-Ethylamino)phenylpropyl
oder 4-Cyanophenylethyl.
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Des
weiteren sind Einheiten der Formel I und/oder Monomere der Formel
II bevorzugt, in denen R2 und/oder R3 eine cyclische oder bicyclische Gruppe,
die aromatisch oder gesättigt
sein kann und 5 bis 10 Kohlenstoffatome enthält, wobei eine oder mehrere
CH- oder CH2-Gruppen durch N oder NH, N
oder NH und S, oder N oder NH und O ersetzt sind, bedeuten.
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R2 und R3 bedeuten
demnach bevorzugt auch einen Pyridinrest, Imidazolylrest, Indolylrest,
ferner bevorzugt einen Pyrrol-, Pyrimidin-, Pyrazin-, Chinolin-
oder Isochinolinrest.
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R2 und/oder R3 können beispielsweise
auch einen Thiazol-, Thiadiazol-, Morpholin-, Triazin-, Piperazin-,
Benzothiazol-, Purin-, Pyrazol-, Triazol-, Pyrrolidin- oder Isoxazol-Rest
bedeuten.
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Insbesondere
bevorzugt sind dabei die aromatischen heterocyclischen Gruppen.
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Die
Reste R2 und R3 müssen, um
zu geeigneten Austauschern zu gelangen, so aufeinander abgestimmt
werden, dass entweder beide Reste eine basische Gruppe enthalten
oder aber einer der Reste neutral ist. Dem Fachmann bereitet es
keine Schwierigkeit, die Gruppen entsprechend zuzuordnen und somit
geeignete Reste für
R2 und R3 zusammenzustellen,
je nach Funktion und Aufgabe des gewünschten Anionenaustauschers.
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Vorzugsweise
ist einer der beiden Reste R2 und R3 ein neutraler Rest.
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R7 und R8 in den Monomeren
der Formel II bedeuten vorzugsweise H, und damit haben auch R' und R'' in Formel I vorzugsweise die Bedeutung
Wasserstoff.
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Bevorzugt
sind auch Trennmaterialien, bei denen in Formel I Y = -OH ist und
einer der Reste R' und R'' ebenfalls -OH bedeutet. Als Monomeres
muss dann ein Vinylencarbonat der Formel III eingesetzt werden, und
das resultierende Produkt muss anschließend in eine Hydroxylphase überführt werden.
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R7 und R1 in Formel
III bedeuten vorzugsweise H. In Formel 1 stellt n die Anzahl der
wiederkehrenden Einheiten dar und bedeutet 2-100, vorzugsweise 5-60,
insbesondere sind Kettenlängen
von 10-30 bevorzugt.
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K.
Woods und Th. Orme beschreiben in
EP-A-0 239 859 , dass es von Vorteil ist, nach
der Virusentfernung oder -inaktivierung und vor der chromatographischen
Trennung die Probe mit Ölen
zu extrahieren, vorzugsweise mit Sojaöl, Rizinusöl und/oder Baumwollsamenöl.
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Durch
die erfindungsgemäßen Maßnahmen
ist es erstmals möglich,
in hohen Ausbeuten einen hochreinen Antihämophiliefaktor herzustellen,
der eine bisher nicht erreichte spezifische Aktivität aufweist.
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Handelsübliches
Kryopräzipitat
wird in Stücke
von ca. 1 bis 2 cm zerteilt und bei Raumtemperatur innerhalb von
3 bis 4 Stunden aufgetaut. Diese Stücke werden bei Temperaturen
zwischen 10 und 25 °C
durch Rühren
in etwa dem doppelten Volumen Wasser suspendiert, welches 1 bis
3 U/ml Heparin-Natrium enthält. Die
Suspension wird mit 0,1 M Essigsäure
auf einen pH-Wert von mindestens 7,0 bis 8,0, vorzugsweise 7,0 bis
7,1, eingestellt. Es wird 15 bis 60 Minuten, vorzugsweise 30 Minuten,
bei Raumtemperatur gerührt.
Daraufhin werden etwa 108 g 2%ige Aluminiumhydroxid-Suspension pro
kg Kryopräzipitat
hinzugefügt,
und das Gemisch wird 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise 5 Minuten, bei
Raumtemperatur gerührt.
Mit Säure,
vorzugsweise 0,1 M Essigsäure,
wird der Säuregehalt
auf pH 6,0 bis 7,0, vorzugsweise 6,5 bis 6,6, eingestellt. Die Probe wird
auf 18 °C
bis 10 °C,
vorzugsweise 16 bis 14 °C,
gekühlt.
Man zentrifugiert bei dieser Temperatur, beispielsweise in einer
Sharples AS-16 (Cepa 61) Zentrifuge mit einer Rate von 1,0 L/min.
Danach schließt
sich eine Filtration des Überstandes
durch ein Pall AB-1 UO1OZP-Filter an. Vorzugsweise nach dem Abzentrifugieren und
Filtrieren erfolgt eine Virusinaktivierung. Besonders bewährt hat
sich die Virusinaktivierung mit Hilfe von Tween/TNBP (Tri-n-butylphosphat).
Gute Ergeb nisse werden auch mit Natriumcholat/TNBP erzielt. Das Tween/TNBP-
bzw. Natriumcholat/TNBP-Gemisch kann beispielsweise durch Ölextraktion
wieder entfernt werden.
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Man
gibt die Probe auf eine Chromatographiesäule, die ein Gelpermeationsmaterial
mit Ionenaustauscheraktivität
aufweist, das unter dem Handelsnamen EMD-TMAE-Fractogel (M) 650 bekannt ist. EMD-TMAE-Fractogel
(M) 650 wurde oben bereits charakterisiert. Die Säulenkapazität soll vorzugsweise
so beschaffen sein, dass 0,5 kg des Säulenmaterials pro kg Kryopräzipitat
sich in der Säule
befinden. Die Säule wird
mit der Probe beschickt und mit Puffern gewaschen. Nach Flution
der Probe mit einem Puffer höherer
Ionenstärke
wird das erhaltene Produkt mit einem Puffer mit niedrigerem Salzgehalt
verdünnt
und, falls nötig, auf
pH 6,5 bis 7,5, vorzugsweise 6,9 bis 7,1, eingestellt. Danach wird
erneut filtriert, vorzugsweise an Nitrocellulosefiltern, worauf
sich eine Sterilfiltration anschließt.
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Gemäß der Erfindung
erfolgt die Reinigung von Faktor VIII durch Waschen und Eluieren
mit Puffern, die nacheinander immer höhere Ionenstärken aufweisen,
und die Ionenstärke
des Puffers wird mittels quartärer
Ammoniumsalze, die wenigstens eine Kohlenwasserstoffkette mit 1
bis 6 Kohlenstoffatomen aufweisen und einen hydrophilen Substituenten
tragen, allein oder in Kombination mit Kochsalz eingestellt.
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Als
besonders vorteilhaft haben sich diejenigen Trennpuffer erwiesen,
deren Ionenstärke
unter Verwendung von Natriumchlorid und/oder einem quartären Ammoniumsalz
mit mindestens einer hydrophil substituierten Kohlenwasserstoffkette
mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Cholinchlorid, eingestellt wird.
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So
wird im erfindungsgemäßen Verfahren
die Säule,
die das oben beschriebene Fractogel (M) 650 enthält, mit einem Puffer A gewaschen
und äquilibriert.
Der Puffer A enthält
Natriumchlorid oder Cholin in einer Konzentration von 50 bis 200
mM, vorzugsweise 120 mM, bei einem pH-Wert von 5,8 bis 7,8, vorzugsweise 6,5
bis 7,0.
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Die
Probe wird vorzugsweise aus einem Puffer, der eine Osmolarität von 200
bis 600 mOsmol, bevorzugt 380 bis 520 mOsmol, bei einem pH-Wert
von 5,8 bis 7,8, vorzugsweise 6,5 bis 7,0, aufweist, auf die Säule aufgetragen.
Es empfiehlt sich, dass die Kapazität der Säule etwa 50 I.E. Faktor VIII
pro ml Gel nicht überschreitet.
Nach dem Auftragen wird die Säule
mit Puffer A gewaschen.
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Danach
wäscht
man die Säule
mit Puffer B, der ebenfalls Natriumcitrat, Calciumchlorid, Glycin
enthält, jedoch
eine höhere
Ionenstärke
als der Puffer A aufweist. Die Konzentration an quartärem Ammoniumsalz
der oben beschriebenen Art und/oder Natriumchlorid sollte zwischen
150 mM und 250 mM, vorzugsweise 180 bis 200 mM, betragen, der pH-Wert
sollte zwischen 5,8 und 7,8, vorzugsweise bei ca. 7,0, liegen.
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Die
Flution des Produkts von der Säule
erfolgt mit einem Puffer C, der eine gegenüber Puffer B nochmals erhöhte Ionenstärke aufweist.
Der Gehalt an quartärem
Ammoniumsalz der oben beschriebenen Art, insbesondere Cholinchlorid
und/oder Natriumchlorid, sollte im Bereich von 200 mM bis 500 mM
liegen, vorzugsweise ca. 400 mM betragen, bei einem pH-Wert von
5,8 bis 7,8, vorzugsweise ca. 7,0.
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Mittels
des Verfahrens gemäß der Erfindung
wird die Gewinnung von Faktor VIII in einer höheren Ausbeute und mit höherer Produktstabilität erreicht.
Es ist vorteilhaft, dass bei dem Verfahren gemäß der Erfindung der sogenannte
von-Willebrand-Faktor
nicht entfernt wird, sondern in den Faktor-VIII-Fraktionen verbleibt.
Es ist also möglich,
die Faktor-VIII-Präparate
auch für
Patienten zu verwenden, die unter einem Mangel an von-Willebrand-Faktor
leiden. Weiterhin kann Faktor VIII aufgrund der Anwesenheit des
von-Willebrand-Faktors, der eine natürliche Stabilisierung von Faktor
VIII erleichtert, auch in kontinuierlichen Infusionstechniken eingesetzt
werden.
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Das
Verfahren wird weiterhin anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht.
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BEISPIEL 1
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Anreicherung des Faktor VIII
aus Kryopräzipitat
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Handelsübliches
Kryopräzipitat
wird in Stücke
von ca. 1 bis 2 cm zerteilt und bei Raumtemperatur innerhalb von
3 bis 4 Stunden aufgetaut. Diese Stücke werden bei 20 °C bis 25 °C durch Rühren suspendiert und
in etwa dem doppelten Volumen Wasser, welches 2 U/ml Heparin-Natrium
enthält,
suspendiert. Die Suspension wird mit 0,1 M Essigsäure auf
einen pH-Wert von 7,0 bis 7,1 eingestellt. Man rührt 30 Minuten bei 20 °C bis 25 °C weiter.
108 g 2%ige Aluminiumhydroxid-Suspension pro kg Kryopräzipitat
werden hinzugefügt
und weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Danach stellt man den
pH-Wert mit 0,1 M Essigsäure
auf pH 6,5 bis 6,6 ein. Man kühlt
die Probe auf 16 °C
bis 14 °C
ab, zentrifugiert in einer Sharples AS-16 (Cepa 61) Zentrifuge mit
einer Rate von 1,0 L/min. Der Überstand
wird durch ein Pall AB-1 UO1OZP-Filter filtriert.
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BEISPIEL 2
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Vorbereitung der Chromatographiesäule
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Zur
Trennung des extrahierten Kryopräzipitats
wird eine Säule
mit mindestens 0,5 l Ionenaustauscher-Harz pro kg Kryopräzipitat
verwendet. Die Säulenhöhe soll ≤ ihr Durchmesser
sein. Nach dem Beschicken der Säule
mit Harz wird die Chromatographiesäule zuerst mit 5 Volumina 0,1
M Natriumchloridlösung
gewaschen. Danach wäscht
man mit einem Puffer A, der wie folgt zusammengesetzt ist:
120
mM Natriumchlorid,
10 mM Natriumcitrat·5H2O,
120
mM Glycin,
1 mM Calciumchlorid·2H2O,
pH-Wert
6,5 bis 7,0, mit 1 M HCl einzustellen.
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Sämtliche
Puffer müssen
virusfrei sein, da die folgenden Operationen mit virusfreien Extrakten
des Kryopräzipitats
durchgeführt
werden.
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BEISPIEL 3
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Die
Probe wird auf die Säule
aufgetragen, und die Absorption des Durchflusses bei einer Wellenlänge von
280 nm beobachtet. Das Filtrat wird aufgenommen und auf Faktor-VIII-Aktivität untersucht,
ebenso wie das Produkt vor der Säulentrennung.
Danach wird die Säule
mit dem Puffer A gewaschen, bis die Absorption wieder ihren Ausgangswert
erreicht. Danach wird die Säule
mit Puffer B gewaschen, bis die Absorption wieder die Grundlinie
erreicht hat.
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Der
Puffer B hat folgende Zusammensetzung:
180 bis 200 mM Natriumchlorid,
10
mM Natriumcitrat·5H2O,
120 mM Glycin,
1 mM Calciumchlorid·2H2O,
pH-Wert 6,9 bis 7,0.
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Die
Flution des Produkts erfolgt mit dem Puffer C. Die nach Zugabe des
Puffers C erscheinende Proteinfraktion wird gesammelt.
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Puffer
C weist folgende Zusammensetzung auf
400 mM Natriumchlorid,
1
mM Natriumcitrat·5H2O,
120 mM Glycin,
1,0 mM Calciumchlorid·2H2O,
pH-Wert 6,9 bis 7,0.
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Nach
Flution des gewünschten
Produkts wird die Säule
mit 5 Volumina des Puffers D, welcher 1 M Natriumchloridlösung enthält, gewaschen.
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Die
Regenerierung der Säule
erfolgt durch Waschen mit 0,1 N NaOH (3 Säulenvolumina), gefolgt durch
Waschen der Säule
mit 0,1 N Salzsäure
(3 Säulenvolumina)
und Waschen der Säule
mit 5 Säulenvolumina
25% Alkohol in Wasser.
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BEISPIEL 4
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Die
gesammelten Fraktionen werden mit Puffer E, der aus folgendem besteht:
20
mM Natriumcitrat,
80 mM Glycin,
2,5 mM Calciumchlorid·2H2O,
pH-Wert 6,9 bis 7,1,
so lange
verdünnt,
bis sie eine Aktivität
von 26 oder 35 U/ml aufweisen. Danach wird der pH-Wert, falls nötig, auf
6,9 bis 7,1 eingestellt, worauf sich eine Filtration des Produkts
durch einen 0,45-μm-Sealklean-Filter
anschließt.
Anschließend
wird eine weitere Sterilfiltration durchgeführt.
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BEISPIEL 5 – Vergleichsexperiment
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In
zwei Durchläufen
werden jeweils 0,3 kg eines Kryopräzipitats, das jeweils von einem
identischen Plasma erhalten wurde, verarbeitet, wobei ein Verfahren
im Einklang mit der vorliegenden Erfindung steht und das andere
im Einklang mit dem Verfahren von
EP 0 343 275 A1 steht. Die Fraktionen werden
analysiert, und die Ergebnisse bezüglich der Bestandteile sind
in der folgenden Tabelle gezeigt.
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Tabelle
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Vergleich
der chromatographischen Reinigungen einer Kryopräzipitatlösung durch das Verfahren gemäß der Erfindung
(I) und durch das Verfahren von
EP 0 343 275 A1 (II). Analytische Ergebnisse
| I | II |
Faktor-VIII-Aktivität [IE/ml] | 27 | 27 |
VWF-AG
[IE/ml] | 66 | 23 |
VWF-AG/Faktor-VIII-Aktivität | 2,4 | 0,85 |
Fibrinogen
[mg/ml] | < 0,01 | 0,01 |
Fibronectin
[mg/ml] | 0,08 | 0,07 |
IgG
[mg/ml] | < 0,08 | < 0,08 |
IgM
[mg/ml] | < 0,03 | 0,2 |
Gesamtprotein
[mg/ml] | 0,4 | 0,3 |
Ausbeute
Faktor VIII/kg Plasma | 297 | 207 |
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Die
Aufarbeitung nach dem Verfahren gemäß der Erfindung führt zu 33
ausgegebenen Portionen, die jeweils 270 IE Faktor VIII enthalten,
was einer Ausbeute von 29 700 IE Faktor VIII/kg Kryopräzipitat
oder 297 IE/kg Plasma entspricht.
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Die
Aufarbeitung nach dem Verfahren gemäß
EP 0 343 275 A1 führt zu nur
23 ausgegebenen Portionen, die jeweils 270 IE Faktor VIII enthalten,
was einer Ausbeute von 20 700 IE Faktor VIII/kg Kryopräzipitat oder
207 IE/kg Plasma entspricht. Daraus folgt ein Vorteil bezüglich der
Ausbeute von fast 51% gegenüber dem
Aufarbeitungsverfahren von
EP
0 343 275 A1 .
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Unerwünschte Proteine,
wie Fibrinogen und Immunglobulin M (IgM) werden bei dem Verfahren
gemäß der Erfindung
effizienter entfernt.