DE69330458T3

DE69330458T3 - Verfahren zur gewinnung eines hochreinen factor viii/von willebrand faktor komplexes durch anionenaustauschchromatographie

Info

Publication number: DE69330458T3
Application number: DE69330458T
Authority: DE
Inventors: Monika Stadler; Horst Schwinn
Original assignee: Octapharma AG
Current assignee: Octapharma AG
Priority date: 1992-02-01
Filing date: 1993-01-20
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2013-01-21
Also published as: AU670776B2; JPH07503241A; WO1993015105A1; EP0625161B9; NO942832L; KR100240310B1; EP0625161B2; ATE203249T1; DE4204694A1; EP0625161B1; FI943545A; US5714590A; DE69330458T2; RU2096414C1; AU3351793A; ES2157920T3; DE69330458D1; NO315426B1; FI109908B; FI943545A0

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinaktiviertem Komplex von Faktor VIII und von-Willebrand-Faktor mittels Anionenaustauscher-Chromatographie aus Kryopräzipitat.
In der EP-A-0 238 701 wird ein Verfahren zur Herstellung eines hochreinen, nichtinfektiösen Antihämophiliefaktors beschrieben, wobei das Kryopräzipitat mittels Ethanolfällung von Fibrinogen, Globulinen, Albuminen und anderen störenden Bestandteilen befreit wird. Die Anreicherung aus dem Kryopräzipitat ist notwendig, da Faktor VIII nur in äußerst geringen Mengen in dem Material enthalten ist. Dieser Anreicherungsschritt beeinträchtigt jedoch den Gehalt an AHF im Endprodukt. Die bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von Faktor VIII ergeben nur geringe Mengen an wirksamer Substanz. Bei der Applikation des auf herkömmlichem Wege hergestellten Faktors VIII belastet man den Patienten daher mit großen Mengen antigener Substanzen. Diese Verfahrensweise ist nicht unbedenklich. Es hat daher nicht an Versuchen gefehlt, den Faktor VIII durch Trennungsoperationen weiter anzureichern. So wurde versucht, mittels Affinitätschromatographie mit gegen Faktor VIII gerichteten tierischen Antikörpern Produkte mit höherer spezifischer Aktivität zu erhalten. Diese Technik ist jedoch sehr aufwendig und kostenintensiv. Zum anderen ist sie auch deshalb nicht unbedenklich, da stets eine gewisse Menge tierischen Eiweißes bei jeder chromatographischen Trennung aus der Säule gewaschen wird.
Die EP-A-343 275 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines hochreinen, virusfreien Antihämophiliefaktors, wobei ein Faktor VIII umfassendes Kryopräzipitat mit Aluminiumhydroxid und biokompatiblen organischen Lösungsmitteln/Detergentien behandelt wird, worauf in einer bevorzugten Ausführungsform eine weitere Gelpermeationschromatographie an Ionenaustauschermaterialien durchgeführt wird. EP-A-0 367 840 beschreibt ein Chromatographiematerial auf Basis von Copolymerisaten aus Oligoethylenglycolen, Glycidylmethacrylaten und Pentaerythritoldimethacrylaten als besonders gut geeignet zur Herstellung eines hochreinen virusfreien Faktors VIII.
WO 90/14886 beschreibt ein Medium zur Trennung von Proteinen. Das dort offenbarte Material beschreibt eine wasserunlösliche Matrix, die eine Vielzahl von Polyamin-Struktureinheiten trägt, wobei die Polyamin-Struktureinheiten wenigstens 3 basische Stickstoffatome umfassen und die Stickstoffatome durch eine Kette von wenigstens zwei dazwischen befindlichen Kohlenstoffatomen voneinander getrennt sind, wobei in dem Fall, dass jede Polyamingruppe insgesamt 3 Stickstoffatome aufweist, wenigstens 5 solche Kohlenstoffatome vorhanden sind. Dieses Trennmedium ist wenigstens für eine partielle Reinigung von Faktor VIII geeignet.
EP-A-0 416 983 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung des Komplexes von Faktor VIII/von-Willebrand-Faktor mittels Anionenaustauscher-Chromatographie ausgehend von humanem Blutplasma.
Die EP 0 343 275 A1 bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines hochreinen Antihämophiliefaktors (AHF oder Faktor VIII), der bei der Reinigung eines Kryopräzipitats durch Behandlung mit biokompatiblen organischen Lösungsmitteln/Detergentien virusfrei gemacht wurde. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Kryopräzipitat vor der Entfernung der Viren aufgetaut wird, mit Wasser, das 1 bis 3 E/ml Heparin mit pH 6,5–7,5 enthält, extrahiert wird, dann mit einer Aluminiumhydroxidsuspension gemischt wird und nach dem Abkühlen auf 10 °C bis 18 °C und Einstellen des pH-Werts auf 6 bis 7 einer Zentrifugation und Filtration unterzogen und dann in einer an sich bekannten Weise weiterverarbeitet wird. Besonders vorteilhaft ist, dass die Probe nach der Entfernung der Viren einer Gelpermeationschromatographie auf Ionenaustauschermaterialien unterzogen wird.
Zwar wird durch das in der EP-A-0 343 275 beschriebene Verfahren eine Ausbeutesteigerung an Faktor VIII verzeichnet, jedoch ist die Ausbeute an biologisch aktivem Faktor VIII nach wie vor nicht optimal.
Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem ist also die Bereitstellung eines Verfahrens, mit dem sich die Gewinnung von biologisch aktivem Faktor VIII aus der Quelle Kryopräzipitat verbessern lässt und eine wirtschaftlichere Arbeitsweise gewährleistet ist.
Überraschenderweise wird dieses Problem gelöst durch ein Verfahren gemäß den Merkmalen des Anspruchs 1. Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die gemäß der Erfindung zu verwendenden Trennmaterialien bestehen aus Trägerteilchen, wie sie in der EP-A-0 337 144 offenbart werden. Dies sind Trägerteilchen mit Hydroxylgruppen, auf die über die Kohlenstoffatome in den α-Positionen bezüglich der Hydroxylgruppen ein polymeres Material aufgepfropft ist. Als Trägerteilchen kommen alle allgemein bekannten porösen und unporösen Chromatographieträger, die primäre oder sekundäre, aliphatische Hydroxylfunktionen an der Oberfläche aufweisen, in Frage. Von diesen sind hydrophile Polymere auf Acrylat- und Methacrylatbasis, Polymere auf Polyvinylalkohol-Basis, diolsubstituierte Kieselgele, Polysaccharide auf Agarose-Basis, Cellulose, Cellulosederivate oder Polymere auf Dextran-Basis bevorzugt. Es können aber selbstverständlich auch andere Polymere oder Copolymere auf der Grundlage von Monomeren wie Vinylverbindungen, Acrylamid, (Meth)Acrylsäureestern oder (Meth)Acrylnitril in hydroxylierter Form eingesetzt werden.
Das polymere Material der Formel I gemäß Anspruch 1, das über die Kohlenstoffatome in den α-Positionen bezüglich der Hydroxylgruppen an die Trägerteilchen gebunden ist, basiert auf den Monomeren der Formeln II und/oder III, wobei die Substituenten wie folgt definiert sind. CR⁷R⁸=CR¹–Y II
Diese Monomere stellen (Meth)Acrylsäure (Y = -COOH), (Meth)Acrylsäurederivate
Allylamine (Y = -CH₂NH₂, -CH₂NR²R³), (Meth)Acrylnitrile (Y = -CN), Acroleine (Y = -CHO), Vinylcarboxylate (Y = -OCOCHR⁵R⁶) oder Vinylencarbonate der Formel III dar.
Alle diese Monomere stellen in wässriger Lösung radikalisch polymerisierbare Substanzen mit reversibel bindenden Gruppen dar, die neutral, sauer oder basisch sein können.
Werden Vinylencarbonate der Formel III oder Vinylcarboxylate CR⁷R⁸=CR¹-OCOCHR⁵R⁶ der Formel II eingesetzt, so wird vorzugsweise das erhaltene Produkt anschließend in ein Trennmaterial mit Hydroxylgruppen überführt. Diese Überführung in eine Hydroxyl-Phase wird durch eine an sich bekannte milde alkalische oder saure Verseifung erreicht. Beispielsweise kann die Reaktion mit methanolischer K₂CO₃-Lösung bei Raumtemperatur, beschrieben z.B. von Y. Tezuka et al. in Macromol. Chem. 186, 685–694 (1985), durchgeführt werden.
In den Formeln I (vgl. Anspruch 1), II und III bedeutet R¹ vorzugsweise Wasserstoff, d.h. die Acrylsäurederivate sind bevorzugt.
Y in Formel II bedeutet vorzugsweise
-CH₂NH₂, -CH₂NR²R³.
X bedeutet sowohl in Formel I als auch in Formel II -NR²R³.
Bevorzugt sind dabei Verbindungen, in denen X -NR²R³ bedeutet und einer der Reste R² und R³ H ist.
Die Reste R² und/oder R³ bedeuten jeweils eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkylphenylgruppe, wobei die Alkyl- und/oder die Phenylgruppe ein- oder mehrfach substituiert sein kann mit Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Trialkylammonium- und ein- oder mehrfach, vorzugsweise ein- oder zweifach und besonders bevorzugt einfach substituiert sein kann mit einer Alkoxy-, Cyano-, Carboxyl-, Sulfonsäure-, Acetoxy- oder Acetamino-Gruppe.
Die Reste R² und/oder R³ bedeuten bevorzugt Alkyl, Alkoxyalkyl, Cyanoalkyl, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkylaminoalkyl, Trialkylammoniumalkyl, Carboxyalkyl mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen, bevorzugt bis zu 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere bevorzugt bis zu 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylgruppe, die linear oder verzweigt sein kann. R² und/oder R³ bedeuten demnach bevorzugt Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Methoxymethyl, Ethoxymethyl, 2-Methoxyethyl, 2-, 3- oder 4-Oxapentyl, 2-, 3-, 4- oder 5-Oxahexyl, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-Oxaheptyl, Isopropyl, 2-Butyl, Isobutyl, 2-Methylbutyl, Isopentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 2-Oxa-3-methylbutyl, 3-Oxa-4-methylbutyl, 2-Methyl-3-oxapentyl, 2-Methyl-3-oxahexyl, ferner auch Heptyl, Octyl, Nonyl oder Decyl.
Ferner bevorzugt sind auch Alkylgruppen, die durch eine Cyano-, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe substituiert vorliegen. Demnach bedeuten R² und/oder R³ bevorzugt Cyanomethyl, Cyanoethyl, Cyanopropyl, Cyanobutyl, Cyanopentyl, Cyanohexyl, 2-Cyanopropyl, 2-Cyanobutyl, Carboxylmethyl, Carboxylethyl, Carboxylpropyl, Carboxylisopropyl, Carboxylbutyl, Carboxylpentyl, Carboxylhexyl, Carboxyl-2-methylpropyl, Carboxyl-2-methylbutyl, Sulfonsäuremethyl, Sulfonsäureethyl, Sulfonsäurepropyl, Sulfonsäurebutyl, Sulfonsäurepentyl, Sulfonsäurehexyl, Sulfonsäure-2-methylpropyl, Sulfonsäure-2-methylbutyl, Sulfonsäure-3-methylbutyl, Sulfonsäure-2-methylpentyl, Sulfonsäure-3-methylhexyl oder Sulfonsäure-2-ethylpentyl.
Ferner sind die Alkylgruppen bevorzugt einfach substituiert mit einer Amino-, Mono- oder Dialkylamino- oder Trialkylammoniumgruppe. Die Alkylgruppen können dabei gleich oder verschieden sein und bis zu 10, vorzugsweise bis zu 6 Kohlenstoffatome und insbesondere bevorzugt bis zu 4 Kohlenstoffatome besitzen. Sie bedeuten demnach vorzugsweise Dimethylaminoethyl, Diethylaminoethyl, Methylaminoethyl, Methylaminopropyl, Dimethylaminopropyl, Ethylaminoethyl, Propylaminoethyl, Propylaminopropyl, Dipropylaminoethyl, Dipropylaminobutyl, Diethylaminoethyl, Trimethylammoniumethyl, Trimethylammoniumpropyl, Trimethylammoniumbutyl, Triethylammoniumethyl, Triethylammoniumpropyl, Triethylammoniumethyl, Aminoethyl, Aminopropyl, Aminobutyl oder Aminopentyl. Alle diese Alkyl- und substituierten Alkylgruppen sind ebenfalls als Substituenten an der Phenylgruppe bevorzugt.
Bevorzugt für R² und/oder R³ ist auch ein Sulfonsulfid der Struktur -(CH₂)-SO₂-(CH₂)_n-S-(CH₂)OH mit n = 2, 3, 4, 5 oder 6, vorzugsweise 2, 3 oder 4.
Vorzugsweise hat R² und/oder R³ auch die Bedeutung einer Phenylgruppe, die vorzugsweise einfach substituiert ist mit Cyano, Cyanoalkyl, Amino, Aminoalkyl, Mono- oder Dialkylamino, Alkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Mono- oder Dialkylaminoalkyl, Trialkylammonium- oder Trialkylammoniumalkyl, Carboxy, Carboxyalkyl, Sulfonsäure oder Sulfonsäurealkyl. Die bevorzugten Bedeutungen dieser Substituenten entsprechen den vorstehend angegebenen bevorzugten Alkylgruppen und substituierten Alkylgruppen. Der Substituent an der Phenylgruppe sitzt vorzugsweise in p-Stellung.
p-Acetoxyphenyl, p-Aminophenyl oder p-Acetaminophenyl sind ebenfalls bevorzugte Bedeutungen für R² und/oder R³. Bevorzugt für R² und/oder R³ ist ferner eine Alkylphenyl- oder Phenylalkylgruppe, wobei ebenfalls die angegebenen bevorzugten Bedeutungen für die Alkyl-, substituierten Alkyl- oder substituierten Phenylgruppen gelten sollen.
Demnach gelten folgende substituierte Phenylgruppen beispielsweise als besonders bevorzugt: 4-Cyanophenyl, 4-Alkylphenyl, 4-(N,N-Dimethylamino)phenyl, 4-(N,N-Dialkylaminoethyl)phenyl, 4-Ethoxyphenyl, 4-Ethoxyethylphenyl, 4-Trialkylammoniumphenyl, 4-Carboxylphenyl, 4-Sulfonsäurephenyl, Phenylethyl, 4-(N-Ethylamino)phenylpropyl oder 4-Cyanophenylethyl.
Des weiteren sind Einheiten der Formel I und/oder Monomere der Formel II bevorzugt, in denen R² und/oder R³ eine cyclische oder bicyclische Gruppe, die aromatisch oder gesättigt sein kann und 5 bis 10 Kohlenstoffatome enthält, wobei eine oder mehrere CH- oder CH₂-Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S, oder N oder NH und O ersetzt sind, bedeuten.
R² und R³ bedeuten demnach bevorzugt auch einen Pyridinrest, Imidazolylrest, Indolylrest, ferner bevorzugt einen Pyrrol-, Pyrimidin-, Pyrazin-, Chinolin- oder Isochinolinrest.
R² und/oder R³ können beispielsweise auch einen Thiazol-, Thiadiazol-, Morpholin-, Triazin-, Piperazin-, Benzothiazol-, Purin-, Pyrazol-, Triazol-, Pyrrolidin- oder Isoxazol-Rest bedeuten.
Insbesondere bevorzugt sind dabei die aromatischen heterocyclischen Gruppen.
Die Reste R² und R³ müssen, um zu geeigneten Austauschern zu gelangen, so aufeinander abgestimmt werden, dass entweder beide Reste eine basische Gruppe enthalten oder aber einer der Reste neutral ist. Dem Fachmann bereitet es keine Schwierigkeit, die Gruppen entsprechend zuzuordnen und somit geeignete Reste für R² und R³ zusammenzustellen, je nach Funktion und Aufgabe des gewünschten Anionenaustauschers.
Vorzugsweise ist einer der beiden Reste R² und R³ ein neutraler Rest.
R⁷ und R⁸ in den Monomeren der Formel II bedeuten vorzugsweise H, und damit haben auch R' und R'' in Formel I vorzugsweise die Bedeutung Wasserstoff.
Bevorzugt sind auch Trennmaterialien, bei denen in Formel I Y = -OH ist und einer der Reste R' und R'' ebenfalls -OH bedeutet. Als Monomeres muss dann ein Vinylencarbonat der Formel III eingesetzt werden, und das resultierende Produkt muss anschließend in eine Hydroxylphase überführt werden.
R⁷ und R¹ in Formel III bedeuten vorzugsweise H. In Formel 1 stellt n die Anzahl der wiederkehrenden Einheiten dar und bedeutet 2-100, vorzugsweise 5-60, insbesondere sind Kettenlängen von 10-30 bevorzugt.
K. Woods und Th. Orme beschreiben in EP-A-0 239 859 , dass es von Vorteil ist, nach der Virusentfernung oder -inaktivierung und vor der chromatographischen Trennung die Probe mit Ölen zu extrahieren, vorzugsweise mit Sojaöl, Rizinusöl und/oder Baumwollsamenöl.
Durch die erfindungsgemäßen Maßnahmen ist es erstmals möglich, in hohen Ausbeuten einen hochreinen Antihämophiliefaktor herzustellen, der eine bisher nicht erreichte spezifische Aktivität aufweist.
Handelsübliches Kryopräzipitat wird in Stücke von ca. 1 bis 2 cm zerteilt und bei Raumtemperatur innerhalb von 3 bis 4 Stunden aufgetaut. Diese Stücke werden bei Temperaturen zwischen 10 und 25 °C durch Rühren in etwa dem doppelten Volumen Wasser suspendiert, welches 1 bis 3 U/ml Heparin-Natrium enthält. Die Suspension wird mit 0,1 M Essigsäure auf einen pH-Wert von mindestens 7,0 bis 8,0, vorzugsweise 7,0 bis 7,1, eingestellt. Es wird 15 bis 60 Minuten, vorzugsweise 30 Minuten, bei Raumtemperatur gerührt. Daraufhin werden etwa 108 g 2%ige Aluminiumhydroxid-Suspension pro kg Kryopräzipitat hinzugefügt, und das Gemisch wird 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise 5 Minuten, bei Raumtemperatur gerührt. Mit Säure, vorzugsweise 0,1 M Essigsäure, wird der Säuregehalt auf pH 6,0 bis 7,0, vorzugsweise 6,5 bis 6,6, eingestellt. Die Probe wird auf 18 °C bis 10 °C, vorzugsweise 16 bis 14 °C, gekühlt. Man zentrifugiert bei dieser Temperatur, beispielsweise in einer Sharples AS-16 (Cepa 61) Zentrifuge mit einer Rate von 1,0 L/min. Danach schließt sich eine Filtration des Überstandes durch ein Pall AB-1 UO1OZP-Filter an. Vorzugsweise nach dem Abzentrifugieren und Filtrieren erfolgt eine Virusinaktivierung. Besonders bewährt hat sich die Virusinaktivierung mit Hilfe von Tween/TNBP (Tri-n-butylphosphat). Gute Ergeb nisse werden auch mit Natriumcholat/TNBP erzielt. Das Tween/TNBP- bzw. Natriumcholat/TNBP-Gemisch kann beispielsweise durch Ölextraktion wieder entfernt werden.
Man gibt die Probe auf eine Chromatographiesäule, die ein Gelpermeationsmaterial mit Ionenaustauscheraktivität aufweist, das unter dem Handelsnamen EMD-TMAE-Fractogel (M) 650 bekannt ist. EMD-TMAE-Fractogel (M) 650 wurde oben bereits charakterisiert. Die Säulenkapazität soll vorzugsweise so beschaffen sein, dass 0,5 kg des Säulenmaterials pro kg Kryopräzipitat sich in der Säule befinden. Die Säule wird mit der Probe beschickt und mit Puffern gewaschen. Nach Flution der Probe mit einem Puffer höherer Ionenstärke wird das erhaltene Produkt mit einem Puffer mit niedrigerem Salzgehalt verdünnt und, falls nötig, auf pH 6,5 bis 7,5, vorzugsweise 6,9 bis 7,1, eingestellt. Danach wird erneut filtriert, vorzugsweise an Nitrocellulosefiltern, worauf sich eine Sterilfiltration anschließt.
Gemäß der Erfindung erfolgt die Reinigung von Faktor VIII durch Waschen und Eluieren mit Puffern, die nacheinander immer höhere Ionenstärken aufweisen, und die Ionenstärke des Puffers wird mittels quartärer Ammoniumsalze, die wenigstens eine Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen aufweisen und einen hydrophilen Substituenten tragen, allein oder in Kombination mit Kochsalz eingestellt.
Als besonders vorteilhaft haben sich diejenigen Trennpuffer erwiesen, deren Ionenstärke unter Verwendung von Natriumchlorid und/oder einem quartären Ammoniumsalz mit mindestens einer hydrophil substituierten Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Cholinchlorid, eingestellt wird.
So wird im erfindungsgemäßen Verfahren die Säule, die das oben beschriebene Fractogel (M) 650 enthält, mit einem Puffer A gewaschen und äquilibriert. Der Puffer A enthält Natriumchlorid oder Cholin in einer Konzentration von 50 bis 200 mM, vorzugsweise 120 mM, bei einem pH-Wert von 5,8 bis 7,8, vorzugsweise 6,5 bis 7,0.
Die Probe wird vorzugsweise aus einem Puffer, der eine Osmolarität von 200 bis 600 mOsmol, bevorzugt 380 bis 520 mOsmol, bei einem pH-Wert von 5,8 bis 7,8, vorzugsweise 6,5 bis 7,0, aufweist, auf die Säule aufgetragen. Es empfiehlt sich, dass die Kapazität der Säule etwa 50 I.E. Faktor VIII pro ml Gel nicht überschreitet. Nach dem Auftragen wird die Säule mit Puffer A gewaschen.
Danach wäscht man die Säule mit Puffer B, der ebenfalls Natriumcitrat, Calciumchlorid, Glycin enthält, jedoch eine höhere Ionenstärke als der Puffer A aufweist. Die Konzentration an quartärem Ammoniumsalz der oben beschriebenen Art und/oder Natriumchlorid sollte zwischen 150 mM und 250 mM, vorzugsweise 180 bis 200 mM, betragen, der pH-Wert sollte zwischen 5,8 und 7,8, vorzugsweise bei ca. 7,0, liegen.
Die Flution des Produkts von der Säule erfolgt mit einem Puffer C, der eine gegenüber Puffer B nochmals erhöhte Ionenstärke aufweist. Der Gehalt an quartärem Ammoniumsalz der oben beschriebenen Art, insbesondere Cholinchlorid und/oder Natriumchlorid, sollte im Bereich von 200 mM bis 500 mM liegen, vorzugsweise ca. 400 mM betragen, bei einem pH-Wert von 5,8 bis 7,8, vorzugsweise ca. 7,0.
Mittels des Verfahrens gemäß der Erfindung wird die Gewinnung von Faktor VIII in einer höheren Ausbeute und mit höherer Produktstabilität erreicht. Es ist vorteilhaft, dass bei dem Verfahren gemäß der Erfindung der sogenannte von-Willebrand-Faktor nicht entfernt wird, sondern in den Faktor-VIII-Fraktionen verbleibt. Es ist also möglich, die Faktor-VIII-Präparate auch für Patienten zu verwenden, die unter einem Mangel an von-Willebrand-Faktor leiden. Weiterhin kann Faktor VIII aufgrund der Anwesenheit des von-Willebrand-Faktors, der eine natürliche Stabilisierung von Faktor VIII erleichtert, auch in kontinuierlichen Infusionstechniken eingesetzt werden.
Das Verfahren wird weiterhin anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht.
BEISPIEL 1
Anreicherung des Faktor VIII aus Kryopräzipitat
Handelsübliches Kryopräzipitat wird in Stücke von ca. 1 bis 2 cm zerteilt und bei Raumtemperatur innerhalb von 3 bis 4 Stunden aufgetaut. Diese Stücke werden bei 20 °C bis 25 °C durch Rühren suspendiert und in etwa dem doppelten Volumen Wasser, welches 2 U/ml Heparin-Natrium enthält, suspendiert. Die Suspension wird mit 0,1 M Essigsäure auf einen pH-Wert von 7,0 bis 7,1 eingestellt. Man rührt 30 Minuten bei 20 °C bis 25 °C weiter. 108 g 2%ige Aluminiumhydroxid-Suspension pro kg Kryopräzipitat werden hinzugefügt und weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Danach stellt man den pH-Wert mit 0,1 M Essigsäure auf pH 6,5 bis 6,6 ein. Man kühlt die Probe auf 16 °C bis 14 °C ab, zentrifugiert in einer Sharples AS-16 (Cepa 61) Zentrifuge mit einer Rate von 1,0 L/min. Der Überstand wird durch ein Pall AB-1 UO1OZP-Filter filtriert.
BEISPIEL 2
Vorbereitung der Chromatographiesäule
Zur Trennung des extrahierten Kryopräzipitats wird eine Säule mit mindestens 0,5 l Ionenaustauscher-Harz pro kg Kryopräzipitat verwendet. Die Säulenhöhe soll ≤ ihr Durchmesser sein. Nach dem Beschicken der Säule mit Harz wird die Chromatographiesäule zuerst mit 5 Volumina 0,1 M Natriumchloridlösung gewaschen. Danach wäscht man mit einem Puffer A, der wie folgt zusammengesetzt ist:
120 mM Natriumchlorid,
10 mM Natriumcitrat·5H₂O,
120 mM Glycin,
1 mM Calciumchlorid·2H₂O,
pH-Wert 6,5 bis 7,0, mit 1 M HCl einzustellen.
Sämtliche Puffer müssen virusfrei sein, da die folgenden Operationen mit virusfreien Extrakten des Kryopräzipitats durchgeführt werden.
BEISPIEL 3
Die Probe wird auf die Säule aufgetragen, und die Absorption des Durchflusses bei einer Wellenlänge von 280 nm beobachtet. Das Filtrat wird aufgenommen und auf Faktor-VIII-Aktivität untersucht, ebenso wie das Produkt vor der Säulentrennung. Danach wird die Säule mit dem Puffer A gewaschen, bis die Absorption wieder ihren Ausgangswert erreicht. Danach wird die Säule mit Puffer B gewaschen, bis die Absorption wieder die Grundlinie erreicht hat.
Der Puffer B hat folgende Zusammensetzung:
180 bis 200 mM Natriumchlorid,
10 mM Natriumcitrat·5H₂O,
120 mM Glycin,
1 mM Calciumchlorid·2H₂O,
pH-Wert 6,9 bis 7,0.
Die Flution des Produkts erfolgt mit dem Puffer C. Die nach Zugabe des Puffers C erscheinende Proteinfraktion wird gesammelt.
Puffer C weist folgende Zusammensetzung auf
400 mM Natriumchlorid,
1 mM Natriumcitrat·5H₂O,
120 mM Glycin,
1,0 mM Calciumchlorid·2H₂O,
pH-Wert 6,9 bis 7,0.
Nach Flution des gewünschten Produkts wird die Säule mit 5 Volumina des Puffers D, welcher 1 M Natriumchloridlösung enthält, gewaschen.
Die Regenerierung der Säule erfolgt durch Waschen mit 0,1 N NaOH (3 Säulenvolumina), gefolgt durch Waschen der Säule mit 0,1 N Salzsäure (3 Säulenvolumina) und Waschen der Säule mit 5 Säulenvolumina 25% Alkohol in Wasser.
BEISPIEL 4
Die gesammelten Fraktionen werden mit Puffer E, der aus folgendem besteht:
20 mM Natriumcitrat,
80 mM Glycin,
2,5 mM Calciumchlorid·2H₂O,
pH-Wert 6,9 bis 7,1,
so lange verdünnt, bis sie eine Aktivität von 26 oder 35 U/ml aufweisen. Danach wird der pH-Wert, falls nötig, auf 6,9 bis 7,1 eingestellt, worauf sich eine Filtration des Produkts durch einen 0,45-μm-Sealklean-Filter anschließt. Anschließend wird eine weitere Sterilfiltration durchgeführt.
BEISPIEL 5 – Vergleichsexperiment
In zwei Durchläufen werden jeweils 0,3 kg eines Kryopräzipitats, das jeweils von einem identischen Plasma erhalten wurde, verarbeitet, wobei ein Verfahren im Einklang mit der vorliegenden Erfindung steht und das andere im Einklang mit dem Verfahren von EP 0 343 275 A1 steht. Die Fraktionen werden analysiert, und die Ergebnisse bezüglich der Bestandteile sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
Tabelle

Vergleich der chromatographischen Reinigungen einer Kryopräzipitatlösung durch das Verfahren gemäß der Erfindung (I) und durch das Verfahren von EP 0 343 275 A1 (II). Analytische Ergebnisse

	I	II
Faktor-VIII-Aktivität [IE/ml]	27	27
VWF-AG [IE/ml]	66	23
VWF-AG/Faktor-VIII-Aktivität	2,4	0,85
Fibrinogen [mg/ml]	< 0,01	0,01
Fibronectin [mg/ml]	0,08	0,07
IgG [mg/ml]	< 0,08	< 0,08
IgM [mg/ml]	< 0,03	0,2
Gesamtprotein [mg/ml]	0,4	0,3
Ausbeute Faktor VIII/kg Plasma	297	207

Die Aufarbeitung nach dem Verfahren gemäß der Erfindung führt zu 33 ausgegebenen Portionen, die jeweils 270 IE Faktor VIII enthalten, was einer Ausbeute von 29 700 IE Faktor VIII/kg Kryopräzipitat oder 297 IE/kg Plasma entspricht.
Die Aufarbeitung nach dem Verfahren gemäß EP 0 343 275 A1 führt zu nur 23 ausgegebenen Portionen, die jeweils 270 IE Faktor VIII enthalten, was einer Ausbeute von 20 700 IE Faktor VIII/kg Kryopräzipitat oder 207 IE/kg Plasma entspricht. Daraus folgt ein Vorteil bezüglich der Ausbeute von fast 51% gegenüber dem Aufarbeitungsverfahren von EP 0 343 275 A1 .
Unerwünschte Proteine, wie Fibrinogen und Immunglobulin M (IgM) werden bei dem Verfahren gemäß der Erfindung effizienter entfernt.

Claims

Verfahren zur Gewinnung eines hochreinen virusinaktivierten Faktor-VIII/von-Willebrand-Faktor-Komplexes aus Kryopräzipitat mittels Anionenaustauscherchromatographie, dadurch gekennzeichnet, dass als Anionenaustauschermaterial ein Trennmaterial auf der Basis von Trägern verwendet wird, die Hydroxygruppen enthalten, wobei die Oberflächen der Träger mit kovalent gebundenen Polymeren beschichtet sind, wobei die Polymere Repetiereinheiten enthalten, die gleich oder verschieden sind und durch die Formel I dargestellt werden:
wobei R¹ H oder CH₃ darstellt; Y
-CH₂-NH₂ oder -CH₂NR²R³ darstellt; R' und R'' jeweils H oder CH₃ darstellen; X -NR²R³ darstellt; R² und R³ jeweils folgendes darstellen: eine Alkyl-, Phenyl-, Phenylalkyl- oder Alkylphenylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen in der Alkyleinheit, wobei diese Gruppen einfach oder mehrfach mit Amino, Mono- oder Dialkylamino, Trialkylammonium oder Carboxy substi tuiert sind und einfach oder mehrfach mit Alkoxy-, Cyan-, Sulfonsäure-, Acetoxy- oder Acetaminoeinheiten substituiert sein können; eine cyclische oder bicyclische Struktureinheit mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, wobei eine oder mehrere CH- oder CH₂-Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S bzw. N oder NH und O ersetzt wurden; einer der Reste R² und R³ auch H darstellen kann; wobei R² und R³ so aneinander angepasst sind, dass entweder beide Struktureinheiten basische Gruppen enthalten oder eine der beiden Struktureinheiten neutral ist; und n 2 bis 100 beträgt; und wobei die Reinigung von Faktor VIII durch Waschen und Eluieren mit Puffern erfolgt, die nacheinander immer höhere Ionenstärken aufweisen, und die Ionenstärke des Puffers mittels quartärer Ammoniumsalze, die wenigstens eine Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen aufweisen und einen hydrophilen Substituenten tragen, allein oder in Kombination mit Kochsalz eingestellt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei Y in Formel I von Anspruch 1
darstellt, wobei X = -NR²R³, wobei R² und R³ jeweils folgendes darstellen: Aminoalkyl, Mono- oder Dialkylaminoalkyl, Trialkylammoniumalkyl mit jeweils bis zu 10 Kohlenstoffatomen in der Alkyleinheit, Phenyl, das unsubstituiert ist oder einfach oder mehrfach mit Alkyl-, Alkoxy-, Alkoxyalkyl-, Cyan-, Cyanalkyl-, Aminoalkyl-, Amino-, Mono- oder Dialkylamino-, Mono- oder Dialkylaminoalkyl-, Trialkylammonium-, Trialkylammoniumalkyl-, Carboxy-, Carboxyalkyl-, Sulfonsäure-, Sulfonsäurealkyl-, Acetoxy- oder Acetaminogruppen mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen in der Alkyleinheit substituiert ist; eine cyclische oder bicyclische Struktureinheit mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, wobei eine oder mehrere CH- oder CH₂-Gruppen durch N oder NH, N oder NH und S bzw. N oder NH und O ersetzt wurden; einer der Reste R² und R³ auch H darstellen kann; wobei R² und R³ so aneinander angepasst sind, dass entweder beide Struktureinheiten basische Gruppen enthalten oder eine der beiden Struktureinheiten neutral ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei Y in Formel I von Anspruch 1 -CH₂NH₂ oder -CH₂NR²R³ darstellt, wobei R² und R³ wie in Anspruch 1 definiert sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem quartären Ammoniumsalz um Cholinchlorid handelt.
Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Salzgradient, der durch die eingesetzten Puffersysteme festgelegt wird, von 0,1 bis 1 M verläuft als Gesamtwert der Konzentrationen von Natriumchlorid und/oder des quartären Ammoniumsalzes gemäß den Ansprüchen 1 und/oder 4.