JPH07503241A - アニオン交換体クロマトグラフィーによる高純度ウィルス不活性化因子ｖｉｉｉの回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、７−オン交換体クロマトグラフ　イー（ａｎｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇ ｅｒ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により、血漿または寒冷沈降物（ｃｒｙ ｏｐｒｅｃｉｐｉ　ｔａｔｅ）から高度に純粋なウィルス不活性化（ｖｉｒｕｓ −ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）因子Ｖ［ＩＩを回収する方法に関連する。

ＥＰ−Ａ−０２３８７０１においては、高い純度の非感染性抗血友病因子の製造 方法が記載されており、該方法においてはフィブリノゲン、グロブリン、アルブ ミン及びその他の妨害成分がエタノール沈澱によって寒冷沈降物から除去される 。

その材料には因子Ｖ［［＋が非常に少量しか含まれていないので、その寒冷沈降 物からの蓄積が必要である。しかし、この蓄積ステップは、最終的な生成物中の ＡＨＦ含有物を損なう。今まで因子ＶＩＩ［の製造に知られている方法は、非常 に少量の活性物質しか製造できない。従って、従来のルートを通して製造された 因子ｖ］１１の適用によって、患者は多量の抗原物質の負担を受けることになる 。この過程は危険なしてはすまない。従って、分離操作によって因子Ｖ［ＩＩを さらに蓄積するための多くの試みがなされてきている。例えば、因子ＶＩ［Ｉに 対する動物の抗体を使用したアフィニティクロマトグラフィーによって、より高 い比活性を有する生成物を得ることか試みられている。しかし、この技術は、非 常に高価であり、経費集約的である。一方、この技術においては各クロマトグラ フィー分離においてカラムから一定量の動物タンパク質が常に溶出されることも あり、十分に申し分のないものとはいえない。

ヨーロッパ特許出願８８１０８４５８．６号は、高度に純粋なウィルスを含まな い抗血友病因子を製造するための方法を記載しており、該方法においては因子ｖ ｒｏを含む寒冷沈降物が水酸化アルミニウム及び生物学上適合できる有機溶媒／ 洗剤で処理され、好ましい態様においてはその後イオン交換体材料を使用したゲ ル浸透クロマトグラフィーか行われる。ヨーロッパ特許出願８８１１８４７８． ２号は、非常に純度の高いウィルスを含まない因子Ｖｌ１１を製造するのに特に 適当なものとして、オリボエチレングリコール、グリシジルメタクリレート及び ペンタエリスリトールジメタクリレートのコポリマーをベースとするクロマトグ ラフィー材料を記載している。

Ｗｏ　９０／１４８８６は、タンパク質を分離するための媒体を記載する。そこ に開示された材料は、複数のポリアミン部分を有する水不溶性のマトリックスを 記載しており、該ポリアミン部分は少くとも３個の塩基性窒素原子を育し、その 窒素原子はその間に位置する少くとも２個の炭素原子の鎖によって分離されてお り、各ポリアミン基が合計３個の窒素原子のを持つ場合にはそのような炭素原子 が少くとも５個存在する。この分離媒体は、少なくとも因子ＶＩｌ［の部分的な 精製に適している。

ＥＰ　Ｏ３４３２７５Ａｌは、非常に純度の高い抗血友病因子（ＡＨＦまたは因 子Ｖ［［Ｄを製造するための方法に関し、該因子は、寒冷沈降物を精製する際に 、生物学上適合できる有機溶媒／洗剤での処理によってウィルスを含まないよう にされる。

該方法は、寒冷沈降物をそこからウィルスを除去する前に解凍し、ｐＨ６，５− ７，５でＩ〜３Ｕ／ｍｌのヘパリンを含む水で抽出し、その後水酸化アルミニウ ム懸濁物を混合し、１０″Ｃ−１８°Ｃに冷却し、ｐＨ値を６〜７に調節した後 に遠心分離と濾過にかけ、そしてそれ自体公知の方法により処理することを特徴 とする特に、ウィルスの除去の後に、イオン交換体材料上でのゲル浸透クロマト グラフィーにかけられることが有利である。

ヨーロッパ特許出願８８１０８４５８．６号に記載された方法は、因子Ｖｌｌｌ の収率の増加を提供することは事実であるが、生物学的に活性な因子Ｖｌ１１の 収率はまだ最適でない。

従って、本発明の目的を定義する技術的課題は、寒冷沈降物または血液血漿のソ ースから生物学的に活性な因子Ｖｌｌｌを回収することを改善することができ、 そしてより経済的な工程を確保できる方法を提供することにある。

この課題は、請求項１の構成に従った方法によって驚異的に解決される。そのサ ブクレームは本発明の方法の好ましい態様に関連する。

本発明に従って使用される分離材料は、ＥＰ−Ａ−０３３７１４４に記載される ように、キャリヤー粒子から成る。これらは、ヒドロキシル基を有するキャリヤ ー粒子てあって、その上に前記ヒドロキシル基に対してα−位置にある炭素原子 を介してポリマー材料がグラフトされたものである。このキャリヤー材料は、そ の表面の上に１級または２級脂肪族ヒドロキシル官能基を有する、一般に公知の 多孔性または非多孔性のクロマトグラフィー支持体のいずれをも含むことができ る。これらの中で好ましいものは、アクリレート類及び／またはメタクリレート 類をベ−ル置換シリカゲル、アガロースをベースとする多糖類、セルロース、セ ルロース誘導体、デキスランをベースとするポリマーである。もちろんビニル化 合物、アクリルアミド、（メタ）アクリル酸エステル類、ヒドロキシル化された 形態の（メタ）アクリロニトリルのようなモノマーをベースとするその他のポリ マーまたはコポリマーも使用することができる。

ヒドロキシル基に対してα−位置＋ｉある炭素原子を介してキャリヤー粒子に結 合する、請求項１の式Ｉのポリマー材料は、式１１及び／またはＩＩＩによって 示されるモノマーから誘導されたものであり、その置換基は以下に定義する。

ＣＲ７Ｒ８−ＣＲ’Ｙ　エエ これらのモノマーは、　（メタ）アクリル酸（Ｙ　＝　−ＣＯＯＨ）、　（メタ ）アクリル酸誘導体（Ｙ　＝　−ＧＯ−Ｘ　）　、−ｉ’　＋Ｊ　ル”ｙ’　ミ ン（Ｙ　＝　−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨ２Ｒ”　）、（メタ）アクリロニト リル（Ｙ　＝　−ＣＮ　）、アクロレイン（Ｙ　＝−ＣＨＯ）、ビニルカルボキ シレート（Ｙ　＝−ＯＣＯＣＨＲ５Ｒ＠）または式Ｉ１１のビニレンカーボネー ト類を表す。

これらのモノマーのすへては、フリーラジカルにより開始される重合により水溶 液中で重合可能な物質であり、中性、酸性または塩基性であってよい可逆的に結 合する基を有する。

式［１１のビニレンカーボネート類または式１１のビニルカルボキシレート類Ｃ Ｒ７Ｒ’＝ＣＲ’−０ＣＯＣＨＲ’Ｒ’を使用する場合、結果として生ずる生成 物をヒドロキシル基を存する分離材料に変換することが好ましい。このヒドロキ シル相への変換は、それ自体公知の穏やかなアルカリまたは酸鹸化よって行うこ とができる。例えばその反応は、例えばＹ、　Ｔｅｚｕｋａ　ｅｔ　ａｌ、、　 ｉｎ　Ｍａｃｒｏｍｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１８６．６８５〜６９４　（１９８５ ）に記載されたように、室温てに、ＣＯｌのメタノール溶液を使用して行うこと ができる。

式Ｉ（請求項１参照）、■及びｌｌ［中のＲ１は、好ましくは水素を表し、即ち アクリル酸誘導体が好ましい。

式１１中（７）Ｙハ、好マＬ　＜　ｌｔ−Ｃ０−Ｘ　、−０ＣＯＣＨＲ’Ｒ’ま りｌ；！−ＣＨｚＮ）１２を表し、次に好ましいのは−ＣＮまたは−Ｃ）１０で ある。従って、式１中のＹは、まず第一に−ＣＯ−Ｘ、−ＯＨ（好ましくは部分 （ｍｏｉｅｔｙ）−０ＣＯＣＨＲ’Ｒ＠がヒドロキシル相に変換されるので）ま たは −Ｃ１（ｚＮＨｔを表し、次に好ましいものとして−ＣＮまたは−ＣＨ０を表す 。

Ｒ５及びＲ＠は、独立してＨまたは５個までの炭素原子を有するアルキル基を表 す。

基Ｒ５及びＲ１の少くとも１つがＨであることが好ましい。特に好ましい部分は 、アセチルオキソ、プロピオニルオキシ、ブチリルオキシ、バレリルオキシ、ヘ キサノイルオキシ基である。

式Ｉ中のＸは式１１中と同様に、−〇Ｒ４、−ＯＨまたは−ＮＲ２Ｒ’を表し、 好ましくは−ＮＲ２Ｒ３を表す。

好ましい化合物は、Ｘか−ＮＲ２Ｒ’を表し、Ｒ２及びＲ３の１つがＨであるも のである。

部分Ｒ２及び／またはＲ２は、好ましくはアルキル、フェニル、フェニルアルキ ルまたはアルキルフェニル基を表し、そのアルキル及び／またはフェニル基は、 アルコキン、シア人アミノ、モノ−またはジアルキルアミ六トリアルキルアンモ ニウム、カルボキシル、スルホン酸、アセトキシまたはアセトアミノ基によりモ ノ−あるいはポリ置換されていてもよく、好ましくはモノ−またはジ置換、特に 好ましくはモノ置換されたものである。

部分Ｒ２及び／またはＲ３は、好ましくはアルキル、アルコキシアルキル、シア ノアルキル、アミノアルキル、モノ−またはジアルキルアミノアルキル、トリア ルキルアンモニウムアルキル、カルボキシアルキルまたはスルホン酸アルキルし 、これらはアルキル基中に多くともｌＯ＠の炭素原子、より好ましく（ヨ最高６ 個の炭素原子、特に好ましくは最高４個の炭素原子を有し、これらのアルキル基 中直鎖あるいは分岐のものであってよい。従って、Ｒ２及び／まｔこ＋ｉＲ’＋ ！好まししλ意味として、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキ シＪし、メトキシメチル、エトキシメチル、２−メトキシエチル、２−、３−ま たは４−オキサペンチル、２−、３−、４−または５−オキサヘキシル、２−、 ３−、４−、５−または６−オキサヘプチル、イソプロピル、２−ブチル、イソ ブチル、２−メチルブチル、イソペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペ ンチル、２−オキサ−３−メチルブチルルブチル、２−メチル−３−オキサペン チル、２−メチル−３−オキサヘキシル、そしてさらに同様なヘプチル、オクチ ル、ノニルあるいはデシルの意味を有する。

さらに、ンア云カルボキシ−またはスルホン酸基で置換されたアルキル同様に好 ましい。従って、Ｒ２及び／またはＲ３は好ましい意味として、シアノメチル、 シアノエチル、シアノプロピル、シアノブチル、シアノペンチル、シアノヘキシ ル、２−シアノプロピル、２−シアノブチル、カルボキシルメチルルエチル、カ ルボキシルプロピル、カルボキシルイソプロピル、カルボキシルブチル ロピル、カルボキシル−２−メチルブチル、スルホン酸−メチル、スルホン酸− エチル、スルホン酸−プロピル、スルホン酸−ブチル、スルホン酸−ペンチル、 スルホン酸−ヘキシル、スルホン酸−２−メチルプロピル、スルホン酸−２−メ チルブチル、スルホン酸−３−メチルブチル、スルホン酸−２−メチルペンチル 、スルホン酸−３−メチルヘキシルまたはスルホン酸−２−エチルペンチルの意 味を有する。

さらにアルキル基がアミ人モノ−またはジアルキルアミノまたはトリアルキルア ンモニウム基でモノ置換されることも好ましい。アルキル基は、同してあっても よいか、または異なってもよ（、そして多くとも１０個の炭素原子を有し、そし て好ましくは多くとも６個の炭素原子を有し、特に好ましくは多くとも４個の炭 素原子育することが好ましい。従って、これらは好ましく１意味として、ジメチ ルアミノエチル、ジエチルアミノエチル、メチルアミノエチル、メチルアミノプ ロピル、ジメチルアミノプロピル、エチルアミノエチル、プロピルアミノエチノ し、プロピルアミノプロピル、ジプロピルアミノエチル、ジプロピルアミノブチ ル、ジエチルアミノエチル、トリメチルアンモニウムエチル、トリメチルアンモ ニウムプロピル、トリメチルアンモニウムブチル、トリエチルアンモニウムエチ ル、トリエチルアンモニウムプロピル、トリエチルアンモニウムエチル、アミノ エチル、アミノプロピル、アミノブチルまたはアミノペンチルの意味を有する。

これらのアルキル及び置換アルキル基の全てはまたフェニル基の置換基として好 ましい。

同様にＲ１及び／またはＲ３として好ましいのは、−（ＣＨｔ）ｎ−３Ｏｘ−（ ＣＨｚ）ｎ−３−（ＣＨｚ）ｎＯＨ（ｎ　：２．３．４．５または６、好ましく は２．３または４）の構造を有しているスルホンスルフィドである。

好ましくは、Ｒ２及び／またはＲ３はまた、フェニル基の意味を有し、このフェ ニル基は好ましくは、シアノ、シアノアルキル、アミ人アミノアルキル、モノ− もしくはジアルキルアミノ、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、モノ −もしくはジアルキルアミノアルキル、トリアルキルアンモニウム−またはトリ アルキルアンモニウムアルキル、カルボキン、カルボキシアルキル、スルホン酸 またはスルホン酸−アルキルでモノ置換されたものである。これらの置換基の好 ましい意味は、上記に好ましいものとして記載したアルキル基及び置換アルキル 基に対応する。フェニル基の置換基は、好ましくはｐ−位置に結合する。

ｐ−アセトキシフェニル、ｐ−アミノフェニルまたはｐ−アセトアミノフェニル も、Ｒ２及び／またはＲ３の好ましい意味である。さらに部分Ｒ２及び／または Ｒ３として好ましいのは、アルキルフェニルまたはフェニルアルキル基であり、 特定された好ましい意味は前記アルキル、置換−アルキルまたは置換−フェニル 基に適用できることも意図するものである。

従って、例えば以下の置換フェニル基、４−シアノフェニル、４−アルキルフェ ニル、４−　（Ｎ、Ｎ−ツメチルアミノ）−フェニル、４−　（Ｎ、Ｎ−ジアル キルアミノエチル）−フェニル、４−エトキシフェニル、４−エトキシエチルフ ェニル、４−トリアルキルアンモニウムフェニル、４−カルボキシルフェニル、 ４−スルホン酸−フェニル、フェニルエチル、４−（Ｎ−エチルアミノ）フェニ ルプロピル、４−シアノフェニルエチルは特に好ましい。

さらに好ましいのは、式■を有する部分及び／または式Ｉ＋のモノマーであって 、Ｒ２及び／またはＲ８が芳香族または飽和の、５〜１０個の炭素原子を含む環 式または二環式基で、環中１つ以上のＣＨ−またはＣＩ（、−基がＮもしくはＮ ＨＳＮもしくはＮＨ及びＳ、またはＮもしくはＮｌ（及び０に置き換えられたも のである。

従って、Ｒ２及び／またはＲ′は好ましくはピリジン部分、イミダゾリル基、イ ンドリル基も表し、さらに好ましくはピロール、ピリミジン、ピラジン、キノリ ンまたはイソキノリン部分を表す。

Ｒ２及び／またはＲ３はまた、例えば、チアゾール、チアジアゾール、モルフォ リン、トリアジン、ピペラジン、ベンゾチアゾール、プリン、ピラゾール、トリ アゾール、ピロリジンまたはイソオキサゾール部分を表してもよい。

これらの中で芳香族へテロ環式基が特に好ましい。

適当な交換体を製造するために、基Ｒ２及びＲ３は、両方の部分が酸性基または 塩基性基のいずれかを含むか、部分の１つが中性であるように互いに調節されな ければならない。当業者が基を選択するにあたって、即ち、所望のイオン交換の 機能と目的に応じて適当な部分をＲ２及びＲ３として組み合わせるのに何等困難 はないであろう。

２個の部分Ｒ２及びＲ３の１つが中性の部分であることが好ましい。

Ｒ４の好ましい意味は、直鎖あるいは分岐していてもよいアルキル基中に多くと も１０個の炭素原子、好ましくは多くとも６個の炭素原子、特に好ましくは多く とも４個の炭素原子を有している、アルキル、アルコキシアルキル、シアノアル キル、カルボキシアルキル及びスルホン酸−アルキルを含む。従って、Ｒ４は好 ましくはメチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、メトキシメチル、工ｌ ・キシメチル、２−メトキシエチル、２−１３−または４−オキサペンチル、イ ソプロピル、２−ブチル、イソブチル、２−メチルブチル、イソペンチル、２− メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−才キサー３−メチルブチル、３−オ キサ−４−メチルブチル、２−メチル−３−オキサペンチルまたは２−メチル− ３−オキサヘキシルを表す。

さらに、シアノ、カルボキシまたはスルホン酸基で置換されたアルキル基も好ま しい。従って、Ｒ４は好ましくは、シアノメチル、シアノエチル、シアノプロピ ル、シアノブチル、シアノペンチル、シアノヘキシル、２−シアノプロピル、２ −シアノブチル、カルボキシルメチル、カルボキシルエチル、カルボキシルプロ ピル、カルボキシルイソプロピル、カルボキシルブチル、カルボキシルエチル、 カルボキシルヘキシル、カルポキソルー２−メチルプロピル、カルボキシル−２ −メチルブチル、スルホン酸−メチル、スルホン酸−エチル、スルホン酸−プロ ピル、スルホン酸−ブチル、スルホン酸−ペンチル、スルホン酸−ヘキシル、ス ルホン酸−２−メチルプロピル、スルホン酸−２−メチルブチル、スルホン酸− ３−メチルブチル、スルホン酸−２−メチルペンチル、スルホン酸−３〜メチル ヘキシルまたはスルホン酸−２−エチルペンチルを表す。

これらのアルキル及び置換−アルキル基のすへては、フェニル基の置換基として も好ましい。

好ましくはＲ４はまた、フェニル基の意味を有し、そしてそれは好ましくはシア ノ、シアノアルキル、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、カルボキシ 、カルホキジアルキル、スルホン酸またはスルホン酸−アルキルでモノ置換され たものである。これらの置換基の好ましい意味は、上記に好ましいものとして特 定したアルキル基及び置換アルキル基に対応する。好ましくは、フェニル基の置 換基はｐ−位置において結合する。

式Ｉ＋のモノマー中のＲ７及びＲ８は、好ましくはＨを表し、そして式■中Ｒ° 及びＲ”も好ましくは水素を表す。

同様に好ましいのは、式Ｉ中のＹが−ＯＨを表し、部分Ｒ゛及びＲ“の１つも一 〇Ｈを表す分離材料である。その場合、式ＩＩＩのビニレンカーボネートがモノ マーとして使用され、得られる生成物はその後ヒドロキシル相に変換されなけれ ばならない。

式ＩＩＩ中のＲ７及びＲ’は、好ましくはＨを表す。式■中、ｎは反復単位の数 を示し、２〜１００、好ましくは５〜６０を表し、好ましい鎖長はｌＯから３０ である。

Ｗｏｏｄｓ、　Ｋ、、及びＯｒｍｅ、　Ｔｈ、、が、ＥＰ−Ａ−０２３９８５９ の中で、ウィルス除去または不活性化の後、クロマトグラフィー分離に先立ち、 油、好ましくは大豆油、ひまし油及び／または綿実油で試料を抽出することが有 利であると記載している。

本発明の工程は、初めて非常に純粋な抗血友病因子を高い収率て製造することを 可能としたものであり、その因子は今まで達成されなかった比活性を存するもの である。

市販の寒冷沈降物を、約１〜２ｃｍのサイズの断片に分割し、３〜４時間室温で 溶解させる。これらの断片を、１０°Ｃ〜２５°Ｃの間の温度で１〜３　Ｕ／ｍ ｌのヘパリン−ナトリウムを含んでいるその約２倍容量の水中で攪拌しながら懸 濁させる。懸濁物のｐＨ値を、０．１Ｍ酢酸で少なくとも７．０〜８．Ｏ１好ま しくは７．０〜７．１に調整する。攪拌を室温で、１５分〜６０分、好ましくは ３０分継続する。そして、寒冷沈降物１ｋｇ当たり約１０８ｇの５水酸化アルミ ニウム懸濁物を加え、混合物を１−１０分、好ましくは５分室温で攪拌する。そ れから、酸、好ましくは０．１Ｍ酢酸で、酸性度を、６．０〜７．０、好ましく は６．５〜６．６のｐＨ値に調節する。試料を１８°Ｃ−１０°Ｃ、好ましくは １６°Ｃ−１４°Ｃに冷却する。この温度で混合物を、例えば５ｈａｒｐｌｅｓ 　ＡＳ−１６（Ｃｅｐａ　６１）遠心分離器中で、１．　ＯＬ／分の速度で遠心 分離にかける。その後、Ｐａ１ｌＡＢ−Ｉ　ＵＯＩＯＺＰフィルターを通してそ の上清を濾過する。ウィルス不活性化は、好ましくは遠心分離及び濾過の後に行 う。Ｔｗｅｅｎ／ＴＮＢＰ　（トリーロープチルホスフェート）によるウィルス 不活性化が特に存用であることが判明した。よい結果は、コール酸ナトリウム／ ＴＮＢＰを使用することによっても得られた。Ｔｗｅｅｎ／ＴＮＢＰまたはコー ル酸ナトリウム／ＴＮＢＰ混合物は次いて、例えば油による抽出により除去する ことができる。

試料を、ＥＭＤ−ＴＭＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　（Ｍ）　６５０の商品名によ ッテ知られテイルゲル浸透材料を含むクロマトグラフィーカラムの上へ注入する 。前記材料はイオン交換体活性を示すものである。ＥＭＤ−ＴＭＡＥ−Ｆｒａｃ ｔｏｇｅｌ　（Ｍ）　６５０はすでに上記に特性化した。

好ましくは、カラム容量は、寒冷沈降物の１ｋｇにつきカラム材料の０．５ｋｇ がカラム中に存在するようにされる。試料をカラム上へ注入し、バッファーで洗 浄する。

より高いイオン強度のバッファーで試料を溶出した後、得られた生成物をより低 い塩含量のバッファーで希釈し、そして必要であるならば、ｐＨ値を６．５〜７ ．５、好ましくは６．９〜７．１に調節する。その後、好ましくはニトロセルロ ース上で再度濾過し、さらに殺菌濾過を行う。

これらの分離バッファーは特に有利なことが判明したものであり、そのイオン強 度は、塩化ナトリウム及び／または１個から６個の炭素原子を有するヒドロカル ビル基を少なくとも１つ存し、親水性の置換基を存する４級アンモニウム塩、例 えば塩化コリンを使用して調整する。

従って、本発明の方法においては、上記のＦｒａｃｔｏｇｅｌ　（Ｍ）　６５０ を含むカラムは、バッファーＡで洗浄され、平衡化される。バッファーＡは、塩 化ナトリウムまたはコリンを５０〜２００　ｍＭ、好ましくは１２０　ｍＭの濃 度で含み、そして５．８〜７．８、好ましくは６．５〜７．０のｐＨ値を存する 。

試料は、２００〜６００　ｍｏｓｍ、好ましくは３８０〜５２０　ｍｏｓｍのモ ル浸透圧濃度（ｏｓｍｏ　１ａｒｉｔｙ）を有し、５．８〜７，８、好ましくは ６．５〜７，０のｐＨ値を有するバッファーからカラムに適用される。カラムの 容量は、１ｍｌのゲルにつき因子Ｖｌｌｌが約５０［、Ｕを越えないことが望ま しい。カラムは試料注入後にバッファーＡて洗浄される。

次に、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム、グリシンを含むが、バッファーＡ より高いイオン強度を有するバッファーＢによりカラムを洗浄する。上記した種 類の４級アンモニウム塩及び／または塩化ナトリウムの濃度は１５０ＩＴＩＭ〜 ２５０ｍＭ、好ましくは１８０〜２００　ｍＭであり、そしてｐＨ値は、５．８ 〜７．８、好ましくは約７．０でなければならない。

生成物のカラムからの溶出は、バッファーＢのイオン強度をさらに上回るイオン 強度を有するバッファーＣにより行う。上記した種類の４級アンモニウム塩、特 に塩化コリン、及び／または塩化ナトリウムの含有量は、５．８〜７．８、好ま しくは約７．０のｐ）Ｉ値において２００　ｍＭ　−５００ｍＭ　、好ましくは 約４００　ｍＭでなければならない。

出発材料としては、寒冷沈降物に換えて血漿を使用してもよい。この場合２ステ ツプのクロマトグラフィー処理が望ましい。

本発明の方法により、因子ＶＩＩ［の回収はより高い収率及びより高い生成物安 定性をもって達成される。本発明の方法においては、いわゆるフォノ・ビルプラ ント因子子（ｖｏｎ−Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　ｆａｃｔｏｒ）は除去されず、因 子Ｖｌｌｌフラクション中に残ることが有利である。従って、フォノ・ビルプラ ント因子の欠如で苦しんでいる患者に対しても前記因子Ｖｌｌ＋調製物を使用す ることができる。さらに、因子Ｖｌｌｌはまた、因子Ｖｌｌｌの自然の安定化を 容易にするフォノ・ビルプラント因子の存在により、連続輸液法（ｃｏｎｔｉｎ ｕｏｕｓ−ｉｎｆｕｓｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）に使用することができる。

前記方法を、以下の実施例によりさらに説明する。

実施例１ 寒冷沈降物からの因子Ｖｌ［Ｉの蓄積 市販の寒冷沈降物を、約１〜２ｃｍのサイズの断片に分割し、３〜４時間室温で 溶解させる。これらの断片を、２０°Ｃ〜２５℃の間の温度で２０／ｍｌのヘパ リン−ナトリウムを含んでいるその約２倍容量の水中で攪拌しながら懸濁させる 。懸濁物のｐＨ値を、０．１Ｍ酢酸で７．０〜７．１に調整する。攪拌を２０″ Ｃ〜２５°Ｃで３０分継続する。寒冷沈降物１ｋｇ当たり１０８ｇの臨水酸化ア ルミニウム懸濁物を加え、混合物を５分室温で攪拌する。その後、０．１Ｍ酢酸 でｐ＋＋値を６．５〜６．６に調節する。試料を１６°Ｃ−１４℃に冷却し、５ ｈａｒｐｌｅｓ　ＡＳ−１６（Ｃｅｐａ　６１）遠心分離器中で、１．ＯＬ／分 の速度で遠心分離にかける。上清をＰａ１ｌ　ＡＢ−Ｉ　ＵＯＩＯＺＰフィルタ ーを通して濾過する。

実施例２ クロマトグラフィーカラムの調製 寒冷沈降物の１ｋｇにつき少くとも０．５１のイオン交換体樹脂を含んでいるカ ラムを抽出した寒冷沈降物の分離のために使用する。そのカラムの高さは直径以 下でなければならない。そのカラムを樹脂で充填した後、クロマトグラフィーカ ラムを最初に５容量の０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄する。この後、以下の 組成を存するバッファーＡで洗浄する。

１２０　ｍ１ｉｌの塩化ナトリウム １０ｍ！ｉｔのクエン酸ナトリウム・５Ｈ６０１２０ＩｍＭのグリシン １ｍＭの塩化カルシウム・２Ｈ２０ ｐＨ値６．５〜７．０　、ＩＭ　ＨＣＩて調整その後の操作を寒冷沈降物のウィ ルスを含まない抽出物を使用して行わなければならないので、バッファーのすへ てはウィルスを含まないものでなければならない。

実施例３ 試料をカラムに注入し、フローの吸光度を２８０　ｎｍの波長で観察する。濾液 を集め、因子ｖ］１１の活性について試験し、カラム分離を受ける前の生成物に ついても行った。その後、吸光度が再び初めの値になるまてカラムをバッファー Ａで洗浄する。そして吸光度が再びベースラインに戻るまで、カラムをバッファ ーＢて洗１８０〜２００　ｍＭの塩化ナトリウム１０ｍＭのクエン酸ナトリウム ・５Ｈ２０１２０ｍＭのグリシン ＩｍＭの塩化カルシウム・２Ｈ２０ ｐＨ値６．９〜７．０ 生成物の溶出はバッファーＣで行う。バッファーＣの添加の後視れるタンパク質 フラクシコンを集める。

バッファーＣは、以下の組成を有する。

４００　ｍＭの塩化ナトリウム ＩｍＭのクエン酸ナトリウム・５Ｈ７０１２０ｍＭのグリシン １．０ｍＭの塩化カルシウム・２Ｈ２０ｐＨ値６．９〜７．０ 所望の生成物が溶出された後、カラムを５容量のバッファーりで洗浄する。バッ ファーりは１Ｍ塩化ナトリウム溶液を含む。

カラムの再生は、それを０．　ｌ　Ｎ　ＮａＯＨ（３カラム容量）で洗浄し、そ の後カラムを０．ＩＮ塩酸（３カラム容量）で洗浄し、５容量の水中の２５％ア ルコールでカラムを洗浄することにより行った。

２０＋ｎＭのクエン酸ナトリウム、 ８０ｍＭのグリシン ２．５ｍＭの塩化カルシウム・２Ｈ２０ｐＨ値６．９〜７．１ を含むバッファーＥて、２６または３５Ｌｌ／ｍｌの活性を有するようになるま で希釈する。

そして必要であるならば、ｐＨ値を６．９〜７．１に調整し、その後０．４５μ ｍ　５ｅａｌｋｌｅａｎ　Ｆｉｌｔｅｒを通して濾過する。さらに殺菌濾過を続 いて行う。

実施例５ ヒト血漿を因子ＶＩ［ｌソースとして使用する場合は、以下の工程を使用する。

新鮮または低温凍結した（ｄ６ｅｐ−ｆ　ｒｏｚｅｎ）ヒト血漿を、任意に水浴 を使用して２０°Ｃの温度にする。血漿を５０％容量の水によって希釈し、そし て濾過する。血漿濾液をＥＭＤ−ＴＭＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　（Ｍ）　６５ ０を含むイオン交換体カラム上に注入する。このカラムは以下の組成を存するバ ッファーで予め平衡化したものである。

５０圃の塩化ナトリウム １０ｍＭのクエン酸ナトリウム １２０　ｍＭのグリシン ＋００　Ｕ几のヘパリン ｐＨ値６．５〜６．９ 試料を注入した後、イオン交換体樹脂を洗浄バッファーで数回洗浄する。そして 、共通の塩の濃度を漸増的に増加させ、最初に１００　ｍ！ｉｆの塩化ナトリウ ムを含んでいるバッファーを洗浄に使用し、その後１６０　ｍＭのナトリウムを 含んでいるバッファー、その後２００　ｍＭの塩化ナトリウムを含んでいるバッ ファーでの洗浄を行う。

因子Ｖｌｌ＋を含むフラクションを集め、そして１．０　ｍｇ／ｎ＋１のヒト血 清アルブミンをそれに加えることによって安定化させる。市販の寒冷沈降物をこ の得られたカラムフラクションに代えた以外は、実施例２〜４と同様に得られた 生成物をさらに処理した。

実施例６　比較実験 ２種の実験のそれぞれにおいて全く同じ血漿から得られた寒冷沈降物の０゜３ｋ ｇを処理したが、１つの工程は本発明によるものであり、もう１つのものはＥＰ ｏ　３４３２７５　Ａｌによるものである。フラクションを分析し、成分に関す る結果を以下の表に示す。

表 本発明の方法（１）とＥＰ　Ｏ３４３２７５Ａｌの方法（！Ｉ）による寒冷沈降 物溶液のクロマトグラフィー精製の比較分析結果 因子Ｖｔ１ｌ活性（１，Ｕ、　／ｍｌ）　２７　２７ＶＷＰ−ＡＧ　（＋、Ｕ、 ／ｍｌ）　６６　２３ＶＷＦ−ＡＧ／因子ＶＩ［Ｉ活性　２．４　０．８５フイ ブリノゲン（ｍｇ／ｍｌ）　＜ｏ、ｏｉ　Ｏ，０１フイブロネクチン（ｍｇ／＋ ＋＋１）　０．０８　０．０７ＩｇＧ　（ｍｇ／ｍｌ）　＜　０．０８　＜　０ ．０８ＩｇＭ　（ｍｇ／ｍｌ）　＜　０．０３　０．２全タンパク質（ｍｇ／ｍ ｌ）　０．４　０．３因子ＶＩＩ［収率／血漿（７）ｋｇ　２９７　２０７本発 明の方法による製造（ｗｏｒｋｕｐ）の結果では、３３個の調製部分（ｄｉｓｐ ｅｎｓｅｄ　ｐｏｒｔ　１ｏｎ）のそれぞれは、２７０　［、Ｕ、の因子Ｖｌ１ １を含んでおり、寒冷沈降物の１ｋｇ当たり２９．７００　［、Ｕ、　（７）因 子Ｖ１１１７）収率、マタハ血漿１ｋｇ当たり２９７＋、Ｕ、ノ収率に一致して いる。

ＥＰ　０３４３２７５　Ａｌに従った方法による製造の結果ては、２３個の調製 部分のみがそれぞれ２７０１．Ｌｌ、の因子Ｖ１１１を含んており、寒冷沈降物 の１ｋｇ当たり２０．７００　＋、Ｕ。

の因子Ｖｌ１１の収率、または血漿１ｋｇ当たり２０７　＋、Ｕ、の収率に対応 している。従って、ＥＰ　Ｏ３４３２７５Ａｌの製造方法に対してほぼ５１％の 収率に関する利点が得られた。

本発明の方法においては、フィブリノゲン及びイムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）の よ

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．高度に純粋なウィルス不活性化因子ＶＩＩＩを、血液血漿または寒冷沈降物 からアニオン交換体クロマトグラフィーによって回収するための方法であって、 アニオン交換体材料として、ヒドロキシル基を含むキャリヤーをベースとする分 離材料であって、前記キャリヤーの表面は共有結合されたポリマーにより被覆さ れており、該ポリマーは式Ｉ ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ 〔式中、Ｒ１はＨまたはＣＨ２を表し、Ｙは【配列があります】または−ＣＨ２ ＮＲ２Ｒ３を表し、Ｒ′及びＲ′′はそれぞれがＨまたはＣＨ３を表し、Ｙが− ＯＨならばＲ′及びＲ′′の１つは−ＯＨであってもよく、 Ｘは−ＯＨ、−ＮＲ２Ｒ３または−ＯＲ４を表し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれアル キル、フェニル、フェニルアルキルもしくはアルキルフェニル基（これらはアル キル部分に１０個までの炭素原子を有し、アルコキシ、シアノ、アミノ、モノ− またはジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、カルボキシル、スルホン 酸、アセトキシまたはアセトアミノ部分によりモノ−あるいはポリ置換されてい てもよい）、５〜１０個の炭素原子を有する環式もしくは二環式部分であって、 １つ以上のＣＨ−またはＣＨ２−基がＮもしくはＮＨ、ＮもしくはＮＨ及びＳ、 あるいはＮもしくはＮＨ及びＯに置き換えられたもの、または構造−ＣＨ２ｎ− ＳＯ２−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎＯＨ（ｎは２〜６である）を有するス ルホンスルフィドを表し、Ｒ２及びＲ３の１つはＨを表してもよく、Ｒ２及びＲ ３は両方の部分が酸性の基もしくは塩基性の基のいずれかを含むようにあるいは ２つの部分の１つが中性であるように互いに調節され、 ｎは２〜１００を表し、 Ｒ４は、アルキル部分に１０個までの炭素原子を有しているアルキル、フェニル 、フェニルアルキルまたはアルキルフェニル基（これらもアルコキシ、シアノ、 カルボキシル、スルホン酸またはアセトキシ部分によりモノ−あるいはポリ置換 されていてもよい）を表す〕によって表される同一であってもよく異なっていて もよい反復単位を含む分離材料を使用することを特徴とする前記方法。
2. ２．請求項１の式Ｉ中のＹが−ＣＯ−Ｘ（ＸはＯＨまたは−ＯＲ４であり、Ｒ４ は請求項１に定義した通りである）を表す請求項１記載の方法。
3. ３．請求項１の式１中のＹが−ＣＯ−Ｘ〔Ｘ＝−ＮＲ２Ｒ２であり、Ｒ２及びＲ ３はそれぞれアルキル、アルコキシアルキル、シアノアルキル、アミノアルキル 、モノ−またはジアルキルアミノアルキル、トリアルキルアンモニウムアルキル 、カルボキシアルキル、スルホン酸−アルキル（これらはアルキル部分に１０個 までの炭素原子を有する）、フェニル（非置換またはアルキル部分に１０個まで の炭素原子を有するアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、シアノ、シア ノアルキル、アミノアルキル、アミノ、モノ−もしくはジアルキルアミノ、モノ −もしくはジアルキルアミノアルキル、トリアルキルアンモニウム、トリアルキ ルアンモニウムアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、スルホン酸、スル ホン酸−アルキル、アセトキシまたはアセトアミノ基によりモノ−あるいはポリ 置換されていてもよい）、５〜１０個の炭素原子を有する環式もしくは二環式部 分であって、１つ以上のＣＨ−またはＣＨ２−基がＮもしくはＮＨ、Ｎもしくは ＮＨ及びＳ、あるいはＮもしくはＮＨ及びＯに置き換えられたもの、または構造 −（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ２−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎＯＨ（ｎは２〜６で ある）を有するスルホンスルフィドを表し、Ｒ２及びＲ３の１つはＨを表しても よく、Ｒ２及びＲ２は両方の部分が酸性の基もしくは塩基性の基のいずれかを含 むようにあるいは２つの部分の１つが中性であるように互いに調節される〕を表 す請求項１記載の方法。
4. ４．請求項１の式Ｉ中のＹが−ＣＨ２ＮＨ２または−ＣＨ２ＮＲ２Ｒ３を表し、 Ｒ２及びＲ３は請求項１に定義した通りである）を表す請求項１記載の方法。
5. ５．請求項１の式Ｉ中のＹが−ＣＮ、−ＣＨＯまたは−ＯＨを表す請求項１記載 の方法。
6. ６．高度に純粋なウィルス不活性化因子ＶＩＩＩを、血液血漿または寒冷沈降物 からアニオン交換体クロマトグラフィーによって回収するための方法であって、 請求項１〜５の少なくとも１つに記載のアニオン交換体材料を使用し、因子ＶＩ ＩＩの精製を続いて増加するイオン強度を有するバッファーで洗浄し溶出するこ とにより行う方法であり、バッファーのイオン強度を、１〜６個の炭素原子を有 し親水性置換基を有する少なくとも１つのヒドロカルビル鎖を有する４級アンモ ニウム塩単独またはこれと共通の塩との組み合わせにより調整することを特徴と する前記方法。
7. ７．４級アンモニウム塩が塩化コリンであることを特徴とする請求項６に記載の 方法。
8. ８．使用したバッファー系によって形成された塩勾配が、塩化ナトリウム及び／ または請求項６及び／もしくは７に記載の４級アンモニウム塩の濃度の合計で０ ．１〜１Ｍであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。