KR20070009995A

KR20070009995A - 바이러스 안전성 면역글로불린을 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20070009995A
Application number: KR1020067017563A
Authority: KR
Inventors: 자코 파키넨
Original assignee: 수오멘 푸나이넨 리스티 베리팔베루
Priority date: 2004-01-30
Filing date: 2005-01-31
Publication date: 2007-01-19
Also published as: MXPA06008435A; EP1709077A1; JP2008500959A; BRPI0507298A; US20070244305A1; WO2005073252A1

Abstract

본 발명은 정제된 면역글로불린 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 미정제 면역글로불린 용액을 카프릴산 처리에 가하고, 단백질 응집체 및 바이러스를 면역글로불린 용액으로부터 제거하고, 면역글로불린을 정제하기 위해서 면역글로불린 용액을 이온 교환 크로마토그래피에 가하고, 얻은 면역글로불린 용액을 바이러스 제거 필터 상에서 여과하여 면역글로불린을 함유하는 용리액을 생성시키고, 면역글로불린을 회수하는 단계들을 포함한다. 카프릴산 처리와 단백질 침전제에 의한 침전의 조합에 의해서, 응집된 단백질 및 바이러스의 수준이 효과적으로 감소되며, 여과 후에 진정한 바이러스 안전성 제제가 제공된다.

Description

바이러스 안전성 면역글로불린을 제조하는 방법{PROCESS FOR THE MANUFACTURE OF VIRUS SAFE IMMUNOGLOBULIN}

본 발명은 면역글로불린의 생산에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 예를 들어, 비경구 투여에 적합한 바이러스 안전성 면역글로불린 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 신규한 바이러스 안전성 면역글로불린 조성물 및 나노여과에 의해서 면역글로불린 용액을 정제하는 방법에 관한 것이다.

항체라고도 칭하는 면역글로불린은 혈장으로부터 추출될 수 있으며, 이들은 하이브리도마 기술 및 재조합 DNA 기술에 의해서 생산될 수 있다. 이들의 광범위한 생물학적 활성 면에서, 항체는 유용한 치료제이다.

정상의 사람 혈장으로부터 정제된 면역글로불린은 정맥내 투여되는 경우 다양한 심각한 질환의 치료에 효과적인 적으로 입증되었다. 약리학적 생성물은 "정맥내 면역글로불린"이라 칭하며(Immune Globulin Intravenous Human or Human Normal Immunoglobulin for Intravenous Administration), 이하에서는 이의 속칭 약어 "IVIG"라 표현한다. 정맥내 다량으로 투여됨으로 인해서, IVIG 생성물의 안전성 및 관용성은 특별히 우려되는 사항이다.

IVIG 생성물에 의해서 야기된 심각한 부작용은 면역글로불린 응집체, 그 밖 의 오염 단백질 및 혈액-유래된 바이러스에 기인한다. 면역글로불린 폴리머 및 응집체는 보체를 활성화시키며 IVIG 생성물로부터의 이들의 제거는 중요하게 여겨지고 있다. 바이러스 마커에 대한 기증자의 혈액 및 혈장의 스크리닝의 도입 및 효과적인 바이러스 불활성화 방법의 실행은 현재의 IVIG 생성물의 안전성을 상당히 개선시키고 있다. 그러나, 바이러스 전염, 특히, 물리-화학적 내성 바이러스, 예컨대, 현재의 화학적 바이러스 불활성화 방법으로는 효과적으로 불활성화되지 않는 파르보바이러스 B19(parvovirus B19)에 의한 바이러스 전염의 위험은 아직도 존재하고 있다[Knezevic-Maramica and Kruskall, Transfusion 43, 1460-1480, 2003].

면역글로불린은 통상적으로 콘 및 온클레이(Cohn and Oncley)에 따른 냉 에탄올 분별 방법[Oncley et al., J Am Chem Soc, 71, 541-550, 1949] 및 이의 후속된 변형방법에 의해서 사람 혈장으로부터 제조되었다. 그러한 면역글로불린 제제는 이들의 정맥내 주입과 연관된 부작용으로 인해서 피하 또는 근육내로만 투여될 수 있다. 따라서, 다른 제조 단계가 응집체 및 그 밖의 오염물의 제거 및 바이러스 불활성화를 위해서 개별적인 제조자에 의해서 부가되고 있다. 그러나, 다수의 제조 단계의 부가는 면역글로불린의 수율을 저하시키고 제조비용을 상승시킨다. 동시에, IVIG 생성물에 대한 증가되고 있는 수요는 수율을 중요한 문제가 되게 하고 있다.

현재 이용되고 있는 화학적 바이러스 불활성화 방법은 지질-엔벨로피드 바이러스(lipid-enveloped virus)에 대해서는 효과적이지만, 상기된 바와 같이, 비-엔벨로피드 바이러스, 예컨대, 파르보바이러스 및 A형 간염 바이러스(hepatitis A virus)는 불활성화시키지 못한다. 혈장 풀(plasma pool)중의 물리-화학적 내성 바이러스, 예컨대, 파르보바이러스 B19의 잠재 부하를 고려하면[Schmidt et al., Vox Sang. 81, 228-235, 2001], 제조 방법은 진정한 무 바이러스 생성물을 수득하기 위해서 아주 많은 양의 비-엔벨로피드 바이러스를 감소시킬 수 있어야 한다. 현재의 제조방법은 이러한 요건에 부합되지 않으며, IVIG 생성물은 파르보바이러스를 전염시킬 수 있다[Hayakaxa et al., Br J Haematol. 118, 1187-1189, 2002].

본 기술분야에서는, 정제된 정맥내 면역글로불린을 생산하는 일부 공지된 방법이 있다. 그러한 예로, 미국특허 제5,886,154호 및 제6,307,028호는 출발 용액으로부터 정제 및 바이러스 불활성화된 항체 제제를 제조하는 고-수율 방법을 개시하고 있다. 그러나, 그러한 방법은 물리-화학적 내성 감염제를 제거하는 단지 제한된 작용만을 한다.

공개된 국제특허출원 WO 99/64462호는 미정제 면역글로불린-함유 혈장 단백질 분획으로부터 면역글로불린 G를 정제하는 방법에 관한 것이다. 이러한 공지된 방법은 일련으로 2회 연속된 음이온 교환 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함한다. 크로마토그래피 전에, 단백질 침전제가 면역글로불린 현탁액에 첨가된다. 바이러스 불활성화는 S/D 처리에 의해서 수행된다.

이러한 공지된 방법의 수율은 단지 중간 정도인데, 그 이유는 단백질 침전제의 높은 농도 및 4 회의 크로마토그래피단계가 이용되기 때문이며, 그러한 크로마토그래피는 면역글로불린이 S/D-처리된 용액으로부터 분리되기 때문이다.

상기 과정 둘 모두 바이러스 불활성화 단계를 포함하지만, 과정 단계는 바이 러스 안전성인 특징을 지니는 생성물을 생성시킬 수 있는 효과적인 바이러스 제거에는 충분하지 않다. 또한, 일반적으로, 바이러스 제거 단계가 더 효과적이면 전체 과정 수율은 더 적다.

나노여과(바이러스-제거 여과)는 생물학적 활성 단백질의 용액으로부터 비-엔벨로피드 바이러스를 제거하는데 효과적인 수단이다. 본 발명자의 미국특허 제6,251,860호 및 제6,326,473호에는, 10 내지 30nm범위의 평균 기공 크기를 지니는 필터를 이용한 나노여과 단계를 사용함으로써 바이러스 안전성 아포트랜스페린을 생성시키는 과정을 기재하고 있다. 그러나, 본 발명자들은 면역글로불린의 용액이 나노필터로 여과하기가 어려운데, 그 이유는 필터가 신속하게 막히기 때문이다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 본 기술분야에서의 상기된 문제의 적어도 일부를 제거하고, 무-응집체 및 무-바이러스 면역글로불린을 제조할 수 있게 하는 신규한 고수율의 면역글로불린 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 바이러스 안전성 면역글로불린 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 나노여과에 의해서 면역글로불린을 정제하는 신규한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은, 다른 처리 단계와 함께 적합하게 수행되는 소량의 단백질 침전제 또는 흡착제로 처리하는 단계로서 용액이 카프릴산과 접촉되는 단계를 포함하는 경우에, 용액 중에 모노머 면역글로불린을 보유시키면서 응집된 단백질 및 바이러스 를 침전시키는 것이 효과적으로 가능하다는 발견에 근거한다. 단백질 침전 또는 흡착 단계 및 카프릴산 처리 단계의 조합 효과로 인해서, 단백질의 효과적인 제거가 얻어진다. 예를 들어, 단백질 침전제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜이 단독으로 사용되는 경우, 더 높은 농도가 효과적인 바이러스 제거를 위해서 요구되며, 이는 면역글로불린의 수율을 감소시킬 것이다.

상기된 바에 근거하여, 신규한 제조방법이 고안되었으며, 이러한 방법은,

A. 미정제 면역글로불린 용액을 카프릴산 처리에 가하고;

B. 침전제 또는 흡착제의 처리에 의한 면역글로불린 용액으로부터 단백질 응집체 및 바이러스를 제거하고;

C. 음이온 교환 크로마토그래피에 의해서 면역글로불린을 정제하고;

D. 무-응집체 면역글로불린 용액을 바이러스-제거 필터로 여과하는 단계를 포함한다.

단계 B 및 C는 임의의 순서로 수행될 수 있지만, 이들은 단계 A후에 및 단계 D 전에 수행된다.

상기된 단계의 결과로서, 검출 가능한 폴리머 또는 응집체를 함유하지 않는 바이러스-안전성 면역글로불린 용액이 얻어진다. 이러한 용액은 고농도의 면역글로불린(250g/l까지의 면역글로불린)을 함유하는 면역글로불린 조성물로 전환될 수 있다. 또한, 놀랍게도, 처리 단계 A 내지 C는 여과 과정 전체 동안 높은 플럭스(flux)을 유지시키면서 바이러스 제거 필터 상에서 높은 면역글로불린 생산량으로 여과될 수 있는 면역글로불린 용액을 생성시킬 것이다.

더욱 특히, 본 발명에 따른 방법은 주로 각각 특허청구범위 제1항 및 제6항의 특징 부분에서 언급된 사항에 특징이 있다.

면역글로불린 조성물은 특허청구범위 제17항의 특징부분에서 언급된 사항에 특징이 있으며, 여과 방법은 특허청구범위 제18항의 특징부분에서 업급된 사항에 특징이 있다.

현저한 이점이 본 발명에 의해서 얻어진다. 따라서, 본 발명에 따른 과정은 사람 혈장으로부터 높은 수율로 무-바이러스 면역글로불린 용액을 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 카프릴산으로 수행되는 바이러스 불활성화 단계 및 물리-화학적 내성 바이러스도 효과적으로 제거하는 두 바이러스 제거 단계의 조합에 근거한다. 첫 번째 바이러스 제거 단계는 또한 응집된 단백질을 제거하고, 그 결과 높은 수율 및 여과 용량으로 제 2 바이러스 제거 단계, 즉, 바이러스 여과를 수행하는 것을 가능하게 한다. 신규한 제조 과정은 물리-화학적 내성 바이러스 및 그 밖의 감염성 제제, 예컨대, 프리온을 제거하는데 있어서 의외의 큰 용량을 지닌다. 이들 두 바이러스 제거 단계의 조합은 기대하지 않은 이점을 준다.

물리-화학적 내성 바이러스를 효과적으로 제거하는 몇몇 단계의 실시는 본 발명의 과정과 미국특허 제5,886,154호 및 제6,307,028호에 따른 과정 사이에서 주된 차이를 이룬다.

이하에서는, 본 발명을 상세한 설명으로 및 일부의 실시예를 참조로 하여 더욱 상세하게 기재할 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 본 발명의 과정의 바람직한 양태의 흐름도이다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 범위내에서, 용어 "면역글로불린"은 IgG 및 IgA의 군으로부터 선택된 모노클로날 및 폴리클로날 면역글로불린을 나타낸다. 이하의 설명에서, 본 발명은 사람 폴리클로날 IgG를 일예로서 사용하면서 더욱 상세히 기재한다. 그러나, 본 발명은 면역글로불린의 상이한 공급원 및 치료 용도를 고려하여 필요한 경우 적합하게 변경된 그 밖의 폴리클로날 및 모노클로날 항체에 적용될 수 있다는 것을 주지해야 한다.

본 발명의 방법은 혈장이 아닌 다른 면역글로불린 공급원, 예컨대, 동물 세포 배양물 및 유전자변형 동물로부터 바이러스-안전성 면역글로불린을 생성시키는데 적용될 수 있다.

상기 설명된 바와 같이, 본 발명은 일반적으로 4 가지의 기본 단계를 포함하며, 그리하여, 첫 번째 단계에서, 미정제 면역글로불린 용액을 pH 5 이하, 바람직하게는 4.0 내지 5.0에서 카프릴산으로 처리한다. 카프릴산 처리는 엔벨로피드 바이러스의 불활성화를 유도한다. 카프릴산처리 후에, 상등 용액은 출발물질 및 제 1 과정단계로부터 유래되는 잠재 비-엔벨로피드 바이러스 및 일부의 단백질 응집체를 함유한다. 이들은 5.0을 초과하는 pH에서 단백질 침전제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 흡착제, 예컨대, 퓸드 실리카(fumed silica)를 사용함으로써 제거된다. 상등 용액의 pH는 5.3 이상으로 상승하며, 폴리에틸렌 글리콜이 첨가되고 형성된 침전물이 여과에 의해서 제거된다. 또한, 상등 용액은 퓸드 실리카에 의해 서 처리되며, 이는 여과에 의해서 제거된다. 면역글로불린의 최종 정제는 용액을 음이온 교환 크로마토그래피 겔의 컬럼을 통과시킴으로써 수행된다. 무-응집체 면역글로불린 용액은 바이러스 여과에 가해진다. 무 바이러스 면역글로불린 용액은 한외여과(ultrafiltration)에 의해서 농축되고 초여과(diafilter)된다. 생성되는 면역글로불린 용액은 액체 제형 또는 동결 건조된 분말로서 제형화 후에 안정하다.

이러한 주 과정 단계는 도 1의 구체예에 도시되어 있다. 따라서, 이러한 과정은 침전된 면역글로불린, 예컨대, 콘 분획 II+III 페이스트(Cohn fraction II+III paste)를 정제수 또는 수성 완충액에 용해시킴으로써 개시된다. 필터 보조-유리 분획 II+III 페이스트의 경우에, 더 큰 용적이 사용될 수도 있지만 8 용적(w/v)의 물을 사용하는 것이 실무이다. 현탁액의 pH는 5 미만, 바람직하게는 약 4.8(예, 0.2mol/l의 아세트산으로)로 조정된다. 현탁액은 약 5℃에서 면역글로불린이 용해되고 용액이 20 내지 25℃로 가온될 때까지 혼합된다. 카프릴산은 15 내지 60mmol/l, 바람직하게는 20 내지 50mmol/l의 최종 농도로 서서히 첨가된다. 처리 동안, 현탁액은 혼합된다. 한 가지 바람직한 구체예에 따르면, 바이러스 불활성화 평가를 기준으로 측정한 카프릴산(또는 상응하는 카프릴산염)의 총량은 약 15 분 내지 2 시간에 걸쳐서 첨가된다. 카프릴산에 의한 전체 처리 시간은 15분 내지 4 시간이다. 더 긴 인큐베이션 시간, 예를 들어, 약 16 시간까지의 시간이 이용될 수 있지만, 이는 수율을 다소 저하시킨다. 침전된 단백질 및 지질은 원심분리 또는 여과에 의해서 제거된다.

응집된 단백질 및 바이러스의 제거의 경우에, 용액의 pH는 5.3 이상, 바람직 하게는 약 5.4로 상승한다. 폴리에틸렌 글리콜은 10 내지 50g/l, 바람직하게는 20 내지 40g/l, 특히, 약 30g/l의 농도로 첨가된다. 더 높은 PEG 농도를 이용하면 면역글로불린 수율이 저하되며, 더 낮은 PEG 농도를 이용하면 바이러스 및 응집체 제거율이 저하된다. PEG의 분자량은 일반적으로 3000 내지 8000Da내에 있으며, 3350 내지 6000Da가 특히 바람직하다. 하기 실시예에서는, PEG 4000이 사용되었다. PEG에 의한 처리 시간은 PEG의 농도 및 출발 물질의 품질에 따라 다양할 수 있다. 전형적으로는, PEG 처리의 시간은 30분 내지 20시간의 범위이지만, 더 짧거나 예를 들어, 36 시간까지 더 긴 시간이 가능하다.

필터 보조제(예를 들어, 20g/l의 규조토)가 첨가되며 현탁액이 여과된다. 투명화된 용액은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 통과한다. 음이온 교환 수지 및 크로마토그래피 조건은 높은 수율 및 IgG의 서브클래스 조성을 유지시키면서 단백질 불순물을 선택적으로 제거하는 이들의 능력에 따라서 선택된다. 만족할 만한 정제는, 예를 들어, ANX 세파로즈 FF 겔(ANX Separose FF gel)을 사용함으로써 얻어진다. IgG를 함유하는 컬럼의 유출물은 수거된다. IgA는 컬럼에 의해서 저지되며 염화나트륨을 함유하는 용리 완충액의 전도성을 증가시킴으로써 용리될 수 있다. 유출 용액의 pH는 바람직하게는 약 4.2 내지 5.0으로 조정된다.

이온 교환 수지는 부착된 하전 기 뿐만 아니라 매트릭스에 관한 다양한 물질을 기초로 할 수 있다. 예를 들어, 하기 매트릭스가 사용될 수 있으며, 언급된 물질은 다소 가교될 수 있다: 한천 기재 매트릭스, 셀룰로오즈 기재 매트릭스, 덱스트란 기재 매트릭스, 실리카 기재 매트릭스 및 합성 중합체 기재 매트릭스. 매트 릭스에 공유결합되는 하전된 기는 예를 들어, 디에틸아미노프로필(ANX), 디에틸아미노에틸(DEAE), 4차 아미노에틸(QAE), 및/또는 4차 암모늄일 수 있다. 둘 이상의 음이온 교환 수지가 조합될 수 있다.

얻어진 무-응집체 면역글로불린 용액은 바이러스 제거 필터로 여과된다. 바람직하게는, 작은 비-엔벨로피드 바이러스, 예컨대, 파르보바이러스를 효과적으로 제거할 수 있는 필터가 사용된다. 본원에 기재된 용어 "바이러스를 효과적으로 제거한다"는 것은 약 3 로그 단위 이상까지, 가장 바람직하게는 약 4 로그 단위 이상까지 바이러스 역가를 감소시킴을 의미한다. "무-응집체 용액"은 본원에서 크기 배제 크로마토그래피에서 검출 가능한 단백질 폴리머가 없는 용액을 의미한다.

바이러스 여과된 용액은 한외여과에 의해서 농축된다. 폴리에틸렌 글리콜의 수준은 초여과(diafiltration)에 의해서 저하되어 최종 면역글로불린 용액중의 이의 농도가 2g/l 미만이 되게 한다. 한외여과는 한외여과 유출물 중의 면역글로불린의 농도에 따라 일부 PEG가 잔류되기는 하지만 대부분의 폴리에틸렌 글리콜을 제거한다. IVIG 생성물의 경우에, pH는 3.8 내지 5.8로 조정되고, 오스말농도는, 예를 들어, 글리신, 다른 아미노산, 당 또는 폴리올로 정맥내 주사에 적합하게 조정된다. 5 내지 20%의 IgG를 함유하는 최종 용액은 무균 여과되고 최종 용기에 분배된다. 생성물은 액체 제형으로서 안정하지만, 동결건조도 될 수 있다. 최종 생성물중의 면역글로불린의 순도는 존(zone) 크로마토그래피에 의한 분석에 의하면 98% 이상이지만, 크기 배제 크로마토그래피에서 검출 가능한 폴리머 또는 응집체를 함유하지 않는다. 크기 배제 크로마토그래피에서의 검출 한계는 약 0.1중량%이다.

카프릴산 처리와 단백질 침전제에 의한 침전의 조합에 의한 예측되지 않은 이점은 응집된 단백질 및 바이러스가 효과적으로 감소한다는 것이다. 응집된 단백질의 농도는 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제 후에 면역글로불린 용액이 작은 기공 크기 바이러스 필터를 통해서 높은 용량으로 여과될 수 있는 범위로 감소된다. 응집체의 제거는 그러한 바이러스 필터를 통한 면역글로불린 용액의 효과적인 여과의 선결요건인데, 그 이유는 단백질 응집체가 필터 기공을 막으며, 이는 플럭스를 감소시키고 바이러스 제거에 영향을 주기 때문이다[문헌: Hirasaki et al., Membrane 20, 135-142, 1995]. 현재까지, 작은 기공 크기 바이러스 제거 필터를 통한 온전한(intact) 면역글로불린의 효과적인 여과는 불가능하다. "작은 기공 크기"는 본원에서 필터 막이 입자 크기 약 20nm의 바이러스, 예컨대, 파르보바이러스를 3 로그 이상으로 제거함을 의미한다. "효과적인 여과"는 본원에서 5kg 이상의 면역글로불린이 1 m²의 필터 영역을 필터 플럭스가 50% 미만 감소하면서 통과될 수 있음을 의미한다. 이러한 여과는 비용 효과적인 산업 규모 바이러스 여과를 가능하게 한다. 작은 기공 크기 바이러스 제거 필터에 의한 바이러스 여과는 유익한 제조단계인데, 그 이유는 이러한 여과가 작은 비-엔벨로피드 바이러스 뿐만 아니라, 다른 물리-화학적 내성의 감염제, 예컨대, 프리온을 제거하기 때문이다.

바이러스 여과의 성공적인 성능을 위한 특정의 응집체 제거 단계의 중요성은 실시예 3에서 예시되고 있다. 폴리에틸렌 글리콜 침전 단계를 바이러스 여과와 조합함으로써, 본 발명은 실시예 2에 예시된 내성 비-엔벨로피드 바이러스의 제거를 위한 효과적인 두 단계를 포함한다.

상기된 바를 기초로 하여, 본 발명은 또한 기공 크기 10 내지 40nm, 바람직하게는, 10 내지 30nm의 나노필터상에서 면역글로불린 용액을 효과적으로 여과하는 방법으로서, 약 2 내지 4중량%의 폴리에틸렌 글리콜을 함유하며 검출 가능한 폴리머 응집체가 없는 순수한 면역글로불린 용액을 필터에 통과시켜서, 입자 크기가 약 20nm인 바이러스를 3 로그 이상 제거함을 포함하는 방법에 관한 것이다. 5kg 이상, 바람직하게는, 7.5kg이상의 면역글로불린이 필터 플럭스가 70% 미만, 특히 약 50% 미만 감소하면서 1m²의 필터 영역을 통과할 수 있다.

본 발명의 목적을 위해서, 바이러스 제거 필터의 평균 기공 크기는 동일한 크기의 실린더 구멍의 균일한 분포를 가정하는 하겐-포이세울레 방정식(Hagen-Poiseulle equation)에 의해서 물의 흐름을 기준으로 계산될 수 있다.

D_av=2.0x(Jdη/△Pα)^1/2

여기서,

D_av[nm] 평균 기공 직경

J[ml/min/m²] 유량(플럭스)

d[μm] 벽 두께

η[센티푸아즈] 물의 점도

△P[mmHg] 여과 압력

α[-] 다공도

기본적으로는, 소정의 기공 크기를 지니거나 상응하는 바이러스 제거 효율을 제공하는 어떠한 바이러스 제거 필터가 이용될 수 있다. 본 발명자들은 본원에서 내용이 참조로 통합되고 있는 미국특허 제5,096,637호에 개시된 종류의 복합 필터를 사용함으로써 특별히 우수한 결과를 얻는다는 것을 발견하였다. 그러한 필터는 전형적으로 비대칭 복합 막 구조를 나타낸다. 그러한 필터는 한외여과 특성을 지닌 스킨 층, 다공성 기판, 및 스킨 층과 기판 사이의 다공성 중간 영역을 포함한다.

본 발명에 따른 바이러스 여과에 사용될 수 있는 필터는 이로 한정되는 것으로 아니지만, 비레솔브 NFP(Viresolve NFP)(Millipore), 플라노바 15N(Planova 15N) 및 플라노바 20N(Asahi Kasei) 및 DV20(Pall)을 포함한다.

바이러스 제거 여과에 주어진 수성 용액은 바람직하게는 약 1 내지 25g/l의 면역글로불린, 예컨대, IgG 또는 IgA를 함유한다. 면역글로불린 용액은 95% 초과, 바람직하게는 98% 초과의 순도를 지닌다. 용액의 pH는 바람직하게는 4.2 내지 5.0, 특히, 약 4.2 내지 4.8 범위 내에 있다. 의외로, 여액 플럭스 및 면역글로불린 생산량은 면역글로불린의 pH가 5.2에서 4.4로 저하되는 경우에 명확하게 증가하였지만, pH 4.2에서는 다시 감소함이 밝혀졌다. 바람직한 범위는 여과에 주어지는 면역글로불린에 따라서 4.2 내지 5.0의 광범위한 범위로 다양할 것이다.

여과는 바람직하게는 20 내지 50℃의 온도 및 약 0.2 내지 8바(bar)의 경막 압력, 바람직하게는 약 0.5 내지 5.5바의 경막 압력에서 수행된다. 존재할 수 있 는 어떠한 입자를 제거하기 위해서, 약 0.05 내지 0.2㎛의 평균 기공크기를 지니는 필터를 통해서 면역글로불린 용액을 예비 여과하는 것이 가능하다. 승온, 예컨대, 30 내지 40℃에서 나노여과를 수행하는 것이 바람직한데, 그 이유는 그러한 온도가 플럭스를 증가시킬 것이기 때문이다. 낮은 pH(약 4.2 내지 4.6)에서의 승온이 바이러스 여과의 성능에 유익할 뿐만 아니라, IVIG 조성물의 약리학적 요건인 면역글로불린 용액의 어떠한 항보체 활성을 감소시키는데도 유익할 것이다.

여과는 바람직하게는 상기된 과정 단계 A 내지 C에 의해서 얻은 면역글로불린 용액에 대해서 수행되지만, 본 발명의 여과 방법은 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜을 함유하거나 흡착제로 처리되고 유사한 방법으로 검출 가능한 양의 단백질 응집체가 없는 어떠한 면역글로불린 용액에 적용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 적합한 과정 단계에서 생성된 면역글로불린 용액에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가함으로써 미국특허 제5,886,154호 및 제6,307,028호의 공지된 면역글로불린 과정을 변경시켜서 단백질 응집체를 제거하고 이어서 최종 면역글로불린 용액을 바이러스 제거 여과에 가하는 것이 가능하다.

미국특허 제5,886,154호 및 제6,307,028호는 카프릴산 침전 및 크로마토그래피를 이용한 항체(면역글로불린)의 정제 방법을 기재하고 있다. 본 발명에서, 카프릴산 침전은 바람직하게는 미국특허 제5,886,154호 및 제6,307,028호에서와 같이 카프릴산을 염의 형태, 예컨대, 소듐 카프릴레이트의 형태로 첨가하는 대신에 유리산으로서 카프릴산을 첨가함으로써 수행된다. 카프릴산은 pH를 증가시키는 소듐 카프릴레이트와는 대조적으로 용액의 pH를 약간 저하시킨다. 본 발명에서는, 미국 특허 제5,886,154호 및 제6,307,028호에 따른 pH 5.0-5.2로의 pH 이동이 없으며, 바이러스 불활성화가 낮은 pH에서 수행된다. 이러한 불활성화는 낮은 pH에서 카프릴산의 비이온화된 형태의 비율이 더 높기 때문에 유리하며, 바이러스 불화성화에 효과적인 형태는 카프릴산의 비-이온화된 형태이다. 그러나, 상기된 단점이 허용된다면, "카프릴산 처리"가 본 발명에서 상기 인용된 미국특허에 의해서 교시된 카프릴산염을 사용하면서 상기된 조건하에 수행될 수도 있다.

상기된 바와 같이, 파르보바이러스 B19는 현재의 혈장 생성물로는 위험이 있는데, 그 이유는 혈장 풀(pool)이 ml당 10¹⁰ 게놈 당량 이상까지의 파르보바이러스를 함유할 수 있으며, 이는 화학적 바이러스 불활성화 과정에 내성이기 때문이다. 본 발명에 따른 제조과정에서, 파르보바이러스 B19 DNA에 대해 PCR로 출발 혈장을 스크리닝하고, 제조과정에서 ≥10⁴ IU/ml를 함유하는 혈장 단위를 배제시키는 것이 바람직하다. 국제단위(IU)는 본원에서 파르보바이러스 B19 DNA에 대한 WHO 국제 표준이다. 정맥내 주입을 통해서 전염될 수 있는 파르보바이러스의 최소한의 감염 용량이 공지되지는 않았기 때문에, 제조 과정은 출발 혈장 풀에 잠제적으로 존재하는 모든 파르보바이러스를 제거해야 한다. 스크리닝에서 10⁴IU/ml의 컷-오프 수준을 적용시킴으로써, 수천 리터를 함유하는 대규모 혈장 풀중의 가장 높은 파르보바이러스 잠재 부하는 10¹⁰-10¹¹IU 정도일 것이다. 본 발명에 따른 제조 과정은 12 로그 초과의 파르보바이러스 B19를 제거하는 용량을 지니기 때문에(실시예 12), 출발 혈장 풀에 잠재적으로 존재하는 파르보바이러스의 완벽한 제거가 달성된다.

상기 신규한 과정에 의해서 제조된 생성물은 진정한 무-바이러스 면역글로불린 생성물이다. 당업자에게는 자명한 바와 같이, 이러한 계산은 화학적 불활성화 방법에 의해서 불활성화되지 않는 어떠한 혈액-유래된 바이러스, 예컨대, A형 간염 바이러스 및 지금까지 알려지지 않은 잠재적 바이러스에 적용될 수 있다. 파르보바이러스는 본원에서 예로서 이용되는데, 그 이유는 파르보바이러스가 혈장 생성물로부터 완전히 제거하기에 가장 어려운 바이러스 중 하나이기 때문이다.

종래 기술에 비한 본 발명이 방법의 추가의 이점은 방법의 단순성이다. 본 발명의 방법은 사람 혈장의 분획 II+III 페이스트로부터 출발할 수 있으며, 콘-온클레이 과정의 4 가지의 에탄올 분별 단계 중 둘을 대체할 수 있다. 단지 하나의 크로마토그래피 컬럼이 최종 생성물의 순도를 확보하는데 요구되지만, 분획 II+III 페이스트로부터 고 수율의 면역글로불린을 수득하고자 기재된 다른 방법에서는 두 개의 크로마토그래피 컬럼이 요구된다. 최종 면역글로불린 용액의 순도는 98%를 초과한다.

본 발명 이전에는, 아주 작은 바이러스, 예컨대, 파르보바이러스를 효과적으로 제거할 수 있는 바이러스 제거 필터로 IVIG 생성물을 여과하는 것은 비교적 비용 소모적이었다. 그 이유는 비교적 고비용의 필터가 막히기 전에 여과될 수 있는 IVIG의 제한된 양 때문이었다. 본 발명은 1m²의 바이러스 제거 필터를 통해서 높은 수율로 약 10kg의 IVIG 단백질을 여과하는 것을 가능하게 하고 있으며, 이는 현저 한 제조비용의 절감을 의미한다(실시예 1, 3 및 5).

본 발명에 따른 폴리머 제거를 위한 또 다른 방법은 흡착제, 예컨대, 퓸드 실리카(예를 들어, 실리카의 콜로이드 분산액의 형태로 적용됨)로 처리하는 것이다. 일반적으로, 단백질 응집체를 흡착할 수 있는 비독성의 미세하게 분할된 실리카 기재 수지가 사용될 수 있다. 0.05 내지 0.5% 퓸드 실리카(예컨대, 에어로실 200: Aerosil 200)에 의한 면역글로불린 용액의 처리는 폴리머를 효과적으로 제거하며, 실시예 6에서 입증된 바와 같이 바이러스 여과에서 면역글로불린 생산량을 증진시킨다. 흡착제는 여과 또는 원심분리에 의해서 제거된다.

놀랍게도, 면역글로불린 용액은 면역글로불린의 침전 없이 고도로 농축될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 20 내지 25%의 면역글로불린을 함유하는 등명한 용액을 제조할 수 있다. 그러한 용액은 예를 들어, 면역글로불린의 피하 투여와 결부되어 추가의 이점을 제공한다.

본 발명에 따라서 제조된 IVIG의 약제학적 조성물은 IVIG의 모든 공지된 임상 사용에 적합하다[문헌: Knezevic-Maramica and Kruskall, Transfusion 43, 1460-1480, 2003]. 조성물은 물리-화학적 내성 바이러스, 예컨대, 파르보바이러스가 없기 때문에, 파르보바이러스에 의해서 야기되는 복합증에 민감한 환자, 예컨대 임산부, 면역기능저하된 환자 및 용혈질환 또는 그 밖의 적혈구 생성증가를 보이는 환자의 치료에 특히 적합할 수 있다. IVIG의 일일 용량은 약 10mg 내지 10g/kg, 특히 약 100mg 내지 1g/kg이다. 과면역글로불린, 예컨대, 항-D 면역글로불린, 및 모노클로날 항체의 경우에, 용량은 더 낮을 수 있으며, 예컨대, 10㎍ 내지 10mg/kg 일 수 있다.

면역글로불린 조성물은 비경구 또는 장내 투여될 수 있다. 비경구 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 안내, 윤활막내, 경피를 포함한 상피투과, 눈, 설하, 및 구강내를 포함한다. 특히, 본 발명의 면역글로불린 조성물은 정맥내, 피하, 또는 근육내 투여용으로 제형화될 수 있다.

요약하면, 본 발명에 따른 제조 방법은 종래 기술에 기재된 제조 방법에 비해서 더 큰 물리-화학적 내성 바이러스 제거 능력을 지닌다. 중요하게는, 본 발명의 방법의 주 바이러스 제거 단계, PEG 침전 및 바이러스 여과는 강력하고, 예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피에서 이들의 효과적인 제거에 영향을 주는 바이러스의 물리-화학적 특성의 차이에 민감하지 않다.

바람직한 구체예에 따르면, 본 면역글로불린 용액은 트레할로스(trehalose)를 IgG 용액에 그대로 가하거나 트레할로스와 그 밖의 통상의 안정화제의 혼합물의 형태로 가함으로써 비경구 조성물로 제형화되고 pH는 필요한 경우 조정된다. 용액은 이어서 무균 여과되고 최종 용기, 예컨대, 바이알에 무균 충전된다. 이들 신규의 약제학적 조성물은 내용이 본원에서 참조로 통합되는 명칭 "약제학적 조성물"로 공동 계류중인 출원에서 더 상세히 개시하고 있다.

본 발명은 IgG를 고농도로 농축되게 한다는 것을 주지해야 한다. 일반적으로, 면역글로불린은 1 내지 250g/l의 농도를 지닌 액체 조성물의 형태로 회수되지만, 이의 통상적인 치료용의 폴리클로날 면역글로불린의 적합한 농도는 약 10 내지 250g/l, 예를 들어, 50 내지 200g/l의 범위이다. 본 발명은 정맥내 뿐만 아니라 피하 및 근육내로 다량의 면역글로불린을 용이하게 투여할 수 있는 고농축 폴리클로날 IVIG 조성물의 생산을 가능하게 한다. 피하 투여의 한 특정의 이점은 고용량의 면역글로불린으로 환자의 가정 치료를 가능하게 한다는 것이다.

하기 비제한적인 실시예는 본 발명을 예시하는 것이다.

실시예에서, 하기 분석 과정이 수행되었다.

IgG는 서모클리니칼 렙시스템즈(ThermoClinical Labsystems)으로부터 키트에 의한 면역혼탁측정으로 측정되며; IgA는 ELISA[문헌: Hirvonen et al., J Immunol Methods 163, 59-65, 1993]에 의해서 측정되고; IgG 서브클래스는 ELISA(PeliClass ELISA kit, Sanguin)에 의해서 측정되었다. 순도는 한천상의 존(zone) 전기영동에 의해서 측정되고, 분자 크기 분포는 문헌[Ph. Eur 3rd Ed. 1997:0338]에 따른 크기배제 액체 크로마토그래피에 의해서 측정되었다. 카프릴산은 문헌[Ph. Eur 2001:1401]에 따른 가스 크로마토그래피에 의해서 측정되고, 폴리에틸렌 글리콜은 문헌[Skoog, Vox Sang 37, 345-349, 1979]에 기재된 바와 같이 측정되었다.

실시예 1

본 실시예에는 사람 혈장으로부터 무-응집체 및 바이러스 안전성 면역글로불린을 고수율로 제조하는 방법이 기재된다.

사람 혈장으로부터의 분획 II+III 페이스트를 콘 방법(Cohn method)(Krijnen, Chemie en Yechniek 25, 193-196, 1970)에 의해서 분별시켰다. 500g의 분획 II+III 페이스트를 약 5℃의 정제수 8 용적에 현탁시키고, pH를 0.2mol/l의 아세트산으로 4.8로 조정하였다. 현탁액은 실온(약 22℃)이 되게 하였 다. 카프릴산을 50mM 농도로 1 시간 동안 가하였다. 현탁액을 1 시간 동안 혼합하고, 침전물을 원심분리에 의해서 제거하였다. 용액의 pH를 0.2M NaOH로 4.5에서 5.4로 상승시키고, 30g/l의 PEG 4000을 가하고, 혼합물을 16시간 동안 혼합하였다. 2% 점토를 가하고 혼합물을 여과하였다. 용액의 전도성을 소듐 아세테이트 완충액을 사용하여 2.0mS/cm으로 조정하였다. 여액을 20mM 소듐아세테이트 완충액, pH 5.4로 평형된 ANX 세파로즈 FF 겔의 컬럼에 가하였다. IgG를 함유하는 분획을 통한 유출물을 수거하였다. 용액의 pH를 0.5M 아세트산을 이용하여 pH 4.4로 조정하였다. 0.1㎛ 예비 필터를 통한 여과 후에, 용액을 35℃의 비레솔브 NFP 바이러스 필터를 통해서 3.5 바의 압력으로 여과하였다. 단백질 농도는 약 8g/l이고 약 10kg IgG/필터면적 m²의 부하가 이용되었다. 용액은 약 98 내지 100%의 IgG 수율로 약 6 시간 이내에 여과되었다. 용액을 한외여과에 의해서 농축시켜, 주입용 물로 초여과(diafilter)하여 폴리에틸렌 글리콜을 제거하고 최종적으로 농축시켰다. 농축된 용액을 0.2M 글리신을 함유하는 pH 4.4의 10% IgG 용액으로 제형화하였다. 0.2M 트레할로스를 함유하는 pH 5.2의 다른 15% IgG 제형을 또한 제조하였다. 제형된 용액을 최종 용기내로 무균 여과하였다.

용해된 페이스트로부터 최종 생성물로의 전체 수율은 약 64%였다(표 1참조). 이러한 수율은 냉 알콜 분별을 기초로 하는 통상의 과정으로 얻은 수율에 비해서 30 내지 70% 더 높다. 대부분의 응집체는 PEG 침전 단계에서 제거되며, 최종 생성물에는 응집체 또는 폴리머가 존재하지 않는다.

표 1. 상이한 과정 단계후의 IgG 수율 및 응집체 발생율

과정 단계	IgG 수율		응집체
과정 단계	g/kg 혈장	%	%
현탁된 II+III 페이스트	7.5		4
카프릴산 처리 후	6.8	91	5
PEG 침전 후	5.7	76	0.1
크로마토그래피 후	5.1	68	0.0
바이러스 여과 후	5.0	67	0.0
최종 생성물	4.8	64	0.0

실시예 2

본 실시예는 실시예 1에 기재된 제조 과정에서 파르보바이러스 B19의 감소를 입증하고 있다.

각각의 과정 단계에서의 바이러스 감소는 출발 용액을 고-역가 파르보바이러스 B19 양성 혈장으로 스파이킹(spiking)함으로써 연구되었다. 핵산을 출발 용액으로부터 분리하고, 파르보바이러스-음성 혈장으로 희석된 샘플을 로쉬 마그나 퓨어 방법(Roche MagNA Pure method)으로 처리하였다. 파르보바이러스 B19 DNA의 양을 로쉬 라이트사이클러(Roche LightCycler) 및 로쉬 파르보바이러스 B18 정량화 키트(Roche Parvovirus B19 Quantitation Kit)를 사용함으로써 실시간 PCR로 측정하였다. 상이한 과정 단계에서의 파르보바이러스의 감소를 표 2에 나타낸다.

표 2. 과정 단계에서의 파르보바이러스의 감소

과정 단계	감소 인자 Log10¹⁰
가프릴산 침전	1.7
PEG 침전	4.8
ANX 크로마토그래피	2.0
바이러스 여과	4.1
전체 감소 인자	12.6

실시예 3

본 실시예는 효과적인 바이러스 여과를 위한 특정의 폴리머 제거 단계의 중 요성을 입증하고 있다. 미정제 면역글로불린 용액을 준비하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 카프릴산으로 처리하였다. 상등 용액의 pH를 5.4로 상승시켰다. 별도의 실험 배치에서, 상이한 양의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG 4000)을 상등 용액에 첨가하거나 첨가하지 않았다. 용액을 실온에서 16시간 동안 혼합하고, 2% 점토를 가하고 용액을 여과하여 등명하게 하였다. 등명한 용액을 ANX 세파로스 상의 음이온 교환 크로마토그래피에 가하고, 정제된 IgG를 함유하는 유출물을 수거하였다. 유출 용액의 pH를 4.4로 조정하였다. 0.1㎛ 필터로 예비 여과한 후에, 용액을 비레솔브 NFP(Millipore) 필터로 3.5 바의 압력 및 35℃에서 여과하였다. 단백질 농도는 약 8g/l였으며, 약 10kg IgG/필터면적m²의 부하가 이용되었다. 여액 플럭스를 여액 중량을 기록함으로써 모니터링하였다. PEG 처리는 여액 플럭스 및 IgG 생성량을 현저하게 개선시켰다(표 3)

표 3. 바이러스 여과에서의 여액 흐름 및 IgG 생성량에 대한 PEG처리의 영향. *별도의 두 개의 별도 실험으로부터의 평균; n.a. 분석되지 않음.

PEG 농도	초기 여액 플럭스(kg/m²/h)	IgG 생성(kg/m²)
무 PEG	42	< 1	< 1	< 1
2% PEG	141	2.8	5.0	6.1
3%PEG	223	13.2	18.8	n.a.

실시예 4

본 실시예는 효과적인 바이러스 여과에 대한 면역글로불린 용액의 pH의 중요성을 입증하고 있다. 무-응집체 면역글로불린 용액을 사람 혈장의 콘 분획 II+III로부터 실시예 1에 기재된 바와 같은 카프릴산 처리, PEG 침전 및 이온 교환 크로 마토그래피에 의해서 제조하였다. 유출 용액의 pH를 4.2로부터 5.2까지 상이한 값으로 조정하였다. 0.1㎛ 필터에 의한 예비 여과 후에, 용액을 3 바의 압력으로 비레솔브 NFP 필터로 여과하였다. 온도는 pH 5.2 용액의 경우에 23℃였고, 두 개의 다른 용액의 경우는 35℃였다. 가장 높은 초기 플럭스 및 IgG 생산량은 유출 용액의 pH가 4.4로 조정되는 경우에 얻어졌다(표 4).

표 4. 바이러스 여과에서 여액 흐름과 IgG 생산량에 대한 면역글로불린 용액의 pH의 효과. * 두 개의 별도의 제조 배치로부터의 평균 값을 나타낸다.

용액의 pH	초기 여액의 플럭스(kg/m²/h)	IgG 생산량(kg/m²)
용액의 pH	초기 여액의 플럭스(kg/m²/h)	초기 플럭스의 80% 플럭스	초기 플럭스의 50% 플럭스	초기 플럭스의 30% 플럭스
5.2	192	< 1	n.a.	n.a.
4.4*	223	13.2	18.8	n.a.
4.2*	164	3.6	6.1	7.3

실시예 5

본 실시예는 펩신 처리에 비교한 본 발명에 따라 제조된 면역글로불린 용액의 바이러스 여과에서 얻어진 고효율을 입증하고 있다.

무-응집체 IgG 용액을 사람 혈장의 콘 분획 II+III으로부터 실시예 1에 기재된 바와 같은 카프릴산 처리, PEG 침전 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해서 제조하였다. 또 다른 순수한 IgG 용액을 사람 혈장의 콘 분획 II로부터 국제공개 특허 출원 WO 96/35710호에 따른 DEAE-세파덱스 처리, 한외여과 및 펩신 처리에 의해서 제조하였다. 0.1㎛ 필터에 의한 예비 여과 후에, 용액을 비레솔브 NFP 필터로 3.5바의 압력 및 35℃에서 여과하였다. 단백질 농도는 약 8g/l였다. 더 많은 IgG 생산량이 펩신 처리에 의해서 제조된 용액 보다는 본 발명의 과정에 의해서 제조된 용액을 여과하는 경우에 얻어졌다(표 5).

표 5. 순수한 면역글로불린 용액의 바이러스 여과에 대한 제조 과정의 효과. *두 개의 별도의 제조 배치로부터의 평균 값을 나타낸다.

면역글로불린 제조과정	초기 여액 플럭스(kg/m²/h)	IgG 생산량(kg/m²)
면역글로불린 제조과정	초기 여액 플럭스(kg/m²/h)	초기 플럭스의 80% 플럭스	초기 플럭스의 50% 플럭스	초기 플럭스의 30% 플럭스
본 발명의 과정*	223	13.2	18.8	n.a.
펩신 처리	142	0.8	1.9	2.9

실시예 6

본 실시예는 퓸드 실리카 처리에 의해서 달성된 면역글로불린 용액의 폴리머 제거 및 개선된 여과 효율을 입증하고 있다. 제 1 실험 세트에서, 미정제 면역글로불린 용액을 실시예 1에 기재된 바와 같이 카프릴산으로 처리하고, 상등 용액의 pH를 5.4로 상승시켰다. 용액의 한 분획에, 0.2%의 퓸드 실리카(에어로실 200)을 첨가하고 현탁액을 1 시간 동안 혼합하였다. 2%의 점토를 첨가하고, 현탁액을 여과하였다. 또 다른 상등 용액의 분획을 2% 점토만에 의한 등명화 여과에 가하였다. 상기 두 용액을 ANX 세파로스 상의 이온 교환 크로마토그래피에 가하고 정제된 IgG를 함유하는 유출물을 회수하였다. 퓸드 실리카 처리된 면역글로불린 용액은 어떠한 검출 가능한 폴리머를 함유하지 않았지만, 참조 용액은 0.4%의 폴리머를 함유하였다.

또 다른 실험 세트에서, 순수한 IgG 용액을 사람 혈장의 용해된 콘 분획 II로부터 WO 96/35710호에 따른 DEAE-세파덱스 처리 및 한외여과에 의해서 얻었다. 단백질 농도를 10g/l로 조정하였다. 용액의 한 분획을 0.2% 에어로실로 처리하고, 2%의 점토를 첨가하고 현탁액을 여과하였다. 용액의 또 다른 분획을 WO 96/35710 에 따른 펩신으로 처리하였다. 제 3 분획을 참조로서 사용하였다. 0.1㎛ 필터에 의한 예비 여과 후에, 용액을 비레솔브 NFP 필터로 3.5바의 압력으로 및 35℃에서 여과하였다. IgG 생산량은 펩신 처리에 비해서 에어로실 처리 후에 약 50% 더 많았다. 상기 처리 둘 모두는 참조 용액에 비해서 IgG 생산량이 몇 배 더 많았다.

Claims

정제된 필수적 바이러스 안전성 면역글로불린 제제를 제조하는 방법으로서,

- 미정제 면역글로불린 용액을 카프릴산 처리에 가하고,

- 면역글로불린 용액으로부터 단백질 응집체 및 바이러스를 제거하고,

- 면역글로불린을 정제하기 위해서 면역글로불린 용액을 음이온 교환 크로마토그래피에 가하고,

- 수득된 면역글로불린 용액을 바이러스 제거 필터 상에서 여과하여 면역글로불린을 함유하는 용리액을 생산하고,

- 면역글로불린을 회수하는 단계들을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 단백질 응집체 및 바이러스가 단백질 침전제의 첨가에 의해서 제거되는 방법.
제 2항에 있어서, 단백질 침전제가 폴리에틸린 글리콜 및 암모늄 설페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제 3항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜이 약 2 내지 4중량%의 양으로 첨가되는 방법.
제 1항에 있어서, 단백질 응집체와 바이러스가 단백질-흡착제, 예컨대, 퓸드 실리카의 첨가에 의해서 제거되는 방법.
정제된 필수적 바이러스 안전성 면역글로불린 제제를 제조하는 방법으로서,

a) 면역글로불린과 폴리머 단백질을 포함하는 출발 용액을 하나 이상의 바이러스 불활성화 단계에 가하는데, 조성물이 카프릴산과 접촉되어 침전물 및 용해된 면역글로불린과 폴리머 단백질을 포함하는 상등 용액을 형성하도록 하여 바이러스 불활성화 단계에 가하고,

b) 상등 용액을 회수하고,

c) 상등 용액을 하나 이상의 이온 교환 수지와 접촉시켜서 면역글로불린을 포함하는 제 1 유출물을 생성시키고,

d) 제 1 유출물을 회수하고,

e) 제 1 유출물을 약 10 내지 40nm의 평균 기공 크기를 지니는 필터상의 나노여과에 가하여 어떠한 엔벨로피드 및 비-엔벨로피드 바이러스를 제거하고 제 2 유출물을 생성시키고,

f) 제 2 유출물을 회수하고,

g) 제 2 유출물을 중합체 단백질이 없는 약제학적으로 허용되는 바이러스 안전성 면역글로불린 제제로 제형하는 단계들을 포함하며,

상기 폴리머 단백질이 단계 b) 또는 단계 d)의 유출물로부터 얻은 상등 용액으로부터 제거되는 방법.
제 6항에 있어서, 단계 a)가 카프릴산을 15 내지 60mmol/l, 바람직하게는 20 내지 50mmol/l 카프릴산 최종 농도로 첨가함으로써 수행되는 방법.
제 7항에 있어서, 단계 a)가 약 4.0 내지 5.0의 pH에서 수행되는 방법.
제 6항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 용액이 면역글로불린 함유 혈액 분획을 pH 약 4.0 내지 5.0, 바람직하게는 4.5 내지 5.0의 수용액에 용해시킴으로써 수행되는 방법.
제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)의 상등 용액의 pH가 약 5.3 이상의 값으로 조정되는 방법.
제 6항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머 물질이 폴리에틸렌 글리콜을 단계 b)의 상등 용액에 첨가함으로써 제거되는 방법.
제 11항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜의 농도가 용액의 2 내지 4중량%인 방법.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상등 용액이 카프릴산을 약 1 내지 20mmol/l의 농도로 함유하는 방법.
제 6항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 e)가 4.2 내지 5.0의 pH에서 수행되는 방법.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 혈장이 10⁴IU/ml 미만의 파르보바이러스 B19 DNA를 함유하는 방법.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 혈장이 사람 혈장의 콘 분획 II+III 페이스트로부터 수득되는 방법.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해서 수득 가능하고 250g/l까지의 면역글로불린을 포함하며 검출 가능한 폴리머 또는 응집체가 없는 바이러스 안전성 면역글로불린 수용액.
10 내지 40nm의 기공 크기를 지니는 나노필터상에서 면역글로불린 용액을 효과적으로 여과하는 방법으로서, 1 내지 25g/l의 면역글로불린을 포함하는 면역글로불린 용액을 필터에 통과시켜 입자 크기 약 20nm의 바이러스를 3 로그 이상 제거함을 포함하고, 상기 여과가 약 4.2 내지 5.0의 pH에서 수행되게 하고, 상기 면역글 로불린 용액이 검출 가능한 폴리머 응집체를 함유하지 않게 하는 방법.
제 18항에 있어서, 용액이 약 20 내지 50℃의 온도 및 약 0.2 내지 8바의 압력차에서 여과되는 방법.
제 19항에 있어서, 용액이 0.5 내지 5.5바의 경막 압력을 이용함으로써 여과되는 방법.
제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 5kg 이상, 바람직하게는 7kg 이상의 면역글로불린이 필터 플럭스 50% 미만의 감소로 1m²의 필터 영역을 통과하는 방법.
제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 용액이 복합 바이러스 제거 필터상에서 여과되는 방법.
제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 여과가 약 4.2 내지 4.8의 pH에서 수행되는 방법.
제 18항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 여과에 주어지는 면역글로불 린 용액이

- 미정제 면역글로불린 용액을 카프릴산 처리에 가하고,

- 폴리에틸렌 글리콜을 첨가함에 의해서 면역글로불린 용액으로부터 단백질 응집체 및 바이러스를 제거하고,

- 미정제 면역글로불린 용액을 정제하고 검출 가능한 양의 단백질 응집체가 없는 용액을 생성기키기 위해서 면역글로불린 용액을 음이온 교환 크로마토그래피에 가함으로써,

미정제 면역글로불린 용액으로부터 수득되는 방법.
제 18항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 용액이 2 내지 4중량%의 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 방법.
제 18항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 용액이 이를 여과 전에 흡착제로 처리함으로써 단백질 응집체가 없게 하는 방법.