KR101464032B1 - 피하 사용을 위한 고 농축 면역글로불린 제제의 제조 방법 - Google Patents
피하 사용을 위한 고 농축 면역글로불린 제제의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 피하 주사를 위해 모여진 혈장으로부터 고 농축된 면역글로불린 조성물을 제조하기 위한 새롭고 개선된 방법에 관한 것이다. 피하 사용을 위해 적절한 20% 이상의 면역글로불린을 포함하는 조성물이 또한 기재되어 있다.
Description
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2009년 5월 27일에 출원된 미국 가출원 61/181,606호를 우선권주장하며, 이 가출원은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
1952년에 면역 결핍을 치료하기 위하여 인간 혈장으로부터의 면역 글로블린 제품이 처음으로 사용되었다. 초기에, IgG의 근육내 또는 피하 투여가 선택된 방법이었다. 그러나, 다양한 질병의 효과적인 치료를 위해 필요한 다량의 IgG를 주사하기 위하여, 저 농도의 IgG (50 mg/mL)를 가진 정맥내 투여가능한 제품이 개발되었다. 보통, 정맥내 면역글로불린(IVIG)은 수 천 명 이상의 혈액 공여자의 혈장으로부터 모여진 면역글로불린 G (IgG) 면역글로불린을 함유한다. IVIG는, 전형적으로 원상태 Fc-의존성 이펙터 기능을 가진 95% 초과의 비변형 IgG 및 단지 미량의 면역글로불린 A (IgA) 또는 면역글로불린 M (IgM)을 함유하고, 하기 3개의 의학적 상태의 주된 범주를 치료하는 데 주로 사용되는 무균 정제된 IgG 제품이다: 1. 낮은 항체 수준을 특징으로 하는, X-결합 무감마글로블린혈증, 저감마글로블린혈증 (원발성 면역 결핍) 및 후천성 저항력 저하 면역 상태 (속발성 면역 결핍)와 같은 면역 결핍; 2. 염증성 및 자가면역 질병; 및 3. 급성 감염.
다수의 IVIG 시판 공급업자들이 다양한 IVIG 제품을 제공한다. 재-용해 후에 용액 중에 단지 50 mg/mL 단백질을 함유하는 기존의 동결건조 IVIG 제품에 비하여, 최근에 개발된 것은 고 정제되고 농축된 인간 IgG 항체의 100 mg/mL 사용 준비된 무균 액체 제제이다. IVIG와 같은 IgG 제품은 모여진 인간 혈장으로부터 제조되기 때문에, 공여자 혈액으로부터의 병원체 오염 (특히, 인간에서의 다양한 질병을 일으키는 것으로 공지된 바이러스)이 제조 과정에서 심각하게 염려된다. IgG 제품에서 다른 중요한 고려사항은 보관 동안의 그들의 안정성, 특히 사용 준비된 제제로서의 안정성이다. IVIG에 비하여, 피하 투여가능한 면역글로불린 제제는 가정-관리 치료 가능성을 갖고 부작용이 적다는 장점을 갖고 있다. 부위 당 작은 주사 부피의 단점을 감소시키기 위하여, 고 농축 IgG (예를 들어, 100 mg/mL 대신에 200 mg/mL 함유)가 명백한 장점일 것이다.
혈청 및 혈장 단백질의 제제 및 성질에 관해 발행된 첨두 논문의 제4회 연재물에서, 콘 등의 문헌 [Cohn et al., J.Am.Chem.Soc., 1946, 68(3): 459-475]은 혈장 단백질의 알콜 분획법 방법을 기재하고 있으며 (방법 6), 이는 인간 혈장으로부터 IgG가 풍부한 분획을 단리할 수 있도록 한다. 몇 년 후에, 온클레이 등의 문헌 [Oncley et al., J.Am.Chem.Soc., 1949, 71(2): 541-550]은 더욱 순수한 IgG 제제를 단리하는 방법 (방법 9)을 공개함으로써 콘 방법을 확장하였다.
이러한 방법들은, 혈장 유래 혈액 인자의 전체 산업을 위한 기초를 쌓고 있긴 하지만, 가와사키 증후군, 면역 혈소판감소 자반병, 및 원발성 면역 결핍을 포함하여 몇 가지 면역-관련 질병의 치료를 위해서 충분히 높은 농도를 가진 IgG 제제를 제공할 수 없었다. 따라서, 더 높은 순도 및 더 높은 농도 IgG 제제를 제공하기 위하여 이온 교환 크로마토그래피와 같은 다양한 기술을 사용한 추가의 방법이 개발되었다. 문헌 [Hoppe et al., Munch Med Wochenschr 1967 (34): 1749-1752] 및 [Falksveden, 스웨덴 특허 348942호] 및 [Falksveden and Lundblad, Methods of Plasma Protein Fractionation 1980]은 이러한 목적을 위해 이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 첫 번째 것들이었다.
다양한 현대 방법은 침전 단계, 예컨대 카프릴레이트 침전 [Lebing et al., Vox Sang 2003 (84): 193-201] 및 컬럼 크로마토그래피에 결합된 콘(Cohn) 분획 (I+) II+III 에탄올 침전 [Tanaka et al., Braz J Med Biol Res 2000 (33) 37-30]을 사용한다. 가장 최근들어, 문헌 [Teschner et al., Vox Sang, 2007 (92): 42-55]은 모여진 혈장으로부터 먼저 저온-침전물을 제거한 다음 변형된 콘-온클레이(Cohn-Oncley) 냉각 에탄올 분획법을 수행하고, 이어서 중간체의 S/D 처리, 이온 교환 크로마토그래피, 나노여과 및 임의로 한외여과/정용여과를 수행하는, 10% IVIG 제품의 제조 방법을 기재하고 있다.
그러나, 이러한 IgG 제조 방법에 의해 부여되는 순도, 안전성 및 수율의 개선에도 불구하고, 피하 및/또는 근육내 투여에 적절한 고 농축 IgG 제제가 여전히 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 기타 요구를 충족하며, 안정하고 고 순도이고 바이러스 불활성화되고, 고 농도의 IgG를 가진 사용 준비된 제품의 제조 방법을 기재하고 있다.
발명의 요약
하나의 측면에서, 본 발명은 조성물 리터 당 약 180 그램 초과의 단백질을 포함하고 단백질의 적어도 95%가 IgG, 예컨대 인간 IgG인 수성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 피하 및 정맥내 투여에 적절한 제품을 유도하는 방법에 의해 제조되고, 10 내지 22%의 단백질 농도 범위에서 어느 농도로 조절되는지와 관계없이 바이러스를 불활성화하기 위해 최종 용기에서 승온에서 처리될 수 있다. 일부 경우에, 조성물에서 단백질 농도는 20% (w/w) 또는 약 20% (w/v)이다. 다른 경우에, 조성물은 약 0.1 내지 0.3M 글리신을 더 포함할 수도 있다. 본 발명의 조성물은 다양한 pH, 예컨대 약 3 내지 6, 또는 약 4 내지 6을 가질 수도 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 (1) 한외여과에 의하여 혈장 제제 내의 단백질을 5% (w/v) 또는 약 5% (w/v)로 농축하고; (2) 정용여과에 의하여 제제 내의 단백질을 20% (w/v) 또는 약 20% (w/v)로 더욱 농축하는 단계를 포함하는, 혈장으로부터 농축된 IgG의 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 조성물에서 언급되는 단백질의 적어도 95%가 IgG, 예컨대 인간 IgG이다. 일부 실시양태에서, 100 kDa 이하의 공칭 분자량 컷오프 (NMWCO)를 가진 한외여과 막을 사용하여 단계 (1)을 수행한다. 다른 실시양태에서, pH 4.2±0.1를 가진 글리신의 정용여과 완충액에 대해 단계 (2)를 수행한다. 일부 경우에 정용여과 완충액은 0.25M 글리신 및 pH 4.0을 갖는다. 일부 특정한 실시양태에서, 단계 (2) 다음의 단백질 농도는 20% (w/v)보다 높고, 이어서 정용여과 완충액에 의하여 20% (w/v) 또는 약 20% (w/v)로 조절한다.
다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계:
(1) 원심분리에 의하여 혈장으로부터 액체 및 침전물을 분리하고;
(2) 사전-냉각된 에탄올을 (1)로부터의 액체와 혼합하여, 약 8% (v/v)의 에탄올 농도를 가진 혼합물을 형성하고;
(3) 원심분리에 의하여 (2)의 혼합물로부터 액체 및 침전물을 분리하고;
(4) (3)으로부터의 액체의 pH 및 에탄올 농도를 각각 약 7.0 및 20-25% (v/v)로 조절하여 혼합물을 형성하고;
(5) 원심분리에 의하여 (4)의 혼합물로부터 액체 및 침전물을 분리하고;
(6) (5)의 침전물을 약 1 대 15의 중량비로 완충액으로 재현탁하여 현탁액을 형성하고;
(7) 이산화규소 (SiO2)를 (6)으로부터의 현탁액과 혼합하고, 여과에 의해 여액을 수득하고;
(8) 세제 및 냉각 알콜을 (7)의 여액과 혼합하고 원심분리에 의해 침전물을 수득하고;
(9) 용매 또는 세제를 포함하는 수용액에 침전물을 용해시키고, 용액을 적어도 60분 동안 유지하고;
(10) (9) 후의 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 통과시키고 컬럼 위에 흡수된 단백질을 용출물로 용출하고;
(11) (10)으로부터의 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 통과시켜 유출물을 얻고;
(12) 유출물을 나노필터에 통과시켜 나노여액을 얻고;
(13) 나노여액을 한외여과 막에 통과시켜 한외여액을 얻고;
(14) 한외여액을 정용여과 완충액에 대해 정용여과하여, 약 20% (w/v)의 단백질 농도를 가진 용액을 얻고;
(15) 0.2㎛ 이하의 필터를 통해 용액을 여과함으로써 (14)로부터의 용액을 살균하여, 이에 의해 농축된 IgG의 조성물을 수득하는 것을 포함하는,
혈장으로부터 농축된 IgG의 조성물의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 단계 (2)를 약 -2 내지 0 ℃의 온도에서 수행하거나; 또는 단계 (2)의 혼합물을 적어도 15분 동안 혼합한 다음 약 -2 내지 0 ℃의 온도에서 적어도 2시간 동안 유지한다. 일부 실시양태에서, 단계 (4)를 적어도 15분 동안 혼합한 다음 약 -7 ℃의 온도에서 적어도 8시간 동안 유지한다. 일부 실시양태에서, 단계 (6)의 현탁액을 약 2 내지 8 ℃의 온도 및 약 5.0의 pH에서 약 40-160분 동안 교반하거나; 또는 단계 (7)에서 이산화규소가 단계 (6)의 현탁액의 40 g/kg의 농도이고 약 2 내지 8 ℃의 온도에서 적어도 약 50분 동안 혼합을 수행한다. 일부 실시양태에서, 약 -5 내지 -10 ℃의 온도에서 단계 (8)을 수행한다. 일부 실시양태에서, 단계 (9)의 용액은 1.0% (v/v) 트리톤 X-100, 0.3%(v/v) 트윈-80 및 0.3% (v/v) 트리-(n-부틸)포스페이트 (TNBP)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (9)의 용액을 약 18 내지 25 ℃의 온도에서 유지한다. 일부 실시양태에서, 단계 (10)의 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 pH 5.5±0.1의 10 mM 아세테이트 완충액으로 세척하고, 35 mM 일염기성 인산나트륨, 10 mM 트리스, pH 8.5±0.1, 전도도 5.0±0.2 mS/cm의 완충액으로 용출한다. 일부 실시양태에서, 단계 (10)으로부터의 용출물을 단계 (11) 이전에 pH 6.4±0.2 및 약 1.5 내지 2.5 mS/cm의 전도도로 조절한다. 일부 실시양태에서, 단계 (12) 이전에 단계 (11)의 유출물을 0.2 ㎛ 이하의 공극 크기의 필터를 통해 통과시킨다. 일부 실시양태에서, 단계 (13)의 한외여액은 약 5±1% (w/v)의 단백질 농도를 갖는다. 다른 실시양태에서, 단계 (13)의 한외여과 막은 50 kDa 이하의 공칭 분자량 컷오프(NMWCO)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 단계(14)의 정용여과 완충액은 pH 4.2±0.1을 가진 0.25M 글리신 용액이다. 다른 실시양태에서, 단계(14)로부터의 용액은 20% (w/v) 초과의 단백질 농도를 갖고, 정용여과 완충액으로 약 20.4±0.4% (w/v)로 조절한다. 일부 실시양태에서, 단계 (13) 및 (14)를 약 2 내지 8 ℃의 온도에서 수행한다. 다른 실시양태에서, 제조 방법은 용기를 밀봉하기 전에 단계 (15)의 살균된 용액을 살균 조건 하에서 용기 내에 분배하는 단계를 더 포함한다.
다른 실시양태에서, 상기 기재된 방법은 밀봉된 용기를 약 30 내지 32 ℃에서 약 21 내지 22일 동안 보관하는 단계를 더 포함할 수도 있거나; 또는 방법은 20% IgG 제품을 당 기술수준의 10% 정맥내 제제만큼 안정하게 만드는 제형 단계를 더 포함할 수도 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 제조 방법에 의해 제조되고 적어도 18% (w/v) 면역글로불린, 예를 들어 적어도 20% (w/v) 면역글로불린을 포함하는 수성 조성물을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 면역결핍, 자가면역 질환 또는 급성 감염을 앓고 있는 환자의 치료 방법을 제공한다.
<도면의 간단한 설명>
도 1은 신규의 한외여과/정용여과 시스템의 그래프 도시이다.
정의
"항체"는 분석물 (항원)을 특이적으로 결합하고 인식하는, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들에 의해 실질적으로 코드화되는 폴리펩티드, 또는 그의 단편을 가리킨다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자 뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경 사슬은 카파 또는 람다로 분류된다. 중 사슬은 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되고, 이것은 다시 각각 면역글로불린 부류 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 한정한다.
일례의 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 폴리펩티드 사슬의 2개 쌍으로 구성되고, 각각의 쌍은 하나의 "경" (약 25 kD) 및 "중" 사슬 (약 50-70 kD)을 갖는다. 각각의 사슬의 N-말단은 주로 항원 인식의 책임이 있는 약 100 내지 110 이상의 아미노산의 가변 영역을 한정한다. 용어 가변 경 사슬 (VL) 및 가변 중 사슬 (VH)은 각각 경 및 중 사슬을 가리킨다.
용어 "한외여과(UF)"는 정수압이 반-투과성 막에 대해 액체를 강제로 보내는 막 여과 방법의 종류를 포함한다. 현탁된 고체 및 고 분자량의 용질이 유지되는 반면, 물 및 저 분자량 용질이 막을 통과한다. 거대분자 (103 - 106 Da) 용액, 특히 단백질 용액을 정제하고 농축하기 위하여 이러한 분리 방법이 종종 사용된다. 보유하는 분자의 크기에 의존하여 다수의 한외여과 막이 이용가능하다. 한외여과는 전형적으로 1 내지 1000 kDa의 막 공극 크기 및 0.01 내지 10 바아의 작동 압력을 특징으로 하고, 당류 및 염류와 같은 소 분자로부터 단백질과 같은 콜로이드를 분리하기 위해 특히 유용하다.
용어 "정용여과"는 한외여과와 동일한 막으로 수행되고 접선 유동방식 여과이다. 정용여과 동안에, 여액을 단위 공정으로부터 제거하면서 완충액을 재순환 탱크에 도입한다. 제품이 보유물 상태인 공정에서 (예를 들어, IgG), 제품으로부터의 정용여과 세척 성분을 여액에 모으고, 이에 의해 완충액을 교환하고 바람직하지 않은 종의 농도를 감소시킨다.
여기에서 사용된 용어 "약"은 특정한 값으로부터 + 또는 - 10%의 근사값 범위를 나타낸다. 예를 들어, 용어 "약 20%"는 18-22%의 범위를 포함한다.
용어 "혼합"은 어떠한 형태의 교반에 의하여 2 이상의 다른 화합물 또는 물질들을 용액 또는 현탁액에 동일하게 분포시키는 작업을 나타낸다. 이 용어가 본 출원에서 사용될 때, "혼합"의 결과로서 용액 또는 현탁액에서 모든 성분들의 완전히 동일한 분포가 요구되지는 않는다.
본 출원에서, 용어 "용매"는 하나 이상의 다른 물질을 용해시키거나 분산시킬 수 있는 액체 물질을 포함한다. 용매는 무기 성질, 예컨대 물일 수도 있거나, 또는 유기 액체, 예컨대 에탄올, 아세톤, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 헥산, 석유 에테르 등일 수도 있다. 용어 "용매 세제 처리"에서 사용된 바와 같이, 용매는 유기 용매 (예를 들어, 트리-N-부틸 포스페이트)를 나타내고, 이것은 용액 중의 액체-외피보유 바이러스를 불활성화하기 위해 사용되는 용매 세제 혼합물의 일부이다.
본 출원에서 용어 "세제"는 용어 "계면활성제" 또는 "표면 작용제"와 서로 바꾸어 사용된다. 계면활성제는 전형적으로 친양쪽성인 유기 화합물, 즉 소수성 기 ("꼬리부") 및 친수성 기 ("머리부") 양쪽 모두를 함유하는 화합물이고, 계면활성제를 유기 용매 및 물 양쪽 모두에 가용성으로 만든다. 계면활성제는 머리부에서 하전된 기의 존재에 의해 분류될 수 있다. 비-이온성 계면활성제는 그의 머리부에 전하 기를 갖지 않는 반면, 이온성 계면활성제는 그의 머리부에 순 전하를 보유한다. 양쪽이온성 계면활성제는 2개의 반대 하전 기를 가진 머리부를 함유한다. 일반적인 계면활성제의 일부 예는 음이온성 (술페이트, 술포네이트 또는 카르복실레이트 음이온 계): 퍼플루오로옥타노에이트 (PFOA 또는 PFO), 퍼플루오로옥탄술포네이트 (PFOS), 소듐 도데실 술페이트 (SDS), 암모늄 라우릴 술페이트, 및 기타 알킬 술페이트 염, 소듐 라우레트 술페이트 (또한 소듐 라우릴 에테르 술페이트, 또는 SLES로서 공지됨), 알킬 벤젠 술포네이트; 양이온성 (4급 암모늄 양이온 계): 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB), a.k.a.헥사데실 트리메틸 암모늄 브로마이드, 및 기타 알킬트리메틸암모늄 염, 세틸피리디늄 클로라이드(CPC), 폴리에톡시화 수지 아민 (POEA), 벤즈알코늄 클로라이드(BAC), 벤즈에토늄 클로라이드(BZT); 장쇄 지방산 및 그들의 염: 카프릴레이트, 카프릴산, 헵타노에이트, 헥산산, 헵탄산, 나논산, 데칸산, 등 포함; 양쪽이온성 (양쪽성): 도데실 베타인; 코카미도프로필 베타인; 코코 암포 글리시네이트; 비이온성: 알킬 폴리(에틸렌 옥시드), 알킬페놀 폴리(에틸렌 옥시드), 폴리(에틸렌 옥시드)와 폴리(프로필렌 옥시드)의 공중합체 (통상적으로 폴록사머 또는 폴록사민으로 공지됨), 옥틸 글루코시드, 데실 말토시드를 포함한 알킬 폴리글루코시드, 지방 알콜 (예, 세틸 알콜 및 올레일 알콜), 코카미드 MEA, 코카미드 DEA, 폴리소르베이트 (트윈 20, 트윈 80 등), 트리톤 세제 및 도데실 디메틸아민 옥시드를 포함한다.
여기에서 사용된 용어 "정맥내 IgG" 또는 "IVIG" 치료란 일반적으로 면역 결핍, 염증성 질환 및 자가면역 질환과 같은 다수의 상태를 치료하기 위해 환자에게 IgG 면역글로불린 조성물을 정맥내, 피하 또는 근육내 투여하는 치료 방법을 가리킨다. IgG 면역글로불린을 전형적으로 혈장으로부터 모으고 제조한다. 전 항체 또는 그의 단편이 사용될 수 있다. IgG 면역글로불린은 피하 투여를 위해 고 농도 (예를 들어 10% 초과)로 제형되거나, 또는 근육내 투여를 위해 제형될 수 있다. 이것은 특히 특정한 항원 (예를 들어, Rho D 인자, 백일해 독소, 파상풍 독소, 보툴리누스 독소, 광견병 등)을 위해 평균 역가보다 높은 값으로 제조된 특수 IgG 제제를 위해 일반적이다. 용이한 언급을 위하여, 이러한 피하 또는 근육내 제형된 IgG 조성물이 본 출원에서 용어 "IVIG"에 포함된다.
"치료적 유효량 또는 투여량" 또는 "충분/유효량 또는 투여량"이란, 투여되는 효과를 일으키는 용량을 의미한다. 실제 투여량은 치료 목적에 의존하고, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있다 (예를 들어 [Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vol. 1-3, 1992)]; [Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)]; [Pickar, Dosage Calculations (1999)]; 및 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro,Ed., Lippincott, Williams & Wilkins] 참조; 이들의 개시내용은 모든 목적을 위하여 전문이 본원에 참고로 포함된다).
현대 의학에서 일상적으로 실행되는 바와 같이, 3개 주된 부류: 면역 결핍, 염증성 및 자가 면역 질환, 및 급성 감염에 속하는 의학적 상태를 치료하기 위하여 농축된 면역글로불린의 무균 제제 (특히 IgGs)가 사용된다. 하나의 일반적으로 사용되는 IgG 제품인, 정맥내 면역글로불린 또는 IVIG이 예를 들어 10% 농도로 정맥내 투여를 위해 제형된다. 농축된 면역글로불린은 피하 또는 근육내 투여를 위해 예를 들어 약 20% 농도로 제형될 수도 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 모여진 혈장으로부터 고 순도 및 고 농축 면역글로불린 조성물을 제조하기 위한 신규의 개선된 방법에 관한 것이다. 앞서 사용된 IgG 정제 및 농축 방법에 비하여, 본 발명자들은 한외여과 및 제형 단계를 포함하고, 그 결과 최종 제제에서 상당한 IgG 손실없이 높은 IgG 농도가 얻어지고 낮은 pH를 유지한다. 전형적으로, 제품은 적어도 18% 중량/부피 (w/v)의 단백질 농도를 갖고, 이것의 대부분 (전형적으로 95% 이상)이 IgG이고, pH는 3 내지 6의 범위이며, 혈장에 존재할 수도 있는 바이러스와 같은 병원체의 불활성화를 촉진한다. 높은 IgG 농도 및 투여 시에 감소된 부피에 기인하여, 본 발명의 제품은 피하 및/또는 근육내 투여를 위해 적절하다. 일부 실시양태에서, IgG 제품은 18 mPascal-초 이하의 점도를 가지며, 따라서 정맥내 투여를 위해 적절할 수도 있다. 정맥내 제품을 위한 품질 속성을 피하 및 근육내 제품을 위해 요구되는 고 농도와 조합할 가능성에 기인하여, 단순한 희석이 정맥내 투여를 가능하게 할 수 있다. 본 발명의 IgG 조성물의 추가의 장점은 이들이 보관 동안에 뛰어난 안정성을 갖는다는 것이다.
특정한 측면에서, 본 발명은 약 17% 초과의 최종 단백질 농도 및 적어도 약 95%의 IgG 순도를 가진 고 농축 IgG 제제의 제조 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 제제는 연장된 안정성을 갖고 정맥내, 피하 및/또는 근육내 투여를 위해 제형된다.
다른 측면에서, 본 발명은 제약 조성물 및 여기에 제공된 개선된 제조 방법에 따라 제조된 IgG 조성물의 제형을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 이러한 조성물 및 제형은 시판되는 다른 IVIG 조성물에 비하여 개선된 성질을 제공한다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 여기에 제공된 조성물 및 제형은 연장된 기간 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 여기에 제공된 조성물 및 제형은 시판되는 다른 IVIG 조성물에 비하여 높은 IgG 농도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 여기에 제공된 조성물 및 제형은 높은 IgG 농도를 갖고 연장된 기간 동안 안정하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 여기에 제공된 개선된 방법을 사용하여 제조된 IgG 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역 결핍, 염증성 및 자가면역 질환, 및 급성 감염의 치료 방법을 제공한다.
I. 농축되고 정제된
IgG
제제의 제조
특정한 자가면역 상태의 치료를 위하여 전 항체를 포함하는 IVIG 조성물이 기재되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 US 2002/0114802, US 2003/0099635 및 US 2002/0098182 참조). 참고문헌에 개시된 IVIG 조성물은 다클론성 항체를 포함한다.
일반적으로, 본 발명에 따른 면역글로불린 제제는 적절한 출발 물질, 예를 들어 회수된 혈장 또는 원료 혈장으로부터 제조될 수 있다. 전형적인 예에서, 건강한 공여자로부터 혈액 또는 혈장을 수집한다. 통상, 면역글로불린 제제를 투여하는 대상체와 동일한 종의 동물로부터 혈액을 수집한다 (전형적으로, "상동성" 면역글로불린이라 일컬음). 면역글로불린을 적절한 절차, 예를 들어 침전 (알콜 분획법 또는 폴리에틸렌 글리콜 분획법), 크로마토그래피 방법 (이온 교환 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 면역친화력 크로마토그래피), 초원심분리 및 전기영동 제조 등에 의하여 혈액으로부터 단리한다 (예를 들어, 문헌 [Cohn et al., J.Am.Chem.Soc. 68: 459-75 (1946)]; [Oncley et al., J.Am.Chem.Soc. 71:541-50 (1949)]; [Barundern et al., Vox Sang. 7: 157-74 (1962)]; [Koblet et al., Vox Sang. 13: 93-102 (1967)]; 미국 특허 5,122,373 및 5,177,194 (이들의 개시내용은 본원에서 모든 목적을 위해 참고로 포함된다) 참조).
상기 기재된 방법과 달리, 하나의 측면에서 본 발명은 저온-불량(cryo-poor) 출발 물질을 이용하는 농축 IgG 조성물의 제조 방법을 제공한다. 일반적으로, 여기에 제공된 방법은, 개선되지 않는다면 현재 이용가능한 시판 IVIG 제제에서 발견되는 것과 동일한 품질을 유지하면서, 뛰어난 IgG 수율을 제공하기 위하여 변형된 콘-온클레이 알콜 분획법 단계 및 이온 교환 크로마토그래피 양쪽 모두를 이용한다.
많은 경우에, 당업자에게 공지된 알콜 분획법 및/또는 이온 교환 및 친화력 크로마토그래피 방법에 의해 제조된 감마 글로블린-함유 제품으로부터 면역글로불린을 제조한다. 정제된 콘 분획 II가 보통 사용된다. 출발 콘 분획 II 페이스트는 전형적으로 약 95% IgG이고, 4개의 IgG 아형으로 이루어진다. 이들이 수득되는 모여진 인간 혈장에서 발견되는 것과 대략 동일한 비율로 상이한 아형이 분획 II에 존재한다. 투여가능한 제품으로 제형하기 전에 분획 II를 더욱 정제한다. 예를 들어, 분획 II 페이스트를 냉각 정제된 수성 알콜 용액에 용해시키고, 침전 및 여과를 통해 불순물을 제거한다. 최종 여과 후에, 알콜을 제거하기 위하여 면역글로불린 현탁액을 투석하거나 정용여과할 수 있다 (예를 들어, 100,000 달톤 이하의 공칭 분자량 한계를 가진 한외여과 막을 사용). 원하는 단백질 농도를 수득하기 위하여 용액을 농축하거나 희석할 수 있고, 당업자에게 공지된 기술에 의해 더욱 정제할 수 있다.
특정한 동종형 또는 아형의 면역글로불린을 풍부하게 하기 위하여 준비 단계를 사용할 수 있다. 예를 들어, IgG 또는 특정한 IgG 아형을 위한 면역글로불린의 혼합물을 풍부하게 하기 위해 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 H 세파로스 크로마토그래피가 사용될 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Harlow and Lane, Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999); Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); 미국 특허 5,180,810] 참조).
하기 상술되는 바와 같이, 본 발명의 고 농도 IgG 제품은 IVIG의 제조 방법에서와 동일하거나 유사한 많은 단계를 가진 방법에 의해 제조된다. 제조 공정의 마지막 근처에서 특정하게 고안된 후-세척 및 제형과 함께 개방 채널 막을 사용한 한외여과/정용여과의 추가의 단계는, 수율 및 보관 안정성에 영향을 미치지 않으면서, 얻어지는 IgG 조성물을 현재 기술상태의 IVIG (예를 들어, GAMMAGARD® LIQUID)에 비하여 대략 2배 만큼 높은 단백질 농도 (200 mg/mL)로 만든다. 대부분의 통상적으로 입수가능한 한외여과 막에 의해서는 주 단백질 손실 없이 200 mg/mL IgG의 농도에 도달될 수 없다. 이러한 막은 조기에 차단될 것이고, 따라서 적절한 후-세척을 달성하기 곤란하다. 따라서, 개방 채널 막 배열이 사용되어야 한다. 심지어 개방 채널 막에 의하여, 상당한 단백질 손실없이 (2% 미만의 손실) 필요한 농도를 수득하기 위하여 특정하게 고안된 후-세척 절차가 사용되어야 한다. 심지어 더욱 놀라운 것은, 200 mg/mL의 고 단백질 농도가 낮은 pH 보관 단계의 바이러스 불활성화 능력에 영향을 미치지 않는다는 사실이다. 고 농도 IgG 조성물의 일반적인 제조 방법은 하기 단계를 포함한다:
A. 저온침전물의 분리
정제 방법은 전형적으로, 이미 안전성 및 품질 고려사항을 점검한, 미리 동결된 모여진 혈장을 해동시키는 것으로 시작한다. 해동은 전형적으로 6 ℃ 이하의 온도에서 수행된다. 보통 해동과 동일한 저온에서, 혈장을 해동시킬 때 고체 및 액체를 분리하기 위하여 원심분리 또는 여과를 냉각 상태로 수행한다. 액체 부분 (또한, "저온-불량 혈장"이라 일컬어짐, 새로 해동된 혈장으로부터 원심분리 또는 여과에 의해 냉-불용성 단백질을 제거한 후)을 이후의 단계에서 더욱 처리한다. 이때에 실시예 1에 상술된 바와 같이 제8 인자 항체 우회 활성(FEIBA), 인자 IX-착물, 인자 VII-농축물, 또는 항트롬빈 III-착물의 단리를 위하여 다양한 추가의 단계를 취할 수 있다.
B. 분획법 I의
상층액을
수득한다
이 단계에서, 저온-불량 혈장을 전형적으로 약 0 ± 1 ℃에서 냉각하고, pH를 약 7.0으로 조절한다. 특정한 실시양태에서, pH를 약 7.0 내지 약 7.5, 바람직하게는 약 7.1 내지 약 7.3, 가장 바람직하게는 약 7.2로 조절한다. 하나의 실시양태에서, pH를 약 7.0으로 조절한다. 다른 실시양태에서, pH를 약 7.1로 조절한다. 다른 실시양태에서, pH를 약 7.2로 조절한다. 다른 실시양태에서, pH를 약 7.3으로 조절한다. 다른 실시양태에서, pH를 약 7.4로 조절한다. 다른 실시양태에서, pH를 약 7.5로 조절한다. 혈장을 교반하면서, 8% v/v의 에탄올의 표적 농도까지 사전-냉각된 에탄올을 첨가한다. 동시에, α2-마크로글로블린, β1A- 및 β1C-글로블린, 피브리노겐 및 인자 VIII와 같은 오염물을 침전시키기 위하여 온도를 약 -4 내지 약 0 ℃, 바람직하게는 약 -2 ℃로 더욱 낮춘다. 전형적으로, 더 짧거나 긴 유지 시간을 사용할 수도 있긴 하지만, 침전은 적어도 약 1시간의 유지 시간을 포함할 것이다. 이어서, 이상적으로 저온-불량 혈장에 존재하는 IgG 내용물의 전체를 함유하는 상층액 (상층액 I)을 원심분리, 여과 또는 기타 적절한 방법에 의해 수집한다.
C, 분획법
II
+
III
의 침전
IgG 함량 및 분획법 순도를 더욱 풍부하게 하기 위하여, 상층액 I을 두 번째 침전 단계로 처리한다. 일반적으로, 용액의 pH를 약 6.8 내지 약 7.2, 바람직하게는 약 7.0의 pH로 조절한다. 약 20% 내지 약 25% (v/v)의 최종 농도로 교반하면서 알콜, 바람직하게는 에탄올을 용액에 첨가한다. 하나의 실시양태에서, 알콜의 최종 농도는 약 20%이다. 다른 실시양태에서, 최종 알콜 농도는 약 (21%)이다. 다른 실시양태에서, 최종 알콜 농도는 약 22%이다. 다른 실시양태에서, 최종 알콜 농도는 약 23%이다. 다른 실시양태에서, 최종 알콜 농도는 약 24%이다. 다른 실시양태에서, 최종 알콜 농도는 약 25%이다. 분획 II+III 상층액으로 일컬어지는 액체 부분을 더욱 처리하여 인자 V를 추출할 수 있다. 이러한 단계로부터의 침전물을 이후의 단계에서 더욱 처리한다. 하나의 실시양태에서, 단계 B 및 C를 함께 수행할 수 있다.
D. 분획법
II
및
III
침전물로부터의 추출
추출 완충액 15부 중에 침전물 1 부의 전형적인 비율로 분획 II+III 침전물을 재현탁하기 위하여 냉 추출 완충액을 사용한다. 일례의 추출 완충액은 5 mM 일염기성 인산나트륨 및 5 mM 아세테이트를 함유하고, 약 4.5±0.2의 pH 및 약 0.7 내지 0.9 mS/cm의 전도도를 갖는다. 하나의 실시양태에서, 추출 완충액의 전도도는 약 0.7 mS/cm이다. 다른 실시양태에서, 추출 완충액의 전도도는 약 0.8 mS/cm이다. 또 다른 실시양태에서, 추출 완충액의 전도도는 약 0.9 mS/cm이다. 약 2 내지 8 ℃의 온도에서 추출 방법을 수행한다.
예를 들어 약 1:8 내지 약 1:30, 또는 약 1:10 내지 약 1:20, 또는 약 1:12 내지 약 1:18, 또는 약 1:13 내지 약 1:17, 또는 약 1:14 내지 약 1:16의 다른 적절한 재-현탁 비율을 사용할 수도 있다. 특정한 실시양태에서, 재-현탁 비율은 약 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30 또는 그 이상일 수도 있다.
II+III 침전물의 추출을 위해 적절한 용액은 일반적으로 약 4.0 내지 약 5.5의 pH를 가질 것이다. 특정한 실시양태에서, 용액은 약 4.0 내지 약 5.0의 pH를 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 용액은 약 4.5 내지 약 5.0의 pH를 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 추출 용액은 약 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4 또는 5.5의 pH를 가질 것이다. 하나의 실시양태에서, 추출 완충액의 pH는 약 4.5일 것이다. 다른 실시양태에서, 추출 완충액의 pH는 약 4.6일 것이다. 다른 실시양태에서, 추출 완충액의 pH는 약 4.7일 것이다. 다른 실시양태에서, 추출 완충액의 pH는 약 4.8일 것이다. 다른 실시양태에서, 추출 완충액의 pH는 약 4.9일 것이다. 다른 실시양태에서, 추출 완충액의 pH는 약 5.0일 것이다.
추출 완충액은 바람직하게는 약 0.5 mS·cm-1 내지 약 2.0 mS·cm-1의 전도도를 갖는다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 추출 완충액의 전도도는 약 0.5 mS·cm-1이거나, 또는 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 약 2.0 mS·cm-1일 것이다. 당업자라면 적절한 전도도를 가진 추출 완충액을 어떻게 생성하는지 알 것이다.
E. 발연 실리카 처리 및 여과
일부 실시양태에서, 발연 실리카 (예, 에어로실 380 또는 균등물)를 마지막 단계에서 약 40 g/kg 현탁액의 농도로, 또는 1.8 g/리터 저온-불량 혈장에 균등한 농도로 현탁액에 첨가한다. 혼합이 적어도 50 내지 70 분 동안 약 2 내지 8 ℃에서 일어난다. 일부 경우에, 여과에 의해 액체/고체 분리의 이후 단계를 촉진하기 위하여 여과 보조제 (예, 하이플로-서퍼-셀(Hyflo-Supper-Cel), World Minerals, 약 0.5 kg/kg 현탁액의 농도로 사용됨)를 첨가한다. 필터 프레스의 후-세척을 위하여 추출 완충액을 사용한다. 여과 과정을 약 2 내지 8 ℃에서 유지한다.
F. 침전물 G의 분획법
마지막 단계로부터의 여액을 약 2 내지 8 ℃의 온도에서 적어도 30분 동안 교반하면서 약 0.2 % w/v의 농도로 폴리소르베이트-80과 혼합한다. 시트르산나트륨 탈수물을 약 2 내지 8 ℃의 온도에서 약 8 g/리터로 추가 30분 동안 교반하면서 용액에 혼합한다. 이어서, 용액의 pH를 약 7.0±0.1로 조절한다. 특정한 실시양태에서, 수산화나트륨 또는 아세트산으로 pH를 조절한다. 냉각 알콜을 약 25% v/v의 농도로 용액에 첨가하고, 콘 II와 유사한 침전 단계를 수행한다.
G. 침전물 G의
현탁
마지막 단계로부터의 침전물을 용해시키고 0.2 ㎛의 공칭 공극 크기 (예, 쿠노 VR06 필터 또는 균등물)의 깊이 필터로 여과하여 투명한 여액을 수득한다. 다른 실시양태에서, 침전물을 용해시킨 다음 원심분리하여 정화된 상층액을 회수한다.
H. 용매 및 세제 처리
용매-/세제 처리를 위하여 마지막 단계로부터의 여액을 사용한다. 전형적인 용매/세제 처리 혼합물은 1.0% (v/v) 트리톤 X-100, 0.3% (v/v) 트윈-80, 및 0.3% (v/v) TNBP를 포함하고, 혼합물을 전형적으로 약 18 내지 25 ℃의 온도에서 적어도 60분 동안 유지시켰다. 혈장 유래 분획의 세제 처리를 위한 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 여기에 제공된 방법과 함께 표준 비-이온성 세제 처리를 사용할 수도 있다.
I. 양이온 교환 크로마토그래피
S/D 처리 PptG 여액로부터 IgG를 더욱 정제하고 농축하기 위하여, 양이온 교환 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피를 사용할 수도 있다. 이온 교환 크로마토그래피를 사용한 IgG의 정제 및 농축 방법이 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,886,154호는 분획 II+III 침전물을 낮은 pH (약 3.8 내지 4.5)에서 추출한 다음, 카프릴산을 사용하여 IgG의 침전을 수행하고 마지막으로 2개의 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 실행하는 방법을 설명하고 있다. 미국 특허 6,069,236은 알콜 침전에 전혀 의존하지 않는 크로마토그래피 IgG 정제 계획을 설명한다. PCT 공개 번호 WO 2005/073252는 분획 II+III 침전물의 추출, 카프릴산 처리, PEG 처리, 및 단일 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함한 IgG 정제 방법을 설명한다. 미국 특허 7,186,410호는 분획 I+II+III 또는 분획 II 침전물의 추출에 이어서 알칼리성 pH에서 수행되는 단일 음이온 교환 단계를 포함하는 IgG 정제 방법을 설명한다. 미국 특허 7,553,938호는 분획 I+II+III 또는 분획 II+III 침전물의 추출, 카프릴레이트 처리, 및 1 또는 2개의 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함한 방법을 설명한다. 미국 특허 6,093,324호는 약 6.0 내지 약 6.6의 pH에서 작동되는 거대공극 음이온 교환 수지를 사용하는 것을 포함하는 정제 방법을 설명하고 있다. 미국 특허 6,835,379호는 알콜 분획법의 부재 하에서 양이온 교환 크로마토그래피에 의존하는 정제 방법을 설명하고 있다.
하나의 실시양태에서, 마지막 단계로부터의 용매/세제 함유 단백질 용액을 양이온 교환 컬럼을 통해 통과시켜 용매 및 세제를 제거한다. SD 시약을 세척해낸 후에, 흡수된 단백질을 높은 pH 용출 완충액으로 용출한다. 하나의 실시양태에서, 용출 완충액은 약 7.5 내지 약 9.5의 pH를 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 용출 완충액은 약 8.0 내지 약 9.0의 pH를 가질 것이다. 바람직한 실시양태에서, 용출 완충액은 약 8.5±0.1의 pH를 가질 것이다.
J. 음이온 교환 크로마토그래피
마지막 단계로부터의 용출물을 pH 6으로 조절하고 하기 평형화 음이온 교환 컬럼을 위하여 적절한 전도도로 희석한다. 추가의 처리를 위하여 부하 및 세정 동안에 컬럼 유동물을 수집한다.
K. 나노여과
여기에 제공된 IgG 조성물의 바이러스 부하를 더욱 감소시키기 위하여, 적절한 나노여과 장치를 사용하여 음이온 교환 컬럼 유출물을 나노여과할 수도 있다. 특정한 실시양태에서, 나노여과 장치는 약 15 nm 내지 약 200 nm의 평균 공극 크기를 가질 것이다. 이러한 사용을 위해 적절한 나노필터의 예는, 이에 한정되지 않지만, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), 비리졸브(Viresolve) NFP, 비리졸브 NFR (밀리포어), 플라노바(Planova) 15N, 20N, 35N 및 75N (플라노바)을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 나노필터는 약 15 nm 내지 약 72 nm, 또는 약 19 nm 내지 약 35 nm, 또는 약 15 nm, 19 nm, 35 nm 또는 72 nm의 평균 공극 크기를 가질 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 나노필터는 약 35 nm의 평균 공극 크기를 가질 것이고, 예컨대 아사히 플라노바(Asahi PLANOVA) 35N 필터 또는 그의 균등물이다.
L.
한외여과
및
정용여과
나노여과에 이어서, 한외여과에 의하여 여액을 5±1% (w/v)의 단백질 농도까지 더욱 농축한다. 일부 예에서, 개방 채널 스크린을 가진 상자에서 한외여과를 수행하고, 한외여과 막은 50 kDa 이하의 공칭 분자량 컷오프 (NMWCO)를 갖는다.
하나의 실시양태에서, 나노여액을 한외여과에 의하여 약 2% 내지 약 10% (w/v)의 단백질 농도로 농축할 수도 있다. 특정한 실시양태에서, 개방 채널 스크린을 가진 상자에서 한외여과를 수행하고, 한외여과 막은 약 100 kDa 미만, 또는 약 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 미만 또는 그 미만의 kDa의 공칭 분자량 컷오프(NMWCO)를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 한외여과 막은 50 kDa 이하의 NMWCO를 갖는다.
한외여과 단계의 완결 시에, 정맥내 또는 근육내 투여에 적절한 용액에 대해 정용여과를 통하여 농축물을 더욱 농축할 수도 있다. 특정한 실시양태에서, 정용여과 용액은 안정화 및/또는 완충제를 포함할 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 안정화 및 완충제는 적절한 농도, 예를 들어 약 0.20M 내지 약 0.30M, 또는 약 0.22M 내지 약 0.28M, 또는 약 0.24M 내지 약 0.26mM, 또는 약 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3.0의 농도의 글리신이다. 바람직한 실시양태에서, 정용여과 완충액은 약 0.25M 글리신을 함유한다.
바람직한 실시양태에서, 한외여과 단계의 완결 시에, 농축물을 낮은 pH를 가진 0.25M 글리신 용액에 대해 정용여과한다. 전형적으로, 최소 교환 부피는 원래 농축물 부피의 6배이고, 용액을 20% w/v 초과의 단백질 농도로 농축하였다. 정용여과 및 농축 과정 후에, 용액의 pH는 전형적으로 4.4 내지 4.9였다.
전형적으로, 최소 교환 부피는 원래 농축물 부피의 적어도 약 3배이거나 또는 원래 농축물 부피의 적어도 약 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 배이다. IgG 용액을 약 5% 내지 약 22% (w/v) 또는 약 10% 내지 약 22% (w/v), 또는 약 15% 내지 약 22% (w/v), 또는 약 18% 내지 약 22% (w/v), 또는 약 20% 내지 약 22%의 최종 단백질 농도로, 또는 약 5% 또는 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22% 또는 그 이상의 최종 농도로 농축할 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, IgG 용액을 약 20% 내지 22%의 최종 단백질 농도로 농축한다. 전형적으로, 농축 과정이 끝나면, 용액의 pH가 약 4.6 내지 5.1일 것이다.
M. 제형
정용여과 단계의 완료 시에, 용액의 단백질 농도를 정용여과 완충액으로 약 5% 내지 약 20% (w/v), 또는 약 10% 내지 약 20% (w/v), 또는 약 15% 내지 약 20% (w/v), 또는 약 18% 내지 약 20%(w/v), 또는 약 5%, 또는 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%의 최종 농도로 조절한다. 바람직한 실시양태에서, 용액의 최종 단백질 농도는 약 19% 내지 약 21%의 범위이다. 바람직한 실시양태에서, 정용여과의 완결 시에, 용액의 단백질 농도는 정용여과 완충액으로 20% w/v 초과, 예를 들어 약 20.4±0.4% (w/v)로 조절된다.
N. 추가의 살균
0.2 마이크로미터 이하의 절대 공극 크기를 가진 막 필터를 통해 먼저 여과함으로써 제형된 벌크 용액을 더욱 살균한다. 이어서, 시험을 위해 샘플을 취하고, 용액을 적절한 밀봉을 위해 최종 용기 내로 무균 분배한다. 최종 단계를 30 내지 32 ℃의 온도에서 장 기간, 예를 들어 21 내지 22일 동안 밀봉 용기에 보관한다.
II
. 농축된
IgG
조성물
하나의 측면에서, 본 발명은 여기에 제공된 방법에 의해 제조된 수성 IgG 조성물에 관한 것이다. 일반적으로, 여기에 기재된 신규 방법에 의해 제조되는 IgG 조성물은 높은 IgG 함량 및 순도를 가질 것이다. 예를 들어, 여기에 제공된 IgG 조성물은 적어도 약 15% (w/v)의 단백질 농도 및 90% 순도 초과의 IgG 함량을 가질 수도 있다. 이러한 고 순도 IgG 조성물은 치료 투여를 위해, 예를 들어 피하 및/또는 근육 투여를 위해 적절하다. 하나의 실시양태에서, 여기에 제공된 IgG 조성물은 예를 들어 투여 전에 희석함으로써 정맥내 투여를 위해 적절하다. 하나의 실시양태에서, IgG의 농도는 약 20%이고, 피하 또는 근육내 투여를 위해 사용된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은
(1) 원심분리에 의해 혈장으로부터 액체 및 침전물을 분리하고;
(2) 사전-냉각된 에탄올을 (1)로부터의 액체와 혼합하여, 약 8% (v/v)의 에탄올 농도를 가진 혼합물을 형성하고;
(3) 원심분리에 의하여 (2)의 혼합물로부터 액체 및 침전물을 분리하고;
(4) (3)으로부터의 액체의 pH 및 에탄올 농도를 각각 약 7.0 및 20-25% (v/v)로 조절하여 이에 의해 혼합물을 형성하고;
(5) 원심분리에 의해 (4)의 혼합물로부터 액체 및 침전물을 분리하고;
(6) (5)의 침전물을 약 1 대 15 중량비의 비율로 완충액으로 재현탁하여 현탁액을 형성하고;
(7) 이산화규소(SiO2)를 (6)으로부터의 현탁액과 혼합하고, 여과에 의해 여액을 수득하고;
(8) 세제 및 냉각 알콜을 (7)의 여액과 혼합하고 원심분리에 의해 침전물을 수득하고;
(9) 침전물을 용매 또는 세제를 포함한 수용액에 용해시키고, 용액을 적어도 60분 동안 유지하고;
(10) (9) 후의 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 통과시켜 컬럼 위에 흡수된 단백질을 용출물로 용출하고;
(11) (10)으로부터의 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 통과시켜 유출물을 얻고;
(12) 유출물을 나노필터에 통과시켜 나노여액을 얻고;
(13) 나노여액을 한외여과 막에 통과시켜 한외여액을 얻고;
(14) 한외여액을 정용여과 완충액에 대해 정용여과하여 약 20% (w/v)의 단백질 농도를 가진 용액을 얻고;
(15) 0.2 ㎛ 이하의 필터를 통해 용액을 여과함으로써 (14)로부터 용액을 살균하고 이에 의해 농축된 IgG의 조성물을 수득하는
단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 수성 IgG 조성물을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 약 150 g/L 내지 약 250 g/L의 단백질 농도를 포함하는 수성 IgG 조성물을 제공한다. 특정한 실시양태에서, IgG 조성물의 단백질 농도는 약 175 g/L 내지 약 225 g/L, 또는 약 200 g/L 내지 약 225 g/L이고, 또는 이러한 범위 내의 적절한 농도, 예를 들어 약 150 g/L, 155 g/L, 160 g/L, 165 g/L, 170 g/L, 175 g/L, 180 g/L, 185 g/L, 190 g/L, 195 g/L, 200 g/L, 205 g/L, 210 g/L, 215 g/L, 220 g/L, 225 g/L, 230 g/L, 235 g/L. 240 g/L, 245 g/L, 250 g/L 또는 그 이상이다. 바람직한 실시양태에서, 수성 IgG 조성물은 약 200 g/L의 단백질 농도를 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 수성 IgG 조성물은 약 204 g/L의 단백질 농도를 포함한다.
여기에 제공된 방법은 매우 높은 수준의 순도를 가진 IgG 조성물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현양태에서, 여기에 제공된 조성물 중의 총 단백질의 적어도 약 95%는 IgG일 것이다. 다른 실시양태에서, 단백질의 적어도 약 96%는 IgG이거나 또는 조성물의 총 단백질의 적어도 약 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 그 이상은 IgG일 것이다.
유사하게, 여기에 제공된 방법은 매우 낮은 수준의 오염 인자를 함유하는 IgG 조성물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 약 100 mg/L IgA 미만을 함유하는 IgG 조성물이 제공된다. 다른 실시양태에서, IgG 조성물은 약 50 mg/L 미만의 IgA, 바람직하게는 약 35 mg/L 미만의 IgA, 가장 바람직하게는 약 20 mg/L 미만의 IgA를 함유할 것이다.
III
. 제약 조성물
다른 측면에서, 본 발명은 여기에 제공된 방법에 의해 제조되는 정제된 IgG를 포함하는 제약 조성물 및 제제를 제공한다. 일반적으로, 여기에 기재된 신규 방법에 의해 제조되는 IgG 제약 조성물 및 제제는 높은 IgG 함량 및 순도를 가질 것이다. 예를 들어, 여기에 제공된 IgG 제약 조성물 및 제제는 적어도 약 15% (w/v)의 단백질 농도 및 90% 초과 순도의 IgG 함량을 가질 수도 있다. 이러한 고 순도 IgG 조성물은 치료적 투여를 위해, 예를 들어 피하 및/또는 근육내 투여를 위해 적절하다. 하나의 실시양태에서, 여기에 제공된 IgG는 예를 들어 투여 전에 희석함으로써 정맥내 투여를 위해 적절하다. 하나의 실시양태에서, IgG의 농도는 약 20%이고, 피하 또는 근육내 투여를 위해 사용된다.
하나의 실시양태에서, 여기에 제공된 제약 조성물은 여기에 제공된 방법을 사용하여 단리된 수성 IgG 조성물을 제형함으로써 제조된다. 일반적으로, 제형된 조성물을 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개, 가장 바람직하게는 적어도 3개의 바이러스 불활성화 또는 제거 단계로 처리한다. 여기에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 바이러스 불활성화 또는 제거 단계의 비-제한적 예는 용매 세제 처리 ([Horowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis, 1994 (5 Suppl 3): S21-S28] 및 [Kreil et al., Transfusion 2003 (43): 1023-1028] (양쪽 모두 모든 목적을 위하여 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)), 나노여과 ([Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56) 230-236] 및 [Yuasa et al., J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)): 2021-2024] (양쪽 모두 본원에서 모든 목적을 위하여 그 전문이 참고로 포함된다)), 및 높은 온도에서의 낮은 pH 배양 ([Kempf et al., Transfusion 1991 (31) 423-427] 및 [Louie et al., Biologicals 1994 (22): 13-19])을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 약 175 g/L IgG 내지 약 225 g/L IgG의 IgG 함량을 가진 제약 제제가 제공된다. 일반적으로, 여기에 기재된 방법을 사용하여 혈장으로부터 IgG 조성물을 단리하고, 조성물을 농축하고, 정맥내 투여에 적절한 용액으로 농축된 조성물을 제형함으로써 IVIG 제제가 제조된다. IgG 조성물은 당업자에게 공지된 적절한 방법을 사용하여 농축될 수도 있다. 하나의 실시양태에서, 조성물은 한외여과/정용여과에 의해 농축된다. 일부 실시양태에서, 조성물을 농축하기 위해 사용되는 한외여과 장치는 약 100 kDa 미만, 또는 약 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 kDa 미만 또는 그 미만의 공칭 분자량 컷오프 (NMWCO)를 가진 한외여과 막을 사용할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 한외여과 막은 50 kDa 이하의 NMWCO를 갖는다. 당업자에게 공지된 적절한 기술을 사용하여 완충액 교환을 달성할 수도 있다. 특정한 실시양태에서, 정용여과에 의하여 완충액 교환이 달성된다.
특정한 실시양태에서,
(1) 원심분리에 의해 혈장으로부터 액체 및 침전물을 분리하고;
(2) 사전-냉각된 에탄올을 (1)로부터의 액체와 혼합하여, 약 8% (v/v)의 에탄올 농도를 가진 혼합물을 형성하고;
(3) 원심분리에 의하여 (2)의 혼합물로부터 액체 및 침전물을 분리하고;
(4) (3)으로부터의 액체의 pH 및 에탄올 농도를 각각 약 7.0 및 20-25% (v/v)로 조절하여 혼합물을 형성하고;
(5) (4)의 혼합물로부터 원심분리에 의해 액체 및 침전물을 분리하고;
(6) (5)의 침전물을 약 1 대 15의 중량비로 완충액으로 재현탁하여 현탁액을 형성하고;
(7) 이산화규소 (SiO2)를 (6)으로부터의 현탁액과 혼합하고, 여과에 의해 여액을 수득하고;
(8) 세제 및 냉각 알콜을 (7)의 여액과 혼합하고, 침전물을 원심분리에 의해 수득하고;
(9) 용매 또는 세제를 포함하는 수용액에 침전물을 용해시키고, 용액을 적어도 60분 동안 유지하고;
(10) (9) 후의 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 통과시키고, 컬럼에 흡수된 단백질을 용출물로 용출하고;
(11) (10)으로부터의 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 통과시켜 유출물을 얻고;
(12) 유출물을 나노필터에 통과시켜 나노여액을 얻고;
(13) 나노여액을 한외여과 막에 통과시켜 한외여액을 얻고;
(14) 한외여액을 정용여과 완충액에 대해 정용여과하여, 약 20% (w/v)의 단백질 농도를 가진 용액을 얻고;
(15) 0.2 ㎛ 이하의 필터를 통해 용액을 여과함으로써 (14)로부터의 용액을 살균하고, 이에 의해 농축된 IgG의 조성물을 수득하는
단계를 포함한 방법을 사용하여 혈장으로부터 IgG 조성물을 정제하는 IgG의 제약 조성물이 제공된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 약 150 g/L 내지 약 250 g/L의 단백질 농도를 포함한 제약 IgG 조성물을 제공한다. 특정한 실시양태에서, IgG 조성물의 단백질 농도가 약 175 g/L 내지 약 225 g/L이거나, 또는 약 200 g/L 내지 약 225 g/L이거나, 또는 이러한 범위 내의 적절한 농도, 예를 들어 약 150 g/L, 155 g/L, 160 g/L, 165 g/L, 170 g/L, 175 g/L, 180 g/L, 185 g/L, 190 g/L, 195 g/L, 200 g/L, 205 g/L, 210 g/L, 215 g/L, 220 g/L, 225 g/L, 230 g/L, 235 g/L, 240 g/L, 245 g/L, 250 g/L 또는 그 이상이다. 바람직한 실시양태에서, 수성 IgG 조성물은 약 200 g/L의 단백질 농도를 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 수성 IgG 조성물은 약 204 g/L의 단백질 농도를 포함한다.
여기에 제공된 방법은 매우 높은 수준의 순도를 가진 IgG 제약 조성물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시양태에서, 여기에 제공된 조성물 내의 총 단백질의 적어도 약 95%는 IgG일 것이다. 다른 실시양태에서, 단백질의 적어도 약 96%가 IgG이거나, 조성물의 총 단백질의 적어도 약 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 이상이 IgG일 것이다.
유사하게, 여기에 제공된 방법은 매우 낮은 수준의 오염 인자를 함유하는 IgG 제약 조성물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 약 100 mg/L 미만의 IgA를 함유하는 IgG 조성물이 제공된다. 다른 실시양태에서, IgG 조성물은 약 50 mg/L 미만의 IgA, 바람직하게는 약 35 mg/L 미만의 IgA, 가장 바람직하게는 약 20 mg/L 미만의 IgA를 함유할 것이다.
여기에 제공된 제약 조성물은 전형적으로 정맥내 투여에 적절한 하나 이상의 완충제 또는 pH 안정화제를 포함할 것이다. 여기에 제공된 IgG 조성물을 제형하기 위해 적절한 완충제의 비-제한적인 예는 적절한 pH로 조절된 글리신, 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트, 글루타메이트, 타르트레이트, 벤조에이트, 락테이트, 히스티딘 또는 기타 아미노산, 글루코네이트, 말레이트, 숙시네이트, 포르메이트, 프로피오네이트, 카르보네이트, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일반적으로, 완충제는 장 기간 동안 제형에서 적절한 pH를 유지하기에 충분할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 완충제는 글리신이다.
일부 실시양태에서, 제형에서 완충제의 농도는 약 100 mM 내지 약 400 mM, 바람직하게는 약 150 mM 내지 약 350 mM, 더욱 바람직하게는 약 150 mM 내지 약 300 mM, 가장 바람직하게는 약 175 mM 내지 약 225 mM일 것이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 농축된 IgG 조성물은 약 150 mM 내지 약 250 mM 글리신, 가장 바람직하게는 약 200 mM 글리신을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 농축된 IgG 조성물은 약 250 mM 글리신을 함유할 것이다.
특정한 실시양태에서, 제형의 pH는 약 4.1 내지 약 5.6, 바람직하게는 약 4.4 내지 약 5.3, 가장 바람직하게는 약 4.6 내지 약 5.1이다. 특별한 실시양태에서, 제형의 pH는 약 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5 또는 5.6일 수도 있다.
일부 실시양태에서, 여기에 제공된 제약 조성물은 조성물의 몰삼투압농도를 조절하기 위한 시약을 임의로 더 포함할 수도 있다. 몰삼투압농도 시약의 비-제한적인 예는 만니톨, 소르비톨, 글리세롤, 슈크로스, 글루코스, 덱스트로스, 레불로스, 프럭토스, 락토스, 폴리에틸렌 글리콜, 포스페이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 칼슘 글루코노글루코헵토네이트, 디메틸 술폰 등을 포함한다.
전형적으로, 여기에 제공된 제형은 생리학적 몰삼투압농도에 필적하는 몰삼투압농도, 약 285 내지 295 mOsmol/kg를 가질 것이다 [Lacy et al., Drug Information Handbook-Lexi-Comp 1999: 1254]. 특정한 실시양태에서, 제형의 몰삼투압농도는 약 200 mOsmol/kg 내지 약 350 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 240 내지 약 300 mOsmol/kg이다. 특별한 실시양태에서, 제형의 몰삼투압농도는 약 200 mOsmol/kg, 또는 210 mOsmol/kg, 220 mOsmol/kg, 230 mOsmol/kg, 240 mOsmol/kg, 245 mOsmol/kg, 250 mOsmol/kg, 255 mOsmol/kg, 260 mOsmol/kg, 265 mOsmol/kg, 270 mOsmol/kg, 275 mOsmol/kg, 280 mOsmol/kg, 285 mOsmol/kg, 290 mOsmol/kg, 295 mOsmol/kg, 300 mOsmol/kg, 310 mOsmol/kg, 320 mOsmol/kg, 330 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg 또는 350 mOsmol/kg이다.
여기에 제공된 IgG 제형은 장 기간 동안 액체 형태에서 안정하다. 특정한 실시양태에서, 제형은 실온에서 적어도 약 3개월 동안, 또는 실온에서 적어도 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개월 동안 안정하다. 제형은 일반적으로 냉장된 조건 하에서 (전형적으로 약 2 ℃ 내지 약 8 ℃) 적어도 약 18개월 동안, 또는 냉장된 조건 하에서 적어도 약 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42 또는 45개월 동안 안정할 것이다.
IV
.
IgG
제제의 투여
현대 의학에서 일반적으로 실행되는 바와 같이, 하기 3개 부류에 속하는 의학적 상태를 치료하기 위하여 농축된 면역글로불린 (특히 IgG)의 무균 제제가 사용된다: 면역 결핍, 염증 및 자기 면역 질환, 및 급성 감염. 이러한 IgG 제제는 다발성 경화증 (특히, 재발-완화성 다발성 경화증 또는 RRMS), 알쯔하이머 병 및 파킨슨병을 치료하기 위해 유용할 수도 있다. 본 발명의 정제된 IgG 제제는 이러한 목적 뿐만 아니라 IgG 제제의 다른 임상적으로 수용되는 용도를 위해 적절하다.
FDA는 동종이계 골수 이식, 만성 림프성 백혈병, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), 소아 HIV, 원발성 면역결핍, 가와사끼 병, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증 (CIDP) 및 고 항체 수용자 또는 ABO 비상용성 공여자와의 신장 이식을 포함하여 다양한 징후를 치료하기 위해 IVIG의 사용을 승인하였다. 특정한 실시양태에서, 여기에 제공된 IVIG 조성물은 이러한 질환 및 상태의 치료 또는 조절을 위해 유용하다.
또한, 다양한 징후, 예를 들어 만성 피로 증후군, 클로스트리듐 디피실레 대장염, 피부근육염 및 다발근육염, 그레이브 눈병증, 길랭-바레 증후군, 근육 퇴행위축, 봉입체 근염, 람버트-이튼 증후군, 홍반루푸스, 다병소성 운동신경병증, 다발성 경화증(MS), 중증 근육 무력증, 신생아 동종면역 혈소판결핍증, 파르보바이러스 B19 감염, 천포장, 수혈후 자반증, 신장 이식 거부, 자발적 유산/낙태, 근육 강직 증후군, 안간대 근경련증, 중증 패혈증 및 중환자에서의 패혈 쇼크, 독성 표피 괴사 용해, 만성 림프구 백혈병, 다발 골수종, X-결합 무감마글로블린혈증 및 저감마글로블린혈증의 치료 또는 관리를 위해 환자에게 IVIG를 위한 허가사항외 처방 (off-label) 사용이 일반적으로 제공된다. 특정한 실시양태에서, 이러한 질병 및 상태의 치료 또는 관리를 위하여 여기에 제공된 IVIG 조성물이 유용하다.
마지막으로, 원발성 면역 결핍, RRMS, 알쯔하이머 병 및 파킨슨병을 포함한 질병의 치료 또는 관리를 위한 IVIG의 실험적 사용이 제안되어 있다 (미국 특허출원 공고 U.S. 2009/0148463, 모든 목적을 위하여 그 전문이 본원에 참고로 포함된다). 특정한 실시양태에서, 원발성 면역 결핍, RRMS, 알쯔하이머 병 또는 파킨슨병의 치료 또는 관리를 위하여 여기에 제공된 IVIG 조성물이 유용하다. 1일 투여를 포함한 특정한 실시양태에서, 연령, 체중, 질병 중증도, 투여 경로 (예, 정맥내, 피하) 및 치료에 대한 반응에서의 개별 차이를 고려하여, 대상체에게 투여되는 유효량은 내과의사에 의해 결정될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 면역글로불린 제제는 각각의 날에 약 5 mg/kg 내지 약 2000 mg/kg으로 대상체에게 투여될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 면역글로불린 제제는 적어도 약 10 mg/kg, 적어도 15 mg/kg, 적어도 20 mg/kg, 적어도 25 mg/kg, 적어도 30 mg/kg 또는 적어도 50 mg/kg의 양으로 투여될 수도 있다. 추가의 실시양태에서, 면역글로불린 제제는 각각의 날에 약 100 mg/kg, 약 150 mg/kg, 약 200 mg/kg, 약 250 mg/kg, 약 300 mg/kg, 약 400 mg/kg까지의 투여량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 면역글로불린 제제의 투여량은 그 보다 많거나 적을 수 있다. 또한, 면역글로불린 제제는 하루에 한 번 이상의 투여량으로 투여될 수 있다. IgG 제제에 의해 치료되는 질병과 친숙한 임상학자는 당 기술분야에 공지된 기준에 따라서 환자에게 적절한 투여량을 결정할 수 있다.
일반적으로 사용되는 IgG 제품인 정맥내 면역글로불린 또는 IVIG가 정맥내 투여를 위해 제형된다. 본 발명의 IgG 제제가 예외적으로 높은 면역글로불린 농도 (20 % w/v 또는 그 이상)을 달성하고, 이것이 치료적 유효량을 위한 부피를 상당히 감소시키기 때문에, 정맥내 투여가 투여를 위한 옵션을 유지하긴 하지만, 본 발명의 조성물은 환자에게 피하 및/또는 근육내 투여를 위해 특히 유리하다.
용어 "유효량"이란, 대상체에서 치료하고자 하는 의학적 상태 (예, 원발성 면역 결핍, RRMS, 알쯔하이머 병, 파킨슨 병 등)의 개선 또는 치유를 가져오는 면역글로불린 제제, 특히 IgG 제제의 양을 가리킨다. 대상체에게 투여되는 유효량은 연령, 체중, 질병 중증도, 투여 경로 (예, 정맥내, 피하), 및 치료에 대한 반응에서의 개별 차이를 고려하여 내과의사에 의해 결정될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 면역글로불린 제제는 각각의 날에 약 5 mg/kg 내지 약 2000 mg/kg으로 대상체에게 투여될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 면역글로불린 제제는 적어도 약 10 mg/kg, 적어도 15 mg/kg, 적어도 20 mg/kg, 적어도 25 mg/kg, 적어도 30 mg/kg, 또는 적어도 50 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 면역글로불린 제제는 각각의 날에 약 100 mg/kg, 약 150 mg/kg, 약 200 mg/kg, 약 250 mg/kg, 약 300 mg/kg, 약 400 mg/kg 이하의 투여량으로 대상체에 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 면역글로불린 제제의 투여량은 더 많거나 더 적을 수 있다. 또한, 면역글로불린 제제는 하루에 한번 이상 투여량으로 투여될 수 있다. IgG 제제에 의해 치료되는 질병과 친숙한 임상학자라면 당 기술분야에 공지된 기준에 따라 환자를 위해 적절한 투여량을 결정할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 농축된 IgG 제제를 투여 당 약 5 mg/kg 내지 약 2000 mg/kg의 투여량으로 대상체에게 투여할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 투여량은 적어도 약 5 mg/kg, 또는 적어도 약 10 mg/kg, 또는 적어도 약 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 500 mg/kg, 550 mg/kg, 600 mg/kg, 650 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 850 mg/kg, 900 mg/kg, 950 mg/kg, 1000 mg/kg, 1100 mg/kg, 1200 mg/kg, 1300 mg/kg, 1400 mg/kg, 1500 mg/kg, 1600 mg/kg, 1700 mg/kg, 1800 mg/kg, 1900 mg/kg, 또는 적어도 약 2000 mg/kg일 수도 있다.
본 발명에 따르면, 치료 과정을 완결하는데 필요한 시간은 내과의사에 의해 결정될 수 있고, 1일 정도로 짧은 기간 내지 1개월 이상의 범위일 수도 있다. 특정한 실시양태에서, 치료 과정은 1 내지 6 개월일 수 있다.
농축된 IgG 치료의 투여량 및 빈도는, 다른 요인 중에서, 치료되는 질병 또는 상태, 및 환자에서 질병 또는 상태의 중증도에 의존할 것이다. 일반적으로, 원발성 면역 기능이상을 위하여, 약 100 mg/kg 내지 약 400 mg/kg 체중의 투여량을 매 3 내지 4주마다 투여할 것이다. 신경학적 및 자가면역 질병을 위하여, 2 g/체중kg 이하를 3 내지 6개월 동안 한달에 한번 5일 과정에 걸쳐 실행한다. 이것은 일반적으로 약 100 mg/kg 내지 약 400 mg/kg 체중을 매 3 내지 4주 마다 대략 한번 투여하는 것을 포함하는 지속 요법으로 보충된다. 일반적으로, 환자는 매 14 내지 35일 마다 대략 한번, 또는 매 21 내지 28일마다 대략 한번의 투여 또는 치료를 받을 것이다. 치료 빈도는, 다른 요인들 중에서, 치료되는 질병 또는 상태, 및 환자에서 질병 또는 상태의 중증도에 의존할 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약 IgG 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 치료가 필요한 인간에서 면역결핍, 자가면역 질병 또는 급성 감염의 치료 방법이 제공된다.
실시예
하기 실시예는 단지 예증을 위해 제공되고 본 발명을 결코 제한하지 않는다. 당업자라면 필수적으로 동일하거나 유사한 결과를 얻기 위해 변화되거나 변형될 수 있는 다양한 비-임계 매개변수를 쉽게 인식할 것이다.
실시예
1: 다양한
IgG
농도 및 제형의 안정성 연구
1. 목적
이 연구의 목적은, 높은 단백질 농도에서 낮은 pH (0.25M 글리신, 농축된 용액에서 측정 시에 pH 4.4-4.9)의 보관 안정성을 근육내 및 피하 주사가능한 면역글로불린을 위해 일반적으로 사용되는 중성 pH 제제 (22.5 g/l 글리신, 3 g/l NaCl pH 7)와 비교하는 것이다.
2. 실험 설계
모든 작업은 나노여액을 5% 단백질까지 농축하는 것으로 시작한다. 0.15M 글리신 (조사된 최저 글리신 농도)에 대해 10회 완충액 교환을 수행하고 20% 단백질 초과의 표적 값까지 최종 농축한다. 첫 번째 실험 동안에 30K의 분자량 컷오프를 가진 0.5 m2 폴리에테르술폰 밀리포어 막 (일반 스크린)이 사용되는 반면, 두 번째 실험은 개방 스크린을 가진 0.5 m2 폴리에테르술폰 밀리포어 막으로 시행되고, 이것은 고 점도의 용액을 위해 더욱 적절하고, 수율 손실을 감소시키기 위하여 세척-후 분획을 낮은 막 표면 (0.1 m2, 개방 스크린)을 가진 두 번째 한외여과/정용여과 장치에 의해 더욱 농축한다.
최종 용기를 제형하고 낮은 pH에서 보관하거나, 낮은 pH 보관을 대량으로 수행하고 그 후에 보관 이전에 중성 pH에서 제형한다.
3. 시험 방법
pH: 메틀러 톨레도 LoT405-DPA-SC-S8/120 전극 및 PT 1000 온도 탐침이 장착된 닉 포타메스(Knick Portamess) 유형 911 XPH에서 pH를 시험하였다.
단백질: 뷰렛을 사용하여 단백질 값을 결정하였다.
분자 크기 분포는 고 성능 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 시험되었다.
ACA 역가는 유럽 약전에 기재된 바와 같이 시험되었다.
4. 허용 기준
하기 허용 기준이 정의된다:
·HPLC에 의한 분자 크기 분포:
i. 단량체 및 올리고-/이량체: ≥ 90%
ii. 응집물: ≤ 10% (IV 투여를 위해 ≤%)
· ACA 역가:
50% 미만의 CH 50 단위 소모/IV 투여를 위한 mg 단백질
5. 결과 및 논의
5.1 응집물 및 단편 함량의 비교 및 낮은 pH 4.7 및 pH 7.0에서 제형된 제제에서의 ACA 역가
하기 표 2에서, 상이한 단백질 농도에서 표준 제형 (pH 4.7, 0.25M 글리신; 또는 pH 7.0, 22.5 g/L 글리신, 3 g/L NaCl)에 대해 28 내지 30 ℃에서 3개월 보관 후에 응집물 및 단편 함량 뿐만 아니라 ACA 역가를 나타낸다.
상기 데이터는 낮은 pH 제형이 28 내지 30 ℃에서 3개월 보관 후에 낮은 응집물 및 낮은 ACA-역가를 갖는다는 것을 명백히 나타낸다. pH 7 제형의 모든 ACA 역가는 이 시험에서 정의된 허용 기준보다 높다. 표 2에서, 2 내지 8 ℃에서 3개월 보관 후의 값을 나타낸다.
2 내지 8 ℃에서의 결과는 28 내지 30 ℃에 나타난 경향을 입증한다. pH 7.0 제형이 더 높은 값을 갖는 것으로 보이긴 하지만, ACA 역가는 모두 허용 기준으로 정의된 한계 미만이다. 단백질 값은 시험된 매개변수의 결과에 영향을 미치지 않는다.
5.2 제제 IGSC 60 (Ph 4.7, A-스크린) 및 IGSC62 (Ph 4.7, V-스크린, 더 작은 UF-시스템으로 세척 후 농축)에서 응집물 및 단편 함량 뿐만 아니라 ACA 역가에 미치는 상이한 농축 절차의 영향
하기 표 4에서, 상이한 단백질 농도에서 상이한 농축 절차에 의해 낮은 Ph 제형에 대해 28 내지 30 ℃에서 3개월 보관 후에 응집물 및 단편 함량 뿐만 아니라 ACA 역가를 나타낸다.
데이터는 양쪽 농축 방법에 대해 3개월 보관 후의 유사한 결과를 나타내었다. 표 5에서 2 내지 8 ℃에서의 상응하는 값을 나타낸다.
2 내지 8 ℃에서 수득된 값은 28 내지 30 ℃에서 수득된 결과를 입증하였다. 농축 방법은 제품의 안정성에 영향을 미치지 않는다.
2개 시스템으로의 접근, 즉 주 농축 방법을 위한 시스템 및 세척 후의 농축을 위한 시스템이 더 높은 수율을 제공하기 때문에, 이 방법이 대규모 제조를 위해 더욱 적절한 것으로 판단되었다.
6. 결론
이 연구에 나타난 결과로부터 하기 결과를 유추할 수 있다:
● 낮은 pH 제형은 2 내지 8 ℃ 및 28 내지 30 ℃에서 3개월 보관 후에 낮은 ACA 값, 낮은 응집물 및 낮은 단편 함량을 제공한다.
● 28 내지 30 ℃에서 3개월 보관 후에 중성 pH 제형의 ACA 값은 허용 기준보다 높다.
● 단백질 값은 시험된 매개변수의 결과에 영향을 미치지 않는다.
● 농축 방법은 제품의 안정성에 영향을 미치지 않는다.
● 개방-스크린 막으로 적절한 후-세척물 만을 수득할 수 있다.
이러한 결론을 근거로 하여, 낮은 pH 제형으로의 피하 투여를 위한 새로운 IgG 제품을 제조하는 것으로 결정되었으며, 농축 방법은 후-세척물을 농축하기 위한 두 번째 더 작은 장치, 개방 스크린 막을 가진 한외-/정용여과 장치 및 20±2%의 단백질 함량을 사용한다.
실시예
2:
SUB
Q
NG
의
한외여과
및 제형
1. 배경
규모 확대 제조 및 사전-임상 20% 로트 동안에 이 정보를 수집하였다. 나노여과 단계까지 20% 로트의 제조를 위해 사용되는 방법은 상기 기재된 바와 같았다. 용액을 20% (한계: 18 내지 22%)까지 농축하기 위하여 한외-/정용여과를 개선하였다. 수율 손실을 최소로 감소시키기 위하여, 정용여과를 위해 사용되는 한외여과 장치의 후-세척물을 동일한 막이 장착된 두 번째 더 작은 장치에 의해 농축하고, 그 후에 벌크 용액에 첨가하였다.
놀랍게도, 낮은 pH 보관 동안에 바이러스 불활성화가 용액의 단백질 농도에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 알 수 있었다. 유사한 바이러스 감소가 10% 용액 (GAMMAGARD® LIQUID) 및 20% 용액에서 달성되었다. 따라서, 20% 제품을 위하여 바이러스 감소 단계 시에 낮은 pH 보관을 유지하였다.
2. 공정 설명
한외여과
나노여액의 글리신 농도를 0.25M의 표적까지 조절한다. 용액을 한외여과(UF)를 통해 6±2% w/v의 단백질 농도까지 농축한다. 전형적으로, AU280 -320의 측정에 의하여 단백질 농도를 결정한다. 14.1의 소멸 계수가 사용된다. pH를 5.2 ±0.2로 조절한다. 사용된 UF 막은 50,000 달톤 이하의 공칭 분자량 컷오프(NMWCO)를 갖고, 고 점도 제품을 위해 특별히 설계된다 (예, 밀리포어로부터의 V 스크린). 예를 들어, 50K 달톤 이하의 NMWCO를 가진 밀리포어 펠리콘 바이오맥스. 막 재료는 폴리에테르술폰이다.
농축물을 0.25M 글리신 용액, pH 4.2±0.2에 대해 정용여과한다. 최소 교환 부피는 원래의 농축물 부피의 10배이다. 한외여과/정용여과 작업 전체에 걸쳐, 용액을 4 내지 20 ℃로 유지한다.
정용여과 후에, 용액을 최소 22% w/v의 단백질 농도로 농축한다. 용액 온도를 2 내지 8 ℃로 조절한다. 단백질 농도는 14.1의 소멸 계수 값을 사용하여 UV 판독에 의해 결정될 수 있다.
시스템에서 완전한 잔류 단백질을 회수하기 위하여, 모든 단백질이 세척되도록 보장하기 위해 재순환 방식으로 죽은 부피의 적어도 2배를 사용하여 첫 번째 더욱 큰 한외여과 시스템의 후-세척을 수행한다. 이어서, 첫 번째 것의 10배 이하의 크기를 가진 동일한 유형의 막이 장착된 두 번째 한외-/정용여과 시스템을 사용하여, 첫 번째 한외여과 시스템의 후-세척물을 적어도 22% w/v의 단백질 농도로 농축한다. 후-세척 농축물을 벌크 용액에 첨가한다. 이어서, 두 번째 한외여과 시스템을 후-세척한다. 최종 벌크의 단백질 농도를 단계 14에서 조절하기 위하여 이러한 후-세척물을 사용한다. 용액 온도를 2 내지 8 ℃로 조절한다.
제형
두 번째 더 작은 한외여과 시스템의 후-세척물 및/또는 정용여과 완충액을 사용하여 단백질 농도를 20.4±0.4% w/v로 더욱 조절한다. 필요하다면, pH를 4.4 내지 4.9로 조절한다.
실시예
3: 20%
로트의
제조
1. 도입
이 기록은, 피하 사용을 위한 20% (w/v) 액체 다가 인간 면역글로불린 제제인, 박스터의 신규 연구용 면역글로불린 제제 "SUBQ NG, 20%"의 사전-임상 제조를 설명하고 연구 결과를 요약한다.
제조를 상기 기재된 것과 같은 농축 방법과 함께 "본 발명의 상세한 설명"에 기재된 바와 같이 수행하였다. 분획법은 저온-침전물의 분리와 함께 시작한다. 이후의 냉각 알콜 분획법에 앞서서 다양한 조 응고 인자 및 억제제를 단리하기 위하여 저온-불량 혈장을 사용할 수도 있다. SUBQ NG, 20% 정제 이전에 저온-불량 혈장으로부터 조 응고 인자 및 억제제의 회분 흡착을 위하여 7개의 경로를 선택하며, 하기 표에서 경로 1 내지 7로 언급한다.
사전-임상 SUBQ NG, 20% 제조를 위하여, 다양한 종류의 상이한 흡착 옵션을 포함하기 위하여 경로 1, 3 및 6으로부터 유래된 콘 출발 물질을 선택하였다. 다양한 흡착 방법은 문헌 [Teschner et al., 2007, Vox Sang. 92: 42-55]; [Polsler et al., 2008, Vox Sang, 94: 184-192]; 미국 특허 6,395,880 및 5,409,990; 및 [Prothrombin complex: Brummelhuis in Methods of Plasma Protein Fractionation (J.M.Curling Editor, Academic Press, 1980)]에 기재되어 있다.
변형된 콘 알콜 분획법에 의하여 주 중간체 IgG 분획 (침전물 G)이 얻어지고, 이것을 크로마토그래피 정제를 사용하여 최종 제품으로 더욱 가공하였다. 하류 제조방법은 양이온 교환 (CM-세파로스 고속 유동) 및 음이온 교환 크로마토그래피 (ANX-세파로스 고속 유동)을 포함하고, 3개의 독립적인 바이러스 불활성화 또는 제거 단계, 즉 하기 단계를 포함한다.
● 용매/세제 처리 (1% 트리톤 X-100, 0.3% 트리-N-부틸 포스페이트 및 0.3% 폴리소르베이트-80의 혼합물),
● 나노여과 (아사히 플라노바 35 nm) 및
● 승온에서 3주일 동안 낮은 pH 보관
피하 적용을 위해 높은 단백질 농도를 달성하기 위하여, 한외-/정용여과 단계에서 개방 채널 스크린을 사용해야 한다. 바람직하게는, 첫 번째 장치로부터 모든 단백질을 회수하기 위하여 후-세척 분획의 농축을 위해 두 번째 한외-/정용여과 장치를 사용한다.
SUBQ NG, 20%는 면역글로불린 G (IgG)의 액체 제형이고, 그의 단백질의 적어도 95%가 감마 글로블린이다. 제품은 등장성이고, 낮은 pH에서 제형된다. 최종 농축 단계 동안에 10% 단백질의 농도에서, pH는 4.4 내지 4.9이다. 연장된 안정성 연구의 결과를 입수한 후에 20% 용액의 최종 pH를 결정한다. 최종 용액은 180 내지 220 g 단백질을 함유하고, 단독 부형제로서 용액 리터 당 0.1 내지 0.3 몰의 글리신을 함유한다. 액체 제제는 투명 내지 약간의 담황색이고, 실질적으로 눈에 보이는 입자를 갖지 않는다.
2. 사전-임상
로트의
데이터 및 물질 밸런스
1. 사전-임상 로트: SC00107NG
흡착 옵션 1: 옵션 6: F IX, F VII, AT-III
출발 물질의 로트 번호: 침전물 G VNELG171 (US-공급원)
최종 용기의 로트 번호: SC00107NG
2. 사전-임상 로트: SC00207NG
흡착 옵션 3: FEIBA, AT-III
출발 물질의 로트 번호: 침전물 G VNELG173 (US-공급원)
최종 용기의 로트 번호: SC00207NG
3. 사전-임상 로트: SC00307NG
흡착 옵션 1: 흡착 단계 없음
출발 물질의 로트 번호: 침전물 G LB0790301 (US-공급원)
최종 용기의 로트 번호: SC00307NG
최종 벌크 수준에서, 제제의 순도는 낮은 수준의 주 불순물에 의해 예증되고, 이것은 총 IgG의 0.1% 미만이다. 최종 공정 단계에서 20% 제품에서의 분자 크기 분포는 GAMMAGARD® LIQUID/KIOVIG 최종 용기의 하나와 유사하다. 이것은, 20% 단백질로의 농축이 IgG 분자의 무결성에 부정적인 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
3. 사전-임상 회분의
특징화로부터
추가의 결과
예비 최종 용기 방출 기준은, 피하 인간 면역글로불린의 권한, 피하 투여를 위한 시판 제품의 최종 용기 규정, 및 GAMMAGARD® LIQUID/KIOVIG 규정으로부터의 요건을 기초로 하여 정의되었다. 제품 및/또는 공정 관련 불순물의 수준을 평가하기 위하여 추가의 품질 조절 시험을 수행하였다.
또한, 최종 용기의 관련 항체 스펙트럼의 특징결정을 수행하고, 사전-임상 IVIG, 10% TVR 로트로부터의 결과와 비교하였다.
결과를 하기 표에 제공한다 (표 8).
항체 역가 및 농축 계수는 3개의 사전-임상 SUBQ NG 20% 최종 용기 및 사전-임상 GAMMAGARD® LIQUID/KIOVIG 로트에 대한 것과 동일한 정도의 크기이다.
제품 및 공정 관련 불순물의 제거는 모든 3개 로트에서 만족스럽다.
4. 결론
SUBQ NG 20%의 3개 최종 용기 로트를 200 리터 규모로 성공적으로 제조하였다. 알콜 분획법 이전에 다양한 흡착 단계를 포함하기 위해 3개의 흡착 경로를 선택하였다:
- 옵션 1. 흡착 단계없이 US 공급원 혈장
- 옵션 3, FEIBA, AT-III 흡착 후의 US 공급원 혈장
- 옵션 6, F-IX, F-VII, AT-III 흡착 후의 US 공급원 혈장
사전-임상 제조 및 중간체의 특징결정 동안에 검출된 공정 매개변수에서, 최종 제품은 3개의 로트 사이에서 검출할 수 있는 분명한 차이가 존재하지 않음을 나타내었다.
모든 최종 용기는, 어떠한 종류의 출발 물질이 선택되는지와 무관하게, 제품과 관련된 예비 규정을 충족한다.
실시예
4. 20% 제제의 보관 연구
1. 도입
SUBQ NG, 20%는 피하 사용을 위한 20% (w/v) 액체 다가 인간 면역글로불린 제제이다. SUBQ NG, 20%를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다.
이러한 연구는 2 내지 8 ℃ 및 28 내지 30 ℃ (실행가능성 로트에서만)에서 6개월 이하 동안 3개의 사전-임상 로트 및 하나의 실행가능성 로트의 보관 데이터를 요약한다.
2. 목적
이 연구의 목적은 2 내지 8 ℃ 및 28 내지 30 ℃에서 Sub Q NG 20% 최종 용기의 보관 안정성을 평가하는 것이다.
3. 안정성 표시 매개변수
주 분해 방식은 변성, 응집 및 단편화이고, 그 결과 샘플의 분자 크기 분포에서의 변화가 일어난다. 따라서, 고 성능 크기 배제 크로마토그래피에 의한 분자 크기 분포 분석은 주 안정성 표시 매개변수이다.
4.
시험된
회분 및 기본 포장
이 기록에 나타낸 안정성 데이터는 사전-임상 로트 SC00107NG, SC00207NG 및 SC00307NG 뿐만 아니라 실행가능성 로트 IgGSC 62/1에서 얻어진다.
5. 결과
하기 표 11에서, 12개월 이하의 보관 후에 사전-임상 최종 용기의 결과를 나타낸다.
6. 결론
데이터는, 2 내지 8 ℃ 및 28 내지 30 ℃에서 18개월 이하의 보관 동안에 조사된 매개변수에 대하여 제품이 사전-정의된 규정에 부합함을 입증하였다.
실시예
5: 바이러스 불활성화를 위한 낮은
pH
처리
목적 및 원리
도입
모여진 인간 혈장으로부터 면역글로불린 피하 (인간), 14%-20%, 삼중 바이러스 감소 (TVR) 용액 (이하에서, Subcuvia NG 용액이라 일컬음)을 제조한다. 응고 인자/억제제를 제거하기 위한 대량 포획 단계 후에, 변형된 콘 알콜 분획법과 함께 Subcuvia NG의 정제를 시작하고, 이에 의해 주 중간체 침전물 G를 수득한 다음, 크로마토그래피 정제 뿐만 아니라 3개의 뚜렷한 바이러스 불활성화/제거 단계를 함유하는 하류 공정을 수행한다. 널리 통용되는 연구에서, 최종 용기의 낮은 pH 보관의 바이러스 감소 능력을 상세히 조사하였다.
하류 정제 공정은 하기 단계를 포함한다: 재현탁된 침전물 G를 용매/세제(S/D) 처리, 카르복시메틸(CM)-세파로스 고속 유동을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피 및 ANX-세파로스® 고속 유동을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피, 나노여과, 한외-정용여과, pH 조절 및 무균 여과 및 충진으로 처리한다. 무균 충진 후에 Subcuvia NG 용액을 최종 용기에서 낮은 pH 보관한다 (제조 공정의 개략적인 도해를 위하여, 하기 공정 계획 참조)
공정 계획
도 2에 나타낸 공정 계획 A는 단계 10에서 시작하여 Subcuvia NG 용액을 위한 제조 계획의 하류 부분의 개요를 제공한다. 널리 통용되는 연구에서 사용되는 통상적으로 만들어진 중간체는 공정 단계 "최종 용기, 예비-보관"에서와 동일하다.
도 2에 나타낸 공정 계획 B는 바이러스 적정을 위한 샘플추출을 포함하여 본 연구에서 사용되는 규모축소 공정의 개요를 제공한다.
목적
잠재적인 바이러스 전달에 관한 고 안전성 한계를 제공하기 위하여, 작용 방식에서 서로 보완하는 3개의 특정한 목적을 위한 바이러스 불활성화/제거 단계를 Subcuvia NG 용액의 제조 방법에 통합한다.
● 용매/세제 처리 (단계 11)
● 나노여과 (단계 14)
● 최종 용기에서 승온에서 낮은 pH 보관 (무균 충진 후)
바이러스의 불활성화에 관해 낮은 pH 및 승온에서 보관 용량 및 강건성을 사전 연구 과정에서 조사하였으며, 이 연구 과정에서 Subcuvia NG와 균등하지만 정맥내 적용을 위해 10% 단백질로 조절된 제품인 IGIV 10% TVR을 사용하였다. 이 연구로부터 수득된 결과는, 모든 지질-외피보유 바이러스가 효과적으로 강건하게 불활성화되었음을 증명하였으며, 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)가 가장 느린 불활성화 속도를 나타내었다. 또한, 이 공정 단계는 작은 비 지질-외피보유 DNA 바이러스에 관하여 제조 공정의 바이러스 안전성에 더욱 기여한다는 것이 증명될 수 있다. Subcuvia NG 및 IGIV 10% TVR은 면역글로불린 제품이고, 여기에서 Subcuvia NG는 피하 투여를 위한 제품 변형이고 IGIV 10% TVR은 정맥내 적용을 위한 변형이다. 양쪽 모두 한외여과/정용여과 및 제형 단계와 동일한 제조 공정을 공유하며, 여기에서 유일한 차이는 Subcuvia NG가 10% 대신에 14 내지 20%의 범위로 조절된다는 것이다.
따라서, 선택된 임계 공정 매개변수를 제조 공정을 위해 규정된 상한 및 하한으로 설정함으로써 (즉, 시간, 온도: 하한; pH: 상한), BVDV 및 MMV의 불활성화에 관하여 Subcuvia NG의 제조에서 낮은 pH 및 승온에서 보관 단계의 능력 및 강건성 (The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products Evaluation of Medicines for Human Use (2001): CPMP Biotechnology Working Party - Note for Guidance on Plasma-Derived Medicinal Products, CPMP/BWP/269/95 (rev.3))을 평가하였다. 추가로, 이러한 바이러스 불활성화 단계의 강건성을 더욱 조사하기 위하여, 규모 축소 작업 동안에 온도를 주어진 기간 동안 감소시켰다.
상기 언급된 바와 같이, 하기 외피보유 및 비-외피보유 바이러스를 사용하였다.
● C형 간염 바이러스(HCV) 및 다른 작은 지질-외피보유 RNA 바이러스를 위한 모델로서 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV)
● 인간 파르보바이러스 B19 (B19V) 및 다른 작은 비-외피보유 DNA 바이러스를 위한 모델로서 생쥐 미닛 바이러스 (MMV)
CPMP 지침 268/95 (The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products Human Medicines Evaluation Unit (1996); CPMP Biotechnology Working Party 참조 - Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses, CPMP/BWP/268/95 (개정))에 따라서, 각각의 제조 단계의 규모 축소한 모델로 연구를 수행하였다. 대규모 제조 방법에서의 제조 단계를 위해 규정된 매개변수와 규모 축소된 모델의 공정 매개변수를 비교함으로써, Subcuvia NG 용액의 제조에서 바이러스 불활성화에 관해 규모 축소 제조 단계 "낮은 pH 및 승온에서의 보관"에서 수득된 결과의 유효성을 증명하였다. 추가로, 선택된 생화학적 매개변수를 검사하고 대규모 공정의 각각의 매개변수와 비교하였다.
물질, 방법 및 장치
바이러스 및 세포
아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC; 미국 매릴랜드 록빌)로부터 수득된 BVDV, 균주 NADL (생물학적으로 클로닝됨, ATCC VR-1422)을 사용한다. 표준 작업 절차에 따라서 MDBK 세포 (ATCC CCL-22)에서 바이러스를 증식시키고, BT 세포 (ATCC CRL-1390)에서 적정하였다.
아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 매릴랜드 록빌)로부터 MMV, 원형 균주 (ATCC VR-1346)을 수득하였다. 표준 작업 절차에 따라 바이러스를 증식시키고 A9 세포 (ATCC CCL-1.4)에서 적정하였다.
시험 항목
"낮은 pH 및 승온에서 보관" 전에, 즉 제조 단계 무균 충진 후에, 박스터의 PPD 제품 지원 부서 (오스트리아 비엔나 인더스티에스트라세 131)로부터 통상적으로 만들어진 Subcuvia NG 중간체의 하기 로트를 수득하였다.
● 로트 번호 IGSC 64, 13.5%의 단백질 농도를 가짐
● 로트 번호 IGSC 64, 20.9%의 단백질 농도를 가짐
+2 ℃ 내지 +8 ℃의 최종 용기에 물질을 적재하고 6개월 이내에 사용하였다.
완충액
/용액
pH
조절을 위한 용액
0.5M NaOH 또는 0.5M HCl을 사용하여 pH를 조절하였다 (양쪽 용액을 실온에서 보관하고 12개월 이내에 사용하였다).
0.5M 염산 (
HCl
)의 제조
시약, 즉 증류수 및 HCl를 주변 온도에서 합하였다.
0.5M 수산화나트륨 (
NaOH
)의 제조
NaOH의 각각의 양을 주변 온도에서 증류수에 용해시켰다.
pH
측정을 위한 용액
직접적으로 그리고 유럽 약전(EP)에 따라 희석된 용액에서 pH를 측정하였다. EP 방법에 따라 pH를 측정하기 위하여, 0.9% NaCl 용액을 사용하여 단백질 농도를 1%로 희석하였다.
0.9% NaCl 용액을 다음과 같이 제조하였다: 9.0 ± 0.9 g NaCl을 1000 ml 증류수에 용해시켰다. 용액을 0.2 ㎛ 여과하고, 실온에서 보관하고 12개월 이내에 사용하였다.
세포 배양 배지
BVDV 및 MMV 바이러스 적정을 위해 표준 작업 절차에 따라서 세포 배양 또는 바이러스 적정을 위해 사용된 배지를 준비하였다.
바이러스 적정 분석
TCID
50
분석
바이러스를 함유하는 샘플을 표준 작업 절차에 따라 TCID50 분석에 의해 적정하였다. 간략하게, 샘플의 연속 1/2 로그 희석액을 각각의 조직 배양 배지에서 준비하고, 각각의 100 ㎕ 희석액을 각각의 지표 세포주로 접종된 마이크로적정 플레이트의 각각 8개 웰에 첨가하였다. 마이크로적정 플레이트를 축축하고 CO2-조절된 보관 장치에서 36 ℃±2 ℃의 온도에서 보관한다. 7일 보관 후에 현미경 아래에서 세포를 육안 검사함으로써 세포변성 효과의 평가를 달성하였다.
푸아송(Poisson) 분포에 따라 조직 배양 감염성 투여량 중앙값 (TCID50)를 계산하고 log10 [TCID50/ml]로 표현하였다.
BVDV
벌크 적정
MMV-스파이크(spiked) 샘플에서 연구를 수행하였다. 낮은 pH 보관의 20일 및 27일 후에 Subcuvia NG 중간체로부터 얻은 BVDV 스파이크 샘플에 대한 검출 한계를 낮추기 위하여, 이러한 샘플을 다음과 같이 적정하였다: 표준 TCID50 분석에 추가로, 1:3.16 희석 샘플 (0.5 log) 및 이후의 2개의 1/2 log 희석 샘플 (희석을 위해 각각의 세포 배양 배지를 사용한다)을 각각의 지표 세포주로 접종된 96-웰 마이크로적정 플레이트의 모든 웰 (웰 당 100 ㎕)에 첨가한다. 세포의 보관 및 각각의 바이러스의 세포변성 효과의 평가를 상기 기재된 바와 같이 수행한다 (TCID50 분석). 결과를 다음과 같이 계산하였다: 벌크 적정으로 적정된 부피와 일반적인 TCID50 분석에서 적정된 부피의 비율 Rvol을 계산하였다. Rvol의 log10을 TCID50 분석에서 결정된 바이러스 역가로부터 빼고, 결과를 벌크 적정에 의해 결정된 바이러스 역가로 나타낸다.
실시예:
- 연속 0.5 log 희석 (모두 12개 컬럼)으로 마이크로적정 플레이트에서 샘플을 분석하고 (TCID50 분석), 웰은 희석 0 (즉, 비희석)으로부터 전진하면서 네가티브로 밝혀졌다. 푸아송 분포에 따른 계산은 0.11 log10 [TCID50/ml] 미만의 바이러스 역가를 제공한다. 분석된 샘플의 상응하는 총 부피는 1.17 ml이다.
- 동일한 샘플 (희석 0)을 마이크로적정 플레이트의 모든 웰에 적용한다 (벌크 적정). 따라서, 적용된 총 샘플 부피는 9.6 ml이다.
- 부피 비는 Rvol = 9.6:1.17 = 8.21; log10 (Rvol)= 0.91
- 계산된 바이러스 역가는 < 0.11 - 0.91 ; 즉 < -0.80이다. 바이러스 역가 신뢰 구간의 상한선을 동일하게 계산한다.
연속 반응속도 샘플에서 감염성이 기록되지 않을 때 바이러스
역가의
계산
낮은 pH 보관의 완결 후에 최종 샘플까지 연속 반응속도 샘플에서 바이러스 감염성이 검출되지 않는 경우에, 분석 검출 한계의 계산을 위하여, 명백한 네가티브 결과를 가진 TCID50 분석에서 웰을 위해 사용된 모든 연속 네가티브 샘플의 부피가 고려된다. 이를 위하여 하기 수학식이 사용되었다 (부록 1 참조):
상기 식에서,
Xi (i= 1, 2, 3,… , n) : n개 연속 네가티브 샘플의 개개의 바이러스 역가 log10 (TGCID50/ml)
모든 네가티브 샘플이 동일한 역가, 즉 x를 갖는다면, 수학식은 다음과 같이 단순화된다:
세포독성
세포독성의 결정을 위해, 모의-스파이크된 Subcuvia NG 중간체, 즉 바이러스 스톡 대신에 감염된 세포를 위한 BT 배지 (5% 말 혈청*)로 스파이크된 중간체로부터, 뿐만 아니라 각각의 세포주에서 모의-스파이크되고 pH-조절되고 (pH 4.9±0.1) 0.45 ㎛ 여과된 출발 물질로부터, 사용된 바이러스 지표 세포주에 대한 공정 중간체의 세포독성을 결정하였다. 샘플을 바이러스-함유 샘플과 같이 분석하고, 다시 말해서 지표 세포주와 함께 연속 희석하고 보관하였다. 보관 후에, 가장 높은 비-세포독성 농도를 결정하였다. 생물학적 시스템에서의 변동을 고려하여, 바이러스 스파이크 샘플 및 모의-스파이크 샘플에서의 세포독성을 비교할 때 ± 0.5 log 단계의 편차는 중요하지 않은 것으로 간주되었다.
* 감염된 세포에 대한 BT-배지의 조성은 다음과 같다: DMEM (4.5 g/l D-글루코스 함유) + 1% (v/v) L-글루타민 (200 mM) + 1% (v/v) 젠타마이신 술페이트 (10 mg/ml) + 1% (v/v) 피루브산나트륨 + 2% (v/v) 중탄산나트륨 (7.5%) + 1% (v/v) 비-필수 아미노산 + 5% (v/v) 말 혈청
간섭
낮은 바이러스 역가를 가진 샘플에 대하여, 감염성 분석의 성능에 미치는 샘플 기질의 영향을 평가할 필요가 있다. 높은 바이러스 역가를 가진 샘플에 대하여, 희석 연속의 관련 부분, 즉 바이러스-포지티브 및 바이러스-네가티브 웰이 기록될 수 있는 부분이 높은 샘플 희석에서 발생한다. 결론적으로, 바이러스 감염성의 검출에 미치는 몇 개의 log10 단계로 희석된 샘플 기질의 영향은 무시할 수 있다. Subcuvia NG 중간체를 함유하는 샘플에 대해 낮은 바이러스 역가의 결정에서의 간섭을 다음과 같이 측정하였다: 샘플을 모의-스파이크되고 pH 조절되고 (pH 4.9± 0.1) 0.45 ㎛ 여과된 출발 물질 (Subcuvia NG 중간체)로부터 뽑아내고, 적절한 조직 배양 배지로 1:3.16으로 희석하고, 사전-희석된 (적절한 조직 배양 배지에서, 즉 BT 세포/BVDV를 위한 BT 배지 및 A9 세포/MMV를 위한 A9 배지) 바이러스 스톡 현탁액으로 1:100으로 2 또는 3 log10 [TCID/ml]의 공칭 역가까지 스파이크하고 상기 기재된 바와 같이 적정하였다. 스파이크된 공정 중간체에 대해 수득된 역가를 스파이크된 세포 배양 배지 대조의 역가와 비교하였다.
바이러스 감소 계수의 계산
하기 수학식을 사용하여 CPMP 지침 268/95[3]에 따라서 공정의 바이러스 불활성화 능력의 분석을 수행하였다.
상기 식에서,
R = 바이러스 감소 계수
V1 = 출발 물질의 부피
T1 = 출발 물질의 바이러스 농도 [TCID50/ml]
V2 = 단계 후의 물질의 부피
T2 = 단계 후의 바이러스 농도 [TCID50/ml]
R을 계산하기 위하여 처리 전 및 후의 각각의 스파이크 샘플의 부피 및 역가를 사용하였다. 바이러스가 검출불가능할 때 언제든지, 검출 한계를 계산을 위한 바이러스 역가로 간주하였다. 표준 작업 절차에 따라서, 2개의 십진법 자리까지 주어진 바이러스 역가 (log10 [TCID50/ml])에 의하여 계산을 수행하였다. 감소 계수를 첫 번째 십진법 자리까지 반올림하였다.
유효 매개변수의 결정
시간, 온도 [℃]
타이머로 보관 시간을 측정하였다; 온도를 Pt-100 센서로 측정하고 연속하여 기록하였다.
pH
-값
직접적인 측정에 의해서 뿐만 아니라 유럽 약전(EP)에 의해 규정된 방법을 실행하여, 다시 말해서 0.9% NaCl 용액으로 1% 단백질까지 희석한 후에, 표준 실험실 pH 측정계로 표준 작업 절차에 따라 pH 값을 결정하였다. 다음에서, 접미사 (EP)를 가진 pH는 EP 방법에 따른 pH 측정을 의미하는 반면, 접미사를 갖지 않은 "pH"는 직접적인 측정을 의미한다.
기타 매개변수의 결정
분자 크기 분포 (
MSD
)
표준 작업 절차에 따라 분석 생화학 (Analytical Biochemistry) 부서 (오스트리아 비엔나 박스터)에 의하여, 분자 크기 분포의 HPLC-SEC (고성능 액체 크로마토그래피 - 크기 배제 크로마토그래피) 분석을 수행하였다. "규모 확대" 로트 (PPD 제품 지원 부서(오스트리아 비엔나 박스터)에서 제조됨)의 모든 샘플의 HPLC-SEC 분석을 이 시험에 따라 수행하였다. 따라서, 모의-스파이크 작업의 샘플의 시험 결과 (이 연구 과정 중에 규모 축소된 공정에서 축적됨)와 "규모-확대" 로트의 시험 결과 간의 동등성을 보장하기 위하여, 동일한 부서에서의 동일한 시험에 따라 모의-스파이크 작업의 샘플의 MSD를 분석하였다.
셀룰로스
아세테이트 전기영동
ACV 케미스트리 부서 (오스트리아 비엔나 박스터)에 의한 표준 작업 절차에 따라서 셀룰로스 아세테이트 전기영동 (CAE)을 수행하였다.
반올림
표준 실행에 따라서 반올림을 수행하였다:
● 제조 방법에서 각각의 매개변수를 위해 규정된 바와 같이, 또는 분석 정확성에 의해 결정된 바와 같이, 동일한 수의 십진법 자리까지 분석 결과를 반올림하였다.
● 분석 결과의 반올림없이 계산을 수행하고, 최종 결과 만을 반올림하였다.
장치
● 표준 실험실 pH-미터를 사용하였다.
● 메틀러(Mettler) AT-100 분석 및 사르토리우스(Sartorius) BP3100P 실험실 밸런스를 사용하였다.
● PVDF 막 필터 (밀렉스-HV 또는 균등장치)에 의해 0.45 ㎛ 여과를 수행하였다.
● 실험실 타이머로 공정 시간을 측정하였다.
● 생체안전성 부류 II 캐비넷을 사용하였다.
● 습도-조절된 헤래우스(Heraeus) CO2-배양기에서 세포를 보관하였다.
● 혼합을 위하여 자기 교반기/교반 막대를 사용하였다.
● 하케(Haake) 또는 줄라보(Julabo) 저온유지장치 및/또는 교반 가열 블록에 의해 온도를 조절하였다.
● μR 1000 요꼬가와(YOKOGAWA) 판독기에 연결된 Pt-100 센서를 사용하여 온도를 측정하였다.
연구 설계
바이러스 불활성화에 관해 Subcuvia NG의 제조 단계 "낮은 pH 및 승온에서의 보관"의 강직성을 조사하기 위하여, 바이러스 불활성화의 효능을 위한 주 매개변수를 하기 언급된 바와 같이 정의하였다. 낮은 pH 보관에 의한 바이러스 불활성화의 강직성을 조사하기 위해 적절한 조건 하에서 작업을 수행하였다. 대규모 공정을 위한 조건과 규모 축소된 작업을 위한 조건의 비교를 표 A에 나타낸다.
● 단백질 농도: Subcuvia NG는 개발 중인 제품이기 때문에, 제형된 벌크의 단백질 농도 범위를 통상적으로 다소 넓게 한정하고, 다시 말해서 대략 14 내지 20%이고, 그 후에 더 좁혀질 수도 있다. 따라서, 낮은 pH 처리의 강건성을 조사하기 위하여, 2개의 작업 (작업 설계)을 가능한 단백질 농도의 2개 극한에서 수행하였다. 작업 설계 1은 13.5% 단백질 농도에서 수행하였고; 작업 설계 2는 20.9% 단백질 농도에서 수행하였다.
통상적으로 만들어진 물질의 단백질 농도는 PPD 제품 지원 부서에 의해 제공되었다. 통상적으로 만들어진 Subcuvia NG 중간체의 제조 후에 수행된 분석으로부터 데이터를 이미 입수할 수 있기 때문에, 통상적으로 만들어진 물질의 단백질 농도는 다시 결정하지 않았다. 규모-축소된 공정을 위해 사용되는 물질은 무균 여과되고 규모-축소된 공정의 시작 때까지 2 내지 8 ℃에서 보관되기 때문에 (즉, 어떠한 동결/해동 절차도 받지 않는다), 최종 제형되고 살균 여과된 중간체에 대하여 단백질 농도에서의 변화가 기대되지 않는다.
● pH-값: 제조 시에, 낮은 pH 보관에 걸쳐서 Subcuvia NG 최종 용기를 위해 4.4 내지 4.9의 pH 범위 (직접 측정)가 규정된다. 바이러스 불활성화를 위해 덜 바람직한 조건 하에서 낮은 pH 처리의 효능 및 강건성을 조사하기 위하여, 규정된 더 높은 한계, 즉 4.9±0.1의 pH에서 양쪽 작업을 수행하였다. 필요하다면, 스파이크 후에 pH를 측정하고 더 높은 한계로 조절하였다. 27일±5시간 동안 낮은 pH 보관 후에, 직접적인 pH-측정에 의해, 그리고 유럽 약전에 의해 추천된 방법, 즉 0.9% NaCl 용액으로 1% 단백질까지 희석에 의해 pH를 다시 측정하였다.
● 온도: 제조 공정에서, 낮은 pH 보관 동안의 온도를 30 내지 32 ℃로 설정한다. 바이러스 불활성화를 위해 덜 유리한 조건 하에서 낮은 pH 보관의 강건성을 조사하기 위하여, 온도 범위의 하한, 즉 30±1 ℃에서 모든 규모-축소된 작업을 수행하였다. 온도 변동의 잠재적인 영향을 검사하기 위하여, 매주 1회 온도를 6시간 이상 동안 25±1 ℃로 저하시켰다 (즉, 보관 0, 7, 14, 20일 및 27일 동안에 온도 저하가 시작되었으며; 날짜 매김은 달력 날짜를 기준으로 하고, 다시 말해서 0일은 보관을 시작한 날짜이다). 착오로, 6시간 동안 25±1 ℃로의 온도 저하를 보관 첫 번째 및 두 번째 주에 1주 당 2회, 다시 말해서 낮은 pH 처리에서 첫 번째 주에 보관 0일 및 4일 동안, 두 번째 주에서 보관 7일 및 10일 동안에 수행하였다.
● 시간: 보관 시간은 전형적으로 21일 (BVDV의 효과적인 불활성화를 위해 요구됨) 내지 28일 (기계적/논리학적 이유에서 상한선)의 범위이다. 바이러스 불활성화를 위해 덜 유리한 조건 하에서 낮은 pH 처리의 효능 및 강건성을 조사하기 위하여, 모든 규모 축소된 작업을 상기 기재된 보관 시간 범위; 즉 단기 옵션을 위해 20일±4시간 동안의 보관 및 장기 옵션을 위해 27일±5시간 동안의 보관의 한계 미만에서 수행하였다. 스파이크 중간체를 27일±5시간 동안 낮은 pH 및 승온에서 보관하였으나, 3주일의 보관 후에 바이러스 제거를 조사하기 위하여 20일±4시간 보관 후에 바이러스 적정을 위한 샘플을 취하였다 (표 A 참조).
일반적으로, "낮은 pH 및 승온에서의 보관" 제조 단계의 바이러스 불활성화 능력의 강건성을 조사하기 위하여, 4회 바이러스-스파이크 작업 전체 (BVDV로 2회, MMV로 2회)를 수행하였다. 또한, 생화학적 매개변수의 결정을 위한 샘플을 얻기 위하여 2개의 비스파이크 대조 작업을 수행하였다. 추가로, 2개의 모의-스파이크 대조 작업을 수행하고, 바이러스 적정 분석에 미치는 공정 중간체의 잠재적 효과 (즉, 세포독성 및 간섭)를 조사하기 위하여 이러한 작업에서 취해진 샘플을 사용하였다.
규모 축소 및 대 규모 공정의 동등성을 더욱 증명하기 위하여, 낮은 pH 보관 전 및 후에 최종 제품에서 하기 생화학적 분석을 수행하였다: 분자 크기 분포 및 셀룰로스 아세테이트 전기영동.
표 A: 대규모 제조 공정에 비교하여, 규모 축소 작업의 공정 및 생화학적 매개변수. 대규모 공정과는 상이한 범위의 매개변수가 규모축소된 공정에 적용되고, 굵은 글씨로 인쇄된다.
1 Subcuvia NG는 개발중인 제품이기 때문에, 단백질 농도는 아직 좁게 한정되지 않는다. 따라서, 가능한 단백질 농도의 2개 한계에서 2개의 규모-축소 작업을 수행하였다.
2 보관 기간은 아직 좁게 한정되지 않았으며, 바이러스 제거 연구의 결과에 의존된다.
3 양쪽 작업을 27일±5시간 동안 수행하고, 바이러스 적정을 위한 샘플을 보관 20일에 취하였으며 그 결과 보관 21일 내지 22일의 대규모 공정 옵션을 위하여 바이러스 불활성화 데이타를 입수할 수 있다.
4 매주 1회 6시간 동안 온도를 25±1 ℃로 감소시켰다 (즉, 0, 7, 14, 20 및 27일 동안에 온도 저하가 시작되었으며; 날짜 매김은 달력 날짜를 기준으로 하고, 다시 말해서 0일은 보관을 시작한 날이다). 항목 4.1.1 ("온도 측면")에 언급된 바와 같이, 착오로 6 시간 동안 25±1 ℃로의 온도 저하를 보관 첫 번째 및 두 번째 주에 1주 당 2회 수행하였다 (DR 1_0407 참조).
5 유럽 약전에 따른 방법
실험 절차
그의 복잡함 때문에, 바이러스 스파이크, pH 조절 및 0.45 mm 여과 단계의 순서를 도 3에 나타낸 흐름도에 도시한다 (화살표의 두께는 상대적 부피를 나타낸다).
출발 물질
작업 1을 위하여, 13.5%의 단백질 농도를 가진 통상적으로 만들어진 물질 (로트 번호 IGSC64)을 취하였다. 가능한 단백질 농도의 하한, pH 범위의 상한 (즉, BVDV: 4.97 및 MMV: 4.93) 및 온도 범위의 하한(즉, 29.4 ℃)에서 작업을 수행하기 위하여 이 물질을 사용하였다.
작업 2를 위하여, 20.9%의 단백질 농도를 가진 통상적으로 만들어진 물질 (로트 번호 IGSC64)을 취하였다. 가능한 단백질 농도의 상한, pH 범위의 상한 (즉, BVDV: 4.92 및 MMV: 4.86) 및 온도 범위의 하한(즉, 29.4 ℃)에서 작업을 수행하기 위하여 이 물질을 사용하였다.
바이러스 스파이크:
BVDV
,
MMV
보관
45.5 ml의 각각의 출발 물질을 4.5 ml의 바이러스 스톡 현탁액과 함께 스파이크하고, 교반 1 내지 2분 후에 1 ml 샘플을 취하였다. 샘플을 즉시 각각의 세포 배양 배지로 1:3.16 (즉, 1 부피의 샘플 + 2.16 부피의 세포 배양 배지)으로 희석하고 적정하였다. 이어서, 다른 3 ml 샘플을 빼내고 0.45 ㎛ PVDF 막을 통해 여과하였다. 1 ml의 여과된 물질을 각각의 세포 배양 배지로 1:3.16으로 즉시 희석하고 적정하였다.
pH
의 조절
교반 하에서 0.5M HCl 용액을 사용하여 35 ml 분취량의 바이러스 스파이크 출발 물질을 pH 4.9±0.1 (양쪽 작업)로 조절하였다. 이어서, 물질을 2개의 분취량으로 나누었다. 30 ml의 하나의 분취량을 "낮은 pH 보관"을 위해 사용하고, 5 ml 분취량을 "온도 유지 대조"를 위해 사용하였다 (항목 "유지 대조" 참조).
다른 분취량의 10 ml 바이러스-스파이크 출발 물질을 0.5M NaOH 용액을 사용하여 pH 7.0±0.1로 조절하고, 여기에서 "pH 유지 대조"를 위해 5 ml의 pH-조절된 물질을 사용하였다.
"조합된 pH 및 온도 유지 대조"를 위하여 pH 조절된 물질의 나머지 5 ml를 사용하였다 (항목 "유지 대조" 참조).
유지 대조
pH 또는 온도에 의한 바이러스 불활성화의 메카니즘을 연구하기 위하여, 3개의 유지 대조를 상이한 조건 하에서 보관하였다:
바이러스-스파이크 및 pH 조절된 (pH 7.0±0.1) 출발 물질의 각각 5 ml 분취량을 0.45 ㎛ PVDF 막 필터를 통해 저온바이알로 여과하였다. 하나의 분취량을 스파이크 공정 물질과 함께 30±1 ℃에서 보관한 다음, 공정의 마지막까지 이 온도에서 유지하였다 (pH 유지 대조, "pH HC"). 다른 분취량을 +2 내지 +8 ℃에서 27일±5 시간 동안 즉시 보관하였다 (조합된 pH 및 온도 유지 대조, "c HC").
바이러스-스파이크되고 pH-조절되고 (pH 4.9±0.1) 0.45 ㎛ 여과된 출발 물질의 5 ml 분취량 (상기 "pH의 조절" 참조)을 공정의 마지막까지 +2 내지 +8 ℃에서 보관하였다 (온도 유지 대조 "t HC").
여과 후에 모든 유지 대조의 최소 부피는 항상 3 ml 초과이고, 따라서 보관 기간 후 바이러스 적정을 위해 적절한 부피를 입수할 수 있었다.
낮은
pH
보관
30 ml 분취량의 바이러스 스파이크 및 pH 조절된 (pH 4.9±0.1) Subcuvia NG 중간체를 0.45 ㎛ PVDF 막 필터를 통해 50 ml 무균 유리 병으로 여과하였다. 여과 후에 Subcuvia NG 중간체의 최소 부피는 항상 24 ml 초과였다. 따라서, 보관 기간 후에 바이러스 적정 후에 충분한 부피를 입수할 수 있었다. 이어서, 외부 온도 센서를 통해 온도 조절된 저온유지장치에 의해 수조를 조절하면서, 수조를 사용하여 앞 뒤로 느리게 움직이면서 교반 하에 온도를 30±1 ℃로 다시 평형화하였다. 외부 온도 센서 및 추가의 Pt 100 전극을, 낮은 pH 보관을 위해 사용되는 것과 균등한, 각각 30 ml의 물로 채워진 1개의 50 ml 유리 병에 넣었고, 이것이 여과 후에 스파이크 공정 물질의 가능한 최대 양이었다. 온도를 연속적으로 기록하였다. 물질이 29 ℃의 온도에 이르자마자, 샘플 채집을 시작하였다. 낮은 pH에 의한 바이러스의 불활성화를 더욱 막기 위하여, 각각의 샘플을 각각의 냉각 세포 배양 배지 (+2 ℃ 내지 +8 ℃에서 보관됨)로 1:3.16 (즉, 1 부피의 샘플 + 2.16 부피의 세포 배양 배지)로 즉시 희석하고, 적정하였다. 모든 작업에서, Subcuvia NG 중간체를 교반 하에 (느린 동작으로 앞 뒤로) 30±1 ℃에서 27일±5시간 동안의 전체 공정에 걸쳐서 보관하고, 보관 매주 1회 적어도 6시간 (≥ 6시간) 동안 온도를 25±1 ℃로 감소시켰다. 착오로, 보관 첫 번째 및 두 번째 주에서 1주에 2회, 즉 낮은 pH 처리의 첫 번째 주에서 0일 및 4일 보관 동안에, 그리고 두 번째 주에서 7일 및 10일 보관 동안에 6시간 동안 25±1 ℃로의 온도 저하를 수행하였다. 논의를 위하여, 항목 4.1.1 ("온도 측면")을 참조한다. 샘플추출 계획에 따라서 추가의 샘플을 취하고 (항목 3.2 참조), 상기 기재된 바와 같이 즉시 희석하고 적정하였다. 30±1 ℃에서 낮은 pH 보관의 완결 후에, 직접적인 측정에 의해 그리고 유럽 약전에 의해 추천된 방법에 의해 (즉, 0.9% NaCl 용액으로 1% 단백질로 희석) pH를 결정하였다.
바이러스를 갖지 않은 대조 작업
바이러스-스파이크 작업을 위해 기재된 것과 같이 2개의 대조 작업을 수행하였으며, 여기에서 비스파이크 및 0.45 ㎛ 여과된 Subcuvia NG 중간체를 처리하였다. 물질을 pH 조절하지 않는 것 이외에는, 동일한 공정 매개변수를 각각 바이러스-스파이크 작업 1 및 2에 대해 규정된 것과 같이 적용하였다. 샘플추출 계획에 따라 생화학적 매개변수의 결정을 위한 샘플을 취하였다 (항목 3.2 참조).
모의-스파이크 출발 물질 (감염된 세포를 위한 BT-배지*로 0.9:10으로 스파이크; 적정 전에 상기 기재된 바와 같이 샘플을 여과함) 및 0.45 ㎛ 여과 후의 모의-스파이크 및 pH 조절된 Subcuvia NG 중간체의 세포독성을 결정하였다. 샘플추출 계획에 따라 세포독성의 결정을 위한 샘플을 취하였다 (항목 3.2 참조).
* 감염된 세포를 위한 BT-배지의 조성은 다음과 같다: DMEM (4.5 g/l D-글루코스 함유) + 1% (v/v) L-글루타민 (200 mM) + 1% (v/v) 겐타마이신 술페이트 (10 mg/ml) + 1% (v/v) 피루브산나트륨 + 2% (v/v) 중탄산나트륨 (7.5%) + 1% 비-필수 아미노산 + 5% (v/v) 말 혈청
잠재적 간섭
바이러스의 검출과 함께 pH 조절 (pH 4.9±0.1) 후에 Subcuvia NG 중간체를 함유하는 샘플에 대하여 샘플 기질의 간섭을 다음과 같이 각각의 지표 세포주에 대해 중복하여 조사하였다: 모의-스파이크 pH 조절되고 0.45 여과된 Subcuvia NG 중간체로부터 빼낸 1 ml의 샘플을 각각의 냉각 세포 배양 배지 (+2 내지 +8 ℃로 보관됨)로 1:3.16 (v/v)으로 희석하였다. 이어서, 1.8 ml의 희석된 물질을 0.2 ml의 사전-희석된* 바이러스 스톡 현탁액으로 2.0 내지 3.0 log10 [TCID50/ml]의 계산된 역가까지 1:10 스파이크하였다. 혼합 후에, 샘플을 빼내고 즉시 적정하였다. 대조로서, 1.8 ml의 각각의 냉각 세포 배양 배지 (+2 내지 +8 ℃에서 보관됨)를 적정 전에 사전-희석된 바이러스 스톡 현탁액과 매우 동일한 방식으로 스파이크하였다.
* 바이러스 스톡 현탁액의 사전-희석을 위하여 적절한 세포 배양 배지 [BT 세포를 위한 BT-배지 (BVDV), A9 세포를 위한 A9-배지 (MMV)]를 사용하였다.
샘플추출 계획
바이러스 적정
샘플 추출을 위해 하기 허용 범위가 적용된다: 1일 보관 후 (± 1시간), 2 내지 6일 보관 후 (± 2시간), 7 내지 13일 보관 후 (± 3시간), 14 내지 20일 보관 후 (± 4시간), 및 21 내지 27일 보관 후 (± 5시간). 샘플 코드에 관해서는 항목 1.1 (공정 계획) 참조.
추가의 보관 없이 샘플을 즉시 적정하였다.
§ 샘플을 적정 전에 각각의 냉각 세포 배양 배지로 1:3.16으로 즉시 희석하였다.
세포독성의 결정
추가의 보관 없이 샘플을 즉시 적정하였다.
§ 샘플을 적정 전에 각각의 냉각 세포 배양 배지로 1:3.16으로 즉시 희석하였다.
간섭의 결정
추가의 보관 없이 샘플을 즉시 적정하였다.
§ 샘플을 적정 전에 각각의 냉각 세포 배양 배지로 1:3.16으로 즉시 희석하였다.
생화학적 매개변수의 결정
각각의 비스파이크 대조 작업 단독으로부터 샘플을 취하고 분석 때까지 +2 ℃ 내지 +8 ℃에서 보관하였다.
1 규모 축소된 공정의 평가를 위하여, 2개의 "규모 확대" 로트 뿐만 아니라 통상적으로 만들어진 재료 (로트 번호 IGSC64)의 제조 동안에 얻은 데이터를 고려하였다.
2 규모 축소된 공정의 평가를 위하여, 2개의 "규모 확대" 로트의 제조 동안에 얻은 데이터를 고려하였다.
3 제품의 개발 단계의 측면에서, 28일 보관 기간 후에 생화학적 매개변수의 데이터를 입수할 수 있는 것으로 보이지 않는다.
결과 및 논의
지질- 및 비-지질-외피보유 바이러스 양쪽 모두에 대해 특정 목적을 위한 불활성화 단계로서 낮은 pH 및 승온에서 Subcuvia NG의 보관의 효능 및 강건성을, 이 단계의 규모-축소 실험실 모델을 사용하여, BVDV 및 MMV으로 조사하였다. 유효 매개변수 및 생화학적 매개변수를 규모-축소된 공정에서 한정하고 측정하였으며, 제조 공정의 조건에 따른 결과를 비교함으로써 2개 공정의 동등성을 확인하였다.
유효 및 생화학적 매개변수의 결과
유효 매개변수
바이러스 불활성화를 위해 중요한 매개변수, 즉 공정 물질의 pH, 낮은 pH 보관 동안의 온도 및 보관 시간을 결정함으로써 규모 축소된 절차의 유효성을 입증하였다.
낮은
pH
및
승온에서
보관 전의
pH
값
모든 작업에서 스파이크 공정 물질의 pH를 측정하고 필요에 따라 4.9±0.1로 조절하였으며, 따라서 연구 계획에 규정된 한계 이내였다. 보관 후에 결정된 pH 값은 항목 4.1.2 (기타 공정 및 생화학적 매개변수)에 언급되어 있다.
온도 프로파일
낮은 pH 및 승온에서 온도 변화에 대한 보관 단계의 강건성을 조사하기 위하여, 보관 매주 1회 6시간 동안 온도를 30±1 ℃로부터 25±1 ℃로 저하시켰다. 온도는 항상 연구 계획에 규정된 범위 이내였다. 그러나, 첫 번째 및 두 번째 보관 주에서, 착오로, 1주 당 2회, 즉 첫 번째 주에 0일 및 4일 동안, 그리고 두 번째 주에 7일 및 10일 동안, 6시간 동안 25±1 ℃로의 온도 저하를 수행하였다. 이러한 사건은 바이러스 불활성화에 대해 작업 측면을 좋지 않은 계획으로 변화시키기 때문에, 바이러스 불활성화의 강건성을 원래 의도된 것보다 더욱 광범위하게 연구하였다.
보관 시간
Subcuvia NG의 제조 방법을 위하여 낮은 pH 및 승온에서 보관의 지속 시간이 규정되지 않는다. 현행 연구의 결과에 의존하여, 몇 가지 옵션이 존재한다: 보관 시간의 지속을 위한 하나의 옵션은 21 내지 22일이고; 두 번째 옵션은 대략 28 일일 수도 있다. 바이러스 불활성화를 위해 덜 유리한 조건 하에서 낮은 pH 처리의 효능 및 강건성을 조사하기 위하여, 모든 규모 축소된 작업을 가능한 보관 시간의 하한 미만; 다시 말해서, 첫 번째 옵션을 위해 20일±4시간, 그리고 두 번째 옵션을 위해 27일±5시간 동안의 보관으로 수행하였다. 스파이크 중간체를 26일+22시간 (MMV, 양쪽 작업) 및 27일+1시간 (BVDV, 양쪽 작업) 동안 낮은 pH 및 승온에서 보관하였다. 3주 보관 후에 바이러스 제거를 조사하기 위하여, MMV를 위해 20일+1시간 후, 그리고 BVDV를 위해 20일+2시간 후에 바이러스 적정을 위한 샘플을 추출하였다.
보관 시간은 규모-축소된 작업을 위해 규정한 한계 이내, 즉 모든 작업에서 20일±4시간, 및 27일±5시간이고, 이것은 제조 시에 보관 수명의 통상적으로 고려되는 하한 미만이다.
기타 공정 및 생화학적 매개변수
낮은
pH
보관 후
pH
낮은 pH 보관 후에, pH 값을 다시 직접적으로 뿐만 아니라 유럽 약전(EP)에 의해 추천되는 방법, 즉 0.9% NaCl 용액으로 1% 단백질까지 희석하는 방법에 따라 측정하였다. 처리 후에 직접적인 측정에 의해 측정되는 pH는 낮은 pH 보관 전의 pH 값과 유사하고, 다시 말해서 차이는 -0.07 내지 +0.04의 범위이다 (보관 후 pH - 보관 전 pH). EP 방법에 따라 측정된 pH는 항상 직접 측정 방법에 비하여 0.2 내지 0.3 더 높았다. EP 방법을 사용할 때 이러한 약간의 pH 값 증가는 pH의 결정에서 2개의 상이한 방법에서 전형적이다. 이러한 사실은 제조 규모에서의 규정된 한계에서 고려되고, 여기에서 낮은 pH 처리 후의 pH 한계가 직접 측정에 의해 결정할 때 4.4 내지 4.9이고 EP 방법에 의해 결정할 때 4.6 내지 5.1이다.
분자 크기 분포 (
MSD
)
2개의 비스파이크 대조 작업에서 보관 전 및 후에 분자 크기 분포 (HPLC 분석에 의함)를 조사하였다. 시험 결과를 Subcuvia NG의 개발 중인 단계 동안 생성된 3개의 "규모-확대" 로트, 및 통상적으로 만들어진 IGSC64 (14% 뿐만 아니라 20% 단백질 농도)와 비교하였다. "규모-확대" 로트로 명명되는 로트 IGSC64를, 이 단계를 위해 충분한 물질을 입수할 수 없기 때문에, 제조 시에 낮은 pH 및 승온에서 보관하지 않았다. 모든 결과를 서로 잘 비교하였다. 분자 크기 분포, 특히 IgG 단량체의 퍼센트의 값은 "규모 확대" 작업에서 관찰되는 것과 유사하였다. 보관 후에 IgG 단량체의 농도가 수 퍼센트 포인트 낮은 두 번째 대조 작업을 위하여, 보관 전의 물질은 이미 비교적 낮은 농도의 IgG 단량체를 가지며, 이것은 "규모 확대" 공정에서 시험된 물질에도 적용된다. 따라서, 분자 크기 분포 데이터는 대규모 공정과 규모-축소 공정의 동등성을 뒷받침한다.
감마글로블린의
순도
2개의 비스파이크 대조 작업으로부터 샘플의 감마글로블린의 순도 (CA-전기영동에 의함)를 결정하고, 2개의 "규모-확대" 로트로부터 수득된 결과 및 통상적으로 만들어진 물질 IGSC 64 (14% 뿐만 아니라 20% 단백질 농도, 낮은 pH 처리 전의 값, 설명을 위해 상기 참조)로부터 수득된 결과와 비교하였다. 규모-축소된 공정 동안에 감마글로블린 순도에 대해 결정된 모든 값을 "규모 확대"로트에 대해 수득된 결과와 비교하였으며, 분석 정확도 이내였다 (상대적 표준 편차는 1.5%였다). 이러한 결과는 제조 공정에 대한 규모 축소의 동등성을 증명한다.
바이러스 적정의 결과
세포독성
낮은 pH 및 승온에서 보관 전에 수득된 중간체의 세포독성을, 바이러스 스파이크 작업에 대해 설명된 것과 같이 각각의 pH로 조절된 모의-스파이크 물질을 사용하여 대조 작업에서 조사하였다. pH 조절된 중간체가 1.0 log10 희석 및 그 이상으로부터의 세포독성 효과를 나타내지 않는 BT 세포에서의 작업 2를 제외하고는, pH 조절 전 및 후의 모의-스파이크 공정 중간체는 모든 2개의 작업에서 사용된 세포에서 단지 매우 약한 세포독성 효과를 나타내었다. 바이러스-스파이크 작업에서 세포독성에서의 상당한 차이가 나타나지 않았다.
간섭 시험
간섭 시험으로부터의 결과는 BVDV 및 MMV의 낮은 역가의 검출과 함께 샘플 기질의 상당한 간섭을 나타내지 않는다; 스파이크 세포 배양 배지 대조와 스파이크 Subcuvia NG 중간체 간의 바이러스 역가에서의 차이는 -1.0 log10 내지 0.1 log10이었고, 이것은 바이러스 적정 분석의 정확도 범위 이내이다. 따라서, 바이러스 불활성화 작업 동안에 수득된 역가는 간섭 효과에 의해 왜곡되지 않았으며, 샘플의 실제 역가를 나타낸다.
바이러스 불활성화
각각의 바이러스 BVDV 및 MMW에서 2개의 작업, 즉 13.5% 단백질 농도에서 작업 1, 및 20.9% 단백질 농도에서의 작업 2을 수행하였다. 양쪽 작업은 pH 4.9± 0.1 및 30±1 ℃에서 수행되었고, 여기에서 1주 당 1회 최소 6시간 동안 온도를 25±1 ℃로 저하시켰다. 2개 작업의 결과를 비교하면, Subcuvia NG의 가능한 단백질 농도의 상한 및 하한에서 수행되는 2개 작업 간의 바이러스 불활성화 반응속도의 현저한 차이를 나타내지 않았다.
바이러스 불활성화를 위해 최소의 바람직한 조건, 즉 보관 시간 및 온도의 하한 뿐만 아니라 pH의 상한을 사용한다면, 조사되는 조건과는 무관하게, 20일±4시간의 보관 후 BVDV의 상당한 불활성화 및 27일±5 시간의 보관 후 개개의 Subcuvia NG 중간체로 스파이크될 수 있는 모든 바이러스의 완전한 불활성화가 BVDV에서 증명되었다. 양쪽 작업에서, BVDV로부터의 잔류 감염성이 20일에도 여전히 검출될 수 있다. 그러나, 모든 BVDV는 27일 보관이 끝날 때 검출 한계 미만으로 불활성화되었다. MMV에 대한 감소 계수는, 비-지질 외피보유 바이러스의 측면에서 이 공정 단계가 제품의 바이러스 안전성에 실질적으로 기여함을 증명한다. 각각의 바이러스 역가 및 사용된 바이러스의 감소 계수를 이하에서 더욱 상세히 언급한다. 추가로, 각각의 결과-표에서 각각의 바이러스에 대해 바이러스 불활성화 반응속도를 그래프로 나타낸다.
BVDV
BVDV는 20일의 보관에 의하여 검출 한계 (작업 1) 또는 검출 한계 (작업 2)까지 거의 불활성화되었고, 작업 1 및 2에서 각각 5.3 log10 및 5.5 log10의 감소 계수를 제공한다. 보관 27일 후에, Subcuvia NG 중간체 내로 스파이크된 모든 BVDV는 양쪽 작업을 위한 검출 한계 미만으로 불활성화되었고, 감소 계수는 작업 1 및 2에서 각각 > 6.6 log10 및 > 6.5 log10이었다. 2개 작업의 불활성화 속도에서 상당한 차이가 관찰될 수 없었다. 작업 1 (13.5% 단백질 농도) 및 작업 2 (20.9% 단백질 농도)에서 양쪽 중간체는 필적하는 불활성화 속도를 나타내었다.
승온에서의 낮은 pH 처리는 20일±4시간 동안의 보관 후에 BVDV의 효과적인 불활성화를 나타내었고, 계산된 평균 감소 계수는 5.4 log10이었다. 낮은 pH 및 승온에서의 처리 27일 후에, BVDV가 검출 한계 미만으로 완전히 불활성화되었으며, 여기에서 >6.6 log10의 평균 감소 계수가 계산되었다.
MMV
MMV에 대하여, 낮은 pH 및 승온에서 20일 보관 후에 작업 1 및 작업 2에 대하여 각각 2.9 log10 및 3.1 log10의 감소 계수가 계산되었다. 계산된 평균 감소 계수는 3.0 log10이다. 낮은 pH 처리의 27일 후에, 3.4 log10 및 3.7 log10의 감소 계수가 수득되었으며, 여기에서 계산된 평균 감소 계수는 3.6log10이다. 이러한 감소 계수는 파르보바이러스에 대한 제조 공정의 바이러스 안전성 측면에 이러한 공정 단계가 실질적으로 기여함을 증명하며, 이것은 물리-화학적 불활성화에 대해 매우 저항성이다. 양쪽 작업에서 바이러스 불활성화 반응속도는 이상성이고, 첫 번째 7일 동안에 더욱 빨리 불활성화되고 그 다음 3주 동안에 다소 느리게 불활성화된다.
유지 대조
바이러스 불활성화의 메카니즘을 조사하기 위하여, 즉 pH에 의해 또는 온도에 의해 또는 이둘의 조합에 의해 매개되는지의 여부를 조사하기 위하여, 3개의 유지 대조를 각각의 조건 아래에 놓아두었다.
양쪽 바이러스에 대하여 2 내지 8 ℃에서 27일±5시간 동안 놓아둔 "조합된 유지 대조" (pH 7.0±0.1)의 적정에 의하여, 역가의 작은 손실 (1.6 log10)이 관찰되는 작업 2에서의 MMV에 대한 것 이외에는, 바이러스 스파이크 출발 물질과 필적하는 바이러스 역가가 조사되었다.
30±1 ℃ 및 pH 7.0±0.1에서의 보관 ("pH 유지 대조")은 지질 외피보유 바이러스 BVDV가 승온에서의 보관에 매우 민감하다는 것을 나타내었다. BVDV는 양쪽 작업에서 4.6 log10 만큼 불활성화되었다. 또한, 비-지질-외피보유 바이러스 MMV는 각각 작업 1 및 작업 2에서 3.3 및 3.8 log10 만큼 불활성화되었다.
양쪽 바이러스에 대하여 2 내지 8 ℃에서 낮은 pH에서 27일±5시간 보관 후에 "온도 유지 대조" (t HC)의 적정에 의하여, 바이러스 스파이크 출발 물질과 필적하는 바이러스 역가가 조사되었다. 이러한 결과는 BVDV 뿐만 아니라 MMV가 낮은 온도에서 4.4 내지 4.9의 낮은 pH에서의 보관에 저항성임을 증명한다.
전체적으로 보면, 3개의 유지 대조의 결과는 다음을 제시한다:
● 온도가 BVDV의 불활성화를 위해 가장 중요한 인자이고, 낮은 pH가 어느 정도 기여한다 (30±1 ℃ 및 중성 pH에서의 대조가 27일 후에 실질적으로 불활성화되지만, 그러나 완전히 불활성화되지는 않는다는 사실에 근거한다).
● MMV의 불활성화를 위하여, 27일 후에 낮은 pH 속도 샘플의 바이러스 역가가 중성 pH 및 30 ℃에서의 대조와 실제로 동일하기 때문에 온도가 유일한 관련 인자인 것으로 생각된다.
요약 및 결론
본 연구 과정에서, Subcuvia NG의 제조에서 낮은 pH 및 승온에서의 규모-축소된 보관 모델을 설정하고, 몇 가지 공정 매개변수의 결정에 의하여 그의 제조 절차와의 동등성을 입증하였다. 추가로, 규모-축소된 모델로부터의 중간체와 제조 공정의 생화학적 매개변수의 비교는 양쪽 공정의 동등성을 더욱 뒷받침하며, 이것은 규모-축소 동안에 수득된 감소 계수가 대 규모에서도 타당함을 나타낸다. 바이러스 불활성화에 관해 강건성을 조사하기 위하여, Subcuvia NG의 상이한 단백질 농도의 영향을 조사하고, 스파이크 출발 물질의 pH를 제조 공정에 비해 상한선으로 조절하였으며, 온도의 주기적 저하의 영향을 조사하였다. 일반적인 연구에서 수득된 바이러스 감소 계수 및 불활성화 속도는, 지질 외피보유된 바이러스 BVDV가 낮은 pH 및 승온에서의 보관에 의하여 27일 이내에 효과적으로 그리고 강건하게 불활성화됨을 증명한다. 또한, 낮은 pH 및 승온에서 20일 동안 보관한 후에, 5.4 log10의 평균 계산된 감소 계수만큼 BVDV의 상당한 불활성화가 BVDV에서 달성되었다. 파르보바이러스 모델 MMV에 대한 계산된 평균 감소 계수, 즉 20일 보관 후의 3.0 log10 및 20일 보관 후의 3.6 log10은, 높은 물리화학적 저항성 [2]을 위한 작은 비 지질-외피보유 DNA 바이러스의 측면에서, 이 공정 단계가 20일 뿐만 아니라 27일의 보관 기간 동안 제조 공정의 바이러스 안전성에 더욱 기여함을 나타낸다.
조사된 양쪽 단백질 농도는, MMV 및 BVDV를 위해 동일한 불활성화 속도를 나타내고, 이것은 바이러스 불활성화 능력에 미치는 단백질 농도의 영향이 농축된 면역글로불린 용액 및 바이러스 BVDV 및 MMV에서 중요하지 않음을 시사한다.
여기에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예증을 위한 것이고, 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제시될 것이며, 본 출원의 의도 및 범위와 청구의 범위의 범위 내에 포함된다는 것을 이해해야 한다. 여기에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
Claims (19)
- (A) 제1 한외여과 막을 포함하는 제1 한외-/정용여과 시스템을 사용하여 한외여과에 의해 IgG를 포함하는 제1 용액을 2% 내지 10%(w/v)의 단백질 농도로 농축시킴으로써, 제1 IgG 농축액을 형성하고;
(B) 제1 한외여과 막을 포함하는 제1 한외-/정용여과 시스템을 사용하여 제1 IgG 농축액을 정용여과 완충액에 대해 정용여과함으로써, 제1 IgG 정용여과액을 형성하고;
(C) 제1 한외여과 막을 포함하는 제1 한외-/정용여과 시스템을 사용하여 한외여과에 의해 제1 IgG 정용여과액을 20%(w/v) 초과의 단백질 농도로 농축시킴으로써, 제2 IgG 농축액을 형성하고;
(D) 제2 IgG 농축액을 제1 한외-/정용여과 시스템으로부터 수집하고;
(E) 제1 한외-/정용여과 시스템의 사 용적(dead volume)의 적어도 2배와 같은 후-세척 완충액의 부피로 세척되는 제1 한외-/정용여과 시스템을 통해 후-세척 완충액을 재순환시켜 제1 한외여과막을 세척함으로써, 제1 IgG 후-세척 용액을 형성하고;
(F) 제1 IgG 후-세척 용액을 제1 한외-/정용여과 시스템으로부터 표면적이 제1 한외여과 막의 표면적보다 작은 제2 한외여과 막을 포함하는 제2 한외-/정용여과 시스템으로 전달하고;
(G) 제2 한외-/정용여과 막을 포함하는 제2 한외-/정용여과 시스템을 사용하여 한외여과에 의해 제1 IgG 후-세척 용액을 20%(w/v) 초과의 단백질 농도로 농축시킴으로써, 제3 IgG 농축액을 형성하고;
(H) 제2 한외-/정용여과 시스템으로부터의 제3 IgG 농축액을 제2 IgG 농축액과 배합함으로써, 농축 IgG 조성물을 형성하는
단계를 포함하는, 농축 면역글로불린 G (IgG) 조성물의 제조 방법. - 제1항에 있어서, IgG를 포함하는 제1 용액이 (A)에서 5±1%(w/v)의 단백질 농도로 농축되는 방법.
- 제1항에 있어서, 제1 한외여과 막이 개방 스크린 막인 방법.
- 제1항에 있어서, 제1 한외여과 막 또는 제2 한외여과 막이 100 kDa 이하의 공칭 분자량 컷오프 (NMWCO)를 갖는 방법.
- 제1항에 있어서, 제1 한외여과 막 및 제2 한외여과 막이 100 kDa 이하의 공칭 분자량 컷오프 (NMWCO)를 갖는 방법.
- 제1항에 있어서, 제1 한외여과 막 또는 제2 한외여과 막이 90 kDa 이하의 공칭 분자량 컷오프 (NMWCO)를 갖는 방법.
- 제1항에 있어서, 제1 한외여과 막 및 제2 한외여과 막이 90 kDa 이하의 공칭 분자량 컷오프 (NMWCO)를 갖는 방법.
- 제1항에 있어서, 제1 한외여과 막 및 제2 한외여과 막이 동일한 공칭 분자량 컷오프 (NMWCO)를 갖는 방법.
- 제1항에 있어서, 정용여과 완충액이 0.2M 내지 0.3M의 글리신을 포함하고 pH가 4.2±0.1인 방법.
- 제1항에 있어서, 제2 IgG 농축액이 22%(w/v) 이상의 단백질 농도를 갖는 방법.
- 제1항에 있어서, 제2 한외여과 막의 표면적이 제1 한외여과 막의 표면적의 1/10 이하인 방법.
- 제1항에 있어서, (H)에서 형성된 농축 IgG 조성물의 단백질 농도가 20%(w/v) 초과이고, (H)에서 형성된 농축 IgG 조성물의 농도를 약 20%(w/v)로 조정하는 것을 더 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, (H)에서 형성된 농축 IgG 조성물의 pH가 4.0 내지 6.0인 방법.
- 제1항에 있어서,
(I) 제2 한외-/정용여과 시스템을 통해 후-세척 완충액을 재순환시킴으로써 제2 한외여과 막을 세척함으로써, 제2 IgG 후-세척 용액을 형성하고;
(J) 제2 IgG 후-세척 용액의 적어도 일부를 (H)에서 형성된 농축 IgG 조성물과 혼합함으로써 (H)에서 형성된 농축 IgG 조성물의 단백질 농도를 조정하는
단계를 더 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, IgG가 인간 IgG인 방법.
- 제1항에 있어서,
(A) 60 kDa 이하의 NMWCO를 갖는 제1 한외여과 막을 포함하는 제1 한외-/정용여과 시스템을 사용하여 한외여과에 의해 IgG를 포함하는 제1 용액을 5±1%(w/v)의 단백질 농도로 농축시킴으로써, 제1 IgG 농축액을 형성하고;
(B) 제1 한외여과 막을 포함하는 제1 한외-/정용여과 시스템을 사용하여 제1 IgG 농축액을 글리신을 포함하고 pH가 4.2±0.1인 정용여과 완충액에 대해 정용여과함으로써, 제1 IgG 정용여과액을 형성하고;
(C) 제1 한외여과 막을 포함하는 제1 한외-/정용여과 시스템을 사용하여 한외여과에 의해 제1 IgG 정용여과액을 20%(w/v) 초과의 단백질 농도로 농축시킴으로써, 제2 IgG 농축액을 형성하고;
(D) 제2 IgG 농축액을 제1 한외-/정용여과 시스템으로부터 수집하고;
(E) 제1 한외-/정용여과 시스템을 통해 제1 한외-/정용여과 시스템의 사 용적의 적어도 2배와 같은 부피를 갖는 후-세척 완충액을 재순환시킴으로써 제1 한외여과막을 세척함으로써, 제1 IgG 후-세척 용액을 형성하고;
(F) 제1 IgG 후-세척 용액을 제1 한외-/정용여과 시스템으로부터 60 kDa 이하의 NMWCO를 갖는 제2 한외여과 막을 포함하는 제2 한외-/정용여과 시스템으로 수집하고;
(G) 제2 한외여과 막의 표면적이 제1 한외여과 막의 표면적의 1/10 이하인 제2 한외-/정용여과 막을 포함하는 제2 한외-/정용여과 시스템을 사용하여 한외여과에 의해 제1 IgG 후-세척 용액을 20%(w/v) 초과의 단백질 농도로 농축시킴으로써, 제3 IgG 농축액을 형성하고;
(H) 제2 한외-/정용여과 시스템으로부터의 제3 IgG 농축액을 제2 IgG 농축액과 배합함으로써, 농축 IgG 조성물을 형성하고;
(I) 제2 한외-/정용여과 시스템을 통해 후-세척 완충액을 재순환시킴으로써 제2 한외여과 막을 세척함으로써, 제2 IgG 후-세척 용액을 형성하고;
(J) 제2 IgG 후-세척 용액의 적어도 일부를 (H)에서 형성된 농축 IgG 조성물과 혼합함으로써 (H)에서 형성된 농축 IgG 조성물의 단백질 농도를 조정하는
단계를 포함하는 방법. - 삭제
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