EA023382B1

EA023382B1 - Способ получения высококонцентрированного препарата иммуноглобулина для подкожного применения

Info

Publication number: EA023382B1
Application number: EA201171481A
Authority: EA
Inventors: Вольфганг Тешнер; Харальд Арно Буттервек; Азра Плевляковиц; Тереза Фридерике Бауэр; Бернхард Кельбль; Ханс-Петер Шварц; Небойса Николич; Герхард Пельслер; Йоханна Киндерманн
Original assignee: Бакстер Интернэшнл Инк.; Бакстер Хелткэр С.А.
Priority date: 2009-05-27
Filing date: 2010-05-27
Publication date: 2016-05-31
Also published as: JP5341252B2; HK1200843A1; CO6480954A2; AU2022228125B2; SG176256A1; EP2762492A2; AU2018200548A1; AU2016203542B2; MX2011012576A; MY157239A; KR101464032B1; US9175068B2; CN102459331A; US20220153823A1; KR20140014403A; US20190085064A1; CN102459331B; US8546548B2; AU2010253830B2; EA201171481A1

Abstract

Изобретение относится к способам получения композиции концентрированного G (IgG). Изобретение позволяет получить стабильный, с высокой степенью очистки вирус-инактивированный, готовый к использованию продукт с высокой концентрацией IgG.

Description

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США Νο. 61/181606, поданной 27 мая 2009 г., которая специально включена в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

Уровень техники

Иммуноглобулиновые продукты из плазмы человека впервые были использованы в 1952 г. для лечения иммунодефицита. Сначала способами выбора были способы внутримышечного или подкожного введения 1§С. Однако для инъекционного введения больших количеств 1§С, необходимых для эффективного лечения различных заболеваний, были созданы продукты для внутривенного введения с более низкими концентрациями 1§С (50 мг/мл). Обычно иммуноглобулин (1У1С) для внутривенного введения содержит смешанный иммуноглобулин С (1дС) из плазмы более чем тысячи доноров крови. Обычно содержащие более чем 95% немодифицированного 1дС, который обладает интактными Рс-зависимыми эффекторными функциями и содержит только следовые количества иммуноглобулина А (1дА) или иммуноглобулина М (1дМ), 1У1С представляют собой стерильные, очищенные 1дС продукты, используемые преимущественно при лечении трех основных категорий медицинских состояний: 1) иммунодефицитов, таких как Х-связанная гаммаглобулинемия, гипогаммаглобулинемия (первичные иммунодефициты) и состояния приобретенного ослабленного иммунитета (вторичных иммунодефицитов), характеризующиеся низкими уровнями содержания антител; 2) воспалительных и аутоиммунных заболеваний и 3) острых инфекций.

Целый ряд коммерческих поставщиков 1У1С предлагает разнообразные 1У1С продукты. По сравнению с использовавшимися ранее лиофилизированными 1У1С продуктами, содержащими только 50 мг/мл белка в растворе после повторного растворения, последние разработки представляют собой 100-мг/мл готовые к использованию, стерильные, жидкие препараты высокой степени очистки концентрированных человеческих 1§С антител. Так как 1§С продукты, такие как 1У1С, получают из смешанной человеческой плазмы, загрязнение патогенами из донорской крови (особенно вирусами, которые, как известно, вызывают у людей различные заболевания) представляет собой серьезную проблему для процесса производства. Другим важным фактором, связанным с 1дС продуктами, является их стабильность при хранении, особенно для готовых к использованию препаратов. По сравнению с 1У1С препараты иммуноглобулинов для подкожного введения отличаются тем преимуществом, что их можно использовать для домашнего лечения, и тем, что они создают меньше побочных эффектов. Для уменьшения недостатка, связанного с небольшим объемом инъекции препарата на сайт, преимуществом была бы более высокая концентрация препарата 1дС (например, препарата, содержащего 200 вместо 100 мг/мл).

В четвертом выпуске ряда основополагающих публикаций, касающихся получения и свойств белков сыворотки и плазмы СоЬп е! а1. (1. Ат. СЬет. §ос, 1946, 68(3): 459-475) впервые описали способы спиртового фракционирования плазменных белков (способ 6), которые позволяют выделять из человеческой плазмы фракции с высоким уровнем содержания 1§С. Несколько лет спустя Опс1еу е! а1. (1. Ат. СЬет. §ос., 1949, 71(2): 541-550) расширили способы Кона и опубликовали способ (способ 9), который обеспечивает выделение более чистых 1§С препаратов.

Указанные способы, хотя и лежали в основе всей индустрии получения факторов крови из плазмы, были не способны обеспечить получение 1дС препаратов, обладающих достаточно высокими концентрациями, для лечения ряда связанных с иммунитетом заболеваний, включая синдром Кавасаки, иммунную тромбоцитопеническую пурпуру и первичные иммунодефициты. Как таковые, были разработаны дополнительные методологии, использующие различные технологии, такие как ионообменная хроматография, для получения 1§С препаратов с более высокой степенью чистоты и в более высоких концентрациях. Норре е! а1. (МипсЬ Меб ^осЬепксЬг 1967 (34): 1749-1752) и Ра1ккуебеп (8\уебРЬ Ра!еп! Νο. 348942) и Ра1ккуебеп апб ЬипбЪ1аб (Ме!Ьобк οί Р1акта Рго!еш РгасОопаОоп 1980) были среди первых, кто использовал для этой цели ионообменную хроматографию.

В различных современных способах используют стадию осаждения, такую как осаждение каприлатом (ЬеЪшд е! а1., Уох 8ап§ 2003 (84): 193-201) и фракционирование Кона (1+)11+111 осаждение этанолом (Тапака е! а1., Βηιζ 1. Меб Вю1. Ке8 2000 (33)37-30) совместно с колоночной хроматографией. Совсем недавно ТексЬпег е! а1. (Уох 8ап§, 2007 (92):42-55) раскрыли способ получения 10% 1У1С продукта, в котором криоосадок сначала удаляют из смешанной плазмы и затем осуществляют модификацию СоЬпОпс1еу, фракционирование холодным этанолом, с последующей δ/ϋ обработкой промежуточного продукта, с использованием ионообменной хроматографии, нанофильтрации и необязательно ультрафильтрации/диафильтрации.

Однако, несмотря на повышенную степень чистоты, безопасность и выходы, достигаемые указанными способами получения 1§С, все еще остается необходимость в препаратах 1дС более высоких концентраций, пригодных для подкожного и/или внутримышечного введения. Настоящее изобретение удовлетворяет указанным и другим потребностям и раскрывает способ получения стабильного, с высокой степенью очистки вирус-инактивированного, готового к использованию продукта с высокой концентрацией 1§С.

- 1 023382

Сущность изобретения

В одном аспекте настоящее изобретение предоставляет собой способ получения композиции концентрированного С (1дС).

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет водную композицию, содержащую более чем около 180 г белка на 1 л указанной композиции, где по меньшей мере 95% белка представляет собой 1дС, такой как человеческий 1§С. В некоторых вариантах осуществления указанную композицию получают способом, обеспечивающим получение продукта, пригодного для подкожного и внутривенного введения, и который можно обрабатывать при повышенной температуре в конечном контейнере для инактивации вирусов, независимо от того, какая из концентраций установлена в интервале значений концентраций от 10 до 22% белка. В некоторых случаях, концентрация белка в указанной композиции составляет точно или около 20% (мас./об.). В других случаях указанная композиция может дополнительно содержать около 0,1-0,3М глицин. Указанная композиция настоящего изобретения может иметь различные значения рН, такие как около 3-6 или около 4-6.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ получения композиции концентрированного 1дС из плазмы при усовершенствовании, включающем стадии: (1) концентрирования белка в препарате плазмы до точно или около 5% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации и (2) дальнейшего концентрирования белка в препарате до точно или около 20% (мас./об.) с помощью диафильтрации. По меньшей мере 95% белка в указанной композиции составляет 1§С, такой как человеческий 1§С. В некоторых вариантах осуществления стадию (1) осуществляют, используя ультрафильтрационную мембрану с номинальным отсечением по молекулярной массе (ΝΜ\νί'.Ό) 100 кДа или менее. В других вариантах осуществления стадию (2) осуществляют против диафильтрационного буфера глицина с рН 4,2±0,1. Диафильтрационный буфер в некоторых случаях представляет собой 0,25 М глицин и рН 4,0. В некоторых конкретных вариантах осуществления концентрация белка после стадии (2) оказывается выше, чем 20% (мас./об.) и затем ее доводят до точно или около 20% (мас./об.), добавляя диафильтрационный буфер.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ получения композиции концентрированного 1дС из плазмы, включающий стадии:

(1) выделения жидкости и осадка из плазмы путем центрифугирования;

(2) смешивания предварительно охлажденного этанола с жидкостью со стадии (1) до образования смеси, в которой концентрация этанола составляет точно или около 8% (об./об.);

(3) выделения жидкости и осадка из смеси (2) путем центрифугирования;

(4) доведения рН и концентрации этанола в жидкости со стадии (3) до точно или около 7,0 и 20-25% (об./об.), соответственно формируя тем самым смесь;

(5) выделения жидкости и осадка из смеси (4) путем центрифугирования;

(6) повторного суспендирования осадка со стадии (5) в буфере при отношении точно или около 1:15 по массе до получения суспензии;

(7) смешивания диоксида кремния (δίΟ₂) с суспензией со стадии (6) и получения фильтрата путем фильтрования;

(8) смешивания детергента и холодного спирта с фильтратом, полученным на стадии (7), и получения осадка путем центрифугирования;

(9) растворения осадка в водном растворе, содержащем растворитель или детергент, и выдерживания полученного раствора в течение по меньшей мере 60 мин;

(10) пропускания раствора, полученного после стадии (9), через катионообменную хроматографическую колонку и элюирования белков, адсорбированных в колонке, в элюат;

(11) пропускания элюата, полученного на стадии (10), через анионообменную хроматографическую колонку до получения элюата;

(12) пропускания указанного элюата через нанофильтр до получения нанофильтрата;

(13) пропускания полученного нанофильтрата через ультрафильтрационную мембрану до получения ультрафильтрата;

(14) диафильтрации ультрафильтрата против диафильтрационного буфера до получения раствора с концентрацией белка точно или около 20% (мас./об.);

(15) стерилизации раствора, полученного на стадии (14), путем фильтрования полученного раствора через фильтр 0,2 мкм или менее, с получением, таким образом, композиции концентрированного 1дС.

В некоторых вариантах осуществления стадию (2) осуществляют при температуре от около -2 до 0°С; или смесь со стадии (2) перемешивают в течение по меньшей мере 15 мин и затем выдерживают в течение по меньшей мере 2 ч при температуре от около -2 до 0°С. В некоторых вариантах осуществления стадии (4) перемешивание осуществляют в течение по меньшей мере 15 мин и затем выдерживают в течение по меньшей мере 8 ч при температуре точно или около -7°С. В некоторых вариантах осуществления суспензию со стадии (6) перемешивают в течение около 40-160 мин при температуре от около 2 до 8°С и при рН точно или около 5,0; или диоксид кремния на стадии (7) имеет концентрацию 40 г/кг суспензии со стадии (6) и перемешивание осуществляют при температуре от около 2 до 8°С в течение по

- 2 023382 меньшей мере около 50 мин. В некоторых вариантах осуществления стадию (8) осуществляют при температуре от около -5 до -10°С. В некоторых вариантах осуществления полученный раствор со стадии (9) включает 1,0% (об./об.) ТгПоп Х-100, 0,3% (об./об.) Т\\есп-80 и 0,3% (об./об.) три(н-бутил)фосфата (ΤΝΒΡ). В некоторых вариантах осуществления полученный раствор со стадии (9) выдерживают при температуре от около 18 до 25°С. В некоторых вариантах осуществления катионообменную хроматографическую колонку на стадии (10) промывают 10 мМ ацетатным буфером с рН 5,5±0,1 и элюируют буфером 35 мМ одноосновного фосфата натрия, 10 мМ Ττίδ, рН 8,5±0,1, с проводимостью 5,0±0,2 мс/см. В некоторых вариантах осуществления рН элюата, полученного на стадии (10), доводят до 6,4±0,2 и значение проводимости доводят до от около 1,5 до 2,5 мс/см перед стадией (11). В некоторых вариантах осуществления элюат со стадии (11) пропускают через фильтр с размером пор 0,2 мкм или меньше перед стадией (12). В некоторых вариантах осуществления концентрация белка в ультрафильтрате со стадии (13) составляет точно или около 5±1% (мас./об.). В других вариантах осуществления номинальная отсечка по молекулярной массе ультрафильтрационной мембраны (ΝΜ\νί'.Ό) со стадии (13) составляет 50 кДа или менее, в некоторых вариантах осуществления диафильтрационный буфер со стадии (14) представляет собой 0,25 М глициновый раствор с рН 4,2±0,1. В других вариантах осуществления концентрация белка в растворе, полученном на стадии (14), выше чем 20% (мас./об.), и затем ее доводят до точно или около 20,4±0,4% (мас./об.), используя диафильтрационный буфер. В некоторых вариантах осуществления стадии (13) и (14) осуществляют при температуре от около 2 до 8°С. В других вариантах осуществления способ получения дополнительно включает стадию распределения стерилизованного раствора со стадии (15) в контейнеры в стерильных условиях перед тем, как контейнеры запаивают.

В других вариантах осуществления описанный выше способ может дополнительно содержать стадию хранения запаянных контейнеров при температуре от около 30 до 32°С в течение около 21-22 дней; или указанный способ может дополнительно включать стадию получения продукта, содержащего 20% 1дС. такого же стабильного, как и используемая в настоящее время 10% композиция для внутривенного применения.

В еще одном аспекте настоящее изобретение предоставляет водную композицию, которая содержит по меньшей мере 18% (мас./об.) иммуноглобулина, например по меньшей мере 20% (мас./об.) иммуноглобулина.

В следующем аспекте настоящее изобретение предоставляет способ лечения пациента с иммунодефицитом, аутоиммунным заболеванием или с острой инфекцией, включающий введение пациенту эффективного количества указанной композиции, как раскрыто выше.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 представляет собой графическую иллюстрацию новой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы.

Определения.

Термин антитело относится к полипептиду, в основном кодируемому геном иммуноглобулина или генами иммуноглобулина, или их фрагментами, которые специфически связывают и распознают аналит (антиген). Распознаваемые гены иммуноглобулина включают каппа, лямбда, альфа, гамма, бета, эпсилон и мю гены константных областей так же, как и огромное число вариабельных областей генов иммуноглобулина. Легкие цепи классифицируют или как каппа, или как лямбда. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, которые, в свою очередь, определяют классы иммуноглобулина, 1§С, 1дМ, Ι§Ά, Ι§ϋ и 1дЕ соответственно.

В качестве примера структурная единица иммуноглобулина (антитела) состоит из двух пар полипептидных цепей, причем каждая пара содержит одну легкую (около 25 кДа) и одну тяжелую цепь (около 50-70 кДа). Ν-конец каждой из цепей определяет вариабельную область, состоящую из около 100110 или более аминокислот, в основном отвечающий за распознавание антигена. Термины вариабельная легкая цепь (У_ь) и вариабельная тяжелая цепь (Ун) относятся к легкой и тяжелой цепям соответственно.

Термин ультрафильтрация (ИР) охватывает различные способы мембранной фильтрации, в которых гидростатическое давление заставляет жидкость проходить через полупроницаемую мембрану. Суспендированные твердые вещества и солюты с высокой молекулярной массой задерживаются, тогда как вода и низкомолекулярные солюты проходят через такую мембрану. Указанный процесс разделения часто используют для очистки и концентрирования макромолекулярных (10³-10⁶ Да) растворов, особенно белковых растворов. Доступен целый ряд ультрафильтрационных мембран в зависимости от размера молекул, которые они удерживают. Ультрафильтрация обычно характеризуется размерами пор мембран от 1 до 1000 кДа и рабочим давлением от 0,01 до 10 бар, и в основном ее используют для отделения коллоидоподобных белков от мелких молекул, таких как сахара и соли.

Термин диафильтрация относится к использованию таких же мембран, как и для ультрафильтрации, и представляет собой тангенциальную проточную фильтрацию. Во время диафильтрации буфер вводят в рециркуляционный резервуар, тогда как фильтрат удаляют из рабочей установки. В процессах, в которых продукт представляет собой ретентат (например, Ι§Ο), диафильтрация приводит к вымыванию компонентов продуктового пула в фильтрат, тем самым изменяя буферы и уменьшая концентрацию не- 3 023382 желательных веществ.

Как использовано в данном описании, выражение около означает приблизительный интервал величиной плюс или минус 10% от указанного значения. Например, выражение около 20% охватывает интервал 18-22%.

Термин смешивание описывает действие, которое вызывает равномерное распределение двух или более различных соединений или веществ в растворе или суспензии с использованием любых способов перемешивания. Указанный термин смешивание, как использовано в данном описании, не требует полного равномерного распределения всех ингредиентов в растворе или суспензии.

В данном описании термин растворитель включает любое жидкое вещество, способное растворять или диспергировать одну или более других субстанций. Растворитель может быть неорганическим по природе, таким как вода, или он может быть органической жидкостью, такой как этанол, ацетон, метилацетат, этилацетат, гексан, петролейный эфир и т.д. Как использовано в данном описании, в выражении обработка детергентным растворителем растворитель означает органический растворитель (например, три-Ы-бутилфосфат), который представляет собой часть смеси детергентного растворителя, используемого для инактивации вирусов в липидной оболочке в растворе.

Термин детергент в данном описании используют взаимозаменяемо с термином поверхностноактивное вещество или поверхностно-активный агент. Поверхностно-активные вещества представляют собой конкретные органические соединения, которые являются амфифильными, то есть содержащими как гидрофобные группы (хвосты), так и гидрофильные группы (головы), что обеспечивает поверхностно-активным веществам растворимость как в органических растворителях, так и в воде. Поверхностно-активные вещества можно классифицировать по присутствию формально заряженных групп в их головах. Неионные поверхностно-активные вещества не содержат заряженных групп в своих головах, тогда как ионные поверхностно-активные вещества содержат заряды в своих головах. Цвиттерионные поверхностно-активные вещества содержат головы с двумя противоположно заряженными группами. Некоторые примеры обычных поверхностно-активных вещества включают: анионные (на основе сульфатного, сульфонатного или карбоксилатного анионов): перфтороктаноатные (ΡΡΘΆ или РРО), перфтороктансульфонатные (РРО8), натрийдодецилсульфатные (δΩδ), аммонийлаурилсульфатные и другие алкилсульфатные соли, натрийлаурилсульфат (известный так же, как δΩΕδ), алкилбензолсульфонат; катионные (основанные на катионах четвертичного аммония): цетилтриметиламмонийбромид (СТАВ) а.к.а. гексадецилтриметиламмонийбромид и другие алкилтриметиламмонийные соли, цетилпиридинийхлорид (СРС), полиэтоксилированный амин животного жира (РОЕА), бензалконийхлорид (ВАС), бензетонийхлорид (ΒΖΤ); длинноцепочечные жирные кислоты и их соли: включая каприлат, каприловую кислоту, гептаноат, гексановую кислоту, гептановую кислоту, наноевую кислоту, декановую кислоту и т.п.; цвиттерионные (амфотерные): додецилбетаин; кокамидопропилбетаин; кокоамфоглицинат; неионные: алкилполи(этиленоксиды), алкилфенолполи(этиленоксиды), сополимеры поли(этиленоксида и поли(пропиленоксида), (под коммерческими названиями полоксамеры или полоксамины), алкилполигликозиды, включая октилгликозид, децилмальтозид, жирные спирты (например, цетиловый спирт и олеиловый спирт), кокамид МЕА, кокамид ΩΕΑ, полисорбаты (Т\уссп 20, Т\уссп 80 и т.д.), детергенты Ττίΐοη и додецилдиметиламиноксид.

Как использовано в данном описании, термин лечение внутривенным введением 1дО или 'ТУЮ относится, как правило, к терапевтическому способу внутривенного, подкожного или внутримышечного введения композиции 1§О иммуноглобулинов пациенту для лечения ряда состояний, таких как иммунодефициты, воспалительные заболевания и аутоиммунные заболевания. 1§О иммуноглобулины обычно представляют собой смешанные и полученные из плазмы. Можно использовать целые антитела или их фрагменты. 1§О иммуноглобулины можно приготовить в более высоких концентрациях (например, больше чем 10%) для подкожного введение, или приготовить для внутримышечного введения. Это особенно характерно для специальных 1§О препаратов, которые получают с более высокими титрами, нежели средние титры для специфических антигенов (например, РНо Ω фактора, коклюшного токсина, столбнячного токсина, токсина ботулизма, бешенства и т.д.). Для простоты обсуждения такие композиции 1§О для подкожного или внутримышечного введения также включены в термин 'ТУЮ в данном описании.

Под выражениями терапевтически эффективное количество или доза или достаточное/эффективное количество или доза подразумевают такую дозу, которая вызывает эффекты, для создания которых ее и вводят. Точная величина дозы будет зависеть от цели лечения, и будет определяться специалистом с использованием известных методик (см., например, ЫеЬегтап, РНагтасен11са1 Ωοχα^ο Ротш8 (νοίδ. 1-3, 1992); Ь1оуб, ТНе Ατί, δ^ΐ'^ апб ТесНпо1оду οί РНаттасеиНса1 Сотроипбтд (1999); Рюкат, ^οδаде Са1си1аОот (1999) и РеийпдЮп: ТНе δ^η^ апб РгасНсе οί РНагтасу, 20ίΗ Ебйюп. 2003, Оеппаго, Еб., ЫрртсоН, ХУНПаиге & ХУбкиге; описания которых включены в данное описание посредством ссылки во всей полноте для всех целей).

- 4 023382

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления изобретения

В соответствии с обычной практикой в современной медицине, стерилизованные концентрированные препараты иммуноглобулинов (особенно 1дО) используют для лечения медицинских состояний, попадающих в три основных класса: иммунодефициты, воспалительные и аутоиммунные заболевания и острые инфекции. Один из обычно используемых 1§О продуктов, внутривенного иммуноглобулина или 1У1О, приготавливают для внутривенного введения, например, в 10% концентрации. Концентрированные иммуноглобулины можно также приготовить для подкожного или внутримышечного введения, например, в точной или около 20% концентрации.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции концентрированного О (1дО), включающему стадии:

(A) концентрирования первого раствора, содержащего 1дО, до концентрации белка от 2 до 10% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, где первая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с номинальным отсечением по молекулярной массе (ΝΜ^ΟΘ) 100 кДа или менее, таким образом получая первый 1§О концентрат;

(B) диафильтрации первого 1дО концентрата диафильтрационным буфером с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая первый 1§О диафильтрат;

(C) концентрирования первого 1дО диафильтрата до концентрации белка более чем 20% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая второй 1§О концентрат;

(Ό) сбора второго 1дО концентрата из первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы;

(Е) промывки первой ультрафильтрационной мембраны путем рециркуляции буфера, прошедшего промывку, через первую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, где первую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему промывают объемом буфера, прошедшего промывку, равному по меньшей мере двукратному мертвому объему первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, таким образом получая первый 1§О раствор, прошедший промывку;

(Р) переноса первого 1дО раствора, прошедшего промывку, из первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы во вторую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, содержащую вторую ультрафильтрационную мембрану, где площадь поверхности второй ультрафильтрационной мембраны меньше, чем площадь поверхности первой ультрафильтрационной мембраны, и где вторая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с номинальным отсечением по молекулярной массе (ΝΜ\νί'.Ό) 100 кДа или менее;

(О) концентрирования первого 1дО раствора, прошедшего промывку, до концентрации белка более чем 20% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием второй ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей вторую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая третий 1§О концентрат;

(Н) объединения третьего 1дО концентрата из второй ультрафильтрационной/диафильтрационной системы со вторым 1§О концентратом, таким образом получая композицию концентрированного 1дО.

Вариантом указанного способа является способ, где первый раствор, содержащий 1§О, концентрируют на стадии (А) до концентрации белка 5±1% (мас./об.).

Другим вариантом указанного способа является способ, где первая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с открытой сеткой или где первая ультрафильтрационная мембрана или вторая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с номинальным отсечением по молекулярной массе (ΝΜ\νί'.Ό) 90 кДа или менее.

Другим вариантом указанного способа является способ, где первая ультрафильтрационная мембрана и вторая ультрафильтрационная мембрана является мембранами с номинальным отсечением по молекулярной массе (ΝΜ\νί'.Ό) 90 кДа или менее.

Еще одним вариантом указанного способа является способ, где первая ультрафильтрационная мембрана и вторая ультрафильтрационная мембрана является мембранами с номинальным отсечением по одинаковой молекулярной массе (ΝΜ\νί'.Ό).

Другим вариантом указанного способа является способ, где диафильтрационный буфер содержит от 0,2 до 0,3 М глицина и имеет величину рН 4,2±0,1.

Еще одним вариантом указанного способа является способ, где второй 1§О концентрат имеет концентрацию белка по меньшей мере 22% (мас./об.).

Другим вариантом указанного способа является способ, где площадь поверхности второй ультрафильтрационной мембраны составляет не более десятой части площади поверхности первой ультрафильтрационной мембраны.

Другим вариантом указанного способа является способ, где концентрация 1§О, полученного на стадии (Н), более чем 20% (мас./об.).

- 5 023382

Вариантом указанного способа является способ, где рН композиции концентрированного 1дС. полученной на стадии (Н), составляет от 4,0 до 6,0.

Еще одним вариантом указанного способа является способ, дополнительно содержащий стадии:

(I) промывки второй ультрафильтрационной мембраны путем рециркуляции буфера, прошедшего промывку, через вторую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, таким образом получая второй 1дС раствор, прошедший промывку; и (1) регулирования концентрации белка композиции концентрированного 1дС, полученной на стадии (Н), путем добавления по крайней мере одной части второго 1дС раствора, прошедшего промывку, в композицию концентрированного 1дС, полученную на стадии (Н).

Другим вариантом указанного способа является способ, в котором 1дС представляет собой человеческий 1дС.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции концентрированного С (1дС), включающему стадии:

(A) концентрирования первого раствора, содержащего 1дС, до концентрации белка 5±1% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая первый 1дС концентрат, причем первая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с номинальным отсечением по молекулярной массе (ΝΜ\νί'.Ό) 60 кДа или менее;

(B) диафильтрации первого 1дС концентрата диафильтрационным буфером с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая первый 1дС диафильтрат, причем диафильтрационный буфер содержит глицин и имеет величину рН 4,2±0,1;

(C) концентрирования первого 1дС диафильтрата до концентрации белка более чем 20% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая второй 1дС концентрат;

(Ό) сбора второго 1дС концентрата из первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы;

(Е) промывки первой ультрафильтрационной мембраны путем рециркуляции буфера, прошедшего промывку, через первую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, таким образом получая первый 1дС раствор, прошедший промывку, причем буфер, прошедший промывку, имеет объем, равный по меньшей мере двукратному мертвому объему первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы;

(Р) сбора первого 1дС раствора, прошедшего промывку, из первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы во вторую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, содержащую вторую ультрафильтрационную мембрану, причем вторая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с номинальным отсечением по молекулярной массе (NΜVСΟ) 60 кДа или менее;

(С) концентрирования первого 1дС раствора, прошедшего промывку, до концентрации белка более чем 20% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием второй ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей вторую ультрафильтрационную мембрану, где площадь поверхности второй ультрафильтрационной мембраны составляет не более десятой части площади поверхности первой ультрафильтрационной мембраны, таким образом получая третий 1дС концентрат;

(H) объединения третьего 1дС концентрата из второй ультрафильтрационной/диафильтрационной системы со вторым 1дС концентратом, таким образом получая композицию концентрированного 1дС;

В другом аспекте настоящее изобретение относится к новому и усовершенствованному способу получения композиций иммуноглобулина с высокой степенью очистки и с высокой концентрацией из смешанной плазмы. В сравнении с использованными ранее способами очистки и концентрирования 1дС, авторы изобретения включили стадии ультрафильтрации и приготовления препарата, что обеспечило более высокие концентрации 1дС без значительных потерь 1дС и при сохранении низких значениях рН в конечной композиции. Обычно концентрация белка в таких продуктах составляет по меньшей мере 18% мас./об., огромное большинство которого (обычно не менее 95%) представляет собой 1дС, и рН находится в интервале значений рН 3-6, что облегчает инактивацию патогенов, таких как вирусы, которые могут присутствовать в плазме. Благодаря высокой концентрации 1дС и поэтому уменьшенного вводимого объема, продукты настоящего изобретения пригодны для подкожного и/или внутримышечного введения. В некоторых вариантах осуществления 1дС продукты имеют вязкость не более чем 18 мПа-с, и поэтому их также можно использовать для внутривенного введения. Благодаря возможности комбинирования

- 6 023382 качественных характеристик продуктов для внутривенного введения с требуемой высокой концентрацией для продуктов подкожного и внутримышечного введения, простое разведение также может обеспечить внутривенное введение. Дальнейшим преимуществом 1дС композиций настоящего изобретения является то, что они обладают превосходной стабильностью при хранении.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предоставляет способы получения высококонцентрированных 1дС препаратов с конечными концентрациями белка выше, чем около 17% и степенью чистоты 1дС по меньшей мере около 95%. В некоторых вариантах осуществления указанные препараты обладают продленной стабильностью и приготовлены для внутривенного, подкожного и/или внутримышечного введения.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет фармацевтические композиции и препараты 1дС композиций, созданные в соответствии с предложенным в настоящем изобретении усовершенствованным способом получения. В некоторых вариантах осуществления указанные композиции и препараты обеспечивают улучшенные свойства по сравнению с другими ГУЮ композициями, существующими на рынке в настоящее время. Например, в некоторых вариантах осуществления предоставленные в данном описании композиции и препараты являются стабильными в течение длительного промежутка времени, в другом варианте осуществления предоставленные в данном описании композиции и препараты характеризуются более высокими концентрациями 1дС по сравнению с другими 1УЮ композициями, существующими на рынке в настоящее время, еще в других вариантах осуществления предоставленные в данном описании композиции и препараты характеризуются более высокими концентрациями 1дС и являются стабильными в течение более длительного промежутка времени.

В еще одном аспекте настоящее изобретение предоставляет способ лечения иммунодефицита, воспалительных и аутоиммунных заболеваний и острых инфекций, включающий введение 1дС композиций, полученных с использованием предоставленных в настоящем изобретении способов.

I. Получение концентрированного очищенного препарата 1дС.

1УЮ композиции, включающие целые антитела, раскрыты для лечения некоторых аутоиммунных состояний (см., например, патентные публикации США 2002/0114802, США 2003/0099635 и США 2002/0098182). Раскрытые в указанных ссылках ГУЮ композиции включают поликлональные антитела.

Как правило, препараты иммуноглобулина в соответствии с настоящим изобретением можно получить из любых подходящих исходных материалов, например, из восстановленной плазмы или из источников плазмы. В конкретном примере кровь или плазму отбирают у здоровых доноров. Обычно кровь собирают из образцов тех же видов животных, что и субъект, которому должен быть введен препарат иммуноглобулина (обычно называемый гомологичными иммуноглобулинами). Такие иммуноглобулины выделяют из крови, используя соответствующие процедуры, такие как, например, осаждение (спиртовое фракционирование или полиэтиленгликольное фракционирование), хроматографические способы (ионообменная хроматография, аффинная хроматография, иммуноаффинная хроматография) ультрацентрифугирование и электрофоретическая обработка, и т.п. (см., например, СоЬи е! а1., 1. Ат. СЬет. §ос. 68:459-75 (1946); Опс1еу е! а1., 1. Ат. СЬет. §ос. 71:541-50 (1949); Вагиибеги е! а1., Уох 8аи§. 7:157-74 (1962); КоЫе! е! а1., Уох 8аи§. 13:93-102 (1967); патенты США 5122373 и 5177194; описания которых включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей).

В отличие от раскрытых выше способов в одном аспекте настоящее изобретение предоставляет способы получения концентрированных 1§О композиций, в которых используют криочистые исходные материалы. Обычно в предложенных в данном описании способах используют как модифицированные стадии СоЬп-Опс1еу спиртового фракционирования, так и ионообменную хроматографию для достижения превосходных 1дО выходов, при этом сохраняя такое же, если не улучшенное, качество, которым характеризуются доступные в настоящее время коммерческие 1У1О препараты.

Во многих случаях, иммуноглобулин получают из содержащих гаммаглобулин продуктов путем спиртового фракционирования и/или используя способы ионообменной и аффинной хроматографии, которые хорошо известны специалистам в данной области. Обычно используют очищенную фракцию Кона II. Исходная паста фракции Кона II обычно содержит точно или около 95% 1дО и включает четыре подтипа !§О. Во фракции II присутствуют различные подтипы примерно в таких же отношениях, которые существуют в собранной человеческой плазме, из которой они получены. Фракцию II далее очищают перед формированием в продукт, который можно вводить. Например, пасту фракции II можно растворить в холодном очищенном водном растворе спирта, и примеси удалить путем осаждения и фильтрования. После окончательного фильтрования суспензию иммуноглобулина можно подвергнуть диализу или диафильтрации (например, используя ультрафильтрационные мембраны с отсечением по номинальной молекулярной массе менее чем или равному 100000 Да) для удаления спирта. Полученный раствор можно концентрировать или разбавить до достижения необходимой концентрации белка и затем очистить способами, известными специалистам в данной области.

Препаративные стадии можно использовать для обогащения конкретным изотипом или подтипом иммуноглобулина.

Например, хроматографию на протеин А-, протеин О- или протеин Н-сефарозе можно использовать для обогащения иммуноглобулинов в отношении !дО или в отношении специфических !дО подтипов (см.

- 7 023382

Наг1о· и Ьапе, Шпд АпБЬоФез Со1б §рттд НагЬог ЬаЬога1огу-Рге88 (1999); Наг1о· апб Ьапе, ЛпЬЬоШсх. А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Рге88 (1988); патент США 5180810).

Как будет подробно раскрыто ниже, высококонцентрированные 1дС продукты настоящего изобретения получают способом, который содержит много таких же или похожих стадий, что и стадии способа получения 1УЮ. Дополнительные стадии ультрафильтрации/диафильтрации с использованием открытоканальных мембран, со специфически сконструированными методами последующей промывки (роз1азЬ) и составления фармацевтической композиции в конце процесса получения, обеспечивают получение 1дС композиций с концентрацией белка (200 мг/мл), что примерно в два раза выше существующих в настоящее время концентраций 1УЮ (например, САММАСАКЭ® иЦиГО) без влияния на выход и стабильность при хранении. С большинством коммерчески доступных ультрафильтрационных мембран невозможно достичь концентрации 1дС 200 мг/мл без существенных потерь белка. Указанные мембраны быстро забиваются и поэтому трудно осуществить адекватную последующую промывку. Поэтому приходится использовать конфигурации с открытоканальными мембранами. Даже с открытоканальными мембранами необходимо использовать специфически сконструированную методику последующей промывки для достижения необходимой концентрации без значительных потерь белка (потерь, менее чем 2%). Еще более удивительным является тот факт, что концентрации белка выше, чем 200 мг/мл не влияют на эффективность инактивации вирусов на стадии хранения с низкими значениями рН. Общий способ получения высококонцентрированных 1дС композиций включает следующие стадии.

A. Выделение криоосадков.

Процесс очистки обычно начинается с оттаивания ранее замороженной смешанной плазмы, которую уже проверили на безопасность и определили качественные параметры. Оттаивание обычно осуществляют при температуре не выше 6°С. Затем осуществляют центрифугирование или фильтрацию на холоде для разделения твердой части и жидкости после того, как плазма оттает, обычно при той же температуре, при которой плазму оттаивают. Жидкую часть (также называемую криосупернатантной плазмой, после удаления нерастворимого в холодном состоянии белка путем центрифугирования или фильтрования из только что оттаявшей плазмы) затем обрабатывают на следующей стадии. В это время можно осуществить различные дополнительные стадии для выделения фактора восемь, ингибитора байпас активности (РЕ1ВА), фактора ΙΧ-комплекса, фактора νίί-концентрата или антитромбинового 111комплекса, что подробно раскрыто в примере I.

B. Получение надосадочной жидкости после фракционирования ί.

На этой стадии криосупернатантную плазму обычно охлаждают до точно или около 0±1°С и рН доводят до точно или около 7,0. В некоторых вариантах осуществления рН доводят до значений от около 7,0 до около 7,5, предпочтительно от точно или около 7,1 до точно или около 7,3, наиболее предпочтительно точно или около 7,2. В одном варианте осуществления значение рН доводят до точно или около 7,0. В другом варианте осуществления значение рН доводят до точно или около 7,1. В другом варианте осуществления значение рН доводят до точно или около 7,2. В другом варианте осуществления значение рН доводят до точно или около 7,3. В другом варианте осуществления значение рН доводят до точно или около 7,4. В другом варианте осуществления значение рН доводят до точно или около 7,5. Затем добавляют предварительно охлажденный этанол, причем плазму при этом перемешивают, до достижения необходимой концентрации этанола 8% об./об. В то же время, температуру дополнительно снижают до температуры от около -4 до около 0°С, предпочтительно до около -2°С для осаждения примесей, таких как а₂-макроглобулин, в_1А- и в_С-глобулины, фибриноген и фактор VIII. Обычно процесс осаждения включает время выдерживания по меньшей мере около 1 ч, хотя можно также использовать более длительные или более короткие промежутки времени. Затем надосадочную жидкость (надосадочная жидкость I), которая в идеале обогащена ЦС, присутствующем в криосупернатантной плазме, собирают путем центрифугирования, фильтрации или другим подходящим способом.

C. Осадок со стадии фракционирования П+Ш.

Для дальнейшего увеличения содержания ЦС и степени чистоты фракционирования, надосадочную жидкость I подвергают второй стадии осаждения. Обычно рН полученного раствора доводят до значения рН от около 6,8 до около 7,2, предпочтительно точно или около 7,0. Затем при перемешивании к полученному раствору добавляют спирт, предпочтительно этанол, до достижения конечной концентрации спирта от около 20% до около 25% (об./об.). В одном варианте осуществления конечная концентрация спирта составляет точно или около 20%. В другом варианте осуществления конечная концентрация спирта составляет точно или около 21%. В другом варианте осуществления конечная концентрация спирта составляет точно или около 22%. В другом варианте осуществления конечная концентрация спирта составляет точно или около 23%. В другом варианте осуществления конечная концентрация спирта составляет точно или около 24%. В другом варианте осуществления конечная концентрация спирта составляет точно или около 25%. Жидкую часть, называемую также фракцией П+Ш, надосадочной жидкости, можно дополнительно обработать, чтобы экстрагировать фактор V. Осадок, полученный на этой стадии, обрабатывают затем на следующей стадии, причем в одном варианте осуществления стадии В и С можно также осуществлять вместе.

- 8 023382

Ό. Экстрагирование осадка после фракционирований II и III/

Для повторного суспендирования осадка фракции П+Ш используют холодный экстракционный буфер обычно в отношении 1 ч. осадка в 15 ч. экстракционного буфера. В качестве примера экстракционный буфер содержит 5 мМ одноосновного фосфата натрия и 5 мМ ацетата, значение его рН составляет точно или около 4,5±0,2 и проводимость составляет точно или около 0,7-0,9 мс/см. В одном варианте осуществления проводимость экстракционного буфера составляет точно или около 0,7 мс/см. В другом варианте осуществления проводимость экстракционного буфера составляет точно или около 0,8 мс/см. В еще одном варианте осуществления проводимость экстракционного буфера составляет точно или около 0,9 мс/см. Экстракционный процесс осуществляют при температуре точно или около 2-8°С.

Можно использовать и другие подходящие отношения при повторном суспендировании, например от около 1:8 до около 1:30, или от около 1:10 до около 1:20, или от около 1:12 до около 1:18, или от около 1:13 до около 1:17, или от около 1:14 до около 1:16. В некоторых вариантах осуществления отношения при повторном суспендировании могут составлять точно или около 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30 или выше.

Подходящие растворы для экстрагирования осадка П+Ш обычно имеют рН от около 4,0 до около 5,5. В некоторых вариантах осуществления полученный раствор имеет рН от около 4,0 до около 5,0. В другом варианте осуществления полученный раствор имеет рН от около 4,5 до около 5,0. В других вариантах осуществления экстракционный раствор имеет рН около 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 или 5,5. В одном варианте осуществления рН экстракционного буфера имеет значение точно или около 4,5. В другом варианте осуществления рН экстракционного буфера имеет значение точно или около 4,6. В другом варианте осуществления рН экстракционного буфера имеет значение точно или около 4,7. В другом варианте осуществления рН экстракционного буфера имеет значение точно или около 4,8. В другом варианте осуществления рН экстракционного буфера имеет значение точно или около 4,9. В другом варианте осуществления рН экстракционного буфера имеет значение точно или около 5,0.

Проводимость экстракционного буфера предпочтительно составляет от около 0,5 мс-см^-1 до около 2,0 мс-см^-1. Например, в некоторых вариантах осуществления проводимость экстракционного буфера составляет точно или около 0,5 мс-см^-1, или точно или около 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, или около 2,0 мс-см^-1. Специалистам в данной области известно, как получить экстракционные буферы с соответствующей проводимостью.

Е. Обработка высокодисперсным диоксидом кремния и фильтрование.

В некоторых вариантах осуществления к суспензии с последней стадии добавляют высокодисперсный диоксид кремния (например, АегоШ 380 или эквивалент) до концентрации точно или около 40 г/кг в суспензии, или эквивалентно 1,8 г/л криосупернатантной плазмы. Перемешивание продолжают при температуре около 2-8°С в течение по меньшей мере 50-70 мин, в некоторых случаях добавляют вспомогательное фильтрующее вещество (например, НуПо-8иррет-Се1 от \УогЮ Мшегак, которое используют в концентрации точно или около 0,5 кг/кг суспензии) для облегчения последующей стадии разделения жидкость/твердая часть путем фильтрования. Экстракционный буфер используют для последующей промывки фильтровального пресса. Процесс фильтрования осуществляют при температуре от около 2 до 8°С.

Р. Фракционирование осадка О.

Фильтрат, полученный на последней стадии, затем смешивают с полисорбатом-80 до концентрации точно или около 0,2% мас./об. при перемешивании в течение по меньшей мере 30 мин при температуре от около 2 до 8°С. Затем к полученному раствору примешивают дегидрат цитрата натрия точно или около 8 г/л в течение еще 30 мин перемешивания при температуре от около 2 до 8°С. Затем рН полученного раствора доводят до точно или около 7,0±0,1. В некоторых вариантах осуществления величину рН регулируют с помощью или гидроксида натрия, или уксусной кислоты. Затем к полученному раствору добавляют холодный спирт до концентрации точно или около 25% об./об. и осуществляют стадию осаждения аналогичную стадии II по Кону.

О. Суспензия осадка О.

Осадок, полученный на последней стадии, растворяют и фильтруют, используя пористый фильтр с номинальным размером пор 0,2 мкм (например, Сипо УР.06 фильтр или эквивалент) перед получением прозрачного фильтрата. В другом варианте осуществления полученный осадок растворяют и затем центрифугируют для выделения осветленной надосадочной жидкости.

Н. Обработка растворителем и детергентом.

Фильтрат, полученный на последней стадии, используют для обработки растворителем/детергентом. Конкретная смесь для обработки растворителем/детергентом включает 1,0% (об./об.) Ττίΐοη Х-100, 0,3% (об./об.) Т\уееп-80 и 0,3% (об./об.) ΤΝΒΡ, и такую смесь обычно выдерживают при температуре от около 18 до 25°С в течение по меньшей мере 60 мин. Способы детергентной обработки полученных из плазмы фракций хорошо известны специалистам в данной области. В предложенных в данном описании способах обычно можно использовать любую стандартную обработку неионным де- 9 023382 тергентом.

I. Катионообменная хроматография.

Для дальнейшей очистки и концентрирования 1§С из δ/ϋ обработанного ΡρΐΟ фильтрата можно использовать катионообменную и/или анионообменную хроматографию. Способы очистки и концентрирования 1§С с использованием ионообменной хроматографии хорошо известны специалистам в данной области. Например, в патенте США 5886154 раскрыт способ, в котором осадок фракции ΙΙ+ΙΙΙ экстрагируют при низком рН (от около 3,8 и 4,5), с последующим осаждением Ι§0 с использованием каприловой кислоты, и в конце с использованием двух стадий анионообменной хроматографии. В патенте США 6069236 раскрыта схема хроматографической очистки Ι§0, которая вообще не имеет отношения к осаждению спиртом. В РСТ публикации νθ 2005/073252 раскрыт способ очистки Ι§Ο, включающий экстрагирование осадка фракции ΙΙ+ΙΙΙ, обработку каприловой кислотой, обработку ΡΕΟ и одну стадию анионообменной хроматографии. В патенте США 7186410 раскрыт способ очистки Ι§Ο, включающий экстрагирование осадка или фракции Ι+ΙΙ+ΙΙΙ или осадка фракции ΙΙ с последующей одной стадией анионообмена, осуществляемой при щелочных значениях рН. В патенте США 7553938 раскрыт способ, включающий экстрагирование или осадка фракции Ι+ΙΙ+ΙΙΙ или осадка фракции ΙΙ+ΙΙΙ, обработку каприлатом и или одну, или две стадии анионообменной хроматографии. В патенте США 6093324 раскрыт способ очистки, включающий использование анионообменной смолы при рН от около 6,0 до около 6,6. В патенте США 6835379 раскрыт способ очистки, основанный на катионообменной хроматографии в отсутствии спиртового фракционирования.

В одном варианте осуществления раствор растворитель/детергент, содержащий полученный на последней стадии белок, затем пропускают через катионообменную колонну для удаления растворителя и детергента. После отмывки δΌ реагентов, абсорбированные белки затем элюируют, используя элюирующий буфер с высоким рН. В одном варианте осуществления рН элюирующего буфера составляет от около 7,5 до около 9,5. В другом варианте осуществления рН элюирующего буфера составляет от около 8,0 до около 9,0. В предпочтительном варианте осуществления рН элюирующего буфера составляет точно или около 8,5±0,1.

1. Анионообменная хроматография.

рН элюата, полученного на последней стадии, доводят до 6 и разводят до соответствующего значения проводимости для последующей уравновешенной анионообменной колонны. Поступающий из колонны элюат во время загрузки и промывки собирают для дальнейшей обработки.

К. Нанофильтрация.

Для дополнительного снижения содержания вирусов в предлагаемой изобретением Ι§Ο композиции, элюат, полученный из анионообменной колонны можно подвергнуть нанофильтрации, с помощью соответствующего нанофильтрационного устройства. В некоторых вариантах осуществления средний размер пор нанофильтрационного устройства составляет величину от около 15 до около 200 нм. Примеры нанофильтров, которые можно использовать для этой цели, включают, но без ограничений, Όνο, Όν 50, Όν 20 (Ра11), νίτθδοίνθ ΝΕΡ, νίτθδοίνθ ΝΡΚ (МПйроте), Р1аиоуа 15Ν, 20Ν, 35Ν и 75Ν (Р1аиоуа). В конкретном варианте осуществления средний размер пор нанофильтра составляет величину от около 15 до около 72 нм, или от около 19 до около 35 нм, или точно или около 15, 19, 35 или 72 нм. В предпочтительном варианте осуществления средний размер пор нанофильтра составляет точно или около 35 нм, как в фильтре АкаЫ ΡΕΑΝΟνΑ 35Ν или его эквивалентах.

Ь. Ультрафильтрация и диафильтрация.

После нанофильтрации полученный фильтрат затем концентрируют до достижения концентрации белка 5±1% мас./об. с помощью ультрафильтрации. В некоторых примерах ультрафильтрацию в кассете с открытоканальным экраном, и отсечкой по номинальной молекулярной массе (ΝΜ\νί'Ό) ультрафильтрационной мембраны 50 кДа или менее.

В одном варианте осуществления нанофильтрат можно концентрировать с помощью ультрафильтрации до концентрации белка от около 2 до около 10% (мас./об.). В некоторых вариантах осуществления ультрафильтрацию осуществляют в кассете с открытоканальным экраном и отсечкой по номинальной молекулярной массе (NМVСΟ) ультрафильтрационной мембраны менее чем около 100 кДа, или менее чем около 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или меньше кДа. В предпочтительном варианте осуществления NМVСΟ ультрафильтрационной мембраны составляет не более чем 50 кДа.

После завершения стадии ультрафильтрации полученный концентрат можно затем концентрировать, используя диафильтрацию против раствора, пригодного для внутривенного или внутримышечного введения. В некоторых вариантах осуществления диафильтрационный раствор может включать стабилизатор и/или буферный агент. В предпочтительном варианте осуществления стабилизирующим и/или буферным агентом является агент глицин в соответствующей концентрации, например, от около 0,20 М до около 0,30 М, или от около 0,22 М до около 0,28 М, или от около 0,24 М до около 0,26 мМ, или в концентрации точно или около 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0. В предпочтительном варианте осуществления диафильтрационный буфер содержит точно или около 0,25 М глицина.

В предпочтительном варианте осуществления после завершения стадии ультрафильтрации полу- 10 023382 ченный концентрат подвергают диафильтрации против 0,25 М глицинового раствора с низким рН. Обычно минимальный обменный объем в 6 раз больше исходного объема концентрата, и полученный раствор концентрируют до концентрации белка более чем 20% мас./об. В конце процессов диафильтрации и концентрирования значение рН полученного раствора обычно составляет величину от 4,4 и 4,9.

Обычно минимальный обменный объем по меньшей мере примерно в 3 раза выше исходного объема концентрата или по меньшей мере в около 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более раз больше исходного объема концентрата. Полученный 1§О раствор можно сконцентрировать до конечной концентрации белка от около 5 до около 22% (мас./об.), или от около 10 до около 22% (мас./об.), или от около 15 до около 22% (мас./об.), или от около 18 до около 22% (мас./об.), или от около 20 до около 22%, или до конечной концентрации точно или около 5, или 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22% или выше. В предпочтительном варианте осуществления 1§О раствор концентрируют до конечной концентрации белка точно или около от 20 и 22%. Обычно в конце процесса концентрирования рН полученного раствора составляет величину от около 4,6 и 5,1.

M. Составление лекарственной формы.

После завершения стадии диафильтрации концентрацию белка в полученном растворе доводят, используя диафильтрационный буфер, до конечной концентрации от около 5 до около 20% (мас./об.), или от около 10 до около 20% (мас./об.), или от около 15 до около 20% (мас./об.), или от около 18 до около 20% (мас./об.), или до конечной концентрации около 5, или 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20%. В предпочтительном варианте осуществления конечная концентрация белка в полученном растворе составляет величину точно или около от 19% до 21%. В предпочтительном варианте осуществления после завершения диафильтрации концентрацию белка полученного раствора доводят до величины немного большей, чем 20% мас./об., например точно или около 20,4±04% мас./об., используя диафильтрационный буфер.

N. Дополнительная стерилизация.

Полученный объемный раствор лекарственной формы затем стерилизуют, сначала фильтруя через мембранный фильтр с абсолютным размером пор 0,2 мкм или менее. Затем полученный раствор в асептических условиях распределяют в конечные контейнеры для соответствующей герметизации, при этом отбирают образцы для тестирования. Конечной стадией является стадия хранения герметизированных контейнеров при температуре от 30 до 32°С в течение длительного промежутка времени, например 21-22 дня.

II. Концентрированные 1§О композиции.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к водной 1§О композиции, полученной представленным выше способом. Обычно 1§О композиции, полученные раскрытыми в данном описании новыми способами, отличаются высоким содержанием 1§О и высокой степенью чистоты. Например, предложенные изобретением 1§О композиции могут иметь концентрацию белка по меньшей мере около 15% (мас./об.), причем содержащийся 1§О имеет степень чистоты больше чем 90%. Указанные 1§О композиции столь высокой степени чистоты пригодны для терапевтического введения, например для подкожного и/или внутримышечного введения. В одном варианте осуществления предложенные изобретением 1§О композиции пригодны для внутривенного введения, например путем разведения перед введением. В одном варианте осуществления концентрация 1§О составляет точно или около 20% и ее используют для подкожного или внутримышечного введения.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет водную 1§О композицию, полученную способом, включающим стадии:

(2) смешивания предварительно охлажденного этанола с жидкостью со стадии (1) до получения смеси, в которой концентрация этанола составляет точно или около 8% (об./об.);

(4) доведения величины рН и концентрация этанола в жидкости, полученной на стадии (3), до точно или около 7,0 и 20-25% (об./об.) соответственно, тем самым формируя смесь;

(5) выделения жидкости и осадка из смеси со стадии (4) путем центрифугирования;

(6) повторного суспендирования осадка со стадии (5) в буфере при отношении около 1:15 по массе до получения суспензии;

(9) растворения осадка в водном растворе, включающем растворитель или детергент, и выдерживания полученного раствора в течение по меньшей мере 60 мин;

(10) пропускания полученного раствора со стадии (9) через катионную хроматографическую колонну и элюирования белков, абсорбированных на колонке, в элюат;

(11) пропускания элюата, полученного на стадии (10), через анионообменную хроматографическую

- 11 023382 колонку для получения элюата;

(12) пропускания полученного элюата через нанофильтр до получения нанофильтрата;

(13) пропускания нанофильтрата через ультрафильтрационную мембрану до получения ультрафильтрата;

(14) диафильтрации ультрафильтрата против диафильтрационного буфера до получения раствора с концентрацией белка точно или около 20% (мас./об.); и (15) стерилизации раствора, полученного на стадии (14), путем фильтрования полученного раствора через фильтр 0,2 мкм или менее, с получением, таким образом, композиции концентрированного 1дС.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет водные 1дС композиции, с концентрацией белка от около 150 до около 250 г/л. В некоторых вариантах осуществления концентрация белка в 1дС композиции составляет величину от около 175 до около 225 г/л, или от около 200 до около 225 г/л, или имеет любую подходящую концентрацию в указанных интервалах, например точно или около 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250 г/л или выше. В предпочтительном варианте осуществления водная 1дС композиция имеет концентрацию белка точно или около 200 г/л. В наиболее предпочтительном варианте осуществления концентрация белка водной 1дС композиции составляет точно или около 204 г/л.

Предложенные изобретением способы позволяют получать 1дС композиции с очень высокой степенью чистоты. Например, в одном варианте осуществления по меньшей мере около 95% всего содержания белка в предложенной изобретением композиции составляет 1дС. В других вариантах осуществления по меньшей мере около 96% белка представляет собой 1дС. или по меньшей мере около 97, 98, 99, 99,5 или более всего белка указанной композиции представляет собой 1дС.

Аналогично, предложенные в настоящем изобретении способы позволяют получать 1дС композиции, с крайне низкими уровнями содержания загрязняющих агентов. Например, в некоторых вариантах осуществления предложены 1дС композиции, содержащие менее чем около 100 мг/л 1дА. В других вариантах осуществления 1дС композиции содержат менее чем около 50 мг/л 1дА, предпочтительно менее чем около 35 мг/л 1дА, наиболее предпочтительно менее чем около 20 мг/л 1дА.

III. Фармацевтические композиции.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет фармацевтические композиции и лекарственные формы, содержащие очищенный 1§С, полученный предложенными настоящим изобретением способами. Как правило, содержащие 1дС фармацевтические композиции и лекарственные формы, полученные раскрытыми в данном описании новыми способами, отличаются высоким содержанием 1дС и высокой степенью чистоты. Например, предложенные в настоящем изобретении 1дС фармацевтические композиции и лекарственные формы могут иметь концентрацию белка по меньшей мере около 15% (мас./об.) и степень чистоты содержащегося 1дС больше чем 90%. 1дС композиции столь высокой степени чистоты пригодны для терапевтического введения, например для подкожного и/или внутримышечного введения, в одном варианте осуществления, предложенные в настоящем изобретении 1дС композиции пригодны для внутривенного введения, например, используя разведение перед введением. В одном варианте осуществления концентрация 1дС соответствует точно или около 20%, и ее используют для подкожного или внутримышечного введения.

В одном варианте осуществления предложенные в настоящем изобретении фармацевтические композиции получают, создавая водные 1дС композиции, используя предложенный в настоящем изобретении способ. Как правило, лекарственную композицию подвергают по меньшей мере одной, предпочтительно по меньшей мере двум, наиболее предпочтительно по меньшей мере трем стадиям инактивации и удаления вирусов. Неограничивающие примеры стадий инактивации и удаления вирусов, которые можно осуществить, используя предложенные в настоящем изобретении способы, включают обработку растворителем детергентом (Ηογο\υΠζ е! а1., В1ооб Соади1 ИЬгто1у818 1994 (5 8ирр1 3):821-828 и Кгей е! а1., Тгаик&кюи 2003 (43):1023-1028, обе из которых включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей), нанофильтрацию (Натато!о е! а1., Уох 8аид 1989 (56)230-236 и Уиака е! а1., 1 Сей У1го1. 1991 (72 (р! 8)):2021-2024, обе из которых включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей), и инкубирование при низких значениях рН при высоких температурах (КетрГ е! а1., ТгапкГикюи 1991 (31)423-427 и Ьоше е! а1., Вю1одюа1к 1994 (22):13-19).

В некоторых вариантах осуществления предложены фармацевтические лекарственные формы с содержанием 1дС от около 175 до около 225 г/л 1дС. Как правило, указанные 1У1С лекарственные формы получают путем выделения 1дС композиции из плазмы, используя раскрытый в настоящем изобретении способ, концентрируя полученную композицию и получая лекарственную форму концентрированной композиции в растворе, пригодном для внутривенного введения. Такие 1дС композиции можно сконцентрировать, используя любой подходящий способ, известный специалистам в данной области. В одном варианте осуществления указанную композицию концентрируют путем ультрафильтрации/диафильтрации. В некоторых вариантах осуществления в ультрафильтрационном устройстве, которое используют для концентрирования указанной композиции, используют ультрафильтрационную мембрану с отсечением по номинальной молекулярной массе (ΝΜ\νί'.Ό) менее чем около 100 кДа или менее чем около 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или меньше кДа. В предпочтительном варианте осуществления

- 12 023382

ΝΜ\νί'.Ό ультрафильтрационной мембраны составляет не более чем 50 кДа. Замену буфера можно осуществить, используя любую подходящую методику, известную специалистам в данной области. В конкретном варианте осуществления замену буфера осуществляют путем диафильтрации.

В конкретном варианте осуществления предложена фармацевтическая композиция 1дС. где 1§С композицию выделяют из плазмы, используя способ, включающий стадии:

(4) доведения рН и концентрации этанола в жидкости со стадии (3) до точно или около 7,0 и 20-25% (об./об.), соответственно получая в результате смесь;

(6) повторного суспендирования осадка со стадии (5) в буфере при отношении от около 1 до 15 по массе до получения суспензии;

(7) перемешивания диоксида кремния (δίθ₂) с суспензией со стадии (6) и получения фильтрата путем фильтрования;

(10) пропускания полученного раствора после стадии (9) через катионообменную хроматографическую колонну и злюирования белков, абсорбированных на колонне, в элюат;

(11) пропускания элюата, полученного на стадии (10), через анионообменную хроматографическую колонну до получения элюата;

(12) пропускания элюата через нанофильтр до получения нанофильтрата;

(14) осуществления диафильтрации ультрафильтрата против диафильтрационного буфера до получения раствора с концентрацией белка около 20% (мас./об.); и (15) стерилизации раствора, полученного на стадии (14), путем фильтрования полученного раствора через фильтр 0,2 мкм или менее, с получением, таким образом, композиции концентрированного 1§С.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет фармацевтические 1§С композиции, с концентрацией белка от около 150 до около 250 г/л. В некоторых вариантах осуществления концентрация белка в 1§С композиции составляет величину от около 175 до около 225 г/л, или от около 200 до около 225 г/л, или любую подходящую концентрацию в указанных интервалах, например точно или около 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250 г/л или выше. В предпочтительном варианте осуществления водная 1§С композиция включает концентрацию белка точно или около 200 г/л. В особенно предпочтительном варианте осуществления указанная водная 1§С композиция включает концентрацию белка точно или около 204 г/л.

Предложенные в настоящем изобретении способы позволяют получать 1§С фармацевтические композиции очень высокой степени чистоты. Например, в одном варианте осуществления по меньшей мере около 95% полного содержания белка в предложенных в настоящем изобретении композициях составляет 1§С. В других вариантах осуществления по меньшей мере около 96% белка составляет 1§С, или по меньшей мере около 97, 98, 99, 99,5% или более от полного содержания белка в указанных композициях составляет 1§С.

Аналогично, предложенные в настоящем изобретении способы обеспечивают возможность получения фармацевтических композиций 1§С, которые содержат крайне низкие уровни содержания загрязняющих агентов. Например, в некоторых вариантах осуществления предложены 1§С композиции, которые содержат менее чем около 100 мг/л 1дА. В других вариантах осуществления 1§С композиции содержат менее чем около 50 мг/л 1дА, предпочтительно менее чем около 35 мг/л 1дА, наиболее предпочтительно менее чем около 20 мг/л 1дА.

Предложенные в настоящем изобретении фармацевтические композиции обычно содержат один или более буферных агентов или стабилизирующих рН агентов, пригодных для внутривенного введения. Неограничивающие примеры буферных агентов, пригодных для создания предложенных в настоящем изобретении 1§С композиций, включают глицин, цитрат, фосфат, ацетат, глутамат, тартрат, бензоат, лактат, гистидин или другие аминокислоты, глюконат, малат, сукцинат, формиат, пропионат, карбонат или любые их комбинации с соответствующим значением рН. Как правило, буферного агента достаточно для поддержания соответствующего значения рН в композиции в течение длительного промежутка времени. В предпочтительном варианте осуществления буферным агентом является глицин.

В некоторых вариантах осуществления концентрация буферного агента в указанной композиции составляет от около 100 до около 400 мМ, предпочтительно от около 150 до около 350 мМ, более предпочтительно от около 150 до около 300 мМ, наиболее предпочтительно от около 175 до около 225 мМ. В

- 13 023382 наиболее предпочтительном варианте осуществления концентрированная композиция 1§О содержит от около 150 до около 250 мМ глицина, наиболее предпочтительно около 200 мМ глицина. В другом предпочтительном варианте осуществления концентрированная композиция 1§О содержит точно или около 250 мМ глицина.

В некоторых вариантах осуществления рН композиции составляет величину от около 4,1 до около 5,6, предпочтительно от около 4,4 до около 5,3, наиболее предпочтительно от около 4,6 до около 5,1. В особенно предпочтительных вариантах осуществления рН композиции может составлять около 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5 или 5,6.

В некоторых вариантах осуществления предложенные в настоящем изобретении фармацевтические композиции могут необязательно дополнительно включать агент для регулирования осмолярности указанной композиции. Неограничивающие примеры регулирующих осмолярность агентов включают маннит, сорбит, глицерин, сахарозу, глюкозу, декстрозу, левулозу, фруктозу, лактозу, полиэтиленгликоли, фосфаты, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, глюконоглюкогептонат кальция, диметилсульфон и т.п.

Обычно предложенные в настоящем изобретении лекарственные формы характеризуются такими значениями осмолярности, которые сравнимы с физиологическими значениями осмолярности около 285295 ммоль/кг (Ьасу с1 а1., Бтид ΙηΙοπηαΙίοη НапбЬоок - Ьех1-Сотр 1999: 1254). В некоторых вариантах осуществления осмолярность композиции составляет от около 200 до около 350 ммоль/кг, предпочтительно от около 240 до около 300 ммоль/кг. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления осмолярность композиции составляет около 200, или 210, 220, 230, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 310, 320, 330, 340, 340 или 350 ммоль/кг.

Предложенные в настоящем изобретении лекарственные формы 1§О обычно стабильны в жидкой форме в течение длительного промежутка времени. В некоторых вариантах осуществления лекарственные формы являются стабильными в течение по меньшей мере около 3 месяцев при комнатной температуре или по меньшей мере в течение около 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 месяцев при комнатной температуре. Указанные композиции также обычно стабильны в течение по меньшей мере около 18 месяцев при хранении в холодильнике (обычно от около 2 до около 8°С) или в течение по меньшей мере около 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42 или 45 месяцев при хранении в холодильнике.

IV. Введение препаратов 1дО.

В соответствии с общепринятой в современной медицине практикой стерилизованные препараты концентрированных иммуноглобулинов (особенно ΐ§θ) используют для лечения медицинских состояний, которые попадают в указанные три основных класса: иммунодефициты, воспалительные и аутоиммунные заболевания и острые инфекции. Указанные препараты 1§О можно также использовать при лечении рассеянного склероза (особенно рецидивирующего-ремиттирующего рассеянного склероза или РКМБ), болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона. Очищенные препараты 1§О настоящего изобретения пригодны для использования в указанных целях так же, как для других клинически приемлемых применений препаратов 1§О.

РБА разрешил использование ΐνίΟ для лечения при различных показаниях, включая трансплантацию аллогенного костного мозга, хронический лимфоцитарный лейкоз, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ΐΤΡ), педиатрический Ηΐν, первичный иммунодефицит, болезнь Кавасаки, хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию (С1БР) и при трансплантации почек у реципиентов с высоким содержанием антител, или в случае донора с несовместимой группой крови. В некоторых вариантах осуществления предложенные в настоящем изобретении ΐνΐθ композиции можно использовать для лечения или стабилизации указанных заболеваний и состояний.

Более того, применения вне зарегистрированных показаний для ΐνΐθ обычно предложены для лечения или стабилизации различных показаний, например синдрома хронической усталости, псевдомембранозного колита, вызванного С. б|ГПс1е. дерматомиозита и полимиозита, офтальмопатии Грейвса, синдрома Жулиан-Барра, мышечной дистрофии, миозита с включенными тельцами, синдрома ЛамбертИтона, красной волчанки, многофокальной моторной нейропатии, рассеянного склероза (МБ), тяжелой миастении, неонатальной аллоиммунной тромбоцитопении, инфекции парвовируса В 19, обыкновенной пузырчатки, посттрансфузионной пурпуры, отторжения почечных трансплантатов, при спонтанных абортах/преждевременных родах, синдрома мышечной скованности, опсоклонус-миоклонуса, тяжелого сепсиса и септического шока при критических состояниях взрослых пациентов, токсического эпидермального некроза, хронического лимфоцитарного лейкоза, множественной миеломы, Х-связанной гаммаглобулинемии и гипогаммаглобулинемии. В некоторых вариантах осуществления предложенные в настоящем изобретении ΐνΐθ композиции можно использовать для лечения или стабилизации указанных заболеваний и состояний.

И, наконец, было предложено экспериментальное использование ΐνΐθ для лечения или стабилизации заболеваний, включая первичный иммунодефицит, ККМБ, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона (и.Б. Ра1еп1 АррЬсабоп РиЬбсабоп Νο. и.Б. 2009/0148463, которые включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей). В некоторых вариантах осуществления пред- 14 023382 ложенные в настоящем изобретении 1УЮ композиции можно использовать для лечения или стабилизации первичного иммунодефицита, ККМ8, болезни Альцгеймера или болезни Паркинсона. В некоторых вариантах осуществления, включающих ежедневное введение, эффективное вводимое пациенту количество должен определить лечащий врач, с учетом индивидуальных особенностей, таких как возраст, масса, тяжесть заболевания, способ введения (например, внутривенное или подкожное) и реакции на лечение. В некоторых вариантах осуществления препарат иммуноглобулина настоящего изобретения можно вводить пациенту в количестве от около 5 до около 2000 мг/кг ежедневно. В дополнительных вариантах осуществления препарат иммуноглобулина можно вводить в количествах по меньшей мере около 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 50 мг/кг. В дополнительных вариантах осуществления препараты иммуноглобулина можно вводить пациенту в дозах вплоть до около 100, до около 150, до около 200, до около 250, до около 300, до около 400 ежедневно. В других вариантах осуществления дозы препаратов иммуноглобулина могут быть больше или меньше. Далее препараты иммуноглобулинов можно вводить в виде одной или нескольких доз в день. Клиницисты, знакомые с заболеваниями, которые лечат препаратами 1§С, могут определить соответствующие дозы для конкретного пациента в соответствии с критериями, известными специалистам в данной области.

Один из обычно используемых 1§С продуктов, иммуноглобулин для внутривенного введения или 1УЮ, приготавливают в форме для внутривенного введения. Благодаря тому, что 1§С препарат настоящего изобретения обеспечивает исключительно высокую концентрацию иммуноглобулина (20% мас./об. или выше), что существенно уменьшает объем терапевтически эффективной дозы, указанные композиции настоящего изобретения особенно благоприятны для подкожного и/или внутримышечного введения пациенту, хотя даже внутривенное введение остается вариантом выбора способа введения.

Термин эффективное количество относится к такому количеству иммуноглобулинового, особенно 1дС. препарата, которое обеспечивает улучшение или реабилитацию болезненного состояния подлежащего лечению пациента (например, первичного иммунодефицита, ККМ8, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и т.д.). Эффективное количество, которое следует вводить пациенту, может определить врач с учетом индивидуальных различий в возрасте, массе, тяжести заболевания, способа введения (например, внутривенного или подкожного) и реакции на указанное лечение. В некоторых вариантах осуществления препарат иммуноглобулина настоящего изобретения можно вводить пациенту в количестве от около 5 до около 2000 мг/кг ежедневно. В дополнительных вариантах осуществления указанный препарат иммуноглобулина можно вводить в количествах по меньшей мере около 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 50 мг/кг. В дополнительных вариантах осуществления препарат иммуноглобулина можно вводить пациенту в дозах вплоть до около 100, до около 150, до около 200, до около 250, до около 300, до около 400 мг/кг ежедневно. В других вариантах осуществления дозы препарата иммуноглобулина могут быть больше или меньше. Далее препараты иммуноглобулина можно вводить как одну или несколько доз в день. Клиницисты, знакомые с заболеваниями, которые лечат препаратами 1§С, могут определить соответствующую дозу для пациента в соответствии с критериями, известными специалистам в данной области.

В некоторых вариантах осуществления концентрированный 1§С препарат можно вводить пациенту в дозе от около 5 до около 2000 мг/кг за введение. В некоторых вариантах осуществления указанная доза может быть по меньшей мере около 5, или по меньшей мере около 10, или по меньшей мере около 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или по меньшей мере около 2000 мг/кг.

В соответствии с настоящим изобретением продолжительность курса лечения может определить врач, и она может составлять один день или длиться более месяца. В некоторых вариантах осуществления курс лечения может длиться от 1 до 6 месяцев.

Величина дозы и частота введения концентрированного 1§С зависит, наряду с другими, от таких факторов, как подлежащее лечению заболевание или состояние и тяжесть заболевания или состояние пациента. Обычно для первичной иммунной дисфункции дозу от около 100 до около 400 мг/кг массы тела вводят примерно каждые 3-4 недели. При неврологических и аутоиммунных заболеваниях дозу вплоть до 2 г/кг массы тела применяют в течение трех-шести месяцев, как пятидневный курс один раз в месяц. Такой курс обычно дополняют поддерживающей терапией, включающей введение от около 100 и до около 400 мг/кг массы тела примерно один раз каждые 3-4 недели. Обычно пациенту вводят дозу или осуществляют лечение примерно один раз каждые 14-35 дней или примерно каждые 21-28 дней. Частота лечения будет зависеть, наряду с другими факторами, от заболевания или состояния, подлежащего лечению, и тяжести заболевания или состояния пациента.

В предпочтительном варианте осуществления предложен способ лечения иммунодефицита, аутоиммунного заболевания или острой инфекции у нуждающегося в этом человека, причем указанный способ включает введение фармацевтической 1§С композиции настоящего изобретения.

- 15 023382

Примеры

Представленные далее примеры приведены только с целью иллюстрации и, никоим образом, не ограничения изобретения. Специалисты в данной области легко узнают различные некритические параметры, которые можно изменить или модифицировать, получая практически такие же или аналогичные результаты.

Пример 1. Исследование стабильности различных 1§С концентраций и лекарственных форм.

1. Цель.

Целью настоящего исследования является сравнение стабильности при хранении композиций с низким значением рН (0,25 М глицин, рН 4,4-4,9 при измерении в концентрированном растворе) и с высокой концентрацией белка с композицией с нейтральным рН (22,5 г/л глицина, 3 г/л ЫаС1 рН 7), которую в настоящее время используют для внутримышечно и подкожно вводимых препаратов иммуноглобулинов.

2. Схема эксперимента.

Все исследования начинают, используя концентрации нанофильтрата до 5% белка. Осуществляют десятикратный обмен буфера против 0,15 М глицина (самая низкая исследованная концентрация глицина), с последующей конечной концентрацией до нужного значения, выше 20% белка. Если во время первой серии экспериментов используют 0,5 м² полиэфирную МПйроге мембрану с отсечением по молекулярной массе 30К (нормальный фильтр), то вторую серию экспериментов осуществляют, используя 0,5 м² полиэфирсульфоновую МПйроге мембрану с открытым фильтром, которая больше пригодна для растворов с более высокой вязкостью, и фракции после промывки концентрируют, используя второе ультрафильтрационное/диафильтрационное устройство с мембраной с меньшей поверхностью (0,1 м², открытый фильтр) для того, чтобы уменьшить потери выхода.

Конечные контейнеры или подготавливают и хранят при низких значениях рН, или осуществляют хранение при низких значениях рН в объеме, после чего их доводят до нейтральных значений рН перед хранением.

Таблица 1

Общий обзор стадий ультрафильтрации/диафильтрации (30К полиэфирсульфоновые мембраны) и рН в конечном контейнере

Ультрафильтрационное	Стандартная	Стандартная	Открытая	Открытая
устройство 0,5 м²	сетка	сетка	сетка	сетка
Ультрафильтрационное	нет	нет	Открытая	Открытая
устройство 0,1 м²	сетка	сетка
рН. в конечном контейнере	4,7	7	4,7	7

3. Способы тестирования.

рН: рН измеряют, используя Ктск Ройатекк 1уре 911 ХРН, снабженный электродом Мей1ег То1ейо. Лот 405-ЭРА-8С-88/120 и РТ 1000 температурным зондом.

Белок: концентрации белка определяют, используя Вшгей

Распределение по размерам молекул исследуют, используя высокоэффективную хроматографию с исключением по размерам.

АСА титры определяют в соответствии с рекомендациями Европейской Фармакопеи.

4. Принятые критерии.

Установлены следующие критерии: распределение по размеру молекул с помощью ВЭЖХ: мономеры и олигомеры/димеры: >90%. Агрегаты: <10% (<% для ВВ введения).

АСА титр: расход менее чем 50% СН50 единиц/мг белка для ВВ введения.

5. Результаты и обсуждение.

5.1. Сравнение содержания агрегатов и фрагментов и АСА титров для препаратов, приготовленных при низких значениях рН (4,7 и при рН 7,0).

В следующей табл. 2 представлено содержание агрегатов и фрагментов так же, как значение АСА титра после 3 месяцев хранения при 28-30°С для стандартных лекарственных форм (рН 4,7, 0,25 М глицин; или рН 7,0, 22,5 г/л глицина, 3 г/л ИаС1) при различных концентрациях белка.

Таблица 2

Содержание фрагментов, агрегатов и значение АСА титров после 3 месяцев хранения при температуре 28-30°С при низких значениях рН и при рН 7,0 для различных концентраций белка

	Фрагменты %	Агрегаты %	АСА титры %
Белок	рН 4,7	рН 7,0	рН 4,7	рН 7, 0	рН 4,7	рН 7, 0
14%	1,35	1,50	0,10	0,92	44,1	52,0
16%	1,24	1,38	0,08	0,91	40,5	53,1
18%	1,24	1,60	0,11	0,93	40,3	52,4
20%	1,35	1,52	0,12	0,93	37,5	62,7

- 16 023382

Представленные результаты четко показывают, что композиции с низким рН содержат меньше агрегатов и имеют более низкие значения АСА титров после 3 месяцев хранения при температуре 28-30°С. ЛИ АСА титры лекарственных форм с рН 7 находятся выше критериев приемлемости, установленных для указанного теста. В табл. 2 приведены значения после 3 месяцев хранения при температуре 2-8°С.

Таблица 3

Содержание фрагментов, агрегатов и значения АСА титров после 3 месяцев хранения при температуре 2-8°С при низких значениях рН и при рН 7,0 для различных концентраций белка

	Фрагменты %	Агрегаты %	АСА титры
Белок	рН 4,7	рН 7,0	рН 4,7	рН 7,0	рН 4,7	рН 7,0
14%	0,36	1,80	0,16	1,09	38,3	46,5
16%	0,30	0,51	0,11	1,01	37,4	44,7
13%	0,33	1,10	0,17	0,86	35,8	39,8
20%	0,33	1,93	0,20	1,06	36,1	46,0

Результаты, полученные при температуре 2-8°С, подтверждают тенденцию, наблюдающуюся при температуре 28-30°С. Значения АСА титров находятся ниже пределов, определенных как критерии приемлемости, хотя лекарственные формы с рН 7,0, по-видимому, имеют более высокие значения. Концентрации белка не оказывают влияния на результаты, полученные для тестированных параметров.

5.2. Влияние различных процедур концентрирования на содержание агрегатов и фрагментов так же, как и на значения АСА титров для препаратов 1О8С60 (РЬ 4,7, А-сетка) и 1О8С62 (РЬ. 4,7, У-сетка, концентрации после последующей промывки с меньшей ИР-системой).

В следующей табл. 4 представлено содержание агрегатов и фрагментов так же, как значения АСА титров после 3 месяцев хранения при 28-30°С для лекарственных форм с низкими значениями рН для различных способов концентрирования при различных концентрациях белка.

Таблица 4

Содержание агрегатов и фрагментов так же, как значения АСА титров после 3 месяцев хранения при 28-30°С для лекарственных форм с низкими значениями рН для различных способов концентрирования при различных концентрациях белка

	Фрагменты %	Агрегате	>1 %	АСА титры
Белок	Стандартная сетка	Открытая сетка	Стандартная сетка	Белок	Стандартная сетка	Открытая сетка
14%	1,35	0,92	0,10	0,21	44,1	42,6
16%	1,24	1,09	0,08	0,20	40,5	40,9
18%	1,24	0,96	0,11	0,23	40,3	40,7
20%	1,35	0,98	0,12	0,30	37,5	41,6

Полученные данные демонстрируют одинаковые результаты после 3 месяцев хранения для обеих концентраций.

В табл. 5 представлены соответствующие результаты, полученные при 2-8°С: содержание агрегатов и фрагментов и значения АСА титров после 3 месяцев хранения при температуре 2-8°С при низких значениях рН для различных способов концентрирования белка.

Таблица 5

	Фрагменты %	Агрегата	л %	АСА титры
Белок	Стандартная	Открытая	Стандартная	Белок	Стандартная	Открытая
сетка	сетка	сетка	сетка	сетка
14%	0, 36	0,27	0,16	0,17	38,3	39,6
16%	0,30	0,22	0,11	0, 14	37,4	38,3
18%	0,33	0,23	0,17	0, 18	35,8	39,6
20%	0,33	0,22	0,20	0,20	36,1	39,9

Значения, полученные при температуре 2-8°С, подтверждают результаты, полученные при температуре 28-30°С. Способ концентрирования не влияет на стабильность продукта.

Что касается сравнения двух систем, то система с основным способом концентрирования и другая для концентрирования после промывки, которая приводит к более высоким выходам, то считают, что указанный способ более пригоден для крупномасштабного производства.

6. Выводы.

Из результатов, полученных в проведенных исследованиях, можно сделать следующие выводы.

Композиции с низким рН обеспечивают более низкие значения АСА титров, меньшее содержание агрегатов и фрагментов после 3 месяцев хранения при температурах 2-8°С и 28-30°С.

После 3 месяцев хранения при температуре 28-30°С значения АСА титров для лекарственных форм с нейтральными значениями рН находятся выше критериев приемлемости.

- 17 023382

Концентрация белка не оказывает влияния на результаты, полученные для тестированных параметров.

Способ концентрирования не влияет на стабильность получаемого продукта.

Адекватные значения после промывки можно получить только с мембранами с открытой сеткой.

На основании указанных выводов было решено создать новый 1дС продукт для подкожного введения с низким значением рН композиции, со способом концентрирования с использованием второго меньшего устройства для концентрирования после промывки и ультрафильтрационного/диафильтрационного устройства с мембранами с открытыми сетками и при содержании белка 20%+2%.

Пример 2. Ультрафильтрация и композиция БИВЦ N0.

1. Предпосылки.

Такую информацию собирают во время получения продукта в промышленном масштабе и для доклинических 20% лотов. Способ, который используют для производства 20% лотов перед стадией нанофильтрации, описан выше.

Ультрафильтрацию/диафильтрацию усовершенствуют для концентрирования полученного раствора до 20% (пределы: 18-22%). Для снижения потерь выхода до минимума последующую промывку ультрафильтрационного устройства, использованного для диафильтрации, концентрируют, используя второе меньшее устройство, снабженное такими же мембранами, и затем добавляют к основному раствору.

Неожиданно оказалось, что на инактивацию вирусов во время хранения при низких значениях рН не влияет концентрация белка в растворе. Аналогичное уменьшение количества вирусов достигается в 10% растворе (САММАСАКИ® ЫфиГО) и в 20% растворе. Поэтому хранение при низких значениях рН, в качестве стадии уменьшения содержания вирусов, поддерживают для 20% продукта.

2. Описание процесса. Ультрафильтрация.

Концентрацию глицина в нанофильтрате доводят до нужного значения 0,25 М. Полученный раствор концентрируют до концентрации белка 6±2% мас./об. с помощью ультрафильтрации (ИР). Обычно концентрацию белка определяют, измеряя АИ_280-з₂₀. Используют коэффициент экстинкции 14,1. рН доводят до 5,2±0,2. В качестве ИР мембраны используют мембрану с отсечением по молекулярной массе (Νοιηίηαΐ Мо1еси1аг νοίβΐιΐ СиГ ОН) (ΝΜνϋΘ) 50000 Да или менее и сконструированную конкретно для продуктов с высокой вязкостью (например, V сетка от МПБроге). Например, МПБроге РеШсои Вютах с NМVСО в 50 кДа или менее. Материал мембран представляет собой полиэфирсульфон.

Осуществляют диафильтрацию полученного концентрата против 0,25 М раствора глицина, рН 4,2±0,2. Минимальный обменный объем равен 10Х от исходных объемов концентратов. На протяжении всех операций ультрафильтрации/диафильтрации полученный раствор выдерживают при температуре 420°С.

После диафильтрации полученный раствор концентрируют до достижения концентрация белка не менее 22% мас./об. Температуру полученного раствора доводят до 2-8°С. Концентрацию белка можно определить, используя ИУ считывающее устройство и используя значение коэффициента экстинкции 14,1.

Для выделения всего оставшегося в системе белка осуществляют последующую промывку первой большой ультрафильтрационной системы, используя по меньшей мере двукратный мертвый объем в рециркуляционном режиме, чтобы обеспечить вымывание всего белка. Затем промывки после первой ультрафильтрационной системы концентрируют до достижения концентрации белка по меньшей мере 22% мас./об., используя вторую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, снабженную мембраной того же типа, размеры которой в десять раз или менее меньше размеров первой мембраны. Концентрат последующих промывок добавляют к основному раствору. Затем промывают вторую ультрафильтрационную систему. Полученные последующие промывки используют для доведения концентрации белка в конечном объеме на стадии 14. Температуру полученного раствора устанавливают 2-8°С.

Композиции.

Концентрацию белка дополнительно доводят до 20,4±0,4% мас./об., используя последующие промывки второй, меньшей системы ультрафильтрации, и/или диафильтрационный буфер. рН доводят до значения 4,4-4,9, при необходимости.

Пример 3. Получение 20% лотов.

1. Введение.

Данное сообщение раскрывает доклиническое получение и в нем суммированы результаты нового исследовательского препарата иммуноглобулина Бакстера БИВЦ N0, 20%, который представляет собой 20% (мас./об.) жидкий поливалентный препарат человеческого иммуноглобулина для подкожного применения.

Процесс получения осуществляют, как описано в подробном описании изобретения, используя раскрытый выше способ концентрирования. Фракционирование начинают, выделяя криоосадок. Полученную криосупернатантную плазму можно использовать для выделения различных неочищенных факторов коагуляции и ингибиторов перед последующим фракционированием холодным спиртом. Выбира- 18 023382 ют семь схем для порционной адсорбции неочищенных факторов коагуляции и ингибиторов из криосупернатантной плазмы до 8ЫВО N0, 20% очистки и называют их схемами 1-7 в следующей таблице.

Таблица 6

	Схемы абсорбции
Стадия	Гель	Гепарин	1	2	3	4	5	б	7
Криопреципитация	-	-	X	X	X	X	X	X	X
ΡΕΙΒΑ	0,5д ΏΕΑΕСефадекс/1	- г

Фактор IX	0,5д ϋΕΑΕСефадекс/1	2000 МЕ/мл		X	X
Фактор VII	120 мг А1(ОН)₃/1	750 МЕ/мл		X	X
Антитромбин	1д ОЕАЕСефадекс/1	80000 МЕ/мл	чИг	X	м

Для доклинических 8ЫВО NС 20% получение исходных материалов по Кону, полученных для схем 1, 3 и 6, выбирают для покрытия широкого разнообразия различных опций адсорбции. Различные процессы адсорбции раскрыты ТеясНпег е! а1., 2007, в Уох 8апд. 92:42-55; РоЫег е! а1., 2008, Уох 8апд. 94:184-192; в и.8. Ра1еп1 Νοδ. 6395880 и 5409990 и РгоШготЪт сотр1ех: ВгиттеШшя ίη МеШоФ о£ Р1а8та Рго1еш Ргасйопайоп (ТМ. Сиг1ш§ ЕДПог, АсаДетю Рге88, 1980).

Применение спиртового фракционирования по Кону приводит к получению основной промежуточной 1дС фракции, называемой осадком С, которую в дальнейшем обрабатывают до конечного продукта, используя хроматографическую очистку. Дальнейшие процедуры включают катионообменную (СМсефароза, быстрый поток) хроматографию и анионообменную хроматографию (ΑΝΧ-сефароза, быстрый поток) и включают три независимые стадии инактивации вирусов, а именно:

обработку растворителем/детергентом (смесь 1% ТгПоп Χ-100, 0,3% три-^бутилфосфат и 0,3% полисорбат-80), нанофильтрацию (АяаЫ РПапоуа 35 нм) и хранение при низких значениях рН в течение 3 недель при повышенной температуре.

Для достижения более высокой концентрации белка для подкожного введения на стадии ультрафильтрации/диафильтрации следует использовать фильтр с открытыми каналами. Предпочтительно используют второе устройство ультрафильтрации/диафильтрации для концентрирования последующей промывочной фракции для удаления всего белка после первого устройства.

81/ВС) NС 20% представляет собой жидкую композицию иммуноглобулина С (1дС), в которой по меньшей мере 95% белка является гаммаглобулином. Полученный продукт является изотоническим, и его получают с низким рН. При концентрации белка 10% на конечной стадии концентрирования рН составляет 4,4-4,9. Конечное значение рН 20% раствора можно определить после длительных исследований стабильности. Конечный раствор содержит 180-220 г белка и только 0,1-0,3 моль глицина на 1 л раствора. Жидкий препарат представляет собой прозрачное до слегка бледно-желтого вещество, практически не содержащее видимых частиц.

2. Результаты и баланс масс доклинических лотов.

1. Доклинический лот: 8№0107Ν0.

Опция поглощения 1: опция 6: Р IX, Р VII, ΑΤ-ΙΙΙ.

Номер лота исходного материала: осадок С УМЕЬС171 (И8-источник).

Номер лота конечного контейнера: 8№0107Ν0.

2. Доклинический лот: 8Ο0207ΝΟ.

Опция поглощения 3: РЕША, АТ-Ш.

Номер лота исходного материала: осадок С УМЕЬС173 (И8-источник).

Номер лота конечного контейнера: 8Ο0207ΝΟ.

3. Доклинический лот: 8Ο0307ΝΟ.

Опция поглощения 1: без стадии адсорбции.

Номер лота исходного материала: осадок С БВ0790301 (И8-источник).

Номер лота конечного контейнера: 8Ο0307ΝΟ.

- 19 023382

Таблица 7

	Стадия	I Стерильный объем
Тест/Способ	ЬоЬ	Г ,
Полное содержание белка/υν	г/л плазмы			3,4	3,7	3,7
1дС/ Нефелометри- чески	г/л плазмы			3,0	3,0	3,0
1дА/ЕЫ8А	г/л плазмы			<0,001	<0,001	<0,001
1дМ/ЕЫ5А	г/л плазмы			<0,001	<0,001	<0,001
Μ3Ό(ВЭЖХ)	ШЙННШШЮ	йй	и	4»ι -н- ι ι Ρ I Г·.	4	Ч^Н ' 1
	% агрегатов			0,1	0,1	0,1
	% олиго/димеров			4,6	4,5	3,2
	% мономеров			95,2	95,4	96,6

	% фрагментов	Ж	и	0,1		0,1

В конечном объеме уровень содержания примесей в препарате иллюстрируется низкими уровнями содержания основных примесей, которые значительно ниже 0,1% от полного количества 1дС. Распределение по размерам молекул в 20% продукте на этой конечной стадии процесса аналогично распределению в одном из САММАСАКЭ® ЫОИГО/КЮУЮ конечных контейнеров. Этот факт свидетельствует о том, что концентрации до 20% белка не оказывают негативного воздействия на целостность молекул 1дС.

3. Дополнительные результаты, полученные при характеризации доклинических партий.

Предварительные критерии выделения для конечных контейнеров определяют на основании требований соответствующих инстанций для подкожного введения человеческих иммуноглобулинов, спецификаций для конечных контейнеров, существующих в настоящее время продуктов для подкожного введение и САММАСАКЭ® ЫОИГО/КЮУЮ спецификаций. Осуществляют дополнительные тесты контроля качества для оценки уровня содержания примесей в продукте или примесей, связанных с процессами обработки.

Далее проводят дополнительную характеризацию соответствующего спектра антител в конечных контейнерах и сравнивают с результатами, полученными для доклинических 1У1С, 10% ТУК лотов.

Полученные результаты представлены в следующей таблице.

Таблица 8

	ЗПВф ΝΟ 20%	ινιο, ιο%τνκ
5000107Ν<3	3Ο00207ΝΟ	ЗСООЗО7Ы5	ΡΟΟΙΟΙΝΰ	Ρ00201ΝΟ	Ρ00301ΝΟ
			01С21АЫ11	01С21МТ21	01ϋ05ΑΝ11
	Тестовая система	Единицы
Бактерии:
СогупеЬасбегхиш сИрЬЪЬегхае ЕЦК	Морская свинка	МЕ/мл	6.			5.	5 .	5 .
Вирусы
НАУ	ЕЫЗА	МЕ/мл	14-			14		1
ΗΒν (антитело против Ьер В е Ад)	ЕЫ5А	МЕ/мг ТР	40.			35,9	40,1	40.
Вирус Меае1ез ΕϋΚ ЕпгхсН.	Гемагглют.		41.			Не определено	Не определено	Не определено
Вирус Меаз1ез из	Гемагглют.	ΝΙΗ 176	0,8			1,001	1,0	1,001
Рагуо 619	ЕЫ8А	МЕ/мл	718	78	71	567	442	36
Поли оми ели ты		ΝΙΗϋ/	1,4	1,711	1,5	1,01	1,11	1,21

Титры антител и коэффициенты обогащения оказываются величинами одного порядка для трех доклинических §иВЦ NС 20% конечных контейнеров и для доклинических САММАСАКЭ® ЫЦИГО/КЮУЮ лотов.

- 20 023382

Таблица 9

Тесты качественного контроля 5>иВО ЫО 20% конечного контейнера

	3000107ΝΟ	5С00207Ы(3	5С00307ЫС
	Тестовая система	Ед.
Гс функциональная целостность	Вс-связывание	% ВРЯ лот 3	15,8	138	164
Анти-комплементарная активность	ЕР-способ	%	41,1	41,5	41,2
Анти-комплементарная активность	ЕР-слособ	СН50 Е/мг	41,4	41,8	41,6
Активаторная активность прекалликреина Еик.	Хромогенный	МЕ/мл.	<0,6	1,004	1,237
Анти-А гемагглютинины, рН, ΕϋΚ	Гемагглют.	Разбавление: 1	8	16	8
Анти-В гемагглютинины, рН, ΕϋΕ	Гемагглют.	Разбавление: 1	4	4	2
Анти-Ώ гемагглютинины, рН, ЕЦЕ	Гемагглют.		выполнено	выполнено	выполнено
Удаление гхирогенности, рН, Еик и СРЕ	Кролик	°С повышение	без пирогенов	без пирогенов	без пирогенов
Бактериальные эндотоксины, чистота по электрофорезу с ацетатом целлюлозы	Хромогенный САЕ	МЕ/мл. %	<1,2 99,6	1,8 99,8	<1,2 99,5
Распределение по размерам молекул {мономер·»· димер)	ЗЕ-ВЭЖХ	%	99,2	99,3	99,2
Распределение по размерам молекул (полимер)	5Е-ВЭЖХ	%	0,2	0,2	0,3
Распределение по размерам молекул (фрагменты)	ЗЕ-ВЭЖХ	%	0,6	0,5	0,5
1дА-Еиг	ЕЫЗА	мкг/мл	20	20	30
1дМ	ЕЫЗА	мкг/мл	1,1	1,0	1,2
1дО	Нефелометрия	мг/мл	177	165	163
Белок (объемный)	УФ	мг/мл	201	203	202
Белок	Аидот.N2	мг/мл	202	208	203
Глицин	ВЭЖХ	мг/мл	14,7	14,5	14,7
Полисорбат 80	Спектрофот.	мкг/мл	<250	<250	<250
ΤΝϋΡ	Газ-хромат.	мкг/мл	<0,3	<0,3	<0,3
Октоксинол 9	Ион-хромат.	мкг/мл	<3	<3	<3

Стерильность	Мембранный фильтр	ΝΑ	стерильно	стерильно	стерильно
Осмолярность		т0зто1/кг	298	298	299
рН неразбавл.	Потенциометрия		5,1	5,2	5,3
Внешний вид	Визуальное иссл.		удовлетв.	удовлетв.	удовлетв.
Этанол	Газ-хромат.	мкг/мл	<20	<20	<20
Изопропанол	Газ-хромат.	мкг/мл	<20	<20	<20
Алюминий АА5	Фотометрия	Нд/л	<50	<50	<50
Диоксид кремния 1СР ОЕЗ	Ион электр.	Нд/л	3466	17270	21180
Гепарин		МЕ/мл	<0,0075	<0,0075	<0,0075

Удаление примесей в продукте и примесей, связанных с процессом получения продукта, оказываются удовлетворительными для всех трех лотов.

4. Выводы.

Три лота конечных контейнеров ШВО ЫО 20% успешно подготавливают в масштабе 200 л. Выбирают три схемы адсорбции, чтобы покрыть широкое разнообразие стадий адсорбции перед стадией фракционирования спиртом, а именно:

опция 1, υδ источник плазмы без стадии адсорбции, опция 3, υδ источник плазмы после РЕГВА, АТ-Ш адсорбции, опция 6, υδ источник плазмы после Р-ЬХ, Р-УП, АТ-Ш адсорбции.

Регистрация параметров процесса во время доклинического получения и характеризация промежуточных и конечного продукта показывает, что не существует очевидных детектируемых различий между указанными тремя лотами.

Все конечные контейнеры удовлетворяют относящимся к продукту предварительным техническим условиям, независимо от того, какой тип исходного материала выбирают.

Пример 4. Исследование хранения 20% препаратов.

1. Введение.

δΡΒΟ ЫО 20% представляет собой 20% (мас./об.) жидкий поливалентный препарат человеческого иммуноглобулина для подкожного введения. δυΒΟ ЫО 20% получают описанным выше способом.

В этих исследованиях суммируют результаты, полученные при хранении 3 доклинических лотов и одного лота применимости при температурах 2-8°С и 28-30°С (только лот применимости) в течение вплоть до 6 месяцев.

2. Цель.

Целью указанного исследования является оценка стабильности при хранении δυΒΟ ЫО 20% конечных контейнеров при температурах 2-8°С и 28-30°С.

3. Параметры индикации стабильности.

Основными типами разложения являются денатурирование, агрегация и фрагментация, которые приводят к изменению распределения молекул по размерам в образце. Поэтому анализ распределения молекул по размерам с использованием высокоэффективной хроматографии с исключением по размерам является основным параметром, характеризующим стабильность.

4. Исследование партий и первичная упаковка.

Результаты, касающиеся стабильности, представленные в указанном протоколе, получают для док- 21 023382 линических лотов 8000107ΝΟ, 8000207ΝΟ и 8000307ΝΟ, а также для лота применимости 1§08С 62/1.

5. Результаты.

В следующей табл. 11 приведены результаты для доклинических конечных контейнеров после хранения в течение вплоть до 12 месяцев.

Таблица 10

Стабильность доклинических 8ЦВЦ 20% партий при температуре 2-8°С

	МЗЦ (НР-ЗЕС) (%)
Лот	Месяцы	Агрегаты 0450 кДа)	Олиг / димеры+ мономеры	Фрагменты {<70 кДа)
5С00107ЫС	0	0,3	99,5	0,2
3	0,4	99,5	0,2
4	0,5	99,4	0,2
6	0,5	99,3	0,2
12	0,7	99,1	0,3
ЗС00207ЫС	0	0,3	99,5	0,2
3	0,4	99,5	0,1
4	0,5	99,3	0,2
6	0,6	99,2	0,2
12	0,8	99, 0	0,2
ЗС00307ЫО	0	0,3	99,6	о,1
3	0,5	99,3	0,2
4	0,6	99,2	0,1
6	0,7	99,1	0,2
12	0, 9	98,8	0,2
Критерий высвобождения		<5	>90	<5

Таблица 11

Стабильность лота применимости 1§О8С 62/1 при температурах 2-8°С и 28-30°С

	МЗО (НР-ЗЕС) (%)
Лот	’С	Месяц ы	Агрегаты {>450 кДа)	Олиг/дине ры+ноконе ры	Фрагменты «450 кДа)
1д(ЗЗС 62/1	ОТ 2 ДО 8	0	0,2	99,5	0,3
1	0,1	99,7	0,2
3	0,2	99,6	0,2
6	0,3	99,4	0,3
12	0,4	99,3	0,3
18	0,4	99,2	0,4
от 28 до 30	0	0,2	99, 5	0,3
1	0,2	99,2	0,6
3	0,3	98,7	1,0
6	0,6	98,0	1,4
12	1,2	95,6	3,2
18	1,9	93,5	3,3
Критерий высвобождения			<5	>90	<5

6. Выводы.

Полученные результаты подтверждают тот факт, что полученный продукт удовлетворяет определенным ранее техническим условиям в отношении исследованных параметров вплоть до 18 месяцев хранения при температурах 2-8°С и 28-30°С.

Пример 5. Обработка при низких значениях рН для инактивации вирусов.

Цель и обоснование.

Введение.

Раствор иммуноглобулина для подкожного введения (человеческий), 14-20%, с тройным уменьшением содержания вирусов (ТУК) раствор, в дальнейшем называемый раствором 8иЬсиу1а N0, получают из смешанной человеческой плазмы. После стадии массового захвата для удаления факторов коагуляции/ингибиторов, очистку 8иЬсиу1а N0 начинают с модифицированного спиртового фракционирования по Кону, приводящего к основному промежуточному осадку 0, с последующим продолжающимся процессом, включающим хроматографическую очистку, так же, как с тремя отличающимися стадиями инактивации вирусов/удаления вирусов. В рассматриваемом исследовании снижение эффективности вирусов при хранении конечных контейнеров при низких значениях рН исследуют более подробно.

Дальнейший процесс очистки включает следующие стадии: обработку повторно суспендированного осадка 0 растворителем/детергентом (8/0), катионообменной хроматографии с использованием карбоксиметилметил (СМ)-сефароза быстрого потока и анионообменной хроматографии с использованием ΛΝΧ-8ορ1ι;·ΐΓθ5θ® быстрого потока, нанофильтрации, ультрафильтрации-диафильтрации, регулирования рН и фильтрации и заполнения контейнеров в стерильных условиях. После асептического заполнения, раствор 8иЬсцу1а N0 отправляют на хранение в конечном контейнере при низких значениях рН (для схе- 22 023382 матической иллюстрации процесса приготовления см. представленную ниже схему).

Схема процесса.

Технологическая схема процесса А, представленная на фиг. 2, представляет собой общий вид дальнейшей части схемы получения раствора διΛαινίπ N0, начиная со стадии 10. Использованное в рассматриваемом исследовании обычным способом полученное производное эквивалентно технологической стадии конечный контейнер, предварительное хранение.

Схема процесса В, представленная на фиг. 2, представляет собой общий вид последующего процесса, использованного в настоящем исследовании, включая отбор образцов для определения титра вирусов.

Цель.

Для обеспечения высокой степени безопасности в отношении потенциального переноса вирусов, три специализированные стадии инактивации/удаления вирусов, которые дополняют друг друга по типу действия, объединяют в способ получения раствора διΛ^ινίη N0:

обработка растворителем/детергентом (стадия 11), нанофильтрация (стадия 14), хранение при низких значениях рН при повышенной температуре в конечном контейнере (постасептическое заполнение).

Эффективность и надежность хранения при низких значениях рН и повышенной температуре в отношении инактивации вирусов уже были исследованы в предыдущих исследованиях, в которых был использован ΙΟίν 10% ТУК, продукт эквивалентный δиЬсиν^а N0, но содержащий 10% белка для внутривенных применений. Данные, полученные в результате указанных исследований, демонстрируют, что все исследованные вирусы в липидной оболочке были эффективно и надежно инактивированы, причем вирус диареи крупного рогатого скота (ВУЭУ) продемонстрировал самую медленную кинетику инактивации. Кроме того, можно продемонстрировать, что указанная стадия процесса далее вносит вклад в вирусную безопасность способа получения с учетом мелких ДНК вирусов без липидной оболочки. δиЬсиν^а N0 и ΙΟίν 10% ТУК представляют собой продукты иммуноглобулина, где δиЬсиν^а N0 представляет собой вариант продукта для подкожного введения, и Ι0ίν 10% ТУК представляет собой вариант продукта для внутривенного введения. Оба получают одинаковым способом вплоть до стадий ультрафильтрация/диафильтрации и разработки композиции, где различие состоит только в том, что концентрацию белка в δиЬсиν^а N0 доводят до 14-20% вместо 10%.

Поэтому эффективность и надежность стадии хранения при низких значениях рН и повышенной температуре при получении δиЬсиν^а N0 (см. ТНе Еигореап Адепсу Гот 1Не Еуа1иабоп οί Мебюша1 Ргобис15 Еуа1иабоп οί Мебюи^ Гог Нитап №е (2001): СРМР Вю1есНпо1оду ХУогктд Рабу - №1е Гог 0шбапсе оп Ρ1аδта-^е^^νеб Мебю1па1 РгобисК СРМР/В^Р/269/95 (геу. 3)) с инактивацией ВУЭУ и ММУ оценивают, устанавливая выбранные критические параметры процесса до верхнего и нижнего пределов, установленных для способа производства (то есть время, температура: нижний предел; рН: верхний предел). Кроме того, с целью дальнейшего изучения надежности указанной стадии инактивации температуру понижают для указанного промежутка времени на протяжении опытов в малом масштабе.

Как обсуждалось выше, были использованы следующие оболочечные вирусы и вирусы без оболочки.

Вирус диареи крупного рогатого скота (ВУИУ) в качестве модели для вируса гепатита С (НСУ) и для других мелких РНК вирусов в липидной оболочке.

Мелкий мышиный вирус (ММУ) в качестве модели для человеческого парвовируса В 19 (В 19У) и для других мелких ДНК вирусов без липидной оболочки.

В соответствии с рекомендациями СРМР 268/95 (ТНе Еигореап Адепсу Гог Не ЕуаИабоп οί МебШпа1 Ргобисб Нитап Мебюи^ ЕуаИабоп Ипб (1996): СРМР В1о1есНпо1оду ХУогктд Рабу- №1е Гог 0шбапсе оп νίπΐδ Уаббабоп δΐиб^еδ: ТНе ^еδ^дη, СопбтЬибоп и 1п1егрге1аНоп οί δΐиб^еδ Уаббабпд Не Насйуабоп апб Кетονа1 οί V^^иδеδ, СРМР/В\УР/268/95 (пересмотрено)) проводились исследования в уменьшенной модели соответствующей стадии получения. Валидность результатов, полученных на стадии получения в уменьшенном масштабе хранения при низких значениях рН и повышенной температуре в отношении инактивации вирусов при получении раствора διώ^ηΗ N0, демонстрируют путем сравнения параметров, указанных для этой стадии для крупномасштабного производства и параметров процессов, осуществляемых в уменьшенном масштабе. Кроме того, выбранные биохимические параметры контролируют и сравнивают с соответствующими параметрами крупномасштабного процесса.

Материалы, способы и оборудование

Вирусы и клетки.

Используют Βνον, штамм НАЭб (биологически клонированный, АТСС УК-1422), полученный из коллекции американских типовых культур (Атепсап Туре Сибиге Со11есбоп) (АТСС; КоскуШе, Магу1апб). Вирус размножают на МИВК клетках (АТСС ССЬ-22) в соответствии со стандартными рабочими методиками и титруют на ВТ клетках (АТСС СКЬ-1390).

ММУ, штамм-прототип (АТСС УК-1346), получают из американской коллекции типовых культур (Атепсап Туре Сибите Со11есбоп, КоскуШе, Магу1апб). Вирус размножают в соответствии со стандартными рабочими методиками и титруют на А9 клетках (АТСС ССЬ-1.4).

- 23 023382

Схема теста.

Следующие лоты полученного обычным способом 8иЬсиу1а N0 промежуточного, перед хранением при низких значениях рН и повышенной температуре, то есть после стадии асептического заполнения контейнеров, получают от ВахГег'5 ΡΡΌ Ргобис18 8иррой берайуей, БИийпейга^е 131, У1еппа, Лийпа:

лот номер Ю8С64 с концентрацией белка 13,5%, лот номер Ю8С64 с концентрацией белка 20,9%.

Материал поставляют в конечном контейнере при температуре 2-8°С и используют в течение 6 месяцев.

Буферы/растворы.

Растворы для регулирования рН.

Величину рН регулируют, используя 0,5 М ΝαΟΗ или 0,5 М НС1. (Все растворы хранят при комнатной температуре и используют в течение 12 месяцев.)

Препарат 0,5 М хлористо-водородной кислоты (НС1)

Компонент	Компонент на литр раствора	Время хранения	Условия хранения
НС1 37%	41,4±0,4 мл	12 месяцев	23±5°С

Реагенты, т.е. дистиллированную воду и НС1, объединяют при комнатной температуре. Препарат 0,5 М гидроксида натрия (№ЮН)

Компонент	Компонент на кг дистил. воды	Время хранения	Условия хранения
ЫаОН	20,0±0,2 г	12 месяцев	+ 5°С

Соответствующее количество №ОН растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре.

Растворы для измерения величины рН.

Величину рН измеряют как непосредственно, так и в разбавленных растворах в соответствии с указаниями Европейской Фармакопеи (ЕР). Для измерения величины рН в соответствии со способом ЕР, концентрированный белок разводят до 1%, используя 0,9% раствор №С1.

0,9% раствор №гС1 приготавливают следующим образом: 9,0±0,9 г №гС1 растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. Полученный раствор фильтруют на фильтре 0,2 мкм, хранят при комнатной температуре и используют в течение 12 месяцев.

Среда для клеточной культуры.

Среду, которую используют для культуры клеток или определения тира вирусов, приготавливают в соответствии со стандартными рабочими методиками для получения титров вирусов ВУЭУ и ММУ.

Анализы титрования вирусов.

ТСШ^, анализ.

Образцы, содержащие вирусы, титруют, используя ТСШ₅₀ анализы, в соответствии со стандартными методиками процедур. Коротко, сериальные 1/2 1од разведения образцов приготавливают в соответствующей среде для культуры тканей и 100 мкл каждого из разведений помещают в 8 лунок микротитровального планшета, засеянного соответствующей индикаторной клеточной линией. Микротитровальные планшеты хранят в контейнерах с регулируемой влажностью и содержанием СО₂ при температуре 36±2°С. Оценку цитопатических эффектов осуществляют путем визуального исследования клеток под микроскопом после 7 дней хранения.

Средние инфекционные дозы культур тканей (ТСГО₅₀) рассчитывают в соответствии с распределением Пуассона и выражают как 1о§₁₀ [ТСГО₅₀/мл].

Титрование ВУЭУ.

Исследования осуществляют, используя ММУ-инфицированные образцы. Для снижения предела детектирования ВУЭУ-инфицированных образцов взятых из 8иЬсиу1а N0 промежуточного после 20 и 27 дней хранения при низких значениях рН, полученные образцы титруют следующим образом: в дополнении к стандартному ТСГО₅₀ анализу, образцы 1:3,16 разведения (0,5 1од§) и следующие два 1/2 1од разведения (для разведения используют соответствующую среду для культуры клеток) добавляют во все лунки (100 мкл на лунку) 96-луночных микротитровальных планшетов, засеянных соответствующей индикаторной клеточной линией. Хранение клеток и оценку цитопатического эффекта для соответствующих вирусов осуществляют, как раскрыто выше (ТСГО₅₀ анализ). Результаты рассчитывают следующим образом: рассчитывают отношение К_то1 объема, титрованного в объемном титровании, и объема, титрованного в регулярном ТСГО₅₀ анализе. 1о§₁₀ К_то1 вычитают из титра вируса, определенного в ТС'Ю₅₀ анализе, и результат представляют как титр вируса, определенный объемным титрованием.

Пример.

Образец анализируют (ТСГО₅₀ анализ), используя микротитровальный планшет в серийных 0,5 1од разведениях (все 12 столбцов) и обнаруживают, что лунки негативны для разведения 0 (т.е. неразбавленные). Расчет в соответствии с распределением Пуассона дает значение титра вируса <0,11 1од₁₀

- 24 023382 [ТСГО₅₀/мл]. Соответствующий полный объем анализируемого образца составляет 1,17 мл.

Тот же самый образец (разбавление 0) вносят во все лунки микротитровального планшета (титрование основного объема). Поэтому полный объем вносимого образца составляет 9,6 мл.

Отношение объемов: Κ_νο1=9/6:1,17=8,21; 1о§₁₀ (Κ_νο1)=0,91.

Рассчитанный титр вируса составляет затем <0,11-0,91; т.е. <-0,80. Верхний предел интервала достоверности титров вируса рассчитывают аналогично.

Расчет титра вируса, когда в следующих кинетических образцах не оценивают инфекционность.

Там, где в последовательных кинетических образцах не детектируется инфекционности вирусов вплоть до конечного образца после завершения хранения при низких значениях рН, объем всех последовательных негативных образцов, использованных для лунок в ТСГО50 анализе с отчетливо негативными результатами, принимают во внимание для расчета предела детектирования в анализе. Для этого используют следующую формулу (см. также АррепЛх 1):

Титр вируса на основании негативных последовательных кинетических образцов, [1од ₁₀ (ТОСЮ^/мл)]

£1/10* с Χ₁ (ί=1, 2, 3, ... п) индивидуальными титрами вируса [1οд1₀(ТСI^5₀/мл)] для п последовательных негативных образцов.

Если все последовательные негативные образцы имеют один и тот же титр, т.е. х, формула упрощается до

Титр вируса, основанный на л негативных последовательных кинетических образцах, [1одю(Т6С105о/мл)] = <χ-1οβ_Ι0(η)

Цитотоксичность.

Цитотоксичность промежуточного процесса для индикаторной клеточной линии вируса используют из имитационно-зараженного διιόονινίη ΝΟ промежуточного, т.е. зараженного ВТ-средой для инфицированных клеток (5% лошадиная сыворотка)* вместо вирусного источника, так же, как из имитационнозараженного, с установленным рН (рН 4,9±0,1) и отфильтрованного на фильтре 0,45 мкм исходного материала для каждой клеточной линии для определения цитотоксичности. Образцы анализируют подобно содержащим вирус образцам, т.е. их серийно разводят и хранят с индикаторной клеточной линией. После хранения определяют наивысшую не токсичную концентрацию. Что касается вариаций в этих биологических системах, отклонения в ±0,5 1ο§ для стадии рассматривают как незначительные при сравнении цитотоксичности зараженных вирусом и имитационно-зараженных образцов.

* Указанный состав ВТ-среды для инфицированных клеток следующий: ΌΜΕΜ (содержащая 45 г/л О-глюкозы)+1% (об./об.) Ь-глутамина (200 мМ)+1% (об./об.) гентамицинсульфата (10 мг/мл)+1% (об./об.) пирувата натрия+2% (об./об.) бикарбоната натрия (7,5%)+1% (об./об.) неосновных аминокислот+5% (об./об.) лошадиной сыворотки.

Интерференция.

Для образцов с низкими значениями титров вируса необходимо оценить влияние матрикса образца на характеристики анализа. Для образцов с высокими титрами вируса соответствующую часть серий разведения, то есть часть, где оценивают вирус-позитивные и вирус-негативные лунки, осуществляют при высоких разведениях образца. Соответственно влиянием матрикса образца, который также разводят на нескольких 1ο§₁₀ стадиях, на определение инфекционность вируса можно пренебречь.

Взаимодействие с определениями низких титров вируса для образцов, содержащих промежуточное διΑοΐ-ΐτίη ΝΟ, измеряют следующим образом: образцы отбирают из имитационно-меченного с установленным рН (рН 4,9±0,1) и отфильтрованного на 0,45 мкм фильтре исходного материала (промежуточного δυόουνίη ΝΟ) разводят 1:3,16, используя соответствующую среду для культуры тканей и метят 1:100 заранее разведенной (в соответствующей среде для культуры тканей, т.е. ВТ среде для ВТ клеток/Βνον и А9 средой для А9 клеток/ММУ) вирусной исходной суспензией до номинального значения титра 2 или 3 1ο§ι₀ [ТСГО₅₀/мл] и титруют, как описано выше. Титры, полученные для меченных промежуточных процессов, сравнивают со значениями для меченных контрольных сред клеточных культур.

Расчет коэффициента уменьшения вирусов.

Анализ эффективности инактивации вирусов в процессе осуществляют в соответствии с рекомендациями СРМР 268/95 [3], используя следующую формулу:

где Κ = коэффициент уменьшения содержания вируса; ν1 = объем исходного материала;

Т1 = концентрация вируса в исходном материале [ТСГО₅₀/мл]; ν2 = объем материала после стадии;

Т2 = концентрация вируса после стадии [ТСГО₅₀/мл].

Объемы и титры для каждого меченого образца до и после обработки используют для расчета Κ. В тех случаях, когда вирус не определяется, пределы детектирования используют в качестве титра вируса

- 25 023382 для расчетов. В соответствии со стандартными рабочими процедурами расчеты осуществляют, используя титры вирусов (1одю [ТСГО5₀/мл), приведенные до двух знаков после запятой; коэффициенты уменьшения округляют до первого десятичного знака.

Определение значимых параметров.

Время, температура [°С].

Время хранения определяют с помощью хронометров; температуру измеряют, используя Ρΐ-100 сенсоры, и непрерывно регистрируют.

Величина рН.

Величину рН определяют в соответствии со стандартными рабочими процедурами, используя стандартный лабораторный рН-метр при непосредственных измерениях, а также применяя способ, специфицированный в Европейской Фармакопее (ЕР), т.е. после разведения до 1% белка 0,9% раствором №С1. В дальнейшем рН с суффиксом (ЕР) означает измерение рН в соответствии с ЕР способом, тогда как рН без суффикса означает непосредственное измерение.

Определение других параметров.

Распределение по размерам молекул (ΜδΌ).

ВЭЖХ-8ЕС (высокоэффективная жидкостная хроматография - хроматография с исключением по размерам (эксклюзионная ВЭЖХ)) анализы распределения молекул по размерам осуществляют в департаменте Аиа1уйса1 В1осЬеш181гу, Вах1ег, У1еппа, Аикйта, в соответствии со стандартными рабочими процедурами. Эксклюзионный ВЭЖХ анализ всех образцов крупномасштабных лотов (полученных в департаменте ΡΡΌ РгойисК §иррой, Вах1ег, У1еппа, Аикйта) осуществляют в соответствии с указанным тестом. Таким образом, для подтверждения сравнимости между результатами тестов для образцов имитационно-меченых опытов (накопленными в более мелкомасштабных процессах во время проведенных исследований) и результатами тестов крупномасштабных лотов, проводят анализ ΜδΌ образцов имитационно-меченых образцов в соответствии с таким же тестом в том же самом департаменте.

Электрофорез на ацетатцеллюлозной мембране.

Электрофорез на ацетатцеллюлозной мембране (САЕ) осуществляют в соответствии со стандартными рабочими процедурами в департаменте АСУ СЬеш181гу, Вах1ег, У1еппа, Аикйта.

Округление.

Округление осуществляют в соответствии со стандартной практикой.

Аналитические результаты округляют до того же числа после запятой, что и у установленных параметров для соответствующих параметров процесса изготовления, или как задано точностью анализа.

Расчеты осуществляют без округления аналитических результатов и округляют только конечный результат.

Оборудование.

Используют стандартный лабораторный рН-метр.

Используют аналитические весы Мей1ег АТ-100 и лабораторные весы §айогш8 ВР3100Ρ.

Фильтрование осуществляют на фильтре 0,45 мкм, используя ΡΥΌΡ мембранные фильтры (МШехНУ или их эквиваленты).

Время процесса регистрируют лабораторными таймерами.

Используют боксы с биозащитой.

Клетки хранят в Негаеик СО₂-инкубаторах с контролируемой влажностью.

Для перемешивания используют магнитные мешалки/бруски для перемешивания.

Температуру регулируют с помощью криостатов Нааке или 1и1аЬо и/или используя нагревательный блок с перемешиванием.

Температуру измеряют, используя Ρΐ-100 сенсоры, соединенные с самописцами μΡ 1000 ΥΟΚΟОА№А.

Протокол исследований.

Для исследования надежности стадии производства хранение при низких значениях рН и повышенной температуре 8иЬсиу1а ΝΟ в отношении инактивации вирусов, ключевые параметры, определяющие эффективность инактивации вирусов определяют, как описано ниже. Опыты осуществляют в условиях, подходящих для исследования надежности инактивирования вирусов при хранении в условиях низких значениях рН. Сравнение условий для крупномасштабного процесса и опыта в небольшом масштабе представлено в табл. А.

Концентрация белка.

Так как §иЬсиу1а ΝΟ представляет собой экспериментальный продукт, интервал значений концентраций белка для готовой нерасфасованной смеси в настоящее время достаточно широко определен, т.е. составляет приблизительно 14-20%, и в дальнейшем может быть сужен. Таким образом, для исследования надежности обработки при низких значениях рН, проводят два опыта (схемы опытов) при двух экстремальных из возможных концентраций белков. Схема опыта 1 предусматривает концентрацию белка 13,5%; схема опыта 2 предусматривает концентрацию белка 20,9%.

Концентрация белка в материале, полученном обычным способом, предоставлена департаментом

- 26 023382

ΡΡΌ Ргобис18 8иррог1. Концентрацию белка материала, полученного обычным способом, заново не определяют, так как данные уже получены из анализов, проведенных после получения промежуточного 8иЬсиу1а ЫС, получаемого обычным способом. Так как материал, который используют в маломасштабном процессе, фильтруют в стерильных условиях и хранят при температуре 2-8°С перед началом маломасштабного процесса (то есть не подвергают каким-либо процедурам замораживания/оттаивания), какиелибо изменения в концентрации белка не предполагаются в конечной композиции профильтрованного в стерильных условиях промежуточного соединения.

Величина рН.

При производстве устанавливают интервал рН 4,4-4,9 (непосредственное измерение) для 8иЬсиу1а ЫС конечного контейнера на протяжении хранения при низких значениях рН. Для исследования эффективности и надежности обработки при низких значениях рН в условиях менее благоприятных для инактивации вирусов оба опыта осуществляют при более высоких установленных пределах, то есть при рН 4,9±0,1. Величину рН измеряют после введения метки и устанавливают на уровне верхнего предела, при необходимости. После хранения при низких значениях рН в течение 27 дней±5 ч, величину рН снова измеряют, используя способ непосредственного измерения рН и способ, рекомендованный Европейской Фармакопеей, то есть разбавляя до концентрации белка 1%, используя 0,9% раствор ЫаС1.

Температура.

В указанном процессе производства температуру на время хранения при низких значениях рН устанавливают 30-32°С. Для исследования надежности при хранении при низком рН в условиях менее благоприятных для инактивации вирусов, все маломасштабные опыты осуществляют в более низких пределах температурного интервала, то есть при 30±1°С. Для исследования потенциального влияния флуктуации температуры, температуру снижают до 25±1°С на >6 ч каждую неделю (то есть снижение температуры начинают в день 0,7, 14, 20 и день 27 хранения; нумерация дней относится к календарным дням, т.е. день 0 представляет собой день начала хранения). Ложно, снижение температуры до 25±1°С на 6 ч проводят дважды в неделю в первую и вторую недели хранения, то есть в течение дней 0 и 4 первой недели хранения и в течение дней 7 и 10 в течение второй недели хранения при низких значениях рН.

Время.

Время хранения обычно находится в интервале от 21 дня (необходимых для инактивации ΒνΌν) до 28 дней (верхний предел исходя из технических/логистических соображений). Для исследования эффективности и надежности обработки при низких значениях рН в условиях менее благоприятных для инактивации вирусов, все маломасштабные опыты осуществляют ниже пределов указанных для интервала времен хранения; т.е. в течение 20 дней±4 ч для кратковременного варианта и хранения в течение 27 дней±5 ч для более длительного варианта. Меченое промежуточное хранят при низких значениях рН и повышенной температуре в течение 27 дней±5 ч, но образцы для определения титра вирусов отбирают через 20 дней±4 ч хранения, чтобы исследовать вирусный клиренс после 3 недель хранения (см. также табл. А).

В целом, все 4 опыта с мечеными вирусами (2 с ΒνΌν, и 2 с ΜΜν) осуществляют для исследования надежности и эффективности инактивирования вирусов на стадии производства хранение при низких значениях рН и повышенной температуре. Кроме того, проводят два немеченых контрольных опыта без введения метки для получения образцов для определения биохимических параметров. Кроме того, проводят два имитационно-меченых контрольных опыта, и образцы, отобранные в указанных опытах, используют для исследования потенциального эффекта (то есть цитотоксичности и вредного воздействия) процесса промежуточных на анализ титра вирусов.

Для дальнейшей демонстрации эквивалентности маломасштабных процессов и крупномасштабных процессов осуществляют следующие биохимические анализы для конечного продукта до и после хранения при низких значениях рН: распределение по размерам молекул и ацетатцеллюлозный электрофорез.

- 27 023382

Таблица А

Процесс и биохимические параметры маломасштабных опытов, сравнение с крупномасштабным производственным процессом. Параметры, интервалы для которых отличаются от крупномасштабного процесса, примененные для маломасштабного процесса, представлены жирным шрифтом

Параметры	Крупно- масштабный процесс	Маломасштабный процесс
Опыт 1	Опыт 2
До введения метки и установления рН
Концентрация белка (г/100 мл)	от 14 до 20¹	14 + 1¹	20±1^х
После введения метки и установления рН
Величина рН (непосредственное измерение)	4,4-4,9	4,9+0,1	4,9±0,1
Хранение при низких значениях рН
Период хранения (дни)	21-28²	20д±4ч³ 27д±5ч²	20д±4ч⁴ 27д+5ч²
Температура при хранении (’С)	30-32	30±1⁴	30+1⁴
После хранения при низких значениях рН
Величина рН (непосредственное измерение)		При измерении (без спецификации)
рН (разбавлено до 1% белка, используя 0,9% ЫаС1) ЕР⁵		При измерении (без спецификации)

¹ Так как 8иЬсиу1а ΝΟ представляет собой экспериментальный продукт, концентрация белка более узко еще не определена. Таким образом, два маломасштабных опыта осуществляют при двух экстремальных из возможных концентраций белка.

² Так как период хранения еще не определен более узко, он зависит от результатов исследования клиренса вирусов.

³ Оба опыта осуществляют в течение 27 дней±5 ч и образцы для определения титров вирусов отбирают в 20 день хранения, так как данные об инактивации вирусов для варианта крупномасштабного производства соответствуют 21-22 дням хранения.

⁴ Температуру снижают до 25±1°С на 6 ч один раз в каждую неделю хранения (т.е. снижение температуры начинают в дни 0, 7, 14, 20 и 27; причем нумерация дней относится к календарным дням, т.е. днем 0 является день, в который начинают стадию хранения). Как уже обсуждалось в разделе 4.1.1 (Температурный профиль), снижение температуры до 25±1°С на 6 ч ошибочно осуществляют дважды в неделю в первую неделю и вторую неделю хранения (см. также 1Ж1 0407).

⁵ Способ, осуществленный в соответствии с указаниями Европейской Фармакопеи.

Экспериментальная методика

Из-за сложности последовательности, стадии введения вирусной метки, установления рН и фильтрования на фильтре 0,45 мм иллюстрируют на технологической схеме, представленной на фиг. 3 (толщина стрелок указывает на относительные объемы).

Исходный материал.

Для опыта 1 отбирают полученный обычным способом материал (номер лота Ю8С64) с концентрацией белка 13,5%. Указанный материал используют для осуществления опытов при нижнем пределе возможной концентрации белка, при верхнем пределе рН интервала (то есть ВУЭУ: 4,97 и ММУ: 4,93) и при низшем пределе температурного интервала (то есть при 29,4°С).

Для опыта 2 выбирают полученный обычным способом материал (номер лота Ю8С64) с концентрацией белка 20,9%. Указанный материал используют для осуществления опытов при верхнем пределе возможной концентрации белка, при верхнем пределе интервала рН (то есть ВУЭУ: 4,92 и ММУ 4,86) и при нижнем пределе температурного интервала (то есть 29,4°С).

Вирусная метка: ВУЭУ. ММУ.

Хранение.

В 45,5 мл каждого из исходных материалов вводят метку, используя 4,5 мл исходной суспензии вирусов, и отбирают образец 1 мл после 1-2 мин перемешивания. Образец немедленно разводят в отношении 1:3,16 (то есть 1 об. образца плюс 2,16 об. клеточной культуральной среды) соответствующей клеточной культуральной средой и титруют. Затем отбирают еще 3 мл образца и фильтруют через 0,45 мкм РУЭР мембрану. Один мл отфильтрованного материала немедленно разводят в отношении 1:3,16 соответствующей клеточной культуральной средой и титруют.

Установление значения рН.

Величину рН аликвоты в 35 мл меченого вирусом исходного материала доводят до рН 4,9±0,1 (оба опыта), используя 0,5 М раствор НС1 при перемешивании. Затем полученный материал разделяют на две аликвоты. Одну аликвоту в 30 мл используют для хранения при низких значениях рН и аликвоту в 5 мл

- 28 023382 используют для удерживания температурного контроля (см. раздел контроли удерживания).

Величину рН другой аликвоты в 10 мл меченого вирусом исходного материала доводят до рН 7,0±0,1, используя 0,5 М раствор Ν;·ιϋΗ, где 5 мл материала с установленным значением рН используют для контроля удерживания рН.

Остальные 5 мл материала с установленным значением рН используют для объединенного контроля удерживания рН и температуры (см. раздел контроли удерживания).

Контроли удерживания.

Для исследования механизма инактивации вирусов, т.е. выяснения того, происходит ли это за счет рН или за счет температуры, три контроля удерживания хранят в различных условиях:

Каждую из 5 мл аликвот меченого вирусом и с установленным значением рН (рН 7,0±0,1) исходного материала фильтруют через 0,45 мкм ΡνΌΡ мембранный фильтр в криоампулу. Одну аликвоту хранят при температуре 30±1°С вместе с меченым материалом процесса и затем хранят при указанной температуре до конца указанного процесса (рН контроль удерживания, рННС). Другую аликвоту одновременно хранят при температуре 2-8°С в течение 27 дней±5 ч (объединенный контроль удерживания рН и температуры, с НС).

5-мл аликвоту меченого вирусом с установленным значением рН (рН 4,9±0,1) и профильтрованного на 0,45-мкм фильтре исходного материала (см. выше Установление рН) одновременно хранят при температуре 2-8°С до конца процесса (контроль удерживания температуры, ΐ НС).

Минимальный объем каждого из контролей удерживания после фильтрования всегда составляет более чем 3 мл, так что доступен соответствующий объем для определения титра вирусов после периода хранения.

Хранение при низких значениях рН.

Аликвоту в 30 мл меченого вирусом и с установленным значением рН (рН 4,9±0,1) БиЬсиу1а Νθ промежуточного фильтруют через 0,45 мкм ΡνΌΡ мембранный фильтр в 50 мл стеклянный пузырек. Минимальный объем БиЬсиу1а Νθ промежуточного после фильтрования всегда оказывается более чем 24 мл. Таким образом, оказывается доступным достаточный объем для определения титра вирусов после периода хранения. Затем температуру уравновешивают при 30±1°С при перемешивании туда и обратно медленными движениями, используя водяную баню, причем температуру водяной бани регулируют в криостате с регулировкой температуры с внешним температурным сенсором. Внешний температурный сенсор и дополнительный Ρΐ 100 электрод расположены в 50 мл стеклянном пузырьке, эквивалентном тому, который используют для хранения при низких значениях рН, причем каждый из них заполнен 30 мл воды, что является максимально возможным количеством меченого материала процесса после фильтрования. Температуру регистрируют непрерывно. Как только температура материала достигает 29°С, начинают отбор образца. Каждый из образцов немедленно разводят в отношении 1:3,16 (т.е. 1 об. образца плюс 2,16 об. клеточной культуральной среды) соответствующей холодной культуральной средой (которую хранят при температуре 2-8°С) для предотвращения дальнейшей инактивации вируса за счет низкого значения рН, и титруют. Во всех опытах промежуточное БиЬсиу1а Νθ хранят при перемешивании (вперед и назад медленными движениями) при температуре 30±1°С в течение всего процесса в течение 27 дней±5 ч, со снижением температуры до 25±1°С в течение по меньшей мере 6 ч (>6 ч) один раз в течение каждой недели хранения. Ошибочно, такое снижение температуры до 25±1°С на 6 ч осуществили дважды в неделю в первую неделю хранения и во вторую неделю хранения, т.е. в течение дней 0 и 4 хранения в первую неделю и в течение дней 7 и 10 хранения во вторую неделю хранения при низких значениях рН. Для рассмотрения, обращайтесь к разделу 4.1.1 (Температурный профиль). Далее отбирают образцы в соответствии с планом отбора образцов (см. раздел 3.2), немедленно разводят, как описано выше, и титруют. После завершения хранения при низких значениях рН при температуре 30±1°С, величину рН определяют непосредственным измерением и измерением по способу, рекомендованному в Европейской Фармакопее (то есть при разведении до 1% белка, используя 0,9% раствор №С1).

Контрольный опыт без вируса.

Осуществляют два контрольных опыта, как раскрыто для меченых вирусом опытов, в которых обрабатывают немеченое и профильтрованное на 0,45-мкм фильтре промежуточное БиЬсиу1а Νθ. Используют те же самые параметры процессов, что и установлены для меченых вирусом опытов 1 и 2 соответственно, за исключением того, что рН материала не устанавливают. Образцы для определения биохимических параметров отбирают в соответствии с планом отбора образцов (см. раздел 3.2).

Цитотоксичность имитационно-меченого исходного материала (меченого 0,9:10 ВТ-средой для инфицированных клеток*; образец фильтруют, как описано выше, перед титрованием) и имитационномеченого и с установленным значением рН промежуточного БиЬсиу1а Νθ после фильтрования на 0,45мкм фильтре. Образцы для определения цитотоксичности отбирают в соответствии с планом отбора образцов (см. раздел 3.2).

* Указанная композиция ВТ-среды для инфицированных клеток следующая: БМЕМ (содержащая 4,5 г/л Б-глюкозы)+1% (об./об.) Ь-глутамина (200 мМ)+1% (об./об.) гентамицинсульфата (10 мг/мл)+1% (об./об.) пирувата натрия+2% (об./об.) бикарбоната натрия (7,5%)+1% (об./об.) несущественных амино- 29 023382 кислот+5% (об./об.) лошадиной сыворотки.

Отрицательное потенциальное взаимодействие.

Отрицательное взаимодействие матрикса образца для образцов, содержащих промежуточное 8иЬсиУ1а ЫС после установления рН (рН 4,9±0,1) с определением вирусов исследуют в дубликате для каждой индикаторной клеточной линии следующим образом: отбирают образец в 1 мл из имитационномеченого, с установленным рН и отфильтрованного на 0,45-мкм фильтре промежуточного 8иЬсиУ1а ЫС, разводят в отношении 1:3,16 (об./об.) соответствующей холодной средой для культуры клеток (хранящейся при температуре 2-8°С). Затем в 1,8 мл разбавленного материала вводят метку в отношении 1:10, используя 0,2 мл предварительно разведенной* исходной суспензии вируса до расчетного титра 2,0 и 3,0 1о§ю [ТСГО50/мл]. После перемешивания образцы отбирают и немедленно титруют. В качестве контроля в 1,8 мл соответствующей холодной культуральной среды (хранящейся при температуре 2-8°С) вводят метку точно таким же образом, используя предварительно разбавленную исходную суспензию вируса перед титрованием.

* Соответствующую клеточную культуральную среду [ВТ-среда для ВТ клеток (ВУБУ), А9-среду для А9 клеток (ММУ)] используют для предварительного разведения исходной суспензии вирусов.

План отбора образцов.

Титрование вирусов.

Для отбора образцов приняты следующие интервалы приемлемости: после 1 дня хранения (±1 ч), после 2-6 дней хранения (±2 ч), после 7-13 дней хранения (±3 ч), после 14-20 дней хранения (±4 ч) и после 21-27 дней хранения (±5 ч). Для кодов образцов см. раздел 1.1 (схема процесса).

Образцы немедленно титруют без дополнительного хранения.

Контрольная стадия	Количество
Исходная суспензия вирусов	1x0,3 мл
Меченый вирусом исходный материал	1X2 мл
Меченый вирусом и профильтрованный исходный материал	1X3 мл
Меченый вирусом, с установленным значением рН и профильтрованный исходный материал⁵	1X1 мл
Меченый вирусом, с установленным значением рН и профильтрованный исходный материал, хранящийся при низких значениях рН при 30+1°С, сразу после достижения температуры 29°С, т.е. 0 д образец⁵ после хранения в течение 7 д⁵, 14 д⁵, 20 д (только ММУ)⁵ и 27 д (только ММУ)⁵	1X1 мл каждый
Меченый вирусом, с установленным значением рН и профильтрованный исходный материал, хранящийся при низких значениях рН при 30±1°С, после хранения в течение 20 д и 27 д (только ВУОУ)⁵, титрованный в ΤΟΙϋ₅ο анализе, также как в объемном титровании	1хб мл каждый
рН контроль удерживания: рН 7,0+0,1 при температуре 30±1°С	1x5 мл
Температурный контроль удерживания: рН 4,9+0,1 §, при температуре +2°С до +8®С	1X5 мл
Комбинированный рН и температурный контроль удерживания: рН 7,0±0,1 при температуре +2®С до +8®С	1X5 МЛ

§ Образцы немедленно разводят в отношении 1:3,16, используя соответствующую холодную клеточную культуральную среду перед титрованием.

Определение цитотоксичности.

Образца! немедленно титруют без дополнительного хранения.

Контрольная стадия	Количество (для каждой клеточной линии и каждого опыта)
Исходная суспензия вирусов	1x0,3 мл
Имитационно-меченый и профильтрованный исходный материал 5М РШ.	1хз мл
Имитационно-меченый, с установленным значением рН и профильтрованный исходный материал⁵ ЗМ рН Ρίΐ£.	1x1 МЛ

§ Образцы немедленно разводят в отношении 1:3,16 соответствующей холодной культуральной средой перед титрованием.

Определение отрицательного взаимодействия.

Образны! немедленно титруют без дополнительного хранения.

- 30 023382

Контрольная стадия	Количество
Исходная суспензия вирусов	1X0,3 мл
Имитационно-меченое, с установленным значение рН (рН 4,9±0,1) и профильтрованное промежуточное ЗиЬсиуьа N3, разбавленное 1:3,16 холодной культуральной клеточной средой, меченое 1:10 предварительно разведенной (758 до расчетного титра 2,0 1одю [ТСЮ₅о/мл]	1X1 мл
Имитационно-меченое, с установленным значение рН (рН 4,Э±0,1) и профильтрованное промежуточное ЗиЪсшгха N3, разбавленное 1:3,16 холодной культуральной клеточной средой, меченое 1:10 предварительно разведенной (735 до расчетного титра 3,0 1одю [ТСЮ₅о/мл]	1x1 мл
Холодная клеточная культуральная среда меченая 1:10 предварительно разведенной (735 до расчетного титра 2,0 1одц, [ТСЮ₅о/мл]	1X2 мл

Холодная клеточная культуральная среда меченая 1:10 предварительно разведенной (755 до расчетного титра 3,0 1одю [ТСЮ₅₀/мл]

1x2 мл § Образцы немедленно разводят в отношении 1:3,16, используя соответствующую холодную культуральную клеточную среду перед титрованием.

Определение биохимических параметров.

Образцы отбирают только из каждого немеченого контрольного опыта и хранят при температуре 28°С до анализа.

Контрольная стадия	Параметр	Количество (внл. Бакап образцы)
Исходный материал перед введением метки¹	Распределение по размерам молекул 5М-М5О	2x1 мл
Ацтатцеллюлозный электрофорез ЗМ- САЕ
Меченый исходный материал после хранения при низких значениях рН при температуре 30°С±1°С, в течение 20 дней²	Распределение по размерам молекул 20ά-Μ3ϋ	2X1 мл
Ацтатцеллюлозный электрофорез 20ά -САЕ
Меченый исходный материал после хранения при низких значениях рН при температуре 30°С±1°С, в течение 27 дней³	Распределение по размерам молекул 20ά-Μ3ϋ	2X1 мл
Ацтатцеллюлозный электрофорез 27ά -САЕ

¹ Результаты, полученные при получении 2 крупномасштабных лотов так же, как и для полученного обычным способом материала (лот Νο 1О8С64), также принимают во внимание для оценки маломасштабного процесса.

² Результаты, полученные во время получения 2 крупномасштабных лотов, также принимались во внимание для оценки маломасштабного процесса.

³ Что касается экспериментальной стадии продукта, то, по-видимому, не похоже, что были доступны результаты для биохимических параметров после 28-дневного периода хранения.

- 31 023382

Результаты и обсуждение.

Исследуют эффективность и надежность хранения при низких значениях рН и повышенной температуре 8иЬсиу1а NС в качестве целевой стадии инактивации как для вирусов в липидной оболочке, так и для вирусов без липидной оболочки, исследуя ВУЭУ и ММУ, при использовании маломасштабной лабораторной модели указанной стадии. Параметры достоверности и биохимические параметры были определены и измерены в маломасштабном процессе, и путем сравнения полученных результатов с условиями промышленного процесса производства была установлена эквивалентность указанных двух процессов.

Результаты для параметров достоверности и биохимических параметров.

Параметры достоверности.

Достоверность маломасштабной процедуры подтверждена путем определения параметров, критических для инактивации вирусов, то есть величины рН материала процесса, температуры во время хранения при низких значениях рН и времени хранения.

Величина рН перед хранением при низких значениях рН и повышенной температуре.

Величину рН меченого материала процесса измеряют и устанавливают 4,9±0,1 во всех опытах, как требуется, и поэтому она находится в пределах, установленных в плане исследования. Значения рН, определенные после хранения, обсуждались в разделе 4.1.2 (другой процесс и биохимические параметры).

Температурный профиль.

Для исследования надежности стадии хранения при низких значениях рН и повышенной температуре в отношении вариаций температуры, температуру снижают с 30±1°С до 25±1°С на 6 ч один раз каждую неделю хранения. Температура всегда находится в интервале, установленном в плане исследования. Однако в первую и вторую неделю стадии хранения снижение температуры до 25±1°С на 6 ч ошибочно осуществляли дважды в неделю, то есть в дни 0 и 4 в первую неделю и в дни 7 и 10 во вторую неделю. Так как этот инцидент сдвинул профиль опыта к менее удачному сценарию в отношении инактивации вирусов, надежность инактивации вирусов была исследована еще более тщательно, чем предполагалось вначале.

Время хранения.

Длительность хранения при низких значениях рН и при повышенной температуре не установлена для процесса производства 8иЬсиу1а ΝΟ В зависимости от конечного результата рассматриваемого исследования существует несколько возможностей: в одном варианте осуществления длительность хранения составляет 21-22 дня; в другом варианте осуществления она может составлять приблизительно 28 дней. Для исследования эффективности и надежности обработки при низких значениях рН в условиях менее благоприятных для инактивации вирусов, все маломасштабные опыты проводят для времени хранения, которое ниже нижних пределов для возможного времени хранения; то есть в течение 20 дней±4 ч в первом варианте осуществления и в течение 27 дней±5 ч во втором варианте осуществления. Меченое промежуточное соединение хранят при низких значениях рН и повышенной температуре в течение 26 дней+22 ч (ММУ, оба опыта) и в течение 27 дней+1 ч (ВУЭУ, оба опыта). С целью исследования клиренса вирусов после 3 недель хранения образцы для определения титра вирусов отбирают после 20 дней+1 ч хранения для ММУ и после 20 дней+2 ч для ВУЭУ.

Время хранения находится в установленных пределах для маломасштабного процесса, то есть 20 дней±4 ч и 27 дней±5 ч во всех опытах, что является ниже рассматриваемых в настоящее время нижних пределов времени хранения при производстве.

Параметры другого процесса и биохимические параметры. рН после хранения при низких значениях рН.

После хранения при низких значениях рН значение рН снова измеряют непосредственно так же, как в способе, рекомендованном в Европейской Фармакопее(ЕР), то есть при разведении до 1% содержания белка, с использованием 0,9% раствора №С1. Значение рН, измеренное непосредственно после обработки, оказывается близким к значению рН, полученному до хранения при низких значениях рН; то есть различия находятся в интервале от -0,07 до +0,04 (рН после хранения минус рН до хранения). Значение рН, измеренное в соответствии со способом ЕР, всегда оказывается на 0,2-0,3 выше по сравнению со значениями, полученными способом непосредственного измерения. Такое небольшое повышение значений рН при использовании ЕР способа обычно для указанных двух различных способов определения величины рН. Указанный факт также учитывается в установленных пределах крупномасштабного производства, где пределы значений рН после обработки при низких значениях рН составляют 4,4-4,9 при непосредственном измерении и 4,6-5,1 при измерении способом ЕР.

Распределение по размерам молекул (М8И).

Распределение по размерам молекул (по данным ВЭЖХ анализа) исследуют до и после хранения для двух не меченых контрольных опытов. Результаты тестов сравнивают с тремя крупномасштабными лотами, полученными в течение экспериментальной стадии 8иЬсиу1а NС и с материалом, полученным обычным способом 1С8С64 (14%, а также 20% концентрации белка). Лот 1С8С64, который также обозначают как крупномасштабный лот, не подвергается при производстве хранению при низких значени- 32 023382 ях рН и повышенной температуре, так как для этой стадии не было достаточного количества материала. Аи результаты хорошо совпадают друг с другом. Величины для распределения по размерам молекул, особенно процентное содержание мономеров 1д0, оказываются близкими к процентному содержанию, полученному для крупномасштабных опытов. Для второго контрольного опыта, где концентрация мономеров 1д0 после хранения оказалась на несколько процентов ниже, отмечается, что материал до хранения уже отличался сравнительно низкой концентрацией мономеров 1д0, что также применимо к материалу, тестированному в крупномасштабном процессе. Таким образом, результаты, полученные для распределения по размерам молекул, подтверждают эквивалентность маломасштабного и крупномасштабного процессов.

Степень чистоты гаммаглобулина.

Определяют степень чистоты гаммаглобулина (по данным СА-электрофореза) образцов для двух немеченых контрольных опытов и сравнивают с результатами, полученными для двух крупномасштабных лотов и для полученного обычным способом материала 108С64 (концентрация белка 14%, а также 20%, значения, полученные только до обработки при низких значениях рН, для объяснения см. выше). Все значения, полученные для определения степени чистоты гаммаглобулина во время маломасштабного процесса, тщательно сравнивают с результатами, полученными для крупномасштабных лотов, и они оказываются в пределах точности анализа (относительное стандартное отклонение составляет 1,5%). Полученные результаты демонстрируют сопоставимость маломасштабного и крупномасштабного процессов.

Результаты, полученные для шифров вирусов.

Цитотоксичность.

Цитотоксичность промежуточных соединений, полученных до хранения при низких значениях рН и повышенной температуре, исследуют в контрольных опытах, используя имитационно-меченый материал, рН которого доводят до соответствующих значений рН, как описано в опытах с мечеными вирусами. Промежуточные соединения имитационно-меченого процесса до и после установления величины рН демонстрируют только очень слабый цитотоксический эффект в отношении клеток, использованных во всех двух опытах, за исключением опыта 2 для ВТ клеток, где промежуточное соединение с установленным рН не демонстрирует эффекта цитотоксичности при 1,0 1од₁₀ разведении и ниже. Не отмечено заметных различий в цитотоксичности в вирус-меченых опытах.

Тестирование интерферентности.

Результаты тестирования интерферентности не демонстрируют заметной интерференции матрикса образца с определением низких титров ВУЭУ и ММУ: различия в титрах вирусов между контролями меченой клеточной культуральной среды и мечеными промежуточными 8иЬсцу1а N0 находится от -1,0 1о§1₀ до 0,1 1од₁₀, что находится в пределах точности анализа титрования вирусов. Так, титры, полученные во время опытов по инактивации вирусов, не нарушаются в результате отрицательных эффектов интерференции и представляют собой реальные титры образцов. Инактивация вирусов

Два опыта осуществляют для каждого из вирусов ВУЭУ и ММУ, т.е. опыт 1 при 13,5% концентрации белка и опыт 2 при 20,9% концентрации белка. Оба опыта проводят при рН 4,9±0,1°С и при 30±1°С, где температуру снижают до 25±1°С на не менее 6 ч один раз в неделю. Сравнение результатов двух опытов не выявляет значительных различий в кинетике инактивации вирусов между двумя опытами, осуществленными при верхнем и нижнем пределе возможных концентраций белка в 8иЬсцу1а N0.

Используя условия, наименее благоприятные для инактивации вирусов, т.е. нижние пределы времени хранения и температуры, а также верхние пределы значений рН, продемонстрировали значительную инактивацию ВУЭУ после 20 дней±4 ч хранения и полную инактивацию всех вирусов, которые могут быть введены в качестве меток в соответствующие промежуточные 8иЬсиу1а N0 после 27 дней±5 ч хранения для ВУЭУ, независимо от исследованных условий. В обоих опытах остаточная инфекционность за счет ВУЭУ все еще может наблюдаться на 20 день. Однако все ВУОУ были инактивированы до ниже нижнего предела детектирования к концу 27 дня хранения. Коэффициенты уменьшения для ММУ демонстрируют существенный вклад указанной стадии процесса в вирусную безопасность полученного продукта так же, как и в отношении вирусов без липидной оболочки. Титры отдельных вирусов и коэффициенты уменьшения для использованных вирусов обсуждаются ниже более подробно. Кроме того, представлены графические иллюстрации кинетики инактивации вирусов для каждого из вирусов в соответствии с соответствующей таблицей результатов.

Βνυν.

ВУЭУ инактивируют почти до пределов детектирования (опыт 1) или до пределов детектирования (опыт 2) к 20 дню хранения, что дает коэффициенты уменьшения 5,3 1од₁₀ и 5,5 1од₁₀ в опытах 1 и 2 соответственно. После 27 дней хранения все ВУЭУ введенные в виде меток в промежуточное 8иЬсиу1а N0 оказываются инактивированными до пределов ниже предела детектирования в обоих опытах, демонстрируя коэффициенты уменьшения >6,6 1од₁₀ и >6,5 1од₁₀ в опытах 1 и 2 соответственно. Каких-либо значительных различий не наблюдается в кинетике инактивации в двух опытах. Оба промежуточных соединения в опыте 1 (при 13,5% концентрации белка) и в опыте 2 (при 20,9% концентрации белка) демонст- 33 023382 рируют сопоставимую кинетику инактивации.

Обработка при низких значениях рН при повышенной температуре демонстрирует эффективную инактивацию ВУЭУ после хранения в течение 20 дней±4 ч, при рассчитанном среднем значении коэффициента уменьшения 5,4 1од₁о- После 27 дней хранения при низких значениях рН и повышенной температуре достигается полная инактивация ВУЭУ до пределов, которые ниже пределов детектирования, при рассчитанном среднем значении коэффициента уменьшения >6,6 1од₁₀.

ММУ.

Для ММУ были рассчитаны коэффициенты уменьшения 2,9 1од₁₀ и 3,1 1од₁₀ для опытов 1 и 2 соответственно после 20 дней хранения при низких значениях рН и повышенной температуре. Рассчитанное среднее значение коэффициента уменьшения составляет 3,0 1од₁₀. После 27 дней обработки при низких значениях рН получены коэффициенты уменьшения 3,4 1од₁₀ и 3,7 1од₁₀, причем рассчитанное среднее значение коэффициента уменьшения составляет 3,6 1од₁₀. Указанные коэффициенты уменьшения демонстрируют существенный вклад указанной стадии процесса в профиль вирусной безопасности процесса получения в отношении парвовирусов, которые весьма устойчивы в отношении физико-химической инактивации. Кинетика инактивации вирусов в обоих опытах является двухфазной, с более быстрой инактивацией в течение первых 7 дней и несколько меньшей скоростью инактивации в течение следующих трех недель.

Контроль удерживания.

Для исследования механизма инактивации вирусов, то есть выяснения того, опосредована ли инактивация величиной рН или температурой или комбинацией указанных двух факторов, три контроля удерживания поддерживают в соответствующих условиях.

Получение титров для объединенного контроля удерживания (рН 7,0±0,1) которое поддерживают при 2-8°С в течение 27 дней±5 ч приводит к тому, что оба исследованных вируса в отношении тира вируса сопоставимы с вирус-меченым исходным материалом, за исключением ММУ в опыте 2, в котором наблюдается небольшое уменьшение титра (1,6 1о§1₀).

Хранение при 30±1°С и рН 7,0±0,1 (рН контроль удерживания) демонстрирует, что вирус ВУЭУ в липидной оболочке оказывается очень чувствительным к хранению при повышенной температуре. ВУЭУ оказывается инактивированным до 4,6 1од₁₀ в обоих опытах. Кроме того, вирус ММУ без липидной оболочки оказывается инактивированным до 3,3 и 3,8 1од₁₀, в опыте 1 и опыте 2 соответственно.

Титрование температурного контроля удерживания (ΐ НС) после 27 дней ±5 ч хранения при низких значениях рН и при 2°С-8°С приводит к тому, что для обоих исследованных вирусов титры вирусов оказываются сопоставимыми с вирус-меченым исходным материалом. Полученные результаты демонстрируют тот факт, что ВУЭУ, а также ММУ, оказываются резистентными при хранении при низких значениях рН в интервале 4,4-4,9 при низкой температуре.

Взятые вместе, полученные результаты для трех контролей удерживания дают возможность предположить следующее.

Температура должна быть наиболее значимым фактором для инактивации ВУЭУ, причем некоторый вклад вносит низкое значение рН (на основании того факта, что контроль при 30±1°С и нейтральном значении рН оказывается существенно, но не полностью инактивирован после 27 дней).

Для инактивации ММУ, температура, по-видимому, является только релевантным фактором, так как титры вирусов образцов с низкой кинетикой рН после 27 дней оказываются практически идентичными контрольным значениям при нейтральных значениях рН и при 30°С.

Обобщение и выводы.

Во время настоящего исследования маломасштабной модели хранения при низких значениях рН и повышенной температуре при получении 8иЬсиу1а N0 устанавливают и демонстрируют ее эквивалентность способу получения, определяя несколько параметров процесса. Кроме того, при сравнении биохимических параметров промежуточных соединений из маломасштабной модели и способа производства далее поддерживают эквивалентность обоих процессов, указывая на то, что коэффициенты уменьшения, полученные во время маломасштабного процесса, также справедливы для крупномасштабного производства. Для исследования надежности в отношении инактивации вирусов исследуют влияние различных концентраций белка в 8иЬсиу1а N0, причем величину рН меченого исходного материала доводят до верхнего предела значений в сравнении со способом производства, а также исследуют влияние периодического снижения температуры. Коэффициенты уменьшения вирусов и кинетические исследования инактивации вирусов, полученные в рассматриваемом исследовании, демонстрируют, что вирус ВУЭУ в липидной оболочке эффективно и надежно инактивируется при хранении при низких значениях рН и повышенной температуре в течение 27 дней. Кроме того, после хранения при низких значениях рН и повышенной температуры в течение 20 дней достигают значительной инактивации ВУЭУ, причем достигнутое среднее значение коэффициента уменьшения для ВУОУ составляет 5,4 1од₁₀. Рассчитанные средние коэффициенты уменьшения для парвовирусной модели ММУ, то есть 3,0 1од₁₀ после 20 дней хранения и 3,6 1од₁₀ после 20 дней хранения, демонстрируют тот факт, что указанная стадия процесса далее вносит вклад в вирусную безопасность процесса производства в отношении небольших ДНК вирусов без

- 34 023382 липидной оболочки с высокой физико-химической устойчивостью [2], при хранении в течение 20 дней, а также в течение 27 дней.

Обе исследованные концентрации белков демонстрируют одинаковую кинетику инактивации для ΜΜν и Βνον, что предполагает, что влияние концентрации белка на эффективность инактивации вирусов незначительно для концентрированных растворов иммуноглобулина и вирусов Βνον и ΜΜν.

Следует понимать, что раскрытые в данном описании примеры и варианты осуществления приведены только для иллюстративных целей, и что различные модификации или изменения в их свете могут быть очевидны специалистам в данной области, и все они должны быть включены в объем настоящей заявки и объем прилагаемой формулы изобретения. Все цитированные публикации, патенты и патентные заявки включены в данное описание посредством ссылки во всей их полноте для всех целей.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения композиции концентрированного иммуноглобулина С (IдС), включающий стадии:

(A) концентрирования первого раствора, содержащего ЦС, до концентрации белка от 2 до 10% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, где первая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с номинальным отсечением по молекулярной массе (ΝΜ\νί'Ό) 100 кДа или менее, таким образом получая первый ЦС концентрат;

(B) диафильтрации первого ЦС концентрата диафильтрационным буфером с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая первый ЦС диафильтрат;

(C) концентрирования первого ЦС диафильтрата до концентрации белка более чем 20% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая второй ЦС концентрат;

(И) сбора второго ЦС концентрата из первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы;

(Е) промывки первой ультрафильтрационной мембраны путем рециркуляции буфера, прошедшего промывку, через первую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, где первую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему промывают объемом буфера, прошедшего промывку, равным по меньшей мере двукратному мертвому объему первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, таким образом получая первый ЦС раствор, прошедший промывку;

(Р) переноса первого ЦС раствора, прошедшего промывку, из первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы во вторую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, содержащую вторую ультрафильтрационную мембрану, где площадь поверхности второй ультрафильтрационной мембраны меньше, чем площадь поверхности первой ультрафильтрационной мембраны, и где вторая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с номинальным отсечением по молекулярной массе (ΝΜ\νί'Ό) 100 кДа или менее;

(С) концентрирования первого ЦС раствора, прошедшего промывку, до концентрации белка более чем 20% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием второй ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей вторую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая третий ЦС концентрат; и (Н) объединения третьего ЦС концентрата из второй ультрафильтрационной/диафильтрационной системы со вторым ЦС концентратом, таким образом получая композицию концентрированного ЦС.
2. Способ по п.1, где первый раствор, содержащий ЦС, концентрируют на стадии (А) до концентрации белка от 4 до 6% (мас./об.).
3. Способ по любому из предыдущих пунктов, где первая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с открытой сеткой.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, где первая ультрафильтрационная мембрана или вторая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с номинальным отсечением по молекулярной массе (ΝΜ\νί'Ό) 90 кДа или менее.
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где первая ультрафильтрационная мембрана и вторая ультрафильтрационная мембрана являются мембранами с номинальным отсечением по молекулярной массе (ΝΜ\νί'Ό) 90 кДа или менее.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где первая ультрафильтрационная мембрана и вторая ультрафильтрационная мембрана являются мембранами с номинальным отсечением по одинаковой молекулярной массе (ΝΜ\νί'Ό).
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, где диафильтрационный буфер содержит от 0,2 до 0,3 М глицина и имеет величину рН от 4,1 до 4,3.

- 35 023382
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где второй 1§С концентрат имеет концентрацию белка по меньшей мере 22% (мас./об.).
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где площадь поверхности второй ультрафильтрационной мембраны составляет не более десятой части площади поверхности первой ультрафильтрационной мембраны.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, где концентрация 1§С, полученного на стадии (Н), более чем 20% (мас./об.).
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, где рН композиции концентрированного 1дС, полученной на стадии (Н), составляет от 4,0 до 6,0.
12. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий стадии:

(I) промывки второй ультрафильтрационной мембраны путем рециркуляции буфера, прошедшего промывку, через вторую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, таким образом получая второй 1§С раствор, прошедший промывку; и (ί) регулирования концентрации белка композиции концентрированного 1дС, полученной на стадии (Н), путем добавления по крайней мере одной части второго 1дС раствора, прошедшего промывку, в композицию концентрированного 1дС, полученную на стадии (Н).
13. Способ по п.1, в котором 1§С представляет собой человеческий 1§С.
14. Способ получения композиции концентрированного иммуноглобулина С (1дС), включающий стадии:

(A) концентрирования первого раствора, содержащего 1дС, до концентрации белка от 4 до 6% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая первый 1§С концентрат, причем первая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с номинальным отсечением по молекулярной массе (ЫМ^СО) 60 кДа или менее;

(B) диафильтрации первого 1дС концентрата диафильтрационным буфером с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая первый 1§С диафильтрат, причем диафильтрационный буфер содержит глицин и имеет величину рН от 4,1 до 4,3;

(C) концентрирования первого 1дС диафильтрата до концентрации белка более чем 20% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей первую ультрафильтрационную мембрану, таким образом получая второй 1§С концентрат;

(Ό) сбора второго 1дС концентрата из первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы;

(Е) промывки первой ультрафильтрационной мембраны путем рециркуляции буфера, прошедшего промывку, через первую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, таким образом получая первый 1§С раствор, прошедший промывку, причем буфер, прошедший промывку, имеет объем, равный по меньшей мере двукратному мертвому объему первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы;

(Р) сбор первого 1дС раствора, прошедшего промывку, из первой ультрафильтрационной/диафильтрационной системы во вторую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, содержащую вторую ультрафильтрационную мембрану, причем вторая ультрафильтрационная мембрана является мембраной с номинальным отсечением по молекулярной массе (ЫМ^СО) 60 кДа или менее;

(С) концентрирования первого 1дС раствора, прошедшего промывку, до концентрации белка более чем 20% (мас./об.) с помощью ультрафильтрации с использованием второй ультрафильтрационной/диафильтрационной системы, содержащей вторую ультрафильтрационную мембрану, где площадь поверхности второй ультрафильтрационной мембраны составляет не более десятой части площади поверхности первой ультрафильтрационной мембраны, таким образом получая третий 1§С концентрат;

(H) объединения третьего 1дС концентрата из второй ультрафильтрационной/диафильтрационной системы со вторым 1§С концентратом, таким образом получая композицию концентрированного 1дС;

(I) промывки второй ультрафильтрационной мембраны путем рециркуляции буфера, прошедшего промывку, через вторую ультрафильтрационную/диафильтрационную систему, таким образом получая второй 1§С раствор, прошедший промывку; и (ί) регулирования концентрации белка композиции концентрированного 1дС, полученной на стадии (Н), путем добавления по крайней мере одной части второго 1дС раствора, прошедшего промывку, в композицию концентрированного 1дС, полученную на стадии (Н).