KR20220069886A - 개선된 면역글로불린의 정제방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역글로불린의 정제방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 면역글로불린을 함유하는 혈장 시료에 대해 음이온교환 크로마토그래피 및 양이온교환 크로마토그래피를 포함하는 면역글로불린의 정제방법에 관한 것이다.

Description

개선된 면역글로불린의 정제방법{Improved Method for Purification of Immunoglobulin}
본 발명은 개선된 면역글로불린의 정제방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 면역글로불린을 함유하는 혈장 단백질 시료에 대해 음이온교환 크로마토그래피 및 양이온교환 크로마토그래피 공정만으로 공정이 단순하면서도 불순물 (impurity)을 충분히 제거할 수 있는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법에 관한 것이다.
면역글로불린은 여러 가지 바이러스 및 세균에 대한 항체를 함유하고 있는 혈장 단백으로서 선천적인 항체 결핍자 또는 바이러스성이나 세균성 질환으로 말미암아 항체의 인위적인 보충을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 질환의 예방과 치료에 사용되는 약제이다.
이러한 면역글로불린을 약제로 사용하기 위해 콘 및 온클레이(Cohn & Oncley)에 따른 냉에탄올 분획법(Cohn E. et al., J. Am. Chem . Soc ., 68:459, 1946) 및 키슬러 및 니츠만에 따른 변형법(Kistler P, Nitschmann HS, Vox Sang, 7:414. 1952)으로 피하 및 근육 주사용 면역글로불린이 제조되었다.
하지만, 근육 주사용 면역글로불린은 1) 투여량이 제한되어 대량 투여가 불가능하며, 2) 주사시 주사부위에 동통현상이 나타나고, 3) 항체능력을 가진 고유의 면역글로불린 G(Immunoglobulin G ; IgG) 함량이 적으며, 4) 주사부위의 단백분해효소에 의한 글로불린의 항체가가 감소되고, 5) 최대혈중농도 도달시간은 24시간 이상이 소요되는 문제점이 있다.
근육 주사의 문제점을 해결하기 위해 정맥 주사를 통한 면역글로불린의 투여가 시도되었으나, 면역글로불린 제제를 정맥으로 투여할 경우 항보체활성(Anticomplementary activity)이 있는 응집체(Aggregate)에 기인하는 부작용(Anaphylacticreaction)이 심각하여 호흡 곤란 현상에서부터 순환계 쇼크까지의 다양한 즉각적인 부작용이 나타났다. 상기의 증상은 주로 면역글로불린이 결핍된 환자들에게서 보였으며, 특히 심각한 과민성 증상의 부작용은 IgA에 대한 항체가 나타난 환자들에서 관찰되었다.
따라서, 상기 문제로 인해 정맥주사가 불가능함에 따라, 정맥주사용 제제의 개발이 요구되었으며, 제조 공정 동안에 이러한 응집체를 제거하고, 및/또는 응집체 형성을 방지할 수 있는 방법들이 개발되었다. 펩신(pepsin), 파페인(papain), 플라스민(Plasmin) 등 단백분해 효소나 베타프로 피오락톤(β-propiolactone)등의 화학물질로 처리하고 구조를 변화시켜 응집체의 생성을 저지하거나 파괴하여 항보체 활성을 저하시켜 줌으로써 정맥주사가 가능하게 되었다.
제1세대 정맥주사용 면역글로불린(Intravenous Immunoglobulin; IVIG)은 면역글로불린 응집체를 제거하기 위해 출발물질(콘 분획 Ⅱ)에 펩신을 처리하였다. 상기 공정에는 컬럼 크로마토그래피 단계가 포함되어 있지 않으며, 제조된 제품은 적당한 기간 동안 안정하게 유지되도록 동결건조시키고, 사용직전에 용해시켜 사용하였다. 하지만, 일부 제조사의 IVIG 제품에서 바이러스성 간염 C등의 바이러스의 감염을 유발시키는 것으로 밝혀졌으며, 이에 제조 공정에 하나 이상의 공지의 바이러스 비활성화 및/또는 제거 단계가 추가로 포함되었다. 이후, 낮은 항보체 활성과 좀더 높은 안정성을 가지는 제2세대 IVIG가 80년대 중반에 개시되었으며, 상기 IVIG는 여러 단계의 크로마토그래피 단계들을 거쳐 정제되었다.
이러한 제제들은 정맥 주사함에 따라 근육주사용 면역글로불린의 단점이었던 투여량의 제한, 주사부위의 동통 현상, 단백분해 효소에 의한 글로불린의 항체가 감소 등이 해결되었으며 최대 혈중농도 도달시간도 수시간 이내로 단축되었다.
그러나, 상기 정맥주사용 면역글로불린은 구조를 변화시켜 항체능력을 가진 고유의 IgG는 거의 없어 보체결합능력이 저하되거나 없고, 혈중농도 반감기도 4 내지 12일 정도로 짧아 질병의 예방과 치료에 만족할 만한 효과를 거두지 못하고 있다. 또한, 동결건조된 분말 형태로 제조된 상기 제1 및 2세대 IVIG는 추가로 용해시키는 작업이 필요하며, 용해속도가 느리기 때문에 액상 IVIG 제품들이 개발되었으며, 좀더 안정하고 순수한 IVIG 제품을 얻을 수 있도록 향상된 공정이 요구되었다.
혈장 유래 면역글로불린의 정제방법으로 불순물 제거를 위해 이온교환 크로마토그래피 (IEX chromatography)를 다수 사용하여 왔다. 특히, 이온교환 크로마토그래피 중 주요 불순물 제거를 위해 음이온교환 크로마토그래피 및 양이온교환 크로마토그래피를 적용하여 왔다. 음이온교환 크로마토그래피 및 양이온교환 크로마토그래피를 모두 사용하는 정제 공정에서 양이온교환 크로마토그래피를 캡쳐 (capture: 1st column)로 사용하고, 음이온교환 크로마토그래피를 폴리싱 (polishing: 2nd column)으로 사용하는 경우가 많으며, 이 경우 후속 공정을 위해 양이온교환 크로마토그래피 공정 완료액의 탈염 (de-salting) 공정이 추가되는 등 전체 공정이 복잡해지고, 수율이 낮아지는 단점이 있다. 반면, 음이온교환 크로마토그래피를 캡쳐 (capture: 1st column) 단계로 사용할 경우, 공정이 단순해지지만, 주요 불순물을 충분히 제거하기 위한 적합 공정 개발이 요구된다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 면역글로불린에 적합한 효율적 공정 개발을 위해 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 음이온교환 크로마토그래피 및 양이온교환 크로마토그래피만을 순서대로 적용하여 면역글로불린을 정제하는 방법을 통해 목적하는 불순물 제거하면서도, 전체 공정의 수율을 향상시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 안정적이고 고순도의 면역글로불린을 생산하기 위해 불순물 및 혈전생성물질을 효율적으로 제거할 수 있는 면역글로불린의 정제방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 면역글로불린을 함유하는 혈장 시료에 대해 음이온교환 크로마토그래피를 수행하여, 음이온교환 크로마토그래피 컬럼에 부착되지 않은 분획을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 수득된 분획에 대해 양이온교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하고,
상기 (b) 단계 이후 추가 이온교환 크로마토그래피를 수행하지 않는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법을 제공한다.
본 발명의 정제방법에 따르면, 공정을 단순화하여 면역글로불린의 정제가 가능하면서도, 공정 전체 수율이 증가되고, 불순물 및 혈전 생성물질을 제거효율을 높이고, 낮은 중합체 함량을 유지할 수 있으므로, 안정적이면서도 품질에 대한 허용기준 (Acceptance Criteria)을 충족하여 면역글로불린을 생산할 수 있다.
도 1은 두 개의 이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 정제 공정 중, AEX 및 CEX 공정의 순서를 각기 달리하였을 경우의 불순물 제거 패턴을 나타낸 것이다. 도 1에서 A는 중합체의 함량, B는 응고인자 XI (coagulation factor XI) 함량, C는 IgA 함량 및 D는 IgM 함량을 나타낸다.
도 2는 AEX 크로마토그래피 공정에서의 pH 조건별 IgG 수율 및 불순물 함량을 나타낸 것이다. 도 2에서 A는 IgG 수율, B는 IgA 함량, C는 IgM 함량 및 D는 중합체 함량을 나타낸다.
도 3은 CEX 크로마토그래피 공정에서의 용출 버퍼 (elution buffer) 중 NaCl 농도 조건별 IgG 수율 및 불순물 함량을 나타낸 것이다. 도 3에서 A는 IgG 수율, B는 중합체 함량, C는 응고인자 XI (coagulation factor XI) 함량 및 D는 응고인자 XIa (coagulation factor XIa) 함량을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 정제방법의 각 단계를 구체적으로 보여주는 모식도이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 면역글로불린을 함유하는 혈장 시료에 대해 음이온교환 크로마토그래피를 수행하여, 음이온교환 크로마토그래피 컬럼에 부착되지 않은 분획을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득된 분획에 대해 양이온교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 를 포함하고, 상기 (b) 단계 이후 추가 이온교환 크로마토그래피를 수행하지 않는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법에 관한 것이다.
상기 면역글로불린을 함유하는 혈장 시료는 (i) 면역글로불린을 함유하는 혈장 단백질 분획 I+Ⅱ+Ⅲ(fraction I+Ⅱ+Ⅲ) 또는 분획 Ⅱ+Ⅲ(fraction Ⅱ+Ⅲ)를 용해시킨 다음, 침전제를 첨가하여 침전반응을 수행하는 단계; 및 (ii) 상기 침전물을 제거하고 면역글로불린이 포함된 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법으로 수득되는 것이다.
본 명세서에서 "면역글로불린을 함유하는 혈장단백질"은 인간 혈장 또는 인간 태반 유래 혈장에서 Factor IX 및 항-트롬빈과 같은 다양한 혈장 단백질이 제거된 무-저온침전물(cryoprecipitate-free) 혈장, 다양한 콘(Cohn) 분획 및 암모늄 설페이트 또는 PEG에 의한 침전법을 통해 얻어지는 분획들을 포함한다. 구체적으로 혈장 단백질 분획은 콘 분획 Ⅱ, 콘 분획 Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ 또는 콘 분획 Ⅱ+Ⅲ가 사용될 수 있다.
본 발명에서는 인간 혈장으로부터 얻어진 분획Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ 또는 분획 Ⅱ+Ⅲ 사용하였으며, 통상적인 콘 혈장 분획법에 따라서 제조되었다. 분획 Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ 또는 분획 Ⅱ+Ⅲ에 포함된 다양한 리포프로테인류, 피브리노겐, α-글로불린, β-글로불린 및 다양한 응고인자들을 제거하기 위한 후속 정제공정을 수행하였다.
본 발명에서는, 인간혈장은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), C형 간염바이러스(HCV), B형 간염바이러스(HBV) 및 파보바이러스 B19(parvovirus B19)에 대한 핵산증폭검사(NAT; Nucleic Acid Amplification Test) 및 혈청학적 검사를 포함하는 바이오테스트(Biotest)를 거쳐 승인된 미국 유래 혈장을 사용하였으며, -20℃ 이하에서 보관되어 있던 혈장을 1 내지 6℃의 자켓식 반응기(jacketed vessel)에서 12 내지 72시간 동안 반응시켜 녹였다.
상기 조건에서 혈장이 녹으면서 피브리노겐(fibrinogen) 및 응고인자(coagulation factors)가 포함된 동결침강혈장(cryoprecipitate)이 생성되는데, 원심분리를 통해 동결침강혈장을 제거시키고, 동결침강혈장이 제거된 냉동 결핍성 혈장(cryopoor plasma)을 회수하였다. 그 후 침전과 여과 과정을 반복하여 최종적으로 분획 Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ를 수득하였다.
면역글로불린이 포함된 혈장을 분리하기 위한 여과과정은 필터 보조제를 첨가하여 혼합시킨 다음 필터 프레스를 사용하여 상층액과 침전물을 분리하였으며, 상기 필터 보조제는 Celpure 300, Celpure 1000를 사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (i) 단계의 분획 Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ 또는 분획 Ⅱ+Ⅲ의 용해는 분획 Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ 또는 분획 Ⅱ+Ⅲ : 증류수를 첨가하는 것을 특징으로 하며, 상기 증류수는 주사용 증류수를 사용할 수 있다.
혈장 단백질 분획은 실질적으로 비-변성 온도 및 pH에서 물 및/또는 완충액에 현탁액화(용해)되는 것이 바람직하다. "실질적으로 비변성"은 상기 언급된 조건이 면역글로불린분자들의 기능성 활성의 실질적으로 비가역적인 손실, 예컨대, 항원결합 활성 및/또는 생물학적 Fc-작용의 손실을 야기시키지 않는 것을 의미한다.
면역글로불린-함유 현탁액의 pH는 면역글로불린의 최적의 용해도를 보장할 수 있도록, 구체적으로 pH 6.0 이하로, 더 구체적으로는 pH 3.9 내지 6.0가 되도록 유지한다. 완충액으로 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용될 수 있으나, 구체적으로는 인산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 아세트산, 수산화 나트륨, 염산, 물(증류수) 등을 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 증류수 또는 주사용 증류수를 사용하였다.
본 출원의 발명자들은 실시예 2에서 1st 컬럼으로 AEX, 2nd 컬럼으로 CEX를 사용할 경우, 전체 정제 단계가 감소하고 전체 수율이 증가하였으며, 품질 (quality)에 대한 허용기준 (acceptance criteria)을 충족함을 확인하였다. 또한, AEX를 1st 컬럼으로 사용하여 주요 불순물 (impurity)을 충분히 제거하기 위해, 단계 (a) 내지 단계 (b)에서 적합한 공정 조건을 확인하였다.
상기 침전제는 다양한 분자량을 가지는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 카프릴산 및 황산암모늄에서 선택된 하나 이상의 물질을 사용할 수 있으며, 당업계에 공지된 비변성 수용성 단백질 침전제를 침전법의 수단으로 사용할 수도 있다. 구체적으로는 카프릴산을 사용할 수 있다. 카프릴산은 비-면역글로불린 불순물 제거에 효과적일 수 있으며, 카프릴산 처리를 통해 불순물을 침전시킴으로써 불순물을 제거할 수 있다.
상기 (i) 단계에 따른 침전반응에서 침전제가 5 내지 26mM이 되도록 첨가할 수 있다. 또한, 면역글로불린을 함유하는 혈장 단백질 분획에 침전제가 첨가된 용액의 pH를 4.7 내지 5.2가 되도록 조정할 수 있다.
본 발명에서 상기 (ii) 단계는 상기 침전물을 제거하고 면역글로불린이 포함된 상층액을 수득하는 단계이다.
상기 단계 (ii)에서 침전물의 제거는 필터막을 통해 면역글로불린이 포함된 상층액을 압력을 가하여 여과하는 과정을 통해 이루어질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 필터막을 통해 면역글로불린이 포함된 상층액을 여과하였다.
이후, 상기 여과액은 투석 및/또는 농축되며, 투석 및/또는 농축은 한외여과 및/또는 투석여과(Ultrafiltration/Diafiltration; UF/DF)를 통해 수행될 수 있다. 한외여과 및/또는 투석여과에서 일정 삼투압으로 변경, 버퍼의 교환 및 농도를 조절하여 면역글로불린과 같은 표적 물질의 순도를 높일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 여과액은 산 또는 염기 예를 들어, 아세트산 또는 수산화나트륨을 통해 pH 4.2 내지 4.8이 되도록 조절한 후 1차 한외여과 (UF) 공정을 진행할 수 있다.
이후 투석여과를 수행할 수 있으며, 투석여과 버퍼 예를 들어, 아세트산 나트륨 (sodium acetate)를 투석여과를 진행한 후 공정완료액을 회수할 수 있다.
상기 (ii) 단계 이후 (a) 음이온교환 크로마토그래피를 수행하여, 컬럼에 부착되지 않은 분획을 수득하는 단계를 수행하여, 불순물을 제거하고 목적하는 IgG를 수득한다.
IgG의 pI는 약 6.4~9.0으로 pH 5.5~6.2의 범위에서 pH가 높을수록 양전하 (positive charge)가 약해지고, pH가 낮을수록 IgG와 AEX 레진 (resin)과의 이온성 상호작용 (ionic interaction)이 약해지며 플로우-쓰루 모드 (flow-through mode) 공정의 IgG 생산성 (yield)이 증가될 수 있다.
IgA의 pI는 약 4.5~5.6으로 pH 5.5~6.2의 범위에서 pH가 높을수록 양전하 (positive charge)가 약해지고 음전하 (negative charge)가 강해지므로, pH가 낮을수록 IgA와 AEX 레진 (resin)과의 이온성 상호작용 (ionic interaction)이 약해지며 플로우-쓰루 모드 (flow-through mode) 공정의 IgA 농도가 증가할 수 있다.
IgM의 pI는 약 4.5~6.5으로 pH 5.5~6.2의 범위에서 pH가 높을수록 양전하 (positive charge)가 약해지고 음전하 (negative charge)가 강해지므로, pH가 낮을수록 IgM과 AEX 레진 (resin)과의 이온성 상호작용 (ionic interaction)이 약해지며 플로우-쓰루 모드 (flow-through mode) 공정의 IgM 농도가 증가할 수 있다.
중합체 (polymer)의 경우에도 IgA, IgM과 유사한 상관관계를 나타내며, AEX 공정 중 pH 조정을 통해 제거될 수 있다. 특히, IgM의 경우 펜타머의 형태를 나타내므로, AEX 공정 중 제거된 중합체는 대부분 IgM일 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피에서는 불순물은 음이온 교환수지에 흡착시키고, 면역글로불린은 여액으로 회수할 수 있도록 적합한 pH 조건을 확인하였으며, 특히 pH 5.8 이상, pH 5.8 내지 6.2, 구체적으로는 6.0 내지 6.2, 더욱 구체적으로 6.05 내지 6.15일 경우에 IgA, IgM 및 중합체와 같은 불순물을 효율적으로 제거할 수 있다.
음이온교환 크로마토그래피 단계에서의 음이온교환 수지는 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 사차 암모니움(Quaternary ammonium)기들로 치환된 것들을 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로는 강염기성의 사차 암모니움기를 가지는 그룹이나 또는 약염기성의 디에틸아미노에틸(DEAE) 그룹을 가지는 음이온 교환수지 중에서 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다.
예를 들면, 강염기성의 음이온교환 수지로는 Q 세파로오스 패스트 플로우 (Sepharose Fast Flow), Q 세파로오스 하이 퍼포먼스(Sepharose High Performance), 리소스 Q(Resource Q), 소스 15Q(Source 15Q), 소스 30Q, 모노 Q(Mono Q), 미니 Q(Mini Q), 캡토 Q(Capto Q), 캡토 Q ImpRes(Capto Q ImpRes), Q 하이퍼셀(Q HyperCel), Q 세르믹 하이퍼D F(Q Cermic HyperD F), 누비아 Q(Nuvia Q), UNOsphere Q, 마크로-프렙 하이 A(Macro-Prep High Q), 마크로-프렙 25 Q(Macro-Prep 25 Q), 프락토겔 EMD TMAE(S)(Fractogel EMD TMAE(S)), 프락토겔 EMD TMAE Hicap (M), 프락토겔 EMD TMAE (M), Eshmono Q, 토요펄 QAE-550C(Toyopearl QAE-550C), 토요펄 SuperQ-650C, 토요펄 GigaCap Q-650M, 토요펄 Q-600C AR, 토요펄 SuperQ-650M, 토요펄 SuperQ-650S, TSKgel SuperQ-5PW (30), TSKgel SuperQ-5PW (20), TSKgel SuperQ-5PW 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 당업계에 공지된 음이온교환 수지를 사용할 수 있다.
음이온교환 크로마토그래피에 사용되는 수지의 적절한 부피는 컬럼 치수, 즉, 컬럼의 직경과 수지의 높이에 의해 반영되고, 예컨대, 적용되는 용액의 면역글로불린 용액양과 사용되는 수지의 결합 성능에 따라 달라진다. 음이온교환 크로마토그래피를 수행하기 전에, 음이온교환 수지는 구체적으로는 완충액으로 평형화시켜, 수지가 그의 짝 이온과 결합할 수 있도록 한다.
본 발명의 구체적 실시예에서는 음이온 교환 수지로 프락토겔 EMD TMAE(S)(Fractogel EMD TMAE(S))를 사용하였으며, UF/DF 완료액을 pH 6.05 내지 6.15가 되도록 조절한 후 15분 이상의 정체 시간 (residence time)으로 Fractogel EMD TMAE(S)에 로딩하였다.
본 발명은 (a) 단계 이후, (b) 상기 수득된 분획에 양이온교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함한다. 본 발명은, 상기 (a) 단계 및 상기 (b) 단계 사이에 계면활성제를 첨가함으로써 바이러스를 불활성화하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 바이러스를 불활성화하는 단계는 면역글로불린이 포함된 용액의 잠재적 지질외피바이러스(lipid enveloped virus) 등의 바이러스를 불활성시키고, 불활성화 이후, 불활성화를 위해 사용된 물질을 제거하기 위한 단계이다.
상기 단계를 통해 HIV1 및 HIV2, 간염 타입 C 및 비-A-B-C, HTLV1 및 2 (non A-B-C, HTLV1 및 HTLV2), 헤르페스 바이러스군, CMV 및 엡스타인 바 바이러스 등의 잠재적 지질외피바이러스들이 불활성화되어, 최종 제품의 안전성이 제고될 수 있다.
상기 단계에서 사용될 수 있는 용매 및/또는 세정제는 바이러스, 특히 지질외피바이러스를 불활성화시킬 수 있는 특성을 가진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용가능하다. 세정제는 비이온성 및 이온성 세정제로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 실질적으로 비변성인 것이 바람직하다. 특히, 제거의 용이성 측면에서, 비이온성 세정제가 바람직하며, 용매는 미국등록특허 제4,764,369 호에 개시된 바와 같이 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP: Tri-n-butyl phosphate) 또는 폴리소르베이트 80(트윈(Tween) 80)이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 실시예에서 AEX 공정 완료액을 TNBP 및 폴리소르베이트 80(트윈(Tween) 80)를 사용하여 바이러스 불활화 공정을 진행하였다.
바람직한 용매/세정제 혼합물은 면역글로불린 함유 용액 중 TNBP 농도가 0.2 내지 0.6 중량%가 되도록 첨가될 수 있으며, 트윈 80의 농도는 0.8 내지 1.5중량%의 농도가 되도록 첨가할 수 있다.
바이러스-불활성화 단계는 지질외피바이러스를 비활성화시켜, 실질적으로 바이러스 위험성이 없는 면역글로불린 함유 용액을 생성시키는 조건 하에서 수행된다. 상기 조건에서 반응온도는 구체적으로는 4 내지 30℃, 더 구체적으로는 19 내지 28℃이며, 반응시간은 구체적으로는 1 내지 24시간, 더 구체적으로는 4 내지 12시간이다.
상기 (b) 단계의 양이온교환 크로마토그래피는 용매/세정제 처리 완료액을 로딩 후 용출 버퍼를 사용하여 흡착된 IgG를 유리시키는 과정일 수 있다.
상기 양이온교환 크로마토그래피에서의 용출 버퍼는 시트르산 나트륨, 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 트리스(Tris), MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 실시예에서 상기 (b) 단계의 양이온교환 크로마토그래피 중 염화나트륨을 포함하는 버퍼로 면역글로불린의 용출을 수행하였다.
양이온교환 크로마토그래피에서는 응고인자를 양이온교환 크로마토그래피 레진에 강하게 결합 (tight binding)시키고, 약하게 결합 (weak binding)된 IgG를 용출버퍼 내 카운터 이온 (counter ion: Na+)을 통해 회수할 수 있도록 적합한 NaCl 농도 조건을 선정하는 것이 중요하다.
용출버퍼의 NaCl 농도와 관련하여 IgG 수율을 고려할 경우, 용출버퍼의 NaCl 농도는 200mM 이상이 요구됨을 확인하였다. IgG의 pI는 약 6.4~9.0으로 pH 5.2에서 양전하 (positive charge)를 나타내어 양이온교환 크로마토그래피 레진에 약하게 결합 (weak binding)하게 된다. 따라서 용출 (elution)시 첨가되는 카운터 이온 (counter ion: Na+)에 의해 레진으로부터 잘 분리될 수 있으며, 용출버퍼의 NaCl 농도가 높을수록 용출액 (eluate)의 응고인자 FXI 농도가 증가할 수 있다.
이에 따라, 용출버퍼 중 포함된 염에 따른 이온강도 조건별로 IgG 수율 및 불순물 제거율이 결정될 수 있으며, 200 내지 300 mM의 염 농도 조건, 보다 구체적으로 200 내지 250 mM, 가장 구체적으로 220 mM 내지 240 mM 조건에서 용출을 수행하는 경우 우수한 IgG 수율 및 응고인자와 같은 불순물을 효율적으로 제거할 수 있음을 확인하였다.
상기 양이온교환 수지는 프락토겔(Fractogel), CM(카르복시메틸), SE(술포에틸), SP(술포프로필), P(포스페이트), S(술포네이트), PROPAC WCX-10™ (Dionex), 캅토 S(Capto S), S-세파로스 FF(S-Sepharose FF), 프락토겔 EMD SO3M, 토요펄 메가캡 II SP 550C(Toyopearl Megacap II SP 550C), 포로스 50 HS(Poros 50 HS), 포로스 XS 및 SP-세파로스 매트릭스(SP-sepharose matrix)로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 상기 (b) 단계의 양이온교환 수지로 포로스 XS(Poros XS)를 사용하였다. 용매/세정제 처리 완료액을 포로스 XS가 충진된 컬럼에 8-10분 이상의 정체 시간으로 로딩 후 NaCl 150 내지 300mM의 용출버퍼를 사용하여 흡착된 IgG를 유리시켰다.
본 발명에 따른 면역글로불린의 정제방법은 상기 (b) 단계 이후 추가적인 이온교환 크로마토그래피를 수행하지 않는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 면역글로불린의 정제방법은 두 단계의 이온 교환 크로마토그래피 공정만으로 주요 불순물을 충분히 제거할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 면역글로불린의 정제방법은 1회의 음이온 크로마토그래피 및 1회의 양이온교환 크로마토그래피만을 포함할 수 있으며, 추가 이온교환 크로마토그래피를 수행하지 않는다.
본 발명에 따르면, 상기 (a) 내지 (b) 단계에서 침전, 1회의 음이온 크로마토그래피 및 1회의 양이온교환 크로마토그래피를 수행하는 것만으로 목적하는 불순물을 제거하여 순도가 96% 이상, 구체적으로 98% 이상인 면역글로불린 수득할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 면역글로불린의 정제방법은 종래 진행하던 정제방법으로 양이온 교환 크로마토그래피 이후, 음이온 교환 크로마토그래피를 진행하지 않기 때문에, 양이온 교환 크로마토그래피 이후 포함되어야 하는 pH 조정 단계, 침전 단계 또는 용매 또는 세정제 처리 단계를 추가로 포함하지 않을 수 있다.
경우에 따라서 본 발명에 따른 면역글로불린의 정제방법은 상기 (b) 단계 이후 면역친화성 크로마토그래피를 연속적으로 포함하여 추가 수행할 수 있다 (도 5). 상기 면역친화성 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피에 고정된 항체를 사용하는 임의의 방법을 의미할 수 있다. 항체-항원 상호작용에 의해 특이도 및 친화도를 통해, 고정된 항체에 대한 면역글로불린의 선별적 흡착을 유도할 수 있다. 이후 용출을 통해 목적하는 면역글로불린을 수득함으로써, 정제와 동시에 농축 과정을 수행할 수 있다.
상기 면역친화성 크로마토그래피 수행 이후, 나노필터로 나노여과(nanofiltration, NF)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 나노여과는 상용화된 나노여과 시스템을 이용하여 수행될 수 있으며, 사용될 수 있는 필터의 종류는 Pall 사의 폴 DVD 프리필터(Pall DVD pre-filter), DV20, SV4 20N 또는 Asahi Kasei 사의 Planova 20N 등이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
경우에 따라서, 저분자 이온을 제거하기 위해 한외여과/투석여과(Ultrafiltration/Diafiltration; UF/DF)를 추가로 수행할 수 있다.
이후, 안정화제를 첨가하여 면역글로불린을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 추가 첨가되는 안정화제는 슈가 알콜, 말토스, 소르비톨, 만노스, 글루코스, 트레할로스, 알부민, 리신, 글리신, PEG 및 Tween 80 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하며, 구체적으로는 글리신을 사용한다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 면역글로불린 정제
1.1 정제 컬럼 순서 공정 연구
1.1.1. 음이온교환 크로마토그래피 ( AEX ) 후 양이온교환 크로마토그래피 (CEX) 실험 조건
· 인간 혈장으로부터 얻어진 분획Ⅰ+II+III를 사용하였으며, 통상적인 콘 혈장 분획법에 따라서 제조되었다.
· 분획 I+II+III 페이스트 용해
분획 I+II+III 페이스트는 -30℃ 이하의 조건에서 보관하며, 사용 전 2-8℃ 조건에서 15~21 시간 동안 용해하였다.
융해된 분획 I+II+III 페이스트는 주사용수를 투입하여 30분 이상 용해한 후, 1M 아세트산 또는 0.5N NaOH를 사용하여 pH 4.0이 되도록 조정하였다.
· 카프릴산 침전
용액의 카프릴산 농도가 19-21mM이 되도록 1M 카프릴산 용액을 첨가하였다.
· 여과
2μm와 18μm 필터막 (filter membrane)을 사용하여 침전 공정액을 2-3 bar의 압력으로 여과하였다.
여과시 생성되는 필터 케이크 (filter cake)로부터 잔여 IgG를 회수하기 위해 후세척 버퍼 (post washing buffer : 20mM 아세트산 나트륨)를 공정에 투입하여 후세척 (post washing)을 진행하였다.
· 1st UF/DF (ultrafiltration/diafiltration)
초기 UF 후 DF (diafiltration buffer : 20mM 아세트산 나트륨)를 사용하여 DF를 진행한 후, 공정 완료액을 회수하였다.
· AEX 크로마토그래피
1st UF/DF 완료액을 1M Tris를 사용하여 pH 6.1이 되도록 조절한 후, Fractogel EMD TMAE (S)가 충진 (packing)된 컬럼에 로딩하였다.
공정액 로딩 후 워싱 버퍼 (washing buffer : 20mM 아세트산 나트륨 pH 6.1)를 사용하여 공정액을 회수하였다.
· S/D 처리(S/D treatment: solvent/detergent treatment)
AEX 공정 완료액에 폴리소르베이트 80 1.0(%, w/v), 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP: Tri-n-butyl phosphate) 0.3(%, w/v)를 첨가하였다.
20-30분간 교반한 뒤, 18-24℃에서 바이러스 불활화 공정을 진행하였다.
· CEX 크로마토그래피
S/D 처리 완료액을 Poros XS가 충진된 컬럼에 로딩하였다.
공정액 로딩 후 워싱 버퍼 (20mM 아세트산 나트륨)를 컬럼 부피의 6-8배 만큼 흘려준 후, 용출 버퍼 (20mM 아세트산 나트륨 230mM NaCl)을 사용하여 흡착된 IgG를 유리시켜 공정액을 회수하였다.
1.1. 2. CEX 후 AEX 실험 조건
· 인간 혈장으로부터 얻어진 분획Ⅰ+II+III를 사용하였으며, 통상적인 콘 혈장 분획법에 따라서 제조되었다.
· 분획 I+II+III 페이스트 용해
분획 I+II+III 페이스트는 -30℃ 이하의 조건에서 보관하며, 사용 전 2-8℃ 조건에서 15~21 시간 동안 용해하였다.
융해된 분획 I+II+III 페이스트는 주사용수를 투입하여 30분 이상 용해한 후, 1M 아세트산 또는 0.5N NaOH를 사용하여 pH 4.0이 되도록 조정하였다.
· 카프릴산 침전
용액의 카프릴산 농도가 19-21mM이 되도록 1M 카프릴산 용액을 첨가하였다.
· 여과
2μm와 18μm 필터막 (filter membrane)을 사용하여 침전 공정액을 2-3 bar의 압력으로 여과하였다.
여과시 생성되는 필터 케이크 (filter cake)로부터 잔여 IgG를 회수하기 위해 후세척 버퍼 (post washing buffer : 20mM 아세트산 나트륨)를 공정에 투입하여 후세척 (post washing)을 진행하였다.
· 1st UF/DF (ultrafiltration/diafiltration)
초기 UF 후 DF (diafiltration buffer : 20mM 아세트산 나트륨)를 사용하여 DF를 진행한 후, 공정 완료액을 회수하였다.
· S/D 처리(S/D treatment: solvent/detergent treatment)
폴리소르베이트 80 1.0(%, w/v), 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP: Tri-n-butyl phosphate) 0.3(%, w/v)를 첨가하였다.
20-30분간 교반한 뒤, 18-24℃에서 바이러스 불활화 공정을 진행하였다.
· CEX 크로마토그래피
S/D 처리 완료액을 Poros XS가 충진된 컬럼에 로딩하였다.
공정액 로딩 후 워싱 버퍼 (20mM 아세트산 나트륨)를 컬럼 부피의 6-8배 만큼 흘려준 후, 용출 버퍼 (20mM 아세트산 나트륨 230mM NaCl)을 사용하여 흡착된 IgG를 유리시켜 공정액을 회수하였다.
· 2nd UF/DF
주사용수를 사용하여 DF를 진행한 후, 공정완료액을 회수하였다.
· AEX 크로마토그래피
2nd UF/DF 완료액을 1M 아세트산 나트륨 pH 6.1을 첨가하여 20mM 아세트산 나트륨 pH 6.1이 되도록 한 후, Fractogel EMD TMAE (S)가 충진된 컬럼에 로딩 하였다.
공정액 로딩 후 워싱 버퍼 (20mM 아세트산 나트륨 pH 6.1)를 사용하여 공정액을 회수하였다.
1.2. AEX 크로마토그래피 pH 조건 연구
· 인간 혈장으로부터 얻어진 분획Ⅰ+II+III를 사용하였으며, 통상적인 콘 혈장 분획법에 따라서 제조되었다.
· 분획 I+II+III 페이스트 용해
분획 I+II+III 페이스트는 -30℃ 이하의 조건에서 보관하며, 사용 전 2-8℃ 조건에서 15~21 시간 동안 용해하였다.
융해된 분획 I+II+III 페이스트는 주사용수를 투입하여 30분 이상 용해한 후, 1M 아세트산 또는 0.5N NaOH를 사용하여 pH 4.0이 되도록 조정하였다.
· 카프릴산 침전
용액의 카프릴산 농도가 19-21mM이 되도록 1M 카프릴산 용액을 첨가하였다.
· 여과
2μm와 18μm 필터막 (filter membrane)을 사용하여 침전 공정액을 2-3 bar의 압력으로 여과하였다.
여과시 생성되는 필터 케이크 (filter cake)로부터 잔여 IgG를 회수하기 위해 후세척 버퍼 (post washing buffer : 20mM 아세트산 나트륨)를 공정에 투입하여 후세척 (post washing)을 진행하였다.
· 1st UF/DF (ultrafiltration/diafiltration)
초기 UF 후 DF (diafiltration buffer : 20mM 아세트산 나트륨)를 사용하여 DF를 진행한 후, 공정 완료액을 회수하였다.
· AEX 크로마토그래피
1st UF/DF 완료액을 1M Tris를 사용하여 pH 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2가 되도록 각기 조절한 후, Fractogel EMD TMAE (S)가 충진된 컬럼에 로딩 하였다.
공정액 로딩 후 워싱 버퍼 (20mM 아세트산 나트륨 pH 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2)를 사용하여 공정액을 회수하였다.
1.3. CEX 크로마토그래피 용출버퍼 NaCl 농도 조건 연구
· 인간 혈장으로부터 얻어진 분획Ⅰ+II+III를 사용하였으며, 통상적인 콘 혈장 분획법에 따라서 제조되었다.
· 분획 I+II+III 페이스트 용해
분획 I+II+III 페이스트는 -30℃ 이하의 조건에서 보관하며, 사용 전 2-8℃ 조건에서 15~21 시간 동안 용해하였다.
융해된 분획 I+II+III 페이스트는 주사용수를 투입하여 30분 이상 용해한 후, 1M 아세트산 또는 0.5N NaOH를 사용하여 pH 4.0이 되도록 조정하였다.
· 카프릴산 침전
용액의 카프릴산 농도가 19-21mM이 되도록 1M 카프릴산 용액을 첨가하였다.
· 여과
2μm와 18μm 필터막 (filter membrane)을 사용하여 침전 공정액을 2-3 bar의 압력으로 여과하였다.
여과시 생성되는 필터 케이크 (filter cake)로부터 잔여 IgG를 회수하기 위해 후세척 버퍼 (post washing buffer : 20mM 아세트산 나트륨)를 공정에 투입하여 후세척 (post washing)을 진행하였다.
· 1st UF/DF (ultrafiltration/diafiltration)
초기 UF 후 DF (diafiltration buffer : 20mM 아세트산 나트륨)를 사용하여 DF를 진행한 후, 공정 완료액을 회수하였다.
· AEX 크로마토그래피
1st UF/DF 완료액을 1M Tris를 사용하여 pH 6.1이 되도록 조절한 후, Fractogel EMD TMAE (S)가 충진 (packing)된 컬럼에 로딩하였다.
공정액 로딩 후 워싱 버퍼 (washing buffer : 20mM 아세트산 나트륨 pH 6.1)를 사용하여 공정액을 회수하였다.
· S/D 처리(S/D treatment: solvent/detergent treatment)
AEX 공정 완료액에 폴리소르베이트 80 1.0(%, w/v), 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP: Tri-n-butyl phosphate) 0.3(%, w/v)를 첨가하였다.
20-30분간 교반한 뒤, 18-24℃에서 바이러스 불활화 공정을 진행하였다.
· CEX 크로마토그래피
S/D 처리 완료액을 Poros XS가 충진된 컬럼에 로딩하였다.
공정액 로딩 후 워싱 버퍼 (20mM 아세트산 나트륨)를 컬럼 부피의 6-8배 만큼 흘려준 후, 각기 NaCl 150mM, 200mM, 250mM, 300mM의 용출버퍼를 사용하여 흡착된 IgG를 유리시켜 공정액을 회수하였다.
실시예 2 : 결과
1.1. 컬럼 순서 공정 연구
혈장 유래 면역글로불린 (plasma derived immunoglobulin)을 정제하는 타사 공정의 경우, 불순물을 제거하기 위해 이온교환 크로마토그래피 (IEX)를 다수 사용한다. AEX 및 CEX를 모두 사용하는 공정의 경우, CEX를 캡쳐 (capture: 1st column) 단계로 사용하고, AEX를 폴리싱 (polishing: 2nd column)으로 사용하는 경우가 많으며, 이 경우 후속 공정을 위해 CEX 공정 완료액의 탈염 (de-salting) 공정이 추가되는 등 전체 공정이 복잡해지고, 수율이 낮아지는 단점이 있다.
반면, AEX를 캡쳐 (capture: 1st column) 단계로 사용할 경우, 공정이 단순해지지만, 주요 불순물 (impurity)을 충분히 제거하기 위한 적합 공정 개발이 요구된다.
비교 실험 결과, 1st 컬럼으로 AEX, 2nd 컬럼으로 CEX를 사용할 경우, 전체 정제 단계가 감소하고 전체 수율이 증가하였으며, 품질 (quality)에 대한 허용기준 (Acceptance Criteria)을 충족함을 확인하였다(표 1, 표 2, 도 1).
[표 1] AEX를 1차 컬럼으로, CEX를 2차 컬럼으로 사용하였을 경우의 각 공정 별 수율 및 불순물 제거 결과
Figure pat00001
[표 2] CEX를 1차 컬럼으로, AEX를 2차 컬럼으로 사용하였을 경우의 각 공정 별 수율 및 불순물 제거 결과
Figure pat00002
특히, AEX 크로마토그래피를 CEX 크로마토그래피 보다 선행하여 공정을 진행하고, AEX 크로마토그래피에서 주요 불순물을 제거하기 위한 바람직한 공정조건을 선정하여야 한다. 또한, 이후 추가 이온 교환 크로마토그래피를 진행하지 않을 경우 선행되는 침전공정 및 두 이온 교환 크로마토그래피 공정만으로 주요 불순물을 충분히 제거할 수 있는 바람직한 공정조건의 개발이 요구된다.
1.2. AEX 크로마토그래피 pH 조건 연구
각 pH 조건 별 음이온 교환 크로마토그래피 연구결과는 표 3과 같다.
[표 3] AEX 크로마토그래피 공정에서의 pH 조건별 IgG 수율 및 불순물 함량
Figure pat00003
IgG의 pI는 약 6.4~9.0으로 알려진 바 있으며(The Human IgG Subclasses" Calbiochem Corporation. 1990), pH 5.5~6.2의 범위에서 pH가 높을수록 양전하 (positive charge)가 약해진다. 따라서, pH가 낮을수록 IgG와 AEX 레진 (resin)과의 이온성 상호작용 (ionic interaction)이 약해지며 플로우-쓰루 모드 (flow-through mode) 공정의 IgG 생산성 (yield)이 증가할 수 있으며, 해당 결과를 표 3 및 도 2A을 통해 확인하였다.
IgA의 pI는 약 4.5~5.6으로 알려진 바 있으며(Kidney Int 1985; Oct;28(4):666-671), pH 5.5~6.2의 범위에서 pH가 높을수록 양전하 (positive charge)가 약해지고 음전하 (negative charge)가 강해진다. 따라서, pH가 낮을수록 IgA와 AEX 레진 (resin)과의 이온성 상호작용 (ionic interaction)이 약해지며 플로우-쓰루 모드 (flow-through mode) 공정의 IgA conc.이 증가할 수 있으며, 특히 pH 5.8 이상일 경우에 바람직한 IgA 제거율을 표 3 및 도 2B을 통해 확인하였다.
IgM의 pI는 약 4.5~6.5으로 알려진 바 있으며(Electrophoresis, Volume 6, Issue 3, 1985, p124-128), pH 5.5~6.2의 범위에서 pH가 높을수록 양전하 (positive charge)가 약해지고 음전하 (negative charge)가 강해진다. 따라서, pH가 낮을수록 IgM과 AEX 레진 (resin)과의 이온성 상호작용 (ionic interaction)이 약해지며 플로우-쓰루 모드 (flow-through mode) 공정의 IgM conc.이 증가할 수 있으며, 특히 pH 5.8 이상일 경우에 바람직한 IgM 제거율을 표 3 및 도 2C를 통해 확인하였다.
pH와 중합체 (polymer)간 상관관계는 IgA, IgM과 유사한 형태로 확인 가능하다. 특히, IgM의 경우 펜타머 (pentamer)의 형태를 나타내는 것으로 보고된 바 있으며(Kuby Immunology, 4th edition, W.H. Freeman and Company. Figure 14.3, page 97), AEX 공정 중 제거된 중합체는 대부분 IgM일 것으로 판단하였다. 특히 pH 5.8 이상일 경우에 바람직한 중합체 제거율을 표 3 및 도 2D를 통해 확인하였다.
음이온 교환 크로마토그래피에서는 불순물은 음이온 교환수지에 흡착시키고, 면역글로불린은 여액으로 회수할 수 있도록 적합한 pH 조건을 선정하는 것이 중요하다. 본 발명에서는 음이온 교환 크로마토그래피에서 불순물을 효율적으로 제거할 수 있도록 pH 조건을 구체적으로는 pH 5.8 이상으로, 더 구체적으로는 6.0 내지 6.2로, 가장 구체적으로는 6.05 내지 6.15로 선정하였다.
1.3. CEX 크로마토그래피 용출버퍼 NaCl 농도 조건 연구
용출버퍼의 이온강도 조건별 CEX 크로마토그래피 연구결과는 표 4와 같다.
[표 4] CEX 크로마토그래피 공정에서의 용출버퍼 NaCl 농도 조건 별 IgG 수율 및 불순물 함량
Figure pat00004
용출버퍼의 NaCl 농도 150mM에서 IgG 수율 (yield)은 72.68%를 나타내었으며, IgG 수율을 고려할 경우, 용출버퍼의 NaCl 농도는 200mM 이상이 요구됨을 확인하였다. 특히, IgG의 pI는 약 6.4~9.0으로 알려진 바 있으며(The Human IgG Subclasses" Calbiochem Corporation. 1990), pH 5.2에서 양전하 (positive charge)를 나타내어 CEX 레진에 약하게 결합 (weak binding)하게 된다. 따라서 용출 (elution)시 첨가되는 카운터 이온 (counter ion: Na+)에 의해 레진으로부터 잘 분리될 수 있으며, 용출버퍼의 NaCl 농도가 높을수록 용출액 (eluate)의 FXI(Human Coagulation Factor XI) 농도가 증가하는 것으로 판단하였다.
FXI의 경우, 용출버퍼의 NaCl 농도가 낮을수록 감소하였으며, NaCl 300mM 과 비교하여, NaCl 200mM에서 약 40% 낮은 값을 확인하였다. FXIa도 FXI 결과와 동일 양상을 나타내었으며, 용출버퍼 NaCl 200mM의 경우 농축시료에서도 검출되지 않음을 확인하였다. 특히, FXI의 pI는 약 9.1로 알려진 바 있으며(THE JOURNAL OP Biological chemistry. Vol. 252, No. 13, Issue of September 25, 1977, p6432-6437), pH 5.2에서 양전하 (positive charge)를 나타내어 강한 CEX 레진 (strong CEX resin)인 Poros XS과 강하게 결합 (tight binding)하게 된다. 따라서, 용출 (elution)시 첨가되는 카운터 이온 (counter ion: Na+)에 의해 레진으로부터 잘 분리될 수 있으며, 용출버퍼의 NaCl 농도가 높을수록 용출액 (eluate)의 FXI conc.이 증가하는 것으로 판단하였다(표 4, 도 3).
CEX 크로마토그래피에서는 응고인자를 CEX 레진에 강하게 결합 (tight binding)시키고, 약하게 결합 (weak binding)된 IgG를 용출버퍼 내 카운터 이온 (counter ion: Na+)을 통해 회수할 수 있도록 적합한 NaCl 조건을 선정하는 것이 중요하다. 본 발명에서는 CEX 크로마토그래피에서 불순물을 효율적으로 제거할 수 있도록 용출버퍼 내 NaCl 농도 조건을 구체적으로는 200mM 내지 300mM로, 더 구체적으로는 200mM 내지 250mM로, 가장 구체적으로는 220mM 내지 240mM로 선정하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. (a) 면역글로불린을 함유하는 혈장 시료에 대해 음이온교환 크로마토그래피를 수행하여, 음이온교환 크로마토그래피 컬럼에 부착되지 않은 분획을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 수득된 분획에 대해 양이온교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 를 포함하고,
    상기 (b) 단계 이후 추가 이온교환 크로마토그래피를 수행하지 않는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린을 함유하는 혈장 시료는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수득되는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법:
    (i) 면역글로불린을 함유하는 혈장 단백질 분획 I+Ⅱ+Ⅲ(fraction I+Ⅱ+Ⅲ) 또는 분획 Ⅱ+Ⅲ(fraction Ⅱ+Ⅲ)를 용해시킨 다음, 침전제를 첨가하여 침전반응을 수행하는 단계; 및
    (ii) 침전물을 제거하고 면역글로불린이 포함된 상층액을 수득하는 단계.
  3. 제2항에 있어서, 상기 (i) 단계의 침전제는 카프릴산(caprylate)인 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 음이온교환 크로마토그래피는 pH 5.8 내지 6.2에서 수행하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 양이온교환 크로마토그래피에서 200 내지 300 mM의 염 농도 조건으로 면역글로불린의 용출을 수행하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 (b) 단계의 양이온교환 크로마토그래피에서 염화나트륨을 포함하는 버퍼로 면역글로불린의 용출을 수행하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계 및 상기 (b) 단계 사이에 계면활성제를 첨가함으로써 바이러스를 불활성화하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 순도가 96% 이상인 면역글로불린 수득하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계 이후 pH 조정 단계, 침전 단계 또는 용매 또는 세정제 처리 단계를 추가로 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
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