BRPI1012082B1

BRPI1012082B1 - Método para preparar uma composição de igg concentrada a partir de plasma

Info

Publication number: BRPI1012082B1
Application number: BRPI1012082-3A
Authority: BR
Inventors: Wolfgang Teschner; Harald Arno Butterweck; Azra Pljevljakovic; Theresa Friederike Bauer; Bernhard Koelbl; Hans-Peter Schwarz; Nebojsa Nikolic; Gerhard Poelsler; Johanna Kindermann
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date: 2009-05-27
Filing date: 2010-05-27
Publication date: 2022-08-16
Also published as: TW201107344A; BRPI1012082A2; CO6480954A2; US20140030252A1; CN102459331A; AU2020204244A1; US11242380B2; AU2018200548B2; US20100330071A1; EP2762492A3; MY157239A; AU2018200548A1; US20160244512A1; AU2022228125A1; MX2011012576A; EA023382B1; US10125189B2; AU2016203542A1; JP5341252B2; KR101464032B1

Abstract

COMPOSIÇÃO AQUOSA, MÉTODO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO DE IgG CONCENTRADA A PARTIR DE PLASMA, E, USO DA COMPOSIÇÃO. A presente invenção diz respeito a um método novo e melhorado para preparar uma composição de imunoglobulina altamente concentrada a partir de plasma reunido para injeção subcutânea. Uma composição que compreende 20% ou mais de imunoglobulina adequada para o uso subcutâneo também é descrita.

Description

REFERÊNCIAS CRUZADAS AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. No 61/181.606 depositado em 27 de maio de 2009, que é expressamente aqui incorporado por referência na sua totalidade para todos os propósitos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Os produtos de imunoglobulina de plasma humano foram primeiro usados em 1952 para tratar a deficiência imune. Inicialmente, a administração intramuscular ou subcutânea de IgG foram os métodos de escolha. Para injetar quantidades grandes de IgG necessárias para o tratamento eficaz de várias doenças, entretanto, produtos administráveis intravenosamente com IgG concentrada mais baixa (50 mg/ml) foram desenvolvidos. Usualmente a imunoglobulina intravenosa (IVIG), contém a imunoglobulina G (IgG) reunida imunoglobulinas do plasma de mais do que mil doadores de sangue. Tipicamente contendo mais do que 95 % de IgG não modificada, que tem funções efetoras dependentes de Fc intactas, e apenas quantidades traço de imunoglobulina A (IgA) ou imunoglobulina M (IgM), IVIGs são produtos estéreis, de IgG purificada primariamente usada no tratamento de três categorias principais de condições médicas: 1. Deficiências imunes tais como agamaglobulinemia ligada a X, hipogamaglobulinemia (deficiências imunes primárias), e condições de imunidade comprometida adquirida (deficiências imunes secundárias), caracterizando níveis de anticorpo baixos; 2. doenças inflamatórias e autoimunes; e 3. infecções agudas.

[003] Vários fornecedores comerciais de IVIG fornecem uma variedade de produtos de IVIG. Comparados aos produtos de IVIG liofilizados mais velhos contendo apenas 50 mg/ml de proteína na solução depois de redissolver, os últimos desenvolvimentos são 100 mg/ml de preparação pronta para o uso estéril, líquida de anticorpos de IgG humana altamente purificadas e concentradas. Visto que os produtos de IgG tais como IVIGs são fabricados a partir de plasma humano reunido, a contaminação de patógeno (especialmente vírus conhecido causar várias doenças em seres humanos) de sangue de doador é um problema sério no processo de produção. Uma outra consideração importante nos produtos de IgG é a sua estabilidade durante a armazenagem, especialmente como preparações prontas para o uso. Comparadas com IVIG, as preparações de imunoglobulina subcutaneamente administráveis têm as vantagens de possibilidade de tratamento doméstico e menos efeitos colaterais. Para reduzir a desvantagem do volume de injeção pequeno por local, um IgG concentrada mais alta (por exemplo, contendo 200 mg/ml ao invés de 100 mg/ml) seria uma vantagem evidente.

[004] Na quarta parte de uma série de documentos contendo potencial para desenvolvimento futuro publicados sobre a preparação e propriedades de proteínas séricas e plasmáticas, Cohn et al. (J. Am. Chem. Soc., 1946, 68(3): 459-475) primeiro descrevem um método para o fracionamento alcoólico de proteínas plasmáticas (método 6), que possibilita a isolação de uma fração enriquecida em IgG a partir de plasma humano. Vários anos mais tarde, Oncley et al. (J. Am. Chem. Soc., 1949, 71(2): 541550) expandiu os métodos de Cohn pela publicação de um método (método 9) que resultou na isolação de uma preparação de IgG mais pura.

[005] Estes métodos, embora assentasse a fundação para uma indústria inteira de fatores sanguíneos derivados de plasma, foram incapazes de fornecer preparações de IgG tendo concentrações suficientemente altas para o tratamento de várias doenças imuno-relacionadas, incluindo a síndrome de Kawasaki, púrpura trombocitopênica imune, e deficiências imunes primárias. Como tal, metodologias adicionais que utilizam várias técnicas, tais como cromatografia de troca iônica, foram desenvolvidas para fornecer formulações de IgG de pureza mais alta e concentração mais alta. Hoppe et al. (Munch Med Wochenschr 1967 (34): 1749-1752) e Falksveden (Patente Suíça No 348942) e Falksveden e Lundblad (Methods of Plasma Protein Fractionation 1980) foram entre os primeiros a utilizar a cromatografia de troca iônica para este propósito.

[006] Vários métodos modernos utilizam uma etapa de precipitação, tal como a precipitação de caprilato (Lebing et al., Vox Sang 2003 (84): 193201) e precipitação com etanol da Fração de Cohn (I+)II+III (Tanaka et al., Braz J Med Biol Res 2000 (33)37-30) ligada à cromatografia de coluna. Mais recentemente, Teschner et al. (Vox Sang, 2007 (92): 42-55) descreveram um método para a produção de um produto com 10 % de IVIG em que o crio- precipitado é primeiro removido a partir de plasma reunido e depois um fracionamento com etanol frio de Cohn-Oncley modificado é realizado, seguido pelo tratamento S/D do intermediário, cromatografia de troca iônica, nanofiltração, e opcionalmente ultrafiltração/diafiltração.

[007] Entretanto, a despeito da pureza, segurança, e rendimento melhorados proporcionados por estes métodos de fabricação de IgG, as preparações de IgG altamente concentradas adequadas para a administração subcutânea e/ou intramuscular são ainda necessárias. A presente invenção satisfaz estas e outras necessidades e descreve o método de fabricação de um produto estável, altamente purificado, viralmente inativado, pronto para o uso com alta concentração de IgG.

SUMÁRIO RESUMIDO DA INVENÇÃO

[008] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma composição aquosa que compreende mais do que cerca de 180 gramas de proteína por litro da composição, e pelo menos 95 % da proteína é IgG, tal como IgG humana. Em algumas formas de realização, a composição é produzida por um processo que leva a um produto adequado para a administração subcutânea e intravenosa, e pode ser tratada em temperatura elevada no recipiente final para inativar vírus sem levar em consideração que a concentração é ajustada entre uma faixa de concentração de 10 a 22 % de proteína. Em alguns casos, a concentração da proteína na composição é de ou cerca de 20 % (p/v). Em outros casos, a composição pode compreender ainda cerca de 0,1 a 0,3 M de glicina. A composição desta invenção pode ter pH variável, tal como de cerca de 3 a 6, ou de cerca de 4 a 6.

[009] Em um outro aspecto, esta invenção fornece um método para preparar uma composição de IgG concentrada a partir de plasma com a melhora que compreende as etapas de: (1) concentrar a proteína em uma preparação plasmática até ou em torno de 5 % (p/v) pela ultrafiltração; e (2) concentrar ainda mais a proteína na preparação até ou em torno de 20 % (p/v) pela diafiltração. Pelo menos 95 % da proteína aludida na composição é IgG, tal como IgG humana. Em algumas formas de realização, a etapa (1) é realizada usando uma membrana de ultrafiltração com um corte de peso molecular nominal (NMWCO) de 100 kDa ou menos. Em outras formas de realização, a etapa (2) é realizada contra um tampão de diafiltração de glicina com um pH de 4,2 ± 0,1. O tampão de diafiltração em alguns casos tem 0,25 M de glicina e um pH de 4,0. Em algumas formas particulares de realização, a concentração da proteína depois da etapa (2) é mais alta do que 20 % (p/v) e é subsequentemente ajustada até ou em torno de 20 % (p/v) com um tampão de diafiltração.

[0010] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para preparar uma composição de IgG concentrada a partir de plasma, que compreende as etapas de: (1) separar líquido e precipitado a partir de plasma pela centrifugação; (2) misturar etanol pré-esfriado com o líquido de (1) para formar uma mistura, que tem uma concentração de etanol de até ou em torno de 8 % (v/v); (3) separar líquido e precipitado da mistura de (2) pela centrifugação; (4) ajustar o pH e a concentração de etanol do líquido de (3) até ou em torno de 7,0 e 20 a 25 % (v/v), respectivamente, formando deste modo uma mistura; (5) separar líquido e precipitado da mistura de (4) pela centrifugação; (6) recolocar o precipitado de (5) em suspensão com um tampão em uma razão de até ou em torno de 1 a 15 em peso para formar uma suspensão; (7) misturar dióxido de silício (SiO2) com a suspensão de (6) e obter um filtrado pela filtração; (8) misturar um detergente e álcool frio com o filtrado de (7) e obter um precipitado pela centrifugação; (9) dissolver o precipitado em uma solução aquosa que compreende um solvente ou detergente e manter a solução por pelo menos 60 minutos; (10) passar a solução depois de (9) através de uma coluna de cromatografia de troca catiônica e eluir proteínas absorvidas na coluna em um eluído; (11) passar o eluído de (10) através de uma coluna de cromatografia de troca aniônica para gerar um efluente; (12) passar o efluente através de um nanofiltro para gerar um nanofiltrado; (13) passar o nanofiltrado através de uma membrana de ultrafiltração para gerar um ultrafiltrado; (14) diafiltrar o ultrafiltrado contra um tampão de diafiltração para gerar uma solução tendo uma concentração de proteína de até ou em torno de 20 % (p/v); e (15) esterilizar a solução de (14) pela filtração da solução através de um filtro de 0,2 μm ou menos, para obter deste modo uma composição de IgG concentrada.

[0011] Em algumas formas de realização, a etapa (2) é realizada em uma temperatura de cerca de -2 a 0° C; ou a mistura da etapa (2) é misturada por pelo menos 15 minutos e depois mantida por pelo menos 2 horas em uma temperatura de cerca de -2 a 0° C. Em algumas formas de realização, a etapa (4) é misturada por pelo menos 15 minutos e depois mantida por pelo menos 8 horas em uma temperatura de até ou em torno de -7° C. Em algumas formas de realização, a suspensão da etapa (6) é agitada por cerca de 40 a 160 minutos em uma temperatura de cerca de 2° C a 8° C e um pH de até ou em torno de 5,0; ou o dióxido de silício na etapa (7) está em uma concentração de 40 g/kg da suspensão da etapa (6) e a mistura é realizada em uma temperatura de cerca de 2 a 8° C por pelo menos cerca de 50 minutos. Em algumas formas de realização, a etapa (8) é realizada em uma temperatura de cerca de -5 a - 10° C. Em algumas formas de realização, a solução da etapa (9) compreende 1,0 % (v/v) Triton X-100, 0,3 % (v/v) Tween-80, e 0,3 % (v/v) de fosfato de tri-(n-butila) (TNBP). Em algumas formas de realização, a solução da etapa (9) é mantida em uma temperatura de cerca de 18 a 25° C. Em algumas formas de realização, a coluna de cromatografia de troca de cátion da etapa (10) é lavada com um tampão de acetato de 10 mM de pH 5,5 ± 0,1 e eluído com um tampão de fosfato de sódio monobásico a 35 mM, 10 mM de Tris, pH 8,5 ± 0,1, condutividade de 5,0 ± 0,2 mS/cm. Em algumas formas de realização, o eluído da etapa (10) é ajustado a um pH de 6,4 ± 0,2 e a condutividade de cerca de 1,5 a 2,5 mS/cm antes da etapa (11). Em algumas formas de realização, o efluente da etapa (11) é passado através de um filtro de 0,2 μm ou tamanho de poro menor antes da etapa (12). Em algumas formas de realização, o ultrafiltrado da etapa (13) tem uma concentração de proteína de até ou em torno de 5 ± 1 % (p/v). Em outras formas de realização, a membrana de ultrafiltração da etapa (13) tem um corte de peso molecular nominal (NMWCO) de 50 kDa ou menos. Em algumas formas de realização, o tampão de diafiltração da etapa (14) é uma solução de glicina a 0,25 M com um pH de 4,2 ± 0,1. Em outras formas de realização, a solução da etapa (14) tem uma concentração de proteína maior do que 20 % (p/v) e é subsequentemente ajustada até ou em torno de 20,4 ± 0,4 % (p/v) com o tampão de diafiltração. Em algumas formas de realização, as etapas (13) e (14) são realizadas em uma temperatura de cerca de 2 a 8° C. Em outras formas de realização, o método de preparação compreendendo ainda uma etapa de dispensar a solução esterilizada da etapa (15) dentro de recipientes sob condições estéreis antes que os recipientes sejam selados.

[0012] Em outras formas de realização, o método descrito acima pode compreender ainda uma etapa de armazenar os recipientes selados em cerca de 30 a 32° C por cerca de 21 a 22 dias; ou o método pode compreender ainda uma etapa de formulação para tornar o produto de IgG a 20 % tão estável quanto à formulação intravenosa de 10 % do estado da técnica.

[0013] Já em um outro aspecto, esta invenção fornece uma composição aquosa que é produzida pelo método de preparação descrito acima e compreende pelo menos 18 % (p/v) de imunoglobulina, por exemplo, pelo menos 20 % (p/v) de imunoglobulina.

[0014] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar um paciente que sofre de uma imunodeficiência, uma doença autoimune, ou uma infecção aguda, que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz da composição como descrita acima.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[0015] A Figura 1 é uma ilustração gráfica do novo sistema de ultrafiltração/diafiltração.

DEFINIÇÕES

[0016] Um “anticorpo” refere-se a um polipeptídeo substancialmente codificado por um gene da imunoglobulina ou genes da imunoglobulina, ou fragmentos destes, que especificamente se ligam e reconhecem um analito (antígeno). Os genes da imunoglobulina reconhecidos incluem os genes da região constante capa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, assim como a miríade de genes da região variável da imunoglobulina. As cadeias leves são classificadas como capa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, que por sua vez definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, respectivamente.

[0017] Uma unidade estrutural da imunoglobulina (anticorpo) exemplar é composta de dois pares de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia “leve” (cerca de 25 kD) e uma “pesada” (cerca de 50 a 70 kD). O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) referem-se a estas cadeias leve e pesada respectivamente.

[0018] O termo “ultrafiltração (UF)” abrange uma variedade de métodos de filtração de membrana em que a pressão hidrostática força um líquido contra uma membrana semipermeável. Sólidos e solutos colocados em suspensão de peso molecular alto são retidos, enquanto a água e solutos de peso molecular baixo passam através da membrana. Este processo de separação é frequentemente usado para purificar e concentrar soluções macromoleculares (103 a 106 Da), especialmente soluções de proteína. Várias membranas de ultrafiltração são disponíveis dependendo do tamanho das moléculas que elas retenham. A ultrafiltração é tipicamente caracterizada por um tamanho de poro de membrana entre 1 e 1000 kDa e pressões de operação entre 0,01 e 10 bar, e é particularmente útil para separar colóides como proteínas de moléculas pequenas como açúcares e sais.

[0019] O termo “diafiltração” é realizado com as mesmas membranas como ultrafiltração e é uma filtração de fluxo tangencial. Durante a diafiltração, tampão é introduzido dentro do tanque de reciclo enquanto o filtrado é removido da operação unitária. Nos processos onde o produto está no retentado (por exemplo IgG), a diafiltração lava componentes fora da reunião do produto no filtrado, trocando deste modo tampões e reduzindo a concentração de espécies indesejadas.

[0020] Como aqui usado, a palavra “cerca de” indica uma faixa aproximada de mais ou menos 10 % de um valor especificado. Por exemplo, a linguagem “cerca de 20 %” abrange uma faixa de 18 a 22 %.

[0021] O termo “misturar” descreve um ato de causar distribuição igual de dois ou mais compostos ou substâncias distintas em uma solução ou suspensão por qualquer forma de agitação. A distribuição completa igual de todos os ingredientes em uma solução ou suspensão não é requerida como um resultado de “misturar” como o termo é usado neste pedido.

[0022] Neste pedido, o termo “solvente” abrange qualquer substância líquida capaz de dissolver ou dispersar uma ou mais outras substâncias. Um solvente pode ser inorgânico por natureza, tal como água, ou pode ser um líquido orgânico, tal como etanol, acetona, acetato de metila, acetato de etila, hexano, éter de petróleo, etc. Como usado no termo “tratamento com detergente solvente,” solvente indica um solvente orgânico (por exemplo, fosfato de tri-N-butila), que é parte da mistura de detergente solvente usada para inativar o vírus envelopado em lipídeo em solução.

[0023] O termo “detergente” é usado neste pedido intercambiavelmente com o termo “tensoativo” ou “agente que atua na superfície.” Os tensoativos são tipicamente compostos orgânicos que são anfifílicos, isto é, contendo tanto grupos hidrofóbicos (“caudas”) quanto grupos hidrofílicos (“cabeças”), que tornam os tensoativos solúveis tanto em solventes orgânicos quanto em água. Um tensoativo pode ser classificado pela presença de grupos formalmente carregados na sua cabeça. Um tensoativo não iônico não tem nenhum grupo carregado na sua cabeça, ao passo que um tensoativo iônico carrega uma carga líquida na sua cabeça. Um tensoativo zuiteriônico contém uma cabeça com dois grupos opostamente carregados. Alguns exemplos de tensoativos comuns incluem: Aniônicos (com base em ânions sulfato, sulfonato ou carboxilato): perfluorooctanoato (PFOA ou PFO), perfluorooctano-sulfonato (PFOS), dodecil sulfato de sódio (SDS), lauril sulfato de amônio, e outros sais de alquil sulfato, laureth sulfato de sódio (também conhecido como lauril éter sulfato de sódio, ou SLES), alquil benzeno sulfonato; catiônicos (com base em cátions de amônio quaternários): brometo de cetil trimetilamônio (CTAB) também conhecido como brometo de hexadecil trimetil amônio, e outros sais de alquiltrimetilamônio, cloreto de cetilpiridínio (CPC), sebo amina polietoxilado (POEA), cloreto de benzalcônio (BAC), cloreto de benzetônio (BZT); Ácidos graxos de cadeia longa e seus sais: incluindo caprilato, ácido caprílico, heptanoato, ácido hexanóico, ácido heptanóico, ácido nanóico, ácido decanóico, e outros; Zuiteriônico (anfotérico): dodecil betaína; cocamidopropil betaína; coco anfo glicinato; não iônico: alquil poli(óxido de etileno), alquilfenol poli(óxido de etileno), copolímeros de poli(óxido de etileno) e óxido de polipropileno) (comercialmente conhecido como Poloxâmeros ou Poloxaminas), alquil poliglicosídeos, incluindo octil glicosídeo, decil maltosídeo, álcoois graxos (por exemplo, álcool cetílico e álcool oleílico), cocamida MEA, cocamida DEA, polissorbatos (Tween 20, Tween 80, etc)., detergentes de Triton, e óxido dodecil dimetilamina.

[0024] Como aqui usado, os termos tratamento com “IgG Intravenoso” ou “IVIG” referem-se no geral a um método terapêutico de administrar intravenosa, subcutânea, ou intramuscularmente uma composição de imunoglubulinas IgG a um paciente para tratar várias condições tais como deficiências imunes, doenças inflamatórias, e doenças autoimunes. As imunoglobulinas IgG são tipicamente reunidas e preparadas a partir de plasma. Anticorpos inteiros ou fragmentos podem ser usados. As imunoglobulinas IgG podem ser formuladas em concentrações mais altas (por exemplo, maior do que 10 %) para a administração subcutânea, ou formuladas para a administração intramuscular. Isto é particularmente comum para preparações de IgG especiais que são preparadas com títulos mais altos do que a média para antígenos específicos (por exemplo, fator Rho D, toxina da coqueluche, toxina do tétano, toxina do botulismo, raiva, etc). Para facilidade de debate, tais composições de IgG subcutânea ou intramuscularmente formuladas também são incluídas no termo “IVIG” neste pedido.

[0025] Por “quantidade ou dose terapeuticamente eficaz” ou “quantidade ou dose suficiente/eficaz,” é intencionada uma dose que produz efeitos para os quais a mesma é administrada. A dose exata dependerá do propósito do tratamento, e será averiguável por uma pessoa habilitada na técnica usando técnicas conhecidas (ver, por exemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); e Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Edição, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins; as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência nas suas totalidades para todos os propósitos).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0026] Como rotineiramente praticado na medicina moderna, preparações esterilizadas de imunoglobulinas concentradas (especialmente IgGs) são usadas para tratar condições médicas que caem em três classes principais: deficiências imunes, doenças inflamatórias e autoimunes, e infecções agudas. Um produto de IgG habitualmente usado, a imunoglobulina intravenosa ou IVIG, é formulado para a administração intravenosa, por exemplo, em uma concentração a 10 %. As imunoglobulinas concentradas também podem ser formuladas para a administração subcutânea ou intramuscular, por exemplo em ou em torno de uma concentração de 20 %.

[0027] Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um método novo e melhorado para produzir composições de imunoglobulina altamente purificadas e altamente concentradas a partir de plasma reunido. Comparados com os métodos de purificação e concentração de IgG anteriormente usados, os inventores incorporaram ultrafiltração e etapas de formulação, que resultaram em concentração de IgG mais alta sem perda de IgG significante e mantendo o pH baixo na formulação final. Tipicamente, os produtos têm uma concentração de proteína de pelo menos 18 % em peso/volume (p/v), dos quais vasta maioria (tipicamente não menos do que 95 %) é IgG, e um pH na faixa do pH 3 a 6, o que facilita a inativação de patógenos tais como vírus que podem estar presentes no plasma. Devido à sua alta concentração de IgG e portanto volume reduzido na administração, os produtos desta invenção são adequados para a administração subcutânea e/ou intramuscular. Em algumas formas de realização, os produtos de IgG têm uma viscosidade não maior do que 18 mPascal-segundo e portanto podem ser adequados também para a administração intravenosa. Devido à possibilidade de combinar atributos de qualidade para produtos intravenosos com a alta concentração requerida para os produtos subcutâneos e intramusculares, a diluição simples também pode permitir a administração intravenosa. Uma outra vantagem da composição de IgG desta invenção é que ela possui excelente estabilidade durante a armazenagem.

[0028] Em certos aspectos, a presente invenção fornece métodos para preparar uma preparação de IgG altamente concentrada com uma concentração de proteína final de mais do que cerca de 17 % e uma pureza de IgG de pelo menos cerca de 95 %. Em certas formas de realização, a preparação tem uma estabilidade prolongada e é formulada para a administração intravenosa, subcutânea, e/ou intramuscular.

[0029] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece composições e formulações farmacêuticas de composições de IgG preparadas de acordo com as metodologias de fabricação melhoradas aqui fornecidas. Em certas formas de realização, estas composições e formulações fornecem propriedades melhoradas quando comparadas com outras composições de IVIG correntemente no mercado. Por exemplo, em certas formas de realização, as composições e formulações aqui fornecidas são estáveis por um período prolongado de tempo. Em uma outra forma de realização, as composições e formulações aqui fornecidas têm uma concentração de IgG mais alta quando comparadas com outras composições IVIG correntemente no mercado. Já em outras formas de realização, as composições e formulações aqui fornecidas têm uma concentração de IgG mais alta e são estáveis por um período prolongado de tempo.

[0030] Já em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar deficiências imunes, doenças inflamatórias e autoimunes, e infecções agudas que compreende a administração de uma composição de IgG preparada usando os métodos melhorados aqui fornecidos. I. Produzindo uma Preparação de IgG Concentrada, Purificada

[0031] As composições de IVIG que compreendem anticorpos inteiros foram descritos para o tratamento de certas condições autoimunes. (Ver, por exemplo, as Publicações de Patente U.S. US 2002/0114802, US 2003/0099635, e US 2002/0098182). As composições de IVIG divulgadas nestas referências incluem anticorpos policlonais.

[0032] No geral, as preparações de imunoglobulina de acordo com a presente invenção podem ser preparadas a partir de qualquer um dos materiais de partida adequados, por exemplo, plasma recuperado ou plasma de fonte. Em um exemplo típico, sangue ou plasma são coletados de doadores saudáveis. Usualmente, o sangue é coletado da mesma espécie de animal como o indivíduo ao qual a preparação de imunoglobulina será administrada (tipicamente aludida como imunoglobulinas “homólogas”). As imunoglobulinas são isoladas do sangue por procedimentos adequados, tais como, por exemplo, precipitação (fracionamento alcoólico ou fracionamento em polietileno glicol), métodos cromatográficos (cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, cromatografia de imunoafinidade) ultracentrifugação, e preparação eletroforética, e outros. (Ver, por exemplo, Cohn et al., J Am. Chem. Soc. 68: 459-75 (1946); Oncley et al., J. Am. Chem. Soc. 71: 541-50 (1949); Barundern et al., Vox Sang. 7: 157-74 (1962); Koblet et al., Vox Sang. 13: 93-102 (1967); Patentes U.S. Nos 5.122.373 e 5.177.194; as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência em suas totalidades para todos os propósitos).

[0033] Diferente dos métodos descritos acima, em um aspecto a presente invenção fornece métodos de preparar composições concentradas de IgG que utilizam um material de partida crio-insuficiente. No geral, os métodos aqui fornecidos utilizam tanto as etapas do fracionamento alcoólico de Cohn-Oncley modificado quanto a cromatografia de troca iônica para fornecer rendimentos de IgG superiores, enquanto mantêm a mesma, se não melhorada, qualidade como encontrada nas preparações de IVIG comerciais correntemente disponíveis.

[0034] Em muitos casos, a imunoglobulina é preparada a partir de produtos contendo gama globulina produzida pelos métodos de fracionamento alcoólico e/ou troca iônica e cromatografia de afinidade bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. A Fração II de Cohn purificada é habitualmente usada. A pasta da Fração II de Cohn de partida está tipicamente em ou em torno de 95 por cento de IgG e é compreendida dos quatro subtipos de IgG. Os subtipos diferentes estão presentes na fração II aproximadamente na mesma razão como eles são encontrados no plasma humano reunido a partir do qual os mesmos são obtidos. a fração II é purificada ainda antes da formulação em um produto administrável. Por exemplo, a pasta da fração II pode ser dissolvida em uma solução alcoólica aquosa purificada fria e as impurezas removidas via precipitação e filtração. A seguir da filtração final, a suspensão de imunoglobulina pode ser dialisada ou diafiltrada (por exemplo, usando membranas de ultrafiltração tendo um limite de peso molecular nominal de menos do que ou igual a 100.000 daltons) para remover o álcool. A solução pode ser concentrada ou diluída para se obter a concentração de proteína desejada e pode ser purificada ainda pelas técnicas bem conhecidas por aqueles habilitados no ramo.

[0035] As etapas preparativas podem ser usadas para enriquecer um isótipo ou subtipo particulares de imunoglobulina. Por exemplo, a cromatografia em proteína A, proteína G ou proteína H sefarose pode ser usada para enriquecer uma mistura de imunoglobulinas para IgG, ou para subtipos específicos de IgG. (Ver no geral Harlow e Lane, Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999); Harlow e Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Patente U.S. No 5.180.810).

[0036] Como será descrito em detalhes abaixo, os produtos de IgG de concentração alta desta invenção são produzidos por um processo tendo muitas das mesmas etapas ou similares como no processo de produzir IVIG. As etapas adicionais de ultrafiltração/diafiltração usando membranas de canal aberto com uma pós-lavagem especificamente planejada e formulação quase no final do processo de produção torna as composições de IgG resultantes em torno de duas vezes tão alta em concentração de proteína (200 mg/ml) comparadas com as IVIGs no estado da técnica (por exemplo, GAMAGARD® LÍQUIDO) sem afetar o rendimento e estabilidade na armazenagem. Com a maioria das membranas de ultrafiltração comerciais disponíveis uma concentração de 200 mg/ml de IgG não pode ser atingida sem perdas de proteína maiores. Estas membranas serão bloqueadas no início e portanto a pós-lavagem adequada é difícil de se obter. Portanto as configurações de membrana de canal aberto têm que ser usadas. Mesmo com as membranas de canal aberto, um procedimento de pós-lavagem especificamente planejado tem que ser usado para se obter a concentração requerida sem perda de proteína significante (menos do que 2 % de perda). Ainda mais surpreendente é o fato de que a concentração de proteína mais alta de 200 mg/ml não afeta a capacidade de inativação de vírus da etapa de armazenagem de pH baixo. O processo geral de produzir a composição de IgG em alta concentração inclui as seguintes etapas:

A. Separação de Crioprecipitados

[0037] O processo de purificação tipicamente começa com o descongelamento do plasma reunido anteriormente congelado, já checado quanto as considerações de segurança e qualidade. O descongelamento é tipicamente realizado em uma temperatura não mais alta do que 6° C. A centrifugação ou filtração são depois realizadas no frio para separar sólido e líquido do plasma que está sendo descongelado, usualmente na mesma temperatura baixa como o descongelamento. A porção líquida (também aludida como “plasma crio-insuficiente,” depois que as proteínas insolúveis a frio são removidas pela centrifugação ou filtração do plasma descongelado fresco) é depois processada na etapa seguinte. Várias etapas adicionais podem ser consideradas nesta conjuntura para a isolação da atividade de desvio do inibidor do fator oito (FERIA), complexo do Fator IX, concentrado do Fator VII, ou complexo Antitrombina III, que são descritas em detalhes no Exemplo 1.

B. Obtenção do Sobrenadante do Fracionamento I

[0038] Nesta etapa, plasma crio-insuficiente é tipicamente esfriado até ou em torno de 0 ± 1° C, e o seu pH é ajustado até ou em torno de 7,0. Em certas formas de realização, o pH é ajustado entre cerca de 7,0 e cerca de 7,5, preferivelmente entre ou em torno de 7,1 e em ou em torno de 7,3, o mais preferivelmente em ou em torno de 7,2. Em uma forma de realização, o pH é ajustado até ou em torno de 7,0. Em uma outra forma de realização, o pH é ajustado até ou em torno de 7,1. Em uma outra forma de realização, o pH é ajustado até ou em torno de 7,2. Em uma outra forma de realização, o pH é ajustado até ou em torno de 7,3. Em uma outra forma de realização, o pH é ajustado até ou em torno de 7,4. Em uma outra forma de realização, o pH é ajustado até ou em torno de 7,5. Etanol pré-esfriado é depois adicionado enquanto o plasma está sendo agitado até uma concentração alvo de etanol em 8 % v/v. Ao mesmo tempo a temperatura é diminuída ainda até entre cerca de -4 e cerca de 0° C, preferivelmente de cerca de -2° C, para precipitar os contaminantes tal como α2-macroglobulina, β1A- e β1C-globulina, fibrinogênio, e Fator VIII. Tipicamente, o evento de precipitação incluirá um tempo de contenção de pelo menos cerca de 1 hora, embora tempos de contenção mais curtos ou mais longos também possam ser utilizados. Subsequentemente, o sobrenadante (Sobrenadante I), idealmente contendo a totalidade do teor de IgG presente no plasma crio-insuficiente, é depois coletado pela centrifugação, filtração, ou um outro método adequado.

C. Precipitado de fracionamento II + III

[0039] Para enriquecer ainda mais o teor de IgG e a pureza do fracionamento, O sobrenadante I é individualizado a uma segunda etapa de precipitação. No geral, o pH da solução é ajustado a um pH entre cerca de 6,8 e cerca de 7,2, preferivelmente em ou em torno de 7,0. Álcool, preferivelmente etanol, é depois adicionado à solução enquanto é agitado até uma concentração final entre cerca de 20 % e cerca de 25 % (v/v). Em uma forma de realização, a concentração final de álcool está em ou em torno de 20 %. Em uma outra forma de realização, a concentração de álcool final está em ou em torno de 21 %. Em uma outra forma de realização, a concentração de álcool final está em ou em torno de 22 %. Em uma outra forma de realização, a concentração de álcool final está em ou em torno de 23 %. Em uma outra forma de realização, a concentração de álcool final está em ou em torno de 24 %. Em uma outra forma de realização, a concentração de álcool final está em ou em torno de 25 %. A porção líquida, também aludida como sobrenadante da fração II + III, pode ser processado ainda mais para extrair o Fator V. O precipitado desta etapa é processado ainda mais na etapa seguinte. Em uma forma de realização, as etapas B e C também podem ser realizadas juntas.

D. Extração do Precipitado dos Fracionamentos II e III

[0040] Um tampão de extração frio é usado para recolocar em suspensão o precipitado da fração II+III em uma razão típica de 1 parte de precipitado em 15 partes de tampão de extração. Um tampão de extração exemplar contém 5 mM de fosfato de sódio monobásico e 5 mM de acetato, e tem um pH em ou em torno de 4,5 ± 0,2 e condutividade de até ou em torno de 0,7 a 0,9 mS/cm. Em uma forma de realização, a condutividade do tampão de extração está em ou em torno de 0,7 mS/cm. Em uma outra forma de realização, a condutividade do tampão de extração está em ou em torno de 0,8 mS/cm. Já em uma outra forma de realização, a condutividade do tampão de extração está em ou em torno de 0,9 mS/cm. O processo de extração é realizado em uma temperatura de até ou em torno de 2 a 8° C.

[0041] Outras razões de recolocação em suspensão adequadas podem ser usadas, por exemplo de cerca de 1:8 a cerca de 1:30, ou de cerca de 1:10 a cerca de 1:20, ou de cerca de 1:12 a cerca de 1:18, ou de cerca de 1:13 a cerca de 1:17, ou de cerca de 1:14 a cerca de 1:16. Em certas formas de realização, a razão de recolocar em suspensão pode estar em ou em torno de 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, ou mais alta.

[0042] As soluções adequadas para a extração do precipitado II+III no geral terá um pH entre cerca de 4,0 e cerca de 5,5. Em certas formas de realização, a solução terá um pH entre cerca de 4,0 e cerca de 5,0. Em uma outra forma de realização, a solução terá um pH entre cerca de 4,5 e cerca de 5,0. Em outras formas de realização, a solução de extração terá um pH de cerca de 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, ou 5,5. Em uma forma de realização, o pH do tampão de extração estará em ou em torno de 4,5. Em uma outra forma de realização, o pH do tampão de extração estará em ou em torno de 4,6. Em uma outra forma de realização, o pH do tampão de extração estará em ou em torno de 4,7. Em uma outra forma de realização, o pH do tampão de extração estará em ou em torno de 4,8. Em uma outra forma de realização, o pH do tampão de extração estará em ou em torno de 4,9. Em uma outra forma de realização, o pH do tampão de extração estará em ou em torno de 5,0.

[0043] O tampão de extração preferivelmente terá uma condutividade de cerca de 0,5 mS.cm-1 a cerca de 2,0 mS.cm-1. Por exemplo, em certas formas de realização, a condutividade do tampão de extração estará em ou em torno de 0,5 mS.cm-1, ou em ou em torno de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, ou cerca de 2,0 mS.cm-1. Uma pessoa de habilidade comum na técnica saberá como gerar tampões de extração tendo uma condutividade apropriada.

E. Tratamento com Sílica Fumigada e Filtração

[0044] Em algumas formas de realização, sílica fumigada (por exemplo, Aerosil 380 ou equivalente) é adicionada à suspensão da última etapa até uma concentração de até ou em torno de 40 g/kg de suspensão, ou equivalente a 1,8 g/litro de plasma crio-insuficiente. A mistura ocorre em cerca de 2 a 8° C por pelo menos 50 a 70 minutos. Em alguns casos, auxiliar de filtração (por exemplo, Hyflo-Supper-Cel da World Minerals, usado em uma concentração de até ou em torno de 0,5 kg/kg de suspensão) é adicionado para facilitar a etapa subsequente de separação de líquido/sólido pela filtração. O tampão de extração é usado para a pós-lavagem da prensa do filtro. O processo de filtração é mantido em uma temperatura de cerca de 2 a 8° C.

F. Fracionamento do Precipitado G

[0045] O filtrado da última etapa é depois misturado com polissorbato-80 a uma concentração de até ou em torno de 0,2 % p/v com agitação por pelo menos 30 minutos em uma temperatura de cerca de 2° C a 8° C.

[0046] Citrato de sódio desidratado é depois misturado na solução em ou em torno de 8 g/litro por mais 30 minutos de agitação em uma temperatura de cerca de 2° C a 8° C. O pH da solução é depois ajustado até ou em torno de 7,0 ± 0,1. Em certas formas de realização, o pH é ajustado com hidróxido de sódio ou ácido acético. Álcool frio é depois adicionado à solução até uma concentração de até ou em torno de 25 % v/v, e uma etapa de precipitação similar a Cohn II é realizada.

G. Suspensão de Precipitado G

[0047] O precipitado da última etapa é dissolvido e filtrado com um filtro profundo de um tamanho de poro nominal de 0,2 μm (por exemplo, filtro Cuno VRO6 ou equivalente) para se obter um filtrado claro. Em uma outra forma de realização, o precipitado é dissolvido e depois centrifugado para recuperar um sobrenadante clarificado.

H. Tratamento com Solvente e Detergente

[0048] O filtrado da última etapa é usado para o tratamento com solvente/detergente. Uma mistura de tratamento com solvente/detergente típica compreende 1,0 % (v/v) de Triton X-100, 0,3 % (v/v) de Tween80, e 0,3 % (v/v) de TNBP, e a mistura é tipicamente mantida em uma temperatura de cerca de 18° C a 25° C por pelo menos 60 minutos. Métodos para o tratamento com detergente de frações derivadas de plasma são bem conhecidos na técnica. No geral, qualquer tratamento com detergente não iônico padrão pode ser usado em conjunção com os métodos aqui fornecidos.

I. Cromatografia de Troca Catiônica

[0049] De modo a purificar e concentrar ainda mais a IgG a cromatografia de troca catiônica e/ou de troca aniônica filtrada em PptG tratada com S/D, pode ser utilizada. Os métodos para purificar e concentrar IgG usando cromatografia de troca iônica são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a Patente U.S. No 5.886.154 descreve um método em que um precipitado da fração II+III é extraído em pH baixo (entre cerca de 3,8 e 4,5), seguido pela precipitação de IgG usando ácido caprílico, e finalmente implementação de duas etapas de cromatografia de troca aniônica. A Patente U.S. No 6.069.236 descreve um esquema de purificação de IgG cromatográfica que não conta de nenhum modo com a precipitação alcoólica. A Publicação PCT No WO 2005/073252 descreve um método de purificação de IgG que envolve a extração de um precipitado da fração II+III, tratamento com ácido caprílico, tratamento com PEG, e uma única etapa de cromatografia de troca aniônica. A Patente U.S. No 7.186.410 descreve um método de purificação de IgG que envolve a extração de um precipitado da fração I+II+III ou um da fração II seguido por uma única etapa de troca aniônica realizada em um pH alcalino. A Patente U.S. No 7.553.938 descreve um método que envolve a extração de um precipitado da fração I+II+III ou um da fração II+III, tratamento com caprilato, e uma ou duas etapas de cromatografia de troca aniônica. A Patente U.S. No 6.093.324 descreve um método de purificação que compreende o uso de uma resina de troca aniônica macroporosa operada em um pH entre cerca de 6,0 e cerca de 6,6. A Patente U.S. No 6.835.379 descreve um método de purificação que conta com a cromatografia de troca catiônica na ausência de fracionamento alcoólico.

[0050] Em uma forma de realização, a solução de proteína contendo solvente/detergente da última etapa é depois passado através de uma coluna de troca catiônica para remover o solvente e detergente. Depois da lavagem de reagentes SD, as proteínas absorvidas são depois eluídas com tampão de eluição de pH alto. Em uma forma de realização, o tampão de eluição terá um pH dentre cerca de 7,5 e cerca de 9,5. Em uma outra forma de realização, o tampão de eluição terá um pH dentre cerca de 8,0 e cerca de 9,0. Em uma forma de realização preferida, o tampão de eluição terá um pH de até ou em torno de 8,5 ± 0,1.

J. Cromatografia de troca aniônica

[0051] O eluído da última etapa é ajustado ao pH 6 e diluído até a condutividade apropriada para a coluna de troca aniônica equilibrada seguinte. A coluna flui durante a carga e a lavagem é coletada para processamento adicional.

K. Nanofiltração

[0052] De modo a reduzir ainda mais a carga viral da composição de IgG aqui fornecida, o efluente da coluna de troca aniônica pode ser nanofiltrada usando um dispositivo de nanofiltração adequado. Em certas formas de realização, o dispositivo de nanofiltração terá um tamanho de poro médio dentre cerca de 15 nm e cerca de 200 nm. Os exemplos de nanofiltros adequados para este uso incluem, sem limitação, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, Viresolve NFR (Millipore), Planova 15N, 20N, 35N, e 75N (Planova). Em uma forma de realização específica, o nanofiltro pode ter um tamanho de poro médio dentre cerca de 15 nm e cerca de 72 nm, ou dentre cerca de 19 nm e cerca de 35 nm, ou de até ou em torno de 15 nm, 19 nm, 35 nm, ou 72 nm. Em uma forma de realização preferida, o nanofiltro terá um tamanho de poro médio de até ou em torno de 35 nm, tal como um filtro Asahi PLANOVA 35N ou equivalente deste.

L. Ultrafiltração e Diafiltração

[0053] Subsequente à nanofiltração, o filtrado é concentrado ainda a uma concentração de proteína de 5 ± 1 % p/v pela ultrafiltração. Em alguns exemplos, a ultrafiltração é realizada em um cassete com uma tela de canal aberto e a membrana de ultrafiltração tem um corte de peso molecular nominal (NMWCO) de 50 kDa ou menos.

[0054] Em uma forma de realização, o nanofiltrado pode ser concentrado pela ultrafiltração a uma concentração de proteína dentre cerca de 2 % e cerca de 10 % (p/v). Em certas formas de realização, a ultrafiltração é realizada em um cassete com uma tela de canal aberto e a membrana de ultrafiltração tem um corte de peso molecular nominal (NMWCO) de menos do que cerca de 100 kDa ou menos do que cerca de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, ou menos kDa. Em uma forma de realização preferida, a membrana de ultrafiltração tem um NMWCO de não mais do que 50 kDa.

[0055] Na conclusão da etapa de ultrafiltração, o concentrado pode ser concentrado ainda via diafiltração contra uma solução adequada para a administração intravenosa ou intramuscular. Em certas formas de realização, a solução de diafiltração pode compreender um agente estabilizante e/ou tamponizante. Em uma forma de realização preferida, o agente de estabilização e tamponização é glicina em uma concentração apropriada, por exemplo entre cerca de 0,20 M e cerca de 0,30 M, ou entre cerca de 0,22 M e cerca de 0,28 M, ou entre cerca de 0,24 M e cerca de 0,26 mM, ou em uma concentração de até ou em torno de 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, ou 3,0. Em uma forma de realização preferida, o tampão de diafiltração contém em ou em torno de 0,25 M de glicina.

[0056] Em uma forma de realização preferida, na conclusão da etapa de ultrafiltração, o concentrado é diafiltrado contra uma solução de glicina a 0,25 M com um pH baixo. Tipicamente, o volume de troca mínima é 6 vezes do volume concentrado original, e a solução é concentrada a uma concentração de proteína de mais do que 20 % p/v. No final do processo de diafiltração e concentração, o pH da solução é tipicamente entre 4,4 a 4,9.

[0057] Tipicamente, o volume de troca mínima é de pelo menos cerca de 3 vezes o volume concentrado original ou pelo menos cerca de 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais vezes o volume concentrado original. A solução de IgG pode ser concentrada a uma concentração de proteína final dentre cerca de 5 % e cerca de 22 % (p/v), ou entre cerca de 10 % e cerca de 22 % (p/v), ou entre cerca de 15 % e cerca de 22 % (p/v), ou entre cerca de 18 % e cerca de 22 % (p/v), ou entre cerca de 20 % e cerca de 22 %, ou a uma concentração final de até ou em torno de 5 %, ou 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, ou mais alta. Em uma forma de realização preferida, a solução de IgG estará concentrada até a concentração de proteína final de ou em torno de cerca de 20 % e de ou em torno de 22 %. Tipicamente, no final do processo de concentração, o pH da solução estará entre cerca de 4,6 e 5,1.

M. Formulação

[0058] Na conclusão da etapa de diafiltração, a concentração da proteína da solução é ajustada com o tampão de diafiltração até uma concentração final entre cerca de 5 % e cerca de 20 % (p/v), ou entre cerca de 10 % e cerca de 20 % (p/v), ou entre cerca de 15 % e cerca de 20 % (p/v), ou entre cerca de 18 % e cerca de 20 % (p/v), ou a uma concentração final de cerca de 5 %, ou 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, ou 20 %. Em uma forma de realização preferida, a concentração de proteína final da solução está em ou entre cerca de 19 % e em ou em torno de 21 %. Em um forma de realização preferida, na conclusão da diafiltração, a concentração da proteína da solução é ajustada para exatamente acima de 20 % p/v, por exemplo, em ou em torno de 20,4 ± 04 % p/v, com o tampão de diafiltração.

N. Esterilização Adicional

[0059] A solução a granel formulada é esterilizada ainda filtrando-se primeiro através de um filtro de membrana com um tamanho de poro absoluto de 0,2 mícron ou menos. Depois a solução é assepticamente dispensada em recipientes finais para a selagem apropriada, com amostras tomadas para teste. A etapa final é armazenar os recipientes selados de 30 a 32° C por um período de tempo prolongado, por exemplo, de 21 a 22 dias.

II. Composições Concentradas de IgG

[0060] Em um aspecto, a presente invenção diz respeito às composições de IgG aquosas preparadas pelos métodos aqui fornecidos. No geral, as composições de IgG preparadas pelos novos métodos aqui descritos terão teor de IgG e pureza altos. Por exemplo, as composições de IgG aqui fornecidas podem ter uma concentração de proteína de pelo menos cerca de 15 % (p/v) e um teor de IgG de mais do que 90 % de pureza. Estas composições de IgG de alta pureza são adequadas para a administração terapêutica, por exemplo, para a administração subcutânea e/ou intramuscular. Em uma forma de realização, as composições IgG aqui fornecidas são adequadas para a administração intravenosa, por exemplo pela diluição antes da administração. Em uma forma de realização, a concentração de IgG está em ou em torno de 20 % e é usada para a administração subcutânea ou intramuscular.

[0061] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece uma composição de IgG aquosa preparada por um método que compreende as etapas de: (1) separar líquido e precipitado a partir de plasma pela centrifugação; (2) misturar etanol pré-esfriado com o líquido de (1) para formar uma mistura, que tem uma concentração de etanol de até ou em torno de 8 % (v/v); (3) separar líquido e precipitado da mistura de (2) pela centrifugação; (4) ajustar pH e concentração de etanol do líquido de (3) até ou em torno de 7,0 e 20 a 25 % (v/v), respectivamente, formando deste modo uma mistura; (5) separar líquido e precipitado da mistura de (4) pela centrifugação; (6) recolocar o precipitado de (5) em suspensão com um tampão em uma razão de cerca de 1 para 15 em peso para formar uma suspensão; (7) misturar dióxido de silício (SiO2) com a suspensão de (6) e obter um filtrado pela filtração; (8) misturar um detergente e álcool frio com o filtrado de (7) e obter um precipitado pela centrifugação; (9) dissolver o precipitado em uma solução aquosa que compreende um solvente ou detergente e manter a solução por pelo menos 60 minutos; (10) passar a solução depois de (9) através de uma coluna de cromatografia de troca de cátion e eluir as proteínas absorvidas na coluna em um eluído; (11) passar o eluído de (10) através de uma coluna de cromatografia de troca de ânion para gerar um efluente; (12) passar o efluente através de um nanofiltro para gerar um nanofiltrado; (13) passar o nanofiltrado através de uma membrana de ultrafiltração para gerar um ultrafiltrado; (14) diafiltrar o ultrafiltrado contra um tampão de diafiltração para gerar uma solução tendo uma concentração de proteína de até ou em torno de 20 % (p/v); e (15) esterilizar a solução de (14) pela filtração da solução através de um filtro de 0,2 μm ou menos, para obter deste modo uma composição de IgG concentrada.

[0062] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece composições de IgG aquosas que compreendem uma concentração de proteína dentre cerca de 150 g/L e cerca de 250 g/L. Em certas formas de realização, a concentração da proteína da composição de IgG está entre cerca de 175 g/L e cerca de 225 g/L, ou entre cerca de 200 g/L e cerca de 225 g/L, ou qualquer concentração adequada dentro destas faixas, por exemplo em ou em torno de, 150 g/L, 155 g/L, 160 g/L, 165 g/L, 170 g/L, 175 g/L, 180 g/L, 185 g/L, 190 g/L, 195 g/L, 200 g/L, 205 g/L, 210 g/L, 215 g/L, 220 g/L, 225 g/L, 230 g/L, 235 g/L, 240 g/L, 245 g/L, 250 g/L, ou mais alta. Em uma forma de realização preferida, a composição de IgG aquosa compreende uma concentração de proteína de até ou em torno de 200 g/L. Em uma forma de realização particularmente preferida, a composição de IgG aquosa compreende uma concentração de proteína de até ou em torno de 204 g/L.

[0063] Os métodos aqui fornecidos permitem a preparação de composições de IgG tendo níveis muito altos de pureza. Por exemplo, em uma forma de realização, pelo menos cerca de 95 % da proteína total em uma composição aqui fornecida serão IgG. Em outras formas de realização, pelo menos cerca de 96 % da proteína são IgG, ou pelo menos cerca de 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, ou mais da proteína total da composição serão IgG.

[0064] Similarmente, os métodos aqui fornecidos permitem a preparação de composições de IgG contendo níveis extremamente baixos de agentes contaminantes. Por exemplo, em certas formas de realização, as composições de IgG são fornecidas que contêm menos do que cerca de 100 mg/l de IgA. Em outras formas de realização, a composição de IgG conterá menos do que cerca de 50 mg/L de IgA, preferivelmente menos do que cerca de 35 mg/L de IgA, o mais preferivelmente menos do que cerca de 20 mg/L de IgA.

III. Composições Farmacêuticas

[0065] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece composições e formulações farmacêuticas que compreendem IgG purificadas preparadas pelos métodos aqui fornecidos. No geral, as composições e formulações farmacêuticas de IgG preparadas pelos novos métodos aqui descritos terão teor de IgG e pureza altos. Por exemplo, as composições e formulações farmacêuticas de IgG aqui fornecidas podem ter uma concentração de proteína de pelo menos cerca de 15 % (p/v) e um teor de IgG de mais do que 90 % de pureza. Estas composições de IgG de alta pureza são adequadas para a administração terapêutica, por exemplo, para a administração subcutânea e/ou intramuscular. Em uma forma de realização, as composições de IgG aqui fornecidas são adequadas para a administração intravenosa, por exemplo pela diluição antes da administração. Em uma forma de realização, a concentração de IgG está em ou em torno de 20 % e é usada para a administração subcutânea ou intramuscular.

[0066] Em uma forma de realização, as composições farmacêuticas aqui fornecidas são preparadas pela formulação de uma composição de IgG aquosa isoladas usando um método aqui fornecido. No geral, a composição formulada terá sido individualizada a pelo menos uma, preferivelmente pelo menos duas, o mais preferivelmente pelo menos três, etapas de inativação ou remoção viral. Os exemplos não limitantes das etapas de inativação ou remoção virais que podem ser utilizadas com os métodos aqui fornecidos incluem, tratamento com detergente solvente (Horowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Supl 3): S21-S28 e Kreil et al., Transfusion 2003 (43): 1023-1028, ambas as quais são aqui expressamente incorporadas por referência em sua totalidade para todos os propósitos), nanofiltração (Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56) 230-236 e Yuasa et al., J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)): 2021-2024, ambas as quais são aqui expressamente incorporadas por referência em sua totalidade para todos os propósitos), e incubação em pH baixo nas temperaturas altas (Kempf et al., Transfusion 1991 (31) 423-427 e Louie et al., Biologicals 1994 (22): 13-19).

[0067] Em certas formas de realização, as formulações farmacêuticas são fornecidas tendo um teor de IgG entre cerca de 175 g/L de IgG e cerca de 225 g/L de IgG. No geral, estas formulações IVIG são preparadas isolando-se uma composição de IgG a partir de plasma usando um método aqui descrito, concentrando a composição, e formulando a composição concentrada em uma solução adequada para a administração intravenosa. As composições de IgG podem ser concentradas usando qualquer método adequado conhecido por uma pessoa habilitada na técnica. Em uma forma de realização, a composição é concentrada pela ultrafiltração/diafiltração. Em algumas formas de realização, o dispositivo de ultrafiltração usado para concentrar a composição utilizará uma membrana de ultrafiltração tendo um corte de peso molecular nominal (NMWCO) de menos do que cerca de 100 kDa ou menos do que cerca de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, ou menos kDa. Em uma forma de realização preferida, a membrana de ultrafiltração tem um NMWCO de não mais do que 50 kDa. a troca de tampão pode ser obtida usando qualquer técnica adequada conhecida por uma pessoa de habilidade na técnica. Em uma forma de realização específica, a troca de tampão é obtida pela diafiltração.

[0068] Em uma forma de realização específica, uma composição farmacêutica de IgG é fornecida, em que a composição de IgG foi purificada a partir de plasma usando um método que compreende as etapas de (1) separar líquido e precipitado a partir de plasma pela centrifugação; (2) misturar etanol pré-esfriado com o líquido de (1) para formar uma mistura, que tem uma concentração de etanol de até ou em torno de 8 % (v/v); (3) separar líquido e precipitado da mistura de (2) pela centrifugação; (4) ajustar o pH e a concentração de etanol do líquido de (3) até ou em torno de 7,0 e 20 a 25 % (v/v), respectivamente, formando deste modo uma mistura; (5) separar líquido e precipitado da mistura de (4) pela centrifugação; (6) recolocar o precipitado de (5) em suspensão com um tampão em uma razão de cerca de 1 para 15 em peso para formar uma suspensão; (7) misturar dióxido de silício (SiO2) com a suspensão de (6) e obter um filtrado pela filtração; (8) misturar um detergente e álcool frio com o filtrado de (7) e obter um precipitado pela centrifugação; (9) dissolver o precipitado em uma solução aquosa que compreende um solvente ou detergente e manter a solução por pelo menos 60 minutos; (10) passar a solução depois de (9) através de uma coluna de cromatografia de troca de cátion e eluir proteínas absorvidas na coluna em um eluído; (11) passar o eluído de (10) através de uma coluna de cromatografia de troca de ânion para gerar um efluente; (12) passar o efluente através de um nanofiltro para gerar um nanofiltrado; (13) passar o nanofiltrado através de uma membrana de ultrafiltração para gerar um ultrafiltrado; (14) diafiltrar o ultrafiltrado contra um tampão de diafiltração para gerar uma solução tendo uma concentração de proteína de cerca de 20 % (p/v); e (15) esterilizar a solução de (14) pela filtração da solução através de um filtro de 0,2 μm ou menos, para obter deste modo uma composição de IgG concentrada.

[0069] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece composições farmacêuticas de IgG que compreende uma concentração de proteína entre cerca de 150 g/L e cerca de 250 g/L. Em certas formas de realização, a concentração da proteína da composição de IgG está entre cerca de 175 g/L e cerca de 225 g/L, ou entre cerca de 200 g/L e cerca de 225 g/L, ou qualquer concentração adequada dentro destas faixas, por exemplo em ou em torno de, 150 g/L, 155 g/L, 160 g/L, 165 g/L, 170 g/L, 175 g/L, 180 g/L, 185 g/L, 190 g/L, 195 g/L, 200 g/L, 205 g/L, 210 g/L, 215 g/L, 220 g/L, 225 g/L, 230 g/L, 235 g/L, 240 g/L, 245 g/L, 250 g/L, ou mais alta. Em uma forma de realização preferida, a composição de IgG aquosa compreende uma concentração de proteína de até ou em torno de 200 g/L. Em uma forma de realização particularmente preferida, a composição de IgG aquosa compreende uma concentração de proteína de até ou em torno de 204 g/L.

[0070] Os métodos aqui fornecidos permitem a preparação de composições farmacêuticas de IgG tendo níveis muito altos de pureza. Por exemplo, em uma forma de realização, pelo menos cerca de 95 % da proteína total em uma composição aqui fornecidas estará IgG. Em outras formas de realização, pelo menos cerca de 96 % da proteína é IgG, ou pelo menos cerca de 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, ou mais da proteína total da composição serão IgG.

[0071] Similarmente, os métodos aqui fornecidos permitem a preparação de composições farmacêuticas de IgG que contêm níveis extremamente baixos de agentes contaminantes. Por exemplo, em certas formas de realização, as composições de IgG são fornecidas que contêm menos do que cerca de 100 mg/L de IgA. Em outras formas de realização, a composição de IgG conterá menos do que cerca de 50 mg/L de IgA, preferivelmente menos do que cerca de 35 mg/L de IgA, o mais preferivelmente menos do que cerca de 20 mg/L de IgA.

[0072] As composições farmacêuticas aqui fornecidas tipicamente compreenderão um ou mais agentes de tamponamento ou agentes de estabilização de pH adequados para a administração intravenosa. Os exemplos não limitantes de agentes de tamponamento adequados para formular uma composição de IgG aqui fornecidos incluem glicina, citrato, fosfato, acetato, glutamato, tartarato, benzoato, lactato, histidina ou outros aminoácidos, gliconato, malato, succinato, formiato, propionato, carbonato, ou qualquer combinação destes ajustada a um pH apropriado. No geral, o agente de tamponamento será suficiente para manter um pH adequado na formulação por um período prolongado de tempo. Em uma forma de realização preferida, o agente de tamponamento é glicina.

[0073] Em algumas formas de realização, a concentração do agente de tamponamento na formulação estará entre cerca de 100 mM e cerca de 400 mM, preferivelmente entre cerca de 150 mM e cerca de 350 mM, mais preferivelmente entre cerca de 150 mM e cerca de 300 mM, o mais preferivelmente entre cerca de 175 mM e cerca de 225 mM. Em uma forma de realização particularmente preferida, a composição de IgG concentrada compreenderá entre cerca de 150 mM e cerca de 250 mM de glicina, o mais preferivelmente em torno de 200 mM de glicina. Em uma outra forma de realização preferida, a composição de IgG concentrada conterá a ou em torno de 250 mM de glicina.

[0074] Em certas formas de realização, o pH da formulação estará entre cerca de 4,1 e cerca de 5,6, preferivelmente entre cerca de 4,4 e cerca de 5,3, o mais preferivelmente entre cerca de 4,6 e cerca de 5,1. Em formas de realização particulares, o pH da formulação pode ser de cerca de 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, ou 5,6.

[0075] Em algumas formas de realização, as composições farmacêuticas aqui fornecidas podem opcionalmente compreender ainda um agente para ajustar a osmolaridade da composição. Os exemplos não limitantes de agentes de osmolaridade incluem manitol, sorbitol, glicerol, sacarose, glicose, dextrose, levulose, frutose, lactose, polietileno glicóis, fosfatos, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, gliconoglicoeptonato de cálcio, dimetil sulfona, e outros.

[0076] Tipicamente, as formulações aqui fornecidas terão osmolaridades que são comparáveis à osmolaridade fisiológica, de cerca de 285 a 295 mOsmol/kg (Lacy et al., Drug Information Handbook - Lexi-Comp 1999: 1254. Em certas formas de realização, a osmolaridade da formulação estará entre cerca de 200 mOsmol/kg e cerca de 350 mOsmol/kg, preferivelmente entre cerca de 240 e cerca de 300 mOsmol/kg. Em formas de realização particulares, a osmolaridade da formulação será de cerca de 200 mOsmol/kg, ou 210 mOsmol/kg, 220 mOsmol/kg, 230 mOsmol/kg, 240 mOsmol/kg, 245 mOsmol/kg, 250 mOsmol/kg, 255 mOsmol/kg, 260 mOsmol/kg, 265 mOsmol/kg, 270 mOsmol/kg, 275 mOsmol/kg, 280 mOsmol/kg, 285 mOsmol/kg, 290 mOsmol/kg, 295 mOsmol/kg, 300 mOsmol/kg, 310 mOsmol/kg, 320 mOsmol/kg, 330 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg, ou 350 mOsmol/kg.

[0077] As formulações de IgG aqui fornecidas são no geral estáveis na forma líquida por um período prolongado de tempo. Em certas formas de realização, as formulações são estáveis por pelo menos cerca de 3 meses na temperatura ambiente, ou de pelo menos cerca de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 meses na temperatura ambiente. A formulação no geral também será estável por pelo menos cerca de 18 meses sob condições refrigeradas (tipicamente entre cerca de 2° C e cerca de 8° C), ou por pelo menos cerca de 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, ou 45 meses sob condições refrigeradas.

IV. Administração da Preparação de IgG

[0078] Como rotineiramente praticado na medicina moderna, as preparações esterilizadas de imunoglobulinas concentradas (especialmente IgGs) são usadas para tratar condições médicas que caem nestas três classes principais: deficiências imunes, doenças inflamatórias e autoimunes, e infecções agudas. Estas preparações de IgG também podem ser úteis para tratar esclerose múltipla (especialmente esclerose múltipla de recaídas e remissões ou RRMS), doença de Alzheimer, e doença de Parkinson. A preparação de IgG purificada desta invenção é adequada para estes propósitos, assim como outros usos clinicamente aceitos de preparações de IgG.

[0079] O FDA aprovou o uso de IVIG para tratar várias indicações, incluindo transplante de medula óssea alogênica, leucemia linfocítica crônica, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), HIV pediátrico, imunodeficiências primárias, doença de Kawasaki, polineuropatia desmielinante inflamatória crônica (CIDP), e transplante renal com um receptor de anticorpo alto ou com um doador ABO incompatível. Em certas formas de realização, as composições de IVIG aqui fornecidas são úteis para o tratamento ou controle destas doenças e condições.

[0080] Além disso, usos extra-oficiais para IVIG são habitualmente fornecidos aos pacientes para o tratamento ou controle de várias indicações, por exemplo, síndrome da fadiga crônica, colite pelo clostridium difficile, dermatomiosite e polimiosite, oftalmopatia de Graves, síndrome de Guillain- Barre, distrofia muscular, miosite de corpo de inclusão, síndrome de Lambert- Eaton, Lupo eritematoso, neuropatia motora multifocal, esclerose múltipla (MS), miastenia grave, trombocitopenia aloimune neonatal, infecção por Parvovírus B19, pênfigo, púrpura pós-transfusão, rejeição de transplante renal, Aborto Espontâneo, síndrome da pessoa dura, opsoclônus Mioclônus, septicemia severa e choque séptico em adultos criticamente enfermos, necrólise epidérmica tóxica, leucemia linfocítica crônica, mieloma múltiplo, agamaglobulinemia ligada a X, e hipogamaglobulinemia. Em certas formas de realização, as composições de IVIG aqui fornecidas são úteis para o tratamento ou controle destas doenças e condições.

[0081] Finalmente, o uso experimental de IVIG para o tratamento ou controle de doenças incluindo deficiência imune primária, RRMS, doença de Alzheimer, e doença de Parkinson foi proposto (Publicação do Pedido de Patente U.S. No U.S. 2009/0148463, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os propósitos). Em certas formas de realização, as composições de IVIG aqui fornecidas são úteis para o tratamento ou controle da deficiência imune primária, RRMS, doença de Alzheimer, ou doença de Parkinson. Em certas formas de realização que compreendem a administração diária, uma quantidade eficaz a ser administrada ao indivíduo pode ser determinada por um médico com consideração de diferenças individuais na idade, peso, severidade da doença, via de administração (por exemplo, intravenosa v. subcutânea) e resposta à terapia. Em certas formas de realização, uma preparação de imunoglobulina desta invenção pode ser administrada a um indivíduo de cerca de 5 mg/quilograma a cerca de 2000 mg/quilograma por dia. Em formas de realização adicionais, a preparação de imunoglobulina pode ser administrada em quantidades de pelo menos cerca de 10 mg/quilograma, pelo menos 15 mg/quilograma, pelo menos 20 mg/quilograma, pelo menos 25 mg/quilograma, pelo menos 30 mg/quilograma, ou pelo menos 50 mg/quilograma. Em formas de realização adicionais, a preparação de imunoglobulina pode ser administrada a um indivíduo em doses de até cerca de 100 mg/ quilograma, até cerca de 150 mg/quilograma, até cerca de 200 mg/ quilograma, até cerca de 250 mg/quilograma, até cerca de 300 mg/ quilograma, até cerca de 400 mg/quilograma a cada dia. Em outras formas de realização, as doses da preparação de imunoglobulina podem ser maiores ou menores. Além disso, as preparações de imunoglobulina podem ser administradas em uma ou mais doses por dia. Os médicos familiarizados com as doenças tratadas pela preparações de IgG podem determinar a dose apropriada para um paciente de acordo com critérios conhecidos na técnica.

[0082] Um produto de IgG habitualmente usado, a imunoglobulina intravenosa ou IVIG, é formulado para a administração intravenosa. Porque a preparação de IgG desta invenção tem alcançado uma concentração de imunoglobulina excepcionalmente alta (20 % p/v ou mais alta), isto significantemente reduz o volume para uma dose terapeuticamente eficaz, a composição da presente invenção é particularmente vantajosa para a administração subcutânea e/ou intramuscular a um paciente, embora a administração intravenosa permaneça uma opção para a administração.

[0083] O termo “quantidade eficaz” refere-se a uma quantidade de uma preparação de imunoglobulina, particularmente IgG, que resulta em uma melhora ou remediação de uma condição médica que é tratada no indivíduo (por exemplo, deficiência imune primária, RRMS, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, etc.). Uma quantidade eficaz a ser administrada ao indivíduo pode ser determinada por um médico com consideração de diferenças individuais na idade, peso, severidade da doença, via de administração (por exemplo, intravenosa v. subcutânea) e resposta à terapia. Em certas formas de realização, uma preparação de imunoglobulina desta invenção pode ser administrada a um indivíduo de cerca de 5 mg/quilograma a cerca de 2000 mg/quilograma a cada dia. Em formas de realização adicionais, a preparação de imunoglobulina pode ser administrada em quantidades de pelo menos cerca de 10 mg/ quilograma, pelo menos 15 mg/quilograma, pelo menos 20 mg/ quilograma, pelo menos 25 mg/quilograma, pelo menos 30 mg/ quilograma, ou pelo menos 50 mg/quilograma. Em formas de realização adicionais, a preparação de imunoglobulina pode ser administrada a um indivíduo em doses de até cerca de 100 mg/quilograma, a cerca de 150 mg/quilograma, a cerca de 200 mg/quilograma, a cerca de 250 mg/ quilograma, a cerca de 300 mg/quilograma, a cerca de 400 mg/ quilograma a cada dia. Em outras formas de realização, as doses da preparação de imunoglobulina podem ser maiores ou menores. Além disso, as preparações de imunoglobulina podem ser administradas em uma ou mais doses por dia. Os médicos familiarizados com as doenças tratadas pelas preparações de IgG podem determinar a dose apropriada para um paciente de acordo com os critérios conhecidos na técnica.

[0084] Em certas formas de realização, uma preparação de IgG concentrada pode ser administrada a um indivíduo na dose de cerca de 5 mg/quilograma a cerca de 2000 mg/quilograma por administração. Em certas formas de realização, a dose pode ser de pelo menos cerca de 5 mg/kg, ou pelo menos cerca de 10 mg/kg, ou pelo menos cerca de 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 500 mg/kg, 550 mg/kg, 600 mg/kg, 650 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 850 mg/kg, 900 mg/kg, 950 mg/kg, 1000 mg/kg, 1100 mg/kg, 1200 mg/kg, 1300 mg/kg, 1400 mg/kg, 1500 mg/kg, 1600 mg/kg, 1700 mg/kg, 1800 mg/kg, 1900 mg/kg, ou pelo menos cerca de 2000 mg/kg.

[0085] De acordo com a presente invenção, o tempo necessário para completar um curso do tratamento pode ser determinado por um médico e pode variar de tão curto quanto um dia a mais do que um mês. Em certas formas de realização, um curso de tratamento pode ser de 1 a 6 meses.

[0086] A dosagem e frequência de tratamento com IgG concentrada dependerá, entre outros fatores, da doença ou condição que é tratada e da severidade da doença ou condição no paciente. No geral, para a disfunção imune primária uma dose entre cerca de 100 mg/kg e cerca de 400 mg/kg de peso corporal será administrada a cerca de cada 3 a 4 semanas. Para as doenças neurológicas e autoimunes, até 2 g/kg de peso corporal é implementada por três a seis meses em um curso de cinco dias a uma vez ao mês. Isto é no geral suplementado com terapia de manutenção que compreende a administração entre cerca de 100 mg/kg e cerca de 400 mg/kg de peso corporal a cerca de uma vez a cada 3 a 4 semanas. No geral, um paciente receberá uma dose ou tratamento de cerca de uma vez a cada 14 a 35 dias, ou de cerca de a cada 21 a 28 dias. A frequência de tratamento dependerá, entre outros fatores, da doença ou condição que é tratada e da severidade da doença ou condição no paciente.

[0087] Em uma forma de realização preferida, um método de tratar uma imunodeficiência, doença autoimune, ou infecção aguda em um ser humano em necessidade deste é fornecido, o método compreendendo administrar uma composição farmacêutica de IgG da presente invenção.

EXEMPLOS

[0088] Os seguintes exemplos são fornecidos apenas por via de ilustração e não por via de limitação. Aqueles de habilidade na técnica facilmente reconhecerão uma variedade de parâmetros não críticos que poderiam ser mudados ou modificados para produzir essencialmente os mesmos ou resultados similares.

Exemplo 1: Estudo de Estabilidade de Várias Concentrações e Formulações de IgG 1. Propósito

[0089] O propósito deste estudo é comparar a estabilidade na armazenagem do pH baixo (0,25 M de glicina pH 4,4 a 4,9 como medido na solução concentrada) na concentração de proteína mais alta com a formulação de pH neutro (22,5 g/l de glicina, 3g/l de NaCl pH 7) como correntemente usado para as imunglobulinas intramuscular e subcutaneamente injetáveis.

2. Planejamento Experimental

[0090] Todas as rodadas começam com a concentração do nanofiltrado a 5 % de proteína. Uma troca de tampão dez vezes contra glicina 0,15 M (a concentração de glicina mais baixa investigada) é realizada seguida pela concentração final a um valor alvo acima de 20 % de proteína. Enquanto que para o primeiro conjunto de experimentos uma membrana Millipore de polietersulfona de 0,5 m2 com corte molecular de 30 K (tela regular) é usada, o segundo conjunto de experimentos é feito com uma membrana Millipore de polietersulfona de 0,5 m2 com tela aberta, que é mais adequada para soluções com viscosidade mais alta e as frações após a lavagem são concentradas por um segundo dispositivo de ultra- / diafiltração com uma superfície de tela mais baixa (0,1 m2, tela aberta) de modo a reduzir perdas de rendimento.

[0091] Os recipientes finais são formulados e armazenados em pH baixo ou a armazenagem no pH baixo é feita a granel e depois disso são formuladas no pH neutro antes da armazenagem.

[0092] Tabela 1: Vista geral das etapas de ultra- / diafiltração (membranas de polietersulfona 30 K) e o pH do recipiente final

Dispositivo de ultrafiltração de 0,5 m2 Tela padrão Tela padrão Tela aberta Tela aberta Dispositivo de ultrafiltração de 0,1 m2 nenhuma nenhuma Tela aberta Tela aberta pH do recipiente final 4,7 7 4,7 7

3. Métodos de Teste

[0093] pH: o pH foi testado com Knick Portamess tipo 911 XPH equipado com um eletrodo LoT405-DPA-SC-S8/120 da Mettler Toledo e uma sonda de temperatura PT 1000.

[0094] Proteína: Os valores de proteína foram determinados usando Biuret.

[0095] A distribuição do peso molecular foi testada usando-se a cromatografia de exclusão de tamanho de alto desempenho.

[0096] O título ACA foi testado como descrito na Farmacopéia Européia.

4. Critérios de Aceitação

[0097] Os seguintes critérios de aceitação são definidos: • Distribuição do peso molecular pela HPLC: i. Monômeros e Oligo-/ Dímeros: > 90 % ii. Agregados: <10 % (< % para a administração IV) • Título ACA: Menos do que 50 % de Unidades CH50 consumidas / mg de proteína para a administração IV.

5. Resultados e Debate 5.1 . Comparação de Teor de Agregado e Fragmento e Título ACA nas Preparações Formuladas em pH baixo (pH 4,7 e no pH 7,0)

[0098] Na seguinte Tabela 2, o teor de agregado e fragmento assim como o título ACA depois de 3 meses de armazenagem de 28 a 30° C para as formulações padrão (pH 4,7, 0,25 M de glicina; ou pH 7,0, 22,5 g/L de glicina, 3 g/L de NaCl) em concentrações de proteína diferentes são mostrados.

[0099] Tabela 2: Fragmento, Agregado e valores ACA depois de 3 meses de armazenagem de 28 a 30° C em pH baixo e pH 7,0 em concentrações de proteína diferentes

[00100] Os dados claramente mostram que a formulação de pH baixo tem agregados mais baixos e títulos ACA mais baixos depois de 3 meses de armazenagem de 28 a 30° C. Todos os títulos ACA das formulações de pH 7 estão acima do critério de aceitação definidos para este teste. Na Tabela 2 os valores depois de 3 meses de armazenagem de 2 a 8° C são dados.

[00101] Tabela 3: Fragmento, Agregado e valores ACA depois de 3 meses de armazenagem de 2 a 8° C em pH baixo e pH 7,0 em concentrações de proteína diferentes

[00102] Os resultados de 2 a 8° C confirmam a tendência observada de 28 a 30° C. Os títulos ACA são todos abaixo do limite definido como critérios de aceitação embora as formulações com pH 7,0 fossem observadas ter valores mais altos. O valor da proteína não influencia os resultados dos parâmetros testados.

5.2 Influência de Procedimentos de Concentração Diferentes sobre o Teor de Agregado e Fragmento assim como Título ACA nas Preparações IGSC60 (pH 4,7, tela V) e IGSC62 (pH 4,7, tela V, concentração após a lavagem com sistema UF menor)

[00103] Na Tabela 4 seguinte, o teor de agregado e fragmento assim como o título ACA depois de 3 meses de armazenagem de 28 a 30° C para as formulações de pH baixo com procedimentos de concentração diferente em concentrações de proteína diferentes são mostrados.

[00104] Tabela 4: Valores de Fragmento, Agregado e ACA depois de 3 meses de armazenagem de 28 a 30° C no pH baixo com métodos de concentração de proteína diferentes % de Fragmentos % de Agregados % de ' rítulo ACA Proteína Tela padrão Tela aberta Tela padrão Tela aberta Tela padrão Tela aberta

[00105] Os dados mostraram resultados similares depois de 3 meses de armazenagem para ambos os modos de concentração. Na Tabela 5 os valores correspondentes de 2 a 8° C são mostrados.

[00106] Tabela 5: Valores de Fragmento, Agregado e ACA depois de 3 meses de armazenagem de 2 a 8° C em pH baixo com métodos de concentração de proteína diferentes

[00107] Os valores obtidos de 2 a 8° C confirmaram os resultados obtidos de 28 a 30° C. O método de concentração não influencia a estabilidade do produto.

[00108] Como o método com dois sistemas, um para o processo de concentração principal e o outro para a concentração da pós-lavagem, resulta em rendimento mais alto, este método foi julgado ser mais apropriado para a fabricação em larga escala.

6. Conclusão

[00109] As seguintes conclusões podem ser esboçadas a partir dos resultados apresentados neste estudo: • A formulação de pH baixo dá valores ACA mais baixos, teores de agregado mais baixo e fragmento mais baixo depois de 3 meses de armazenagem de 2 a 8° C e de 28 a 30° C. • Depois de 3 meses de armazenagem de 28 a 30° C os valores ACA das formulações de pH neutro estão acima dos critérios de aceitação. • O valor de proteína não influencia os resultados dos parâmetros testados. • O método de concentração não influencia a estabilidade do produto. • A pós-lavagem adequada pode ser obtida apenas com membranas de tela aberta

[00110] Com base nestas conclusões foi decidido produzir o novo produto de IgG para administração subcutânea com a formulação de pH baixo, o método de concentração usando um segundo dispositivo menor para concentrar a pós-lavagem, um dispositivo de ultra/diafiltração com membranas tela aberta e em um teor de proteína de 20 % ± 2 %.

Exemplo 2: Ultrafiltração e Formulação de SUB Q NG 1. Fundamentos

[00111] Esta informação foi obtida durante a produção em escala aumentada e lotes a 20 % pré-clínicos. O processo usado para a fabricação de lotes a 20 % até a etapa do nanofiltrado foi como descrito acima. A ultra/diafiltração foi melhorada para concentrar a solução para 20 % (limites: 18 a 22 %). De modo a reduzir a perda de rendimento a um mínimo, a pós- lavagem do dispositivo de ultrafiltração usado para a diafiltração é concentrada por um segundo dispositivo menor equipado com as mesmas membranas e depois disso adicionado ao grosso da solução.

[00112] Surpreendentemente pode ser mostrado que a inativação do vírus durante a armazenagem em pH baixo não é influenciada pela concentração da proteína da solução. Redução viral similar foi obtida em solução a 10 % (GAMAGARD® LÍQUIDO) e em solução a 20 %. Portanto a armazenagem em pH baixo como uma etapa de redução de vírus foi mantida para o produto a 20 %.

2. Narrativa de Processo ULTRAFILTRAÇÃO

[00113] A concentração de glicina do nanofiltrado é ajustada a um alvo de 0,25 M. A solução é concentrada a uma concentração de proteína de 6 ± 2 % p/v através da ultrafiltração (UF). Tipicamente, a concentração de proteína é determinada pela medição de AU280-320. Um coeficiente de extinção de 14,1 é usado. O pH é ajustado a 5,2 ± 0,2. A membrana UF usada tem um corte de peso molecular nominal (NMWCO) de 50.000 daltons ou menos e é especialmente planejada para produtos de viscosidade alta (por exemplo, tela V da Millipore). Por exemplo, Millipore Pellicon Biomax com um NMWCO de 50 K daltons ou menos. O material da membrana é polietersulfona.

[00114] O concentrado é diafiltrado contra uma solução de glicina a 0,25 M, pH 4,2 ± 0,2. O volume de troca mínima é 10X dos volumes concentrados originais. Através da operação de ultrafiltração/diafiltração, a solução é mantida de 4° C a 20° C.

[00115] Depois da diafiltração, a solução é concentrada a uma concentração de proteína de no mínimo 22 % p/v. A temperatura da solução é ajustada de 2° C a 8° C. A concentração da proteína pode ser determinada pela leitura de UV através do uso de um valor de coeficiente de extinção de 14,1

[00116] De modo a recuperar a proteína residual completa no sistema, a pós-lavagem do primeiro sistema de ultrafiltração maior é feita com pelo menos 2 vezes o volume morto no modo de recirculação para garantir que toda a proteína é retirada por lavagem. Depois que a pós-lavagem do primeiro sistema de ultrafiltração é concentrada a uma concentração de proteína de pelo menos 22 % p/v com um segundo sistema de ultra/ diafiltração equipado com o mesmo tipo de membrana que é dimensionado a um décimo ou menos do primeiro. O concentrado da pós-lavagem é adicionado à solução volumosa. O segundo sistema de ultrafiltração é depois pós-lavado. Esta pós-lavagem é usada para o ajuste da concentração de proteína do volume final na etapa 14. A temperatura da solução é ajustada de 2° C a 8° C.

FORMULAÇÃO

[00117] A concentração da proteína é ajustada ainda a 20,4 ± 0,4 % p/v com pós-lavagem do segundo sistema de ultrafiltração menor e/ou com tampão de diafiltração. O pH é ajustado de 4,4 a 4,9, se necessário.

Exemplo 3: Fabricação de lotes de 20 % 1. INTRODUÇÃO

[00118] Este relato descreve a produção pré-clínica e resume os resultados da nova preparação de imunoglobulina investigacional de Baxter “SUBQ NG, 20 %,” que é uma preparação de imunoglobulina humana polivalente líquida a 20 % (p/v) para o uso subcutâneo.

[00119] A fabricação foi feita como descrita na “Descrição Detalhada da Invenção” com o método de concentração como descrito acima. O fracionamento começa com a separação do crio-precipitado. O plasma crio- insuficiente pode ser depois usado para a isolação de vários fatores e inibidores de coagulação brutos antes do fracionamento com álcool frio subsequente. Sete caminhos são escolhidos para a absorção de lote de fatores e inibidores de coagulação brutos a partir do plasma crio-insuficiente antes da purificação de SUBQ NG, 20 % e são aludidos como caminhos de 1 a 7 na tabela que segue.

[00120] Para a produção de SUBQ NG, 20 % pré-clínica, os materiais de partida de Cohn derivados dos caminhos 1, 3 e 6 foram escolhidos para abranger uma ampla variedade de opções de absorção diferentes. Vários processos de absorção são descritos em Teschner et al., 2007, Vox Sang. 92: 42-55; Polsler et al., 2008, Vox Sang. 94: 184-192; Patentes U.S. Nos 6.395.880 e 5.409.990; e Complexo de Protrombina: Brummelhuis em Methods of Plasma Protein fractionation (J. M. Curling Editor, Academic Press, 1980).

[00121] O fracionamento alcoólico de Cohn modificado leva a uma fração de IgG intermediária principal, aludida como Precipitado G, que é processada ainda mais até o produto final usando purificação cromatográfica. A fabricação a jusante compreende cromatografia de troca catiônica (fluxo rápido de CM-Sepharose) e de troca aniônica (fluxo rápido de ANX- Sepharose) e inclui três etapas de inativação ou de remoção viral independente, a saber • Tratamento com solvente/detergente (mistura de Triton X100 a 1 %, fosfato de Tri-N-butila a 0,3 % e Polissorbato-80 a 0,3 %), • Nanofiltração (Asahi Planova 35 nm) e • Armazenagem e pH baixo por 3 semanas em temperatura elevada.

[00122] De modo a atingir uma concentração de proteína mais alta para a aplicação subcutânea uma tela de canal aberto tem que ser usada na etapa de ultra/diafiltração. Preferivelmente um segundo dispositivo de ultra/diafiltração é usado para a concentração da fração de pós-lavagem de modo a recuperar toda a proteína do primeiro dispositivo.

[00123] SUBQ NG, 20 % é uma formulação líquida de Imunoglobulina G (IgG), da qual pelo menos 95 % da proteína é gama globulina. O produto é isotônico e formulado em pH baixo. A uma concentração de 10 % de proteína durante a etapa de concentração final o pH é de 4,4 a 4,9. O pH final da solução a 20 % será determinado depois que os resultados de estudos de estabilidade prolongada estiverem disponíveis. A solução final contém de 180 a 220 g de proteína e como o único excipiente de 0,1 a 0,3 mol de Glicina por litro de solução. A preparação líquida é clara a levemente amarelo claro e substancialmente isenta de partículas visíveis. 2. Dados e Equilíbrio de Massa dos Lotes Pré-Clínicos

1. Lote Pré-Clínico: SC00107NG

[00124] Opção de Absorção 1: Opção 6: F IX, F VII, AT-III

[00125] Número do lote do material de partida: Precipitado G VNELG171 (fonte US)

[00126] Número do lote do recipiente final: SC00107NG

2. Lote Pré-Clínico: SC00207NG

[00127] Opção de Absorção 3: FEIBA, AT-III

[00128] Número do lote do material de partida: Precipitado G VNELG173 (fonte US)

[00129] Número do lote do recipiente final: SC00207NG

3. Lote Pré-Clínico: SC00307NG

[00130] Opção de Absorção 1: nenhuma etapa de absorção

[00131] Número do lote do material de partida: Precipitado G LB0790301 (fonte US)

[00132] Número do lote do recipiente final: SC00307NG

[00133] Ao nível de volume final a pureza da preparação é ilustrada pelos níveis baixos das impurezas principais, que estão bem abaixo de 0,1 % da IgG total. A distribuição do peso molecular no produto a 20 % neste estágio final do processo é similar àquela de um recipiente final de GAMAGARD® LÍQUIDO / KIOVIG. Isto indica que a concentração para a proteína a 20 % não tem nenhum impacto negativo sobre a integridade da molécula de IgG.

4. Resultados adicionais da caracterização dos lotes pré- clínicos

[00134] Os critérios de liberação de recipiente final preliminares foram definidos com base nas exigências das autoridades para as imunoglobulinas humanas subcutâneas, as especificações do recipiente final do produto corrente para a administração subcutânea e as especificações de GAMAGARD® LÍQUIDO / KIOVIG. Testes de Controle de Qualidade Adicionais foram realizados para avaliar o nível de produto e/ou impurezas relacionadas com o processo.

[00135] Além disso, a caracterização do Espectro de Anticorpo relevante dos Recipientes Finais foi feita e comparada com os resultados da IVIG pré-clínica, lotes TVR a 10 %.

[00136] Os resultados são dados na tabela que segue (Tabela 8)

[00137] Os títulos de anticorpo e os fatores de enriquecimento são na mesma ordem de magnitude para os três recipientes SUBQ NG 20 % pré- clínicos finais e para os lotes GAMAGARD® LÍQUIDO / KIOVIG pré- clínicos.

[00138] Testes de Controle de Qualidade de Recipiente Final SUBQ NG 20 % (Tabela 9)

[00139] A remoção de produto e impurezas relacionadas com o processo é satisfatória para todos os três lotes.

5. Conclusões

[00140] Três lotes de recipiente final de SUBQ NG 20 % foram fabricados com êxito na escala de 200 litros. Três caminhos de absorção foram escolhidos para abranger uma ampla variedade de etapas de absorção antes do fracionamento alcoólico, a saber: - Opção 1, plasma de fonte US sem etapas de absorção - Opção 3, plasma de fonte US depois de FEIBA, absorção AT-III - Opção 6, plasma de fonte US depois F-IX, F-VII, absorção AT-III

[00141] No processo, os parâmetros monitorados durante a produção pré-clínica e a caracterização de intermediários e o produto final mostraram que não existe nenhuma diferença óbvia detectável entre os três lotes.

[00142] Todos os recipientes finais atingem as especificações preliminares relacionados com o produto independente de qual tipo de material de partida foi escolhido.

Exemplo 4: Estudo de Armazenagem de Preparação a 20 % 1. Introdução

[00143] SUBQ NG, 20 % é uma preparação de imunoglobulina humana a 20 % (p/v) líquida polivalente para o uso subcutâneo. A SUBQ NG, 20 % foi produzida como descrito acima.

[00144] Este estudo resume os dados de armazenagem de 3 lotes pré- clínicos e um lote de praticabilidade de 2 a 8° C e de 28 a 30° C (apenas lote de praticabilidade) por até 6 meses.

2. Propósito

[00145] O propósito deste estudo é avaliar a estabilidade na armazenagem de recipientes finais Sub Q NG 20 % de 2 a 8° C e de 28 a 30° C.

3. Parâmetros que Indicam a Estabilidade

[00146] Os modos de degradação primária são desnaturação, agregação e fragmentação, que resultam em uma mudança na distribuição do peso molecular da amostra. Portanto a análise da distribuição do peso molecular pela Cromatografia de Exclusão de Tamanho de Alto Desempenho é o parâmetro principal que indica a estabilidade.

4. Lotes Examinados e Empacotamento Primário

[00147] Os dados de estabilidade apresentados neste relato são feitos com os Lotes Pré-Clínicos SC00107NG, SC00207NG e SC00307NG assim como com o lote de praticabilidade IgGSC 62/1.

5. Resultados

[00148] Na Tabela 11 que segue os resultados dos recipientes finais pré-clínicos depois da armazenagem até 12 meses são mostrados. Tabela 10: Estabilidade de lotes Sub Q 20 % pré-clínicos de 2 a 8° C

Tabela 11: Estabilidade do lote de praticabilidade IgGSC 62/1 de 2 a 8° C

6. Conclusão

[00149] Os dados confirmaram que o produto está de acordo com as especificações pré-definidas para os parâmetros investigados por até 18 meses de armazenagem de 2 a 8° C e de 28 a 30° C.

Exemplo 5: Tratamento em pH Baixo para a Inativação Viral PROPÓSITO E ANÁLISE RACIONAL Introdução

[00150] Imuno Globulina Subcutânea (Humana), 14 % a 20 %, Solução Tripla Viralmente Reduzida (TVR), na seguinte chamada Solução Subcuvia NG, é fabricada a partir de plasma humano reunido. Depois da captura de massa as etapas para remover fatores/inibidores de coagulação, a purificação da Subcuvia NG começa com um fracionamento alcoólico de Cohn modificado, que leva a um precipitado G principal intermediário, seguido por um processo a jusante que contém purificação cromatográfica assim como três etapas de inativação / remoção viral distintas. No estudo corrente, a capacidade de redução viral da armazenagem em pH baixo do recipiente final foi investigada em detalhes.

[00151] O processo de purificação a jusante compreende as seguintes etapas: o Precipitado G recolocado em suspensão é individualizado para o tratamento de Solvente/Detergente (S/D), cromatografia de troca catiônica usando fluxo rápido de Carboximetil(CM)-Sepharose e cromatografia de troca aniônica usando fluxo rápido de ANX-Sepharose®, nanofiltração, ultra- diafiltração, ajuste de pH, e filtração estéril e enchimento. Depois do enchimento asséptico a Solução de Subcuvia NG é individualizada até a armazenagem em pH baixo no recipiente final (para a ilustração esquemática do processo de fabricação, ver o esquema de processo abaixo).

Esquema de Processo

[00152] O esquema de processo A, mostrado na figura 2, fornece uma vista geral da parte a jusante do esquema de fabricação para Solução de Subcuvia NG começando com a Etapa 10. O intermediário feito de encomenda usado no estudo corrente é igual à etapa de processo “Recipiente final, Pré-Armazenagem.”

[00153] O esquema de processo B, mostrado na Figura 2, fornece uma vista geral do processo em escala reduzida usado no presente estudo incluindo a retirada de amostra para a titulação viral.

Propósito

[00154] Para fornecer uma margem altamente segura com respeito a uma transmissão viral potencial, três etapas de inativação/remoção viral separadas, que complementam-se entre si no seu modo de ação, são integradas no processo de fabricação da Solução Subcuvia NG: • Tratamento com Solvente/Detergente (etapa 11) • Nanofiltração (etapa 14) • Armazenagem em pH baixo em temperatura elevada no recipiente final (enchimento pós-asséptico)

[00155] A capacidade e a robustez da armazenagem no pH baixo e temperatura elevada com respeito à inativação de vírus já foi investigada no curso de um estudo anterior, em que IGIV 10 % TVR, um produto equivalente a Subcuvia NG mas ajustado a 10 % de proteína para a aplicação i.v., foi usado. Os resultados obtidos a partir deste estudo demonstrou que todos os vírus envelopados em lipídeo investigados foram eficaz e robustamente inativados, com o vírus da diarréia viral bovina (BVDV) mostrando as cinéticas de inativação mais lentas. Além disso, pôde ser demonstrado que esta etapa de processo contribui ainda para a segurança viral do processo de fabricação com respeito a vírus de DNA não envelopado em lipídeo pequeno. Subcuvia NG e IGIV 10 % TVR são produtos de imunoglobulina, onde Subcuvia NG é a variação para a administração subcutânea, e IGIV 10 % TVR é a variação de produto para a aplicação i.v.. Ambos compartilham do mesmo processo de fabricação até as etapas de ultrafiltração/diafiltração e de formulação, onde a única diferença é que a concentração da proteína de Subcuvia NG é ajustada a uma faixa de 14 % a 20 % ao invés de 10 %.

[00156] Portanto a capacidade e robustez da etapa de armazenagem em pH baixo e temperatura elevada na fabricação de Subcuvia NG (ver, The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products Evaluation of Medicines for Human Use (2001): CPMP Biotechnology Working Party - Note for Guidance on Plasma-Derived Medicinal Products, CPMP/BWP/269/95 (rev. 3)) com respeito à inativação de BVDV e MMV foi avaliado ajustando-se parâmetros de processo críticos selecionados para os limites superior e inferior especificados para o processo de fabricação (isto é, tempo, temperatura: limite inferior; pH: limite superior). Além disso, para investigar ainda mais a robustez desta etapa de inativação viral, a temperatura foi reduzida por um dado período de tempo durante as rodadas em escala reduzida.

[00157] Como debatidos acima, os seguintes vírus envelopados e não envelopados foram usados. • Vírus da diarréia viral bovina (BVDV) como um modelo para o vírus da hepatite C (HCV) e para outros vírus de RNA envelopados em lipídeo pequenos. • Vírus diminuto de camundongo (MMV) como um modelo para o Parvovírus Humano B19 (B19V) e para outros vírus de DNA não envelopado pequeno.

[00158] De acordo com a diretriz CPMP 268/95 (The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products Human Medicines Evaluation Unit (1996): CPMP Biotechnology Working Party - Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses, CPMP/B VVP/268/95 (revisado)) o estudo foi conduzido com um modelo em escala reduzida da respectiva etapa de fabricação. A validade dos resultados obtidos com a etapa de fabricação em escala reduzida “Armazenagem em pH baixo e temperatura elevada” com respeito à inativação viral na fabricação de Solução de Subcuvia NG, foi demonstrado pela comparação de parâmetros especificados para esta etapa de fabricação no processo de produção em larga escala e parâmetros de processo do modelo reduzido. Adicionalmente, os parâmetros bioquímicos selecionados foram monitorados e comparados com os respectivos parâmetros do processo em larga escala.

MATERIAIS, MÉTODOS E EQUIPAMENTO Vírus e Células

[00159] BVDV, cepa NADL (biologicamente clonado, ATCC VR- 1422), obtido da American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Mariland) é usado. O vírus é propagado nas células MDBK (ATCC CCL-22), de acordo com procedimentos de operação padrão, e titulados em células BT (ATCC CRL-1390).

[00160] MMV, cepa protótipo (ATCC VR-1346), foi obtida da American Type Culture Collection, Rockville, Mariland. O vírus foi propagado de acordo com procedimentos de operação padrão e titulado em células A9 (ATCC CCL-1,4). Item de Teste

[00161] Os seguintes lotes de intermediário de Subcuvia NG feitos de encomenda, antes da “Armazenagem em pH baixo e temperatura elevada”, isto é, depois da etapa de fabricação de enchimento asséptico, foram obtidos do departamento de Suporte do Produto PPD da Baxter, Industriestrasse 131, Vienna, Áustria: • Número do lote IGSC64, com uma concentração de proteína de 13,5 % • Número do lote IGSC64, com uma concentração de proteína de 20,9 %

[00162] O material foi enviado no recipiente final de +2° C a +8° C e foi usado dentro de 6 meses. Tampões / Soluções Soluções para o Ajuste do pH

[00163] O pH foi ajustado usando NaOH 0,5 M ou HCl 0,5 M. (Ambas as soluções foram armazenadas na temperatura ambiente e usadas dentro de 12 meses). Preparação do Ácido Clorídrico (HCl) 0,5 M

[00164] Os reagentes, isto é água destilada e HCl foram combinados na temperatura ambiente. Preparação do Hidróxido de Sódio (NaOH) 0,5 M

[00165] A respectiva quantidade de NaOH foi dissolvida em água destilada na temperatura ambiente.

Soluções para a Medição do pH

[00166] O pH foi medido tanto diretamente quanto em uma solução diluída de acordo com a Farmacopéia Européia (EP). Para medir o pH de acordo com o método da EP, a concentração da proteína foi diluída a 1 % usando uma solução de NaCl a 0,9 %.

[00167] A solução de NaCl a 0,9 % foi preparada como segue: 9,0 ± 0,9 g de NaCl foram dissolvidos em 1000 ml de água destilada. A solução foi filtrada em 0,2 μm, armazenada na temperatura ambiente e usada dentro de 12 meses.

Meio de cultura de célula

[00168] Os meios usados para a cultura de célula ou titulação viral foram preparadas de acordo com procedimentos de operação padrão para titulação viral de BVDV e MMV.

Ensaios de Titulação Viral Ensaio de TCID50

[00169] As amostras contendo vírus foram tituladas pelos ensaios de TCID50 de acordo com procedimentos de operação padrão. Em resumo, diluições de ^ log em série das amostras foram preparadas no respectivo meio de cultura de tecido, e 100 μl de cada diluição foram adicionados a cada um dos 8 reservatórios de uma placa microtituladora semeada com a respectiva linhagem de célula indicadora. As placas microtituladoras são armazenadas em unidades de armazenagem umidificadas e reguladas com CO2 em uma temperatura de 36° C ± 2° C. A avaliação dos efeitos citopáticos é realizada pela inspeção visual das células sob um microscópio depois de 7 dias de armazenagem.

[00170] As doses infecciosas de cultura de tecido médias (TCID50) foram calculadas de acordo com a distribuição de Poisson e expressadas como log10[TCID50/ml].

Titulação de BVDV a Granel

[00171] Estudos foram realizados em amostras reforçadas com MMV. De modo a diminuir o limite de detecção para as amostras reforçadas com BVDV tiradas do intermediário de Subcuvia NG depois de 20 e 27 dias de armazenagem em pH baixo, estas amostras foram tituladas como segue: além do ensaio de TCID50 padrão, as amostras da diluição de 1:3,16 (0,5 log) e seguindo duas diluições Y2 log (o respectivo meio de cultura de célula é usado para diluição) são adicionadas a todos os reservatórios (100 μl por reservatório) de placas microtituladoras de 96 reservatórios semeadas com a respectiva linhagem de célula indicadora. A armazenagem das células e a avaliação do efeito citopático do respectivo vírus são feitos como descrito acima (Ensaio TCID50). Os resultados foram calculados como segue: A razão RVol do volume titulado na titulação a granel e o volume titulado no ensaio de TCID50 regular foi calculado. O log10 de RVol é subtraído do título viral determinado no ensaio TCID50, e o resultado é dado como o título viral determinado pela titulação a granel. Exemplo: - Uma amostra é ensaiada (ensaio TCID50) em uma placa microtituladora em diluições de 0,5 log em série (todas as 12 colunas) e os reservatórios são encontrados negativos da diluição 0 (isto é não diluído) em diante. O cálculo de acordo com a distribuição de Poisson dá um título viral de <0,11 log10[TCID50/ml]. O volume total correspondente da amostra ensaiada é de 1,17 ml. - A mesma amostra (diluição 0) é aplicada em todos os reservatórios de uma placa microtituladora (titulação a granel). Portanto, o volume de amostra total aplicado é de 9,6 ml - A razão de volumes é: Rvol = 9,6: 1,17 = 8,21; log10 (Rvol = 0,91. - O título viral calculado é depois < 0,11 - 0,91; isto é < - 0,80. O limite superior do intervalo de confidência do título viral é calculado de modo idêntico.

[00172] Cálculo do título viral quando nenhum infectividade é contada nas amostras cinéticas sucessivas

[00173] Onde nenhuma infectividade viral foi detectada em amostras cinéticas sucessivas até que a amostra final depois da conclusão da armazenagem em pH baixo, o volume de todas as amostras negativas sucessivas usadas para os reservatórios no ensaio de TCID50 com um resultado negativo claro como levado em consideração quanto ao cálculo do limite de detecção do ensaio. Para isto a seguinte fórmula foi usada (ver também Apêndice 1):

com Xi (i = 1, 2, 3, n) títulos virais individuais [log10(TC1D50/ml)] de n amostras negativas sucessivas

[00174] Se todas as amostras negativas têm o mesmo título, isto é x, a fórmula simplifica para: Título viral com base em n amostras = < x - log10 (n) de cinética negativas sucessivas [log10 (TGCID50/ml)] Citotoxicidade

[00175] A citotoxicidade dos intermediários de processo para as linhagens de células indicadoras virais usadas foi determinada a partir de intermediário de Subcuvia NG reforçado simulado, isto é reforçado com meio BT para células infectadas (5 % de soro de cavalo)* ao invés do estoque viral assim como de material de partida reforçado simulado, ajustado no pH (pH 4,9 ± 0,1) e filtrado em 0,45 μm em cada linhagem de célula para a determinação da citotoxicidade. As amostras foram ensaiadas como amostras contendo vírus, isto é elas foram diluídas em série e armazenadas com a linhagem de célula indicadora. Depois da armazenagem, a concentração não citotóxica mais alta foi determinada. Com respeito às variações nestes sistemas biológicos, os desvios de etapas de ± 0,5 log foram considerados não significantes quando da comparação com a citotoxicidade em amostras reforçadas com vírus e reforçadas simulado.

[00176] * A composição do meio BT para células infectadas é como segue: DMEM (contendo 4,5 g/l de D-Glicose) + 1 % (v/v) de L-Glutamina (200 mM) + 1 % (v/v) de Sulfato de Gentamicina (10 mg/ml) + 1 % (v/v) de Piruvato de Sódio + 2 % (v/v) de Bicarbonato de Sódio (7,5 %) + 1 % (v/v) de aminoácidos não essenciais + 5 % (v/v) de soro de Cavalo. Interferência

[00177] Para as amostras com títulos virais baixos, a influência da matriz de amostra sobre o desempenho do ensaio de infectividade necessita ser avaliada. Para amostras contendo títulos virais altos, a parte relevante da série de diluição, isto é a parte onde reservatórios positivos em vírus e negativos em vírus podem ser contados, ocorre em diluições de amostra altas. Consequentemente, a influência da matriz de amostra, que também é diluída várias etapas de log10, na detecção da infectividade viral pode ser negligenciada. A interferência com as determinações de títulos virais baixas para amostras contendo intermediário de Subcuvia NG foi medido como segue: As amostras foram tiradas de material de partida reforçado simulado, ajustado no pH (pH 4,9 ± 0,1) e filtrado em 0,45 μm (intermediário de Subcuvia NG), diluído 1:3,16 com o meio de cultura de tecido apropriado e reforçado 1:100 com suspensão de estoque viral pré-diluída (em meio de cultura de tecido apropriado, isto é meio BT para células BT /BVDV e meio A9 para células A9 /MMV) a um título nominal de 2 ou 3 log10[TCID50/ml] e titulado como descrito acima. Os títulos obtidos para os intermediários de processo reforçados foram comparados com aqueles de controles de meio de cultura de célula reforçados. Cálculo de Fatores de Redução Viral

[00178] A análise da capacidade de inativação viral do processo foi realizada de acordo com as diretrizes de CPMP 268/95 [3], usando a seguinte fórmula:

onde, R = fator de redução viral V1= volume do material de partida T1 = concentração de vírus no material de partida [TCID50/ml] V2 = volume de material depois da etapa T2 = concentração de vírus depois da etapa [TCID50/ml]

[00179] Os volumes e os títulos de cada amostra reforçada antes e depois do tratamento foram usados para calcular R. Sempre que o vírus foi indectável, o limite de detecção foi tomado como o título viral para o cálculo. De acordo com os procedimentos de operação padrão, os cálculos foram realizados com títulos virais (log10[TCID50/ml) dados com duas casas decimais; os fatores de redução foram arredondados para a primeira casa decimal. Determinação dos Parâmetros de Validação Tempo, Temperatura [°C]

[00180] O tempo de armazenagem foi medido com cronômetros; a temperatura foi medida com sensores Pt-100 e registrados continuamente. Valor de pH

[00181] O valor de pH foi determinado de acordo com os procedimentos de operação padrão com um medidor de pH de laboratório padrão pela medição direta assim como implementando o método especificado pela farmacopéia Européia (EP), isto é depois da diluição a 1 % de proteína com 0,9 % de solução de NaC1. No que segue, o pH com sufixo (EP) significa medição pH de acordo com o método EP, ao passo que “pH” sem sufixo significa medição direta. Determinação de Outros Parâmetros Distribuição do peso molecular (MSD)

[00182] A análise de HPLC-SEC (Cromatografia Líquida de Alto Desempenho - Cromatografia de Exclusão de Tamanho) da distribuição do peso molecular foi feita pelo departamento de Bioquímica Analítica, Baxter, Vienna, Áustria, de acordo com procedimentos de operação padrão. A análise de HPLC-SEC de todas as amostras dos lotes “aumentados” (produzidos no departamento de Suporte ao Produto PPD, Baxter, Vienna, Áustria) foi realizada de acordo com este teste. Assim, para garantir a comparabilidade entre os resultados de teste das amostras das conduções reforçadas com simulado (acumulados no processo em escala reduzida no curso deste estudo) e os resultados de teste dos lotes “aumentados”, a análise de MSD das amostras das rodadas reforçadas com simulado foi feita de acordo com o mesmo teste no mesmo departamento. Eletroforese em Acetato de Celulose

[00183] A Eletroforese em Acetato de Celulose (CAE) foi realizada de acordo com procedimentos de operação padrão pelo departamento de Química ACV, Baxter, Vienna, Áustria. Arredondamento

[00184] O arredondamento foi realizado de acordo com práticas padrão: • Os resultados de ensaio foram arredondados até o mesmo número de casas decimais como especificado para o respectivo parâmetro no processo de fabricação, ou como determinado pela precisão do ensaio. • Os cálculos foram feitos sem arredondamento de resultados de ensaio, e apenas o resultado final foi arredondado. Equipamento • Um medidor de pH de laboratório padrão foi usado. • Uma balança de laboratório analítica Mettler AT-100 e uma Sartorius BP3100P foram usadas. • Filtração em 0,45 μm foi realizada com filtros de membrana de PVDF (Millex-HV, ou equivalente). • O tempo de processo foi medido com cronômetros de laboratório. • Cabinas de Bio-segurança classe II foram usadas. • As células foram armazenadas em incubadoras com CO2 e umidade controlada Heraeus. • Agitadores magnéticos/barras agitadoras foram usados para misturar. • A temperatura foi controlada pelos criostatos Haake ou Julabo e/ou um bloco de aquecimento sob agitação. • A temperatura foi medida usando sensores Pt-100 conectados a um registrador μR 1000 YOKOGAWA.

PLANEJAMENTO DO ESTUDO

[00185] De modo a investigar a robustez da etapa de fabricação “Armazenagem em pH baixo e temperatura elevada” de Subcuvia NG com respeito à inativação viral, os parâmetros chave para a eficácia de inativação viral foram definidos como debatido abaixo. As rodadas foram realizadas sob condições adequadas para investigar a robustez da inativação viral pela armazenagem em pH baixo. Uma comparação das condições para o processo em larga escala e as rodadas em escala reduzida é dada na Tabela A. • Concentração de Proteína: Como Subcuvia NG é um produto, a faixa de concentração da proteína para o volume formulado é correntemente de certa forma amplamente definida, isto é de aproximadamente 14 % a 20 %, e pode ser limitada mais tarde. Assim, para investigar a robustez do tratamento em pH baixo, duas rodadas (projetos de rodada) foram realizadas nos dois extremos de concentrações de proteína possíveis. O projeto de rodada 1 foi realizado a 13,5 % de concentração de proteína; o Projeto de rodada 2 foi realizado a 20,9 % de concentração de proteína.

[00186] A concentração da proteína do material feito por encomenda foi fornecido pelo departamento de Suporte de Produto PPD. A concentração da proteína do material feito de encomenda não foi determinada novamente, visto que os dados já foram disponíveis das análises, realizadas depois da produção do intermediário de Subcuvia NG feito de encomenda. Visto que o material, que foi usado para o processo em escala reduzida, foi filtrado estéril e armazenado de 2° C a 8° C até o início do processo em escala reduzida (isto é, não individualizado para nenhum procedimento de congelamento/descongelamento), nenhuma mudança na concentração da proteína é prevista para o intermediário finalmente formulado e filtrado estéril. • Valor de pH: Na produção, uma faixa de pH de 4,4 a 4,9 (medição direta) é especificada para o recipiente final de Subcuvia NG por toda a armazenagem em pH baixo. Para investigar a eficácia e robustez do tratamento em pH baixo sob condições menos favoráveis para a inativação viral ambas as rodadas foram realizadas no limite mais alto especificado, isto é, um pH de 4,9 ± 0,1. O pH foi medido depois de reforçar e ajustado para o limite mais alto, se necessário. Depois da armazenagem em pH baixo por 27 dias ± 5 horas, o pH foi medido mais uma vez pela medição de pH direto e pelo método recomendado pela Farmacopéia Européia, isto é, diluição para 1 % de proteína com 0,9 % de solução de NaCl. • Temperatura: No processo de produção a temperatura durante a armazenagem em pH baixo é ajustado de 30 a 32° C. Para investigar a robustez da armazenagem em pH baixo sob condições menos favoráveis para a inativação viral, todas as rodadas em escala reduzida foram realizadas no limite mais baixo da faixa de temperatura, isto é, a 30 ± 1° C. Para examinar o impacto potencial de flutuações da temperatura, a temperatura foi reduzida a 25 ± 1° C por 6 horas uma vez a cada semana (isto é, a diminuição na temperatura foi iniciada durante os dias 0, 7, 14, 20 e dia 27 de armazenagem; a numeração dos dias refere-se aos dias do calendário, isto é dia 0 é o dia em que a armazenagem é iniciada). Erroneamente, a diminuição na temperatura para 25 ± 1° C por 6 horas foi realizada duas vezes por semana na primeira e na segunda semana de armazenagem, isto é, durante o dia 0 e 4 de armazenagem na primeira semana e durante os dias 7 e 10 da armazenagem na segunda semana do tratamento em pH baixo. • Tempo: O tempo de armazenagem está tipicamente na faixa de 21 dias (requeridos para a inativação eficaz de BVDV) a 28 dias (limite superior por razões técnicas/logísticas). Para investigar a eficácia e robustez do tratamento em pH baixo sob condições menos favoráveis para a inativação viral todas as rodadas em escala reduzida foram realizadas abaixo dos limites da faixa de tempo de armazenagem listada acima; isto é por 20 dias ± 4 horas para a opção curta e armazenagem por 27 dias ± 5 horas para a opção mais longa. O intermediário reforçado foi armazenado em pH baixo e temperatura elevada por 27 dias ± 5 horas, mas as amostras para a titulação viral foram tiradas depois de 20 dias ± 4 horas de armazenagem, de modo a investigar a depuração viral depois de 3 semanas de armazenagem (ver também a Tabela A).

[00187] No geral, um total de 4 rodadas de vírus reforçado (2 com BVDV, e 2 com MMV) foram realizadas para investigar a robustez da capacidade de inativação viral da etapa de fabricação “Armazenagem em pH baixo e temperatura elevada.” Além disso, duas rodadas de controle não reforçado foram realizadas para gerar amostras para a determinação de parâmetros bioquímicos. Além disso, duas rodadas de controle reforçadas com simulado foram realizadas e as amostras tiradas destas rodadas foram usadas para investigar efeitos potenciais (isto é, citotoxicidade e interferência) de processos intermediários no ensaio de titulação viral.

[00188] Para demonstrar ainda mais a equivalência dos processos em escala reduzida e em larga escala, a seguinte análise bioquímica foi realizada no produto final antes e depois da armazenagem em pH baixo: distribuição do peso molecular e eletroforese em acetato de celulose.

[00189] Tabela A: Processo e parâmetros bioquímicos das rodadas em escala reduzida, comparados com o processo de fabricação em larga escala. Parâmetros, onde faixas diferentes do processo em larga escala aplicam-se para o processo em escala reduzida, estão em negrito.

1 Como Subcuvia NG é um produto desenvolvimental, a concentração da proteína não é ainda definida mais limitada. Assim, as duas rodadas em escala reduzida foram realizadas nos dois extremos da concentração de proteína possível. 2 O período de armazenagem não é ainda definido mais limitado, como dependente do resultado dos estudos de depuração viral. 3 Ambas as rodadas foram realizadas por 27 d 5 h e as amostras para a titulação viral foram tiradas no dia 20 de armazenagem de modo que os dados da inativação viral também foram disponíveis para a opção de processo em larga escala de 21 a 22 dias de armazenagem. 4 A temperatura foi reduzida para 25 ± 1° C por • 6 horas uma vez a cada semana (isto é a diminuição na temperatura foi iniciada durante os dias 0, 7, 14, 20 e dia 27; a numeração dos dias refere-se aos dias do calendário, isto é dia 0 é o dia no qual a armazenagem é iniciada) de armazenagem. Como debatido na Seção 4.1.1 (“Perfil de Temperatura”), a diminuição na temperatura para 25 ± 1° C por 6 horas foi erroneamente realizada duas vezes por semana na primeira e na segunda semanas de armazenagem (ver também DR1_0407). 5 Método de acordo com a Farmacopéia Européia. Procedimento Experimental

[00190] Devido à sua complexidade, a sequência das etapas de reforço viral, ajustes de pH e filtração em 0,45 mm é ilustrada no diagrama de fluxo encontrado na Figura 3 (a espessura das setas indica volumes relativos). Material de partida

[00191] Para a Rodada 1 o material feito de encomenda (Número do lote IGSC64) com uma concentração de proteína de 13,5 % foi tomado. Este material foi usado para realizar rodadas no limite inferior da concentração de proteína possível, no limite superior da faixa de pH (isto é, BVDV: 4,97 e MMV: 4,93) e no limite inferior da faixa de temperatura (isto é, a 29,4° C).

[00192] Para a Rodada 2 o material feito de encomenda (Número do lote IGSC64) com uma concentração de proteína de 20,9 % foi tomado. Este material foi usado para realizar rodadas no limite superior da concentração de proteína possível, no limite superior da faixa de pH (isto é, BVDV: 4,92 e MMV 4,86) e no limite inferior da faixa de temperatura (isto é, 29,4° C). Reforço Viral: BVDV, MMV armazenagem

[00193] 45,5 ml de cada material de partida foi reforçado com 4,5 ml de suspensão de estoque viral, e uma amostra de 1 ml foi tirada depois de 1 a 2 minutos de agitação. A amostra foi diluída imediatamente 1:3,16 (isto é, 1 volume de amostra mais 2,16 volumes de meio de cultura de célula) com o respectivo meio de cultura de célula e titulado. Subsequentemente, uma outra amostra de 3 ml foi tirada e filtrada através de uma membrana de PVDF de 0,45 μm. Um ml do material filtrado foi diluído imediatamente 1:3,16 com o respectivo meio de cultura de célula e titulado.

Ajuste de pH

[00194] Uma alíquota de 35 ml do material de partida reforçado com vírus foi ajustada a um pH de 4,9 ± 0,1 (ambas as rodadas) usando uma solução de HCl a 0,5 M sob agitação. O material foi depois dividido em duas alíquotas. Uma alíquota de 30 ml foi usada para a “Armazenagem em pH baixo” e uma alíquota de 5 ml foi usada para o “controle de manter a temperatura” (ver a seção “Controles de Manutenção”).

[00195] Uma outra alíquota de 10 ml do material de partida reforçado com vírus foi ajustada a um pH de 7,0 ± 0,1 usando uma solução de NaOH a 0,5 M, onde 5 ml do material ajustado no pH foram usados para o “Controle de manutenção do pH”.

[00196] Os 5 ml remanescentes do material ajustado no pH foram usados para o “Controle de manutenção de pH e Temperatura Combinados” (ver a seção “Controles de manutenção”). Controles de Manutenção

[00197] Para investigar o mecanismo de inativação viral, isto é pelo pH ou pela temperatura, três controles de manutenção foram armazenados sob condições diferentes:

[00198] Cada uma das alíquotas de 5 ml do material de partida reforçado em vírus e ajustado no pH (pH 7,0 ± 0,1) foi filtrada através de um filtro de membrana de PVDF de 0,45 μm em um criofrasco. Uma alíquota foi armazenada a 30 ± 1° C, junto com o material de processo reforçado e depois mantido nesta temperatura até o final do processo (Controle de Manutenção do pH, “pH HC”). A outra alíquota foi imediatamente armazenada de +2° C a +8° C por 27 dias ± 5 horas (Controle de Manutenção do pH e Temperatura Combinado, “c HC”).

[00199] A alíquota de 5 ml do material de partida reforçado em vírus, ajustados no pH (pH 4,9 ± 0,1) e filtrado em 0,45 μm (ver acima “Ajuste de pH”) foi imediatamente armazenada de +2° C a +8° C até o final do processo (Controle de Manutenção da Temperatura, “t HC”).

[00200] O volume mínimo de todos os controles de manutenção depois da filtração foi sempre maior do que 3 ml, assim, um volume apropriado para a titulação viral depois do período de armazenagem foi disponível.

Armazenagem em pH Baixo

[00201] A alíquota de 30 ml do intermediário de Subcuvia NG reforçado em vírus e ajustado no pH (pH 4,9 ± 0,1) foi filtrada através de um filtro de membrana de PVDF de 0,45 μm dentro de uma garrafa de vidro estéril de 50 ml. O volume mínimo do intermediário de Subcuvia NG depois da filtração foi sempre mais do que 24 ml. Assim, volume suficiente para a titulação viral depois do período de armazenagem foi disponível. Subsequentemente, a temperatura foi equilibrada a 30 ± 1° C sob agitação para frente e para trás em movimento lento usando um banho de água, com o banho de água regulado por uma temperatura controlada por criostato via um sensor de temperatura externa. O sensor de temperatura externo e um eletrodo de Pt 100 adicional foram colocados em uma garrafa de vidro de 50 ml equivalente àquela usada para a armazenagem em pH baixo, cada um delas cheia com 30 ml de água, que foi a quantidade máxima possível de material de processo reforçado depois da filtração. A temperatura foi registrada continuamente. Tão logo o material atingiu uma temperatura de 29° C, a amostra tomada foi iniciada. Cada amostra foi imediatamente diluída 1:3,16 (isto é 1 volume de amostra mais 2,16 volumes de meio de cultura de célula) com o respectivo meio de cultura de célula frio (armazenado de +2° C a +8° C) para impedir inativação adicional de vírus pelo pH baixo, e titulada. Em todas as rodadas o intermediário de Subcuvia NG foi armazenado sob agitação (para frente e para trás em movimento lento) a 30 ± 1° C durante todo o processo por 27 dias ± 5 horas, com uma redução da temperatura para 25 ± 1° C por pelo menos seis horas (> 6 h) uma vez a cada semana de armazenagem. Erroneamente, a diminuição na temperatura para 25 ± 1° C por 6 horas foi realizada duas vezes por semana na primeira e na segunda semana de armazenagem, isto é durante os dias 0 e 4 de armazenagem na primeira semana e durante os dias 7 e 10 de armazenagem na segunda semana do tratamento em pH baixo. Para debate, favor reportar-se à Seção 4.1.1 (“Perfil de Temperatura”). Outras amostras foram tiradas de acordo com o plano de amostragem (ver a Seção 3.2), imediatamente diluída como descrito acima e titulado. Depois da conclusão da armazenagem em pH baixo a 30° C ± 1° C, o pH foi determinado pela medição direta e pelo método recomendado pela Farmacopéia Européia (isto é, diluição a 1 % de proteína com 0,9 % de solução de NaCl).

Rodadas de Controle sem Vírus

[00202] Duas rodadas de controle foram realizadas como descrito para as rodadas reforçadas com vírus, onde o intermediário de Subcuvia NG não reforçado e filtrado em 0,45 μm é processado. Os mesmos parâmetros de processo se aplicam como especificado para as Rodadas 1 e 2 reforçadas com vírus, respectivamente, exceto que o material não foi ajustado no pH. A amostras para a determinação dos parâmetros bioquímicos foram tiradas de acordo com o plano de amostragem (ver a Seção 3.2).

[00203] A citotoxicidade do material de partida reforçado com simulado (reforçado 0,9:10 com meio BT para células infectadas *; a amostra é filtrada como descrito acima antes da titulação) e o intermediário de Subcuvia NG reforçado com simulado e ajustado no pH depois de filtração em 0,45 μm foi determinado. As amostras para a determinação de citotoxicidade foram tomadas de acordo com o plano de amostragem (ver a Seção 3.2).

[00204] * A composição do meio BT para células infectadas é como segue: DMEM (contendo 4,5 g/l de D-Glicose) + 1 % (v/v) de L-Glutamina (200 mM) + 1 % (v/v) de Sulfato de Gentamicina (10 mg/ml) + 1 % (v/v) de Piruvato + 2 % (v/v) de Bicarbonato de Sódio (7,5 %) + 1 % (v/v) de aminoácidos não essenciais + 5 % (v/v) de soro de cavalo.

Interferência Potencial

[00205] A interferência da matriz de amostra para amostras contendo intermediário de Subcuvia NG depois do ajuste do pH (pH 4,9 ± 0,1) com a detecção de vírus foi investigada em duplicata para cada linhagem de célula indicadora como segue: uma amostra de 1 ml, tirada do intermediário de Subcuvia NG reforçado com simulado pH ajustado e filtrado em 0,45 μm, foi diluída 1:3,16 (v/v) com o respectivo meio de cultura de célula frio (armazenado de +2° C a +8° C). Subsequentemente, 1,8 ml do material diluído foi reforçado 1:10 com 0,2 ml de suspensão de estoque viral pré- diluído* a um título calculado de 2,0 e 3,0 log10[TCID50/ml]. Depois de misturar, as amostras foram tiradas e tituladas imediatamente. Como um controle, 1,8 ml do respectivo meio de cultura de célula frio (armazenado de +2° C a +8° C) foi reforçado do exatamente do mesmo modo com suspensão de estoque viral pré-diluída antes da titulação. * O meio de cultura de célula apropriado [meio BT para células BT (BVDV), meio A9 para células A9 (MMV)] foi usado para a pré- diluição de suspensões de estoque viral. Plano de Amostragem Titulações Virais

[00206] As seguintes faixas de aceitação aplicam-se para a retirada de amostra: depois de 1 dia de armazenagem (± 1 hora), depois de 2 a 6 dias de armazenagem (± 2 horas), depois de 7 a 13 dias de armazenagem (± 3 horas), depois de 14 a 20 dias de armazenagem (± 4 horas), e depois de 21 a 27 dias de armazenagem (± 5 horas). Para os códigos de amostra, ver a Seção 1.1 (Esquema de Processo).

[00207] As amostras foram imediatamente tituladas sem armazenagem adicional.

§ As amostras foram imediatamente diluídas 1:3,16 com o respectivo meio de cultura de célula frio antes da titulação. Determinação da Citotoxicidade

[00208] As amostras foram imediatamente tituladas sem a armazenagem adicional.

§ As amostras foram imediatamente diluídas 1:3,16 com o respectivo meio de cultura de célula frio antes da titulação. Determinação da Interferência

[00209] As amostras foram imediatamente tituladas sem armazenagem adicional.

§ As amostras foram imediatamente diluídas 1:3,16 com o respectivo meio de cultura de célula frio antes da titulação. Determinação de Parâmetros Bioquímicos

[00210] As amostras foram tiradas apenas de cada rodada de controle não reforçada e armazenadas de +2 a +8° C até a análise.

1 Dados gerados durante a produção de 2 lotes “Aumentados” assim como do material feito de encomenda (Lote No IGSC64) também foram levados em conta para a avaliação do processo diminuído. 2 Dados gerados durante a produção de 2 lotes “Aumentados” também foram levados em conta para a avaliação do processo diminuído. 3 Com respeito ao estágio desenvolvimental do produto parece diferentemente aqueles dados de parâmetros bioquímicos depois de um período de armazenagem de 28 dias foram disponíveis. RESULTADOS E DEBATE

[00211] A eficácia e robustez da armazenagem em pH baixo e temperatura elevada de Subcuvia NG como uma etapa de inativação dedicada tanto para vírus envelopado em lipídeo quanto para não envelopado em lipídeo, foram investigadas com BVDV e MMV, usando um modelo de laboratório em escala reduzida desta etapa. Os parâmetros de validação e parâmetros bioquímicos foram definidos e medidos no processo em escala reduzida, e pela comparação dos resultados com as condições do processo de fabricação a equivalência dos dois processos foi estabelecida. Resultados para Validação e Parâmetros bioquímicos Parâmetros de Validação

[00212] A validade do procedimento em escala reduzida foi verificado pela determinação dos parâmetros críticos para a inativação viral, isto é, o pH do material de processo, a temperatura durante a armazenagem em pH baixo e o tempo de armazenagem.

[00213] Valor de pH antes da armazenagem em pH baixo e temperatura elevada

[00214] O pH do material de processo reforçado foi medido e ajustado a 4,9 ± 0,1 em todas as rodadas, como requerido e foi portanto dentro dos limites especificados no Plano de Estudo. Os valores de pH determinados depois da armazenagem são debatidos na Seção 4.1.2 (Outros Processos e Parâmetros Bioquímicos). Perfil de Temperatura

[00215] Para investigar a robustez da etapa de armazenagem no pH baixo e temperatura elevada contra variações de temperatura, a temperatura foi diminuída de 30° C ± 1° C para 25 ± 1° C por 6 horas uma vez a cada semana de armazenagem. A temperatura foi sempre dentro das faixas especificadas no Plano de Estudo. Entretanto, na primeira e na segunda semanas de armazenagem, a diminuição na temperatura para 25 ± 1° C por 6 horas foi erroneamente realizada duas vezes por semana, isto é, durante os dias 0 e 4 na primeira semana e durante os dias 7 e 10 na segunda semana. Visto que este incidente mudou o perfil de rodada para um cenário pior com respeito à inativação viral, a robustez da inativação viral foi ainda mais extensivamente investigada do que originalmente pretendido. Tempo de Armazenagem

[00216] A duração da armazenagem em pH baixo e em temperatura elevada não é especificada para o processo de fabricação de Subcuvia NG. Dependendo do resultado do estudo corrente, existem diversas opções: uma opção para a duração do tempo de armazenagem é de 21 a 22 dias; uma segunda opção pode ser de aproximadamente 28 dias. Para investigar a eficácia e robustez do tratamento em pH baixo sob condições menos favoráveis para a inativação viral todas as rodadas diminuídas foram realizadas abaixo dos limites inferiores do tempo de armazenagem possível; isto é, por 20 dias ± 4 horas para a primeira opção e armazenagem por 27 dias ± 5 horas para a segunda opção. O intermediário reforçado foi armazenado em pH baixo e temperatura elevada por 26 dias + 22 horas (MMV, ambas as rodadas) e por 27 dias + 1 hora (BVDV, ambas as rodadas). De modo a investigar a depuração viral depois de 3 semanas de armazenagem, as amostras para titulação viral foram tiradas depois de 20 dias + 1 hora de armazenagem para MMV e depois de 20 dias + 2 horas para BVDV.

[00217] O tempo de armazenagem foi dentro dos limites especificados para a escala reduzida, isto é, 20 dias ± 4 horas, e 27 dias ± 5 horas em todas as rodadas, que é abaixo dos limites inferiores correntemente considerados de tempo de armazenagem na fabricação. Outros Processo e Parâmetros Bioquímicos pH depois da armazenagem em pH baixo

[00218] A seguir da armazenagem em pH baixo, o valor de pH foi medido mais uma vez diretamente assim como de acordo com o método recomendado pela Farmacopéia Européia (EP), isto é, diluição a 1 % de proteína com solução de NaCl a 0,9 %. O pH medido pela medição direta depois do tratamento foi próximo ao valor de pH antes da armazenagem em pH baixo; isto é, as diferenças variaram de -0,07 a +0,04 (pH depois menos pH antes da armazenagem). O pH medido de acordo com o método da EP foi sempre 0,2 a 0,3 mais alto comparado com o método de medição direta. Este aumento leve dos valores de pH quando do uso do método da EP é típico para estes dois métodos diferentes na determinação do pH. Este fato também é considerado nos limites especificados na escala de fabricação, onde os limites para o pH depois do tratamento em pH baixo são de 4,4 a 4,9 quando determinados pela medição direta e de 4,6 a 5,1 quando determinados pelo método da EP. Distribuição do peso molecular (MSD)

[00219] A distribuição do peso molecular (pela análise de HPLC) foi investigada antes e depois da armazenagem para as duas rodadas de controle não reforçadas. Os resultados de teste foram comparados com três lotes “aumentados”, produzidos durante o estágio desenvolvimental de Subcuvia NG e para o material feito de encomenda IGSC64 (14 % assim como 20 % de concentração de proteína). O Lote IGSC64, que também é designado como um lote “Aumentado” não foi individualizado a uma armazenagem em pH baixo e temperatura elevada na fabricação, visto que material suficiente não foi disponível para esta etapa. Todos os resultados compararam bem entre si. Os Valores para Distribuição do Peso Molecular, especialmente a porcentagem de Monômeros IgG, foram próximos daqueles observados nas rodadas “Aumentadas”. Para a segunda rodada de controle, onde a concentração de monômeros de IgG depois da armazenagem foi uns poucos por centos mais baixos, é mencionado que material antes armazenagem já teve uma concentração comparativamente baixa de monômeros IgG, que também se aplica para o material testado dentro do processo “Aumentado”. Assim, os dados de distribuição do peso molecular sustentam a equivalência da escala reduzida com o processo em larga escala. Pureza de Gamaglobulina

[00220] A pureza da gamaglobulina (pela eletrofoerese em CA) de amostras das duas rodadas de controle não reforçadas foi determinada e comparada com os resultados obtidos de dois lotes “Aumentados” e do material fabricado de encomenda IGSC64 (14 % assim como 20 % de concentração de proteína, valores apenas antes do tratamento em pH baixo, para explicação ver acima). Todos os valores determinados quanto a pureza de gamaglobulina durante o processo em escala reduzida compararam bem com os resultados obtidos para os lotes “Aumentados” e foram dentro da precisão do ensaio (o desvio padrão relativo é de 1,5 %). Estes resultados demonstram a comparabilidade da escala reduzida para o processo de fabricação. Resultados para a Citotoxicidade da Titulação Viral

[00221] A citotoxicidade de intermediários obtidos antes da armazenagem em pH baixo e temperatura elevada foi investigada em rodadas de controle usando material reforçado com simulado ajustado ao respectivo pH como descrito para as rodadas reforçadas com vírus. Os intermediários de processo reforçados com simulado antes e depois do ajuste de pH mostrou apenas um efeito citotóxico muito fraco sobre as células usadas em todas as duas rodadas, exceto na rodada 2 nas células BT, onde o intermediário ajustado no pH não mostrou nenhum efeito citotóxico da diluição de 1,0 log10 e além. Nenhuma diferença significante na citotoxicidade foi observada para as rodadas reforçadas em vírus. Teste de Interferência

[00222] Os resultados de teste de interferência não apresentam nenhuma interferência significante da matriz da amostra com a detecção de títulos baixos de BVDV e MMV: As diferenças nos títulos virais entre os controles de meio de cultura de célula reforçados e os intermediários de Subcuvia NG reforçados foram entre -1,0 log10 a 0,1 log10, que está dentro da precisão do ensaio de titulação viral. Assim, os títulos obtidos durante as rodadas de inativação viral não foram distorcidas pelos efeitos de interferência e representam o título real da amostra. Inativação viral

[00223] Duas rodadas foram realizadas com cada um dos vírus BVDV e MMV, isto é a rodada 1 a 13,5 % de concentração de proteína, e a rodada 2 a 20,9 % de concentração de proteína. Ambas as rodadas foram realizadas no pH 4,9 ± 0,1 e a 30 ± 1° C, onde a temperatura foi diminuída para 25 ± 1° C por um mínimo de 6 horas uma vez por semana. A comparação dos resultados das duas rodadas não revelaram nenhuma diferença significante nas cinéticas de inativação viral entre as duas rodadas realizadas no limite superior e no inferior da concentração de proteína possível de Subcuvia NG.

[00224] Utilizando condições menos favoráveis para a inativação viral, isto é os limites inferiores de tempo de armazenagem e temperatura, assim como limites superiores de pH, a inativação significante de BVDV depois de 20 dias ± 4 horas de armazenagem e a inativação completa de todos os vírus que puderam ser reforçados no respectivo intermediário de Subcuvia NG depois de 27 dias ± 5 horas de armazenagem foi demonstrada para BVDV, independente das condições investigadas. Em ambas as rodadas a infectividade residual de BVDV pôde ser ainda detectada no dia 20. Entretanto, todos BVDV foram inativados até abaixo do limite de detecção pelo final dos 27 dias de armazenagem. Os fatores de redução para MMV demonstram uma contribuição substancial desta etapa de processo para a segurança viral do produto, também com respeito ao vírus não envelopado com lipídeo. Os títulos virais individuais e os fatores de redução para o vírus usado são debatidos em mais detalhes em mais detalhes mais abaixo. Além disso, ilustrações gráficas das cinéticas de inativação viral são dadas para cada vírus a seguir dos respectivos resultados-tabela. BVDV

[00225] BVDV foi inativado quase no limite de detecção (rodada 1) ou no limite de detecção (rodada 2) no dia 20 de armazenagem, fornecendo fatores de redução de 5,3 log10 e 5,5 log10 nas rodadas 1 e 2, respectivamente. Depois de 27 dias de armazenagem todo o BVDV reforçado no intermediário de Subcuvia NG foi inativado até abaixo do limite de detecção para ambas as rodadas, com fatores de redução de >6,6 log10, e >6,5 log10 nas rodadas 1 e 2, respectivamente. Nenhuma diferença significante pôde ser observada nas cinéticas de inativação das duas rodadas. Os intermediários tanto da rodada 1 (com 13,5 % de concentração de proteína)] quanto da rodada 2 (com 20,9 % de concentração de proteína) mostrou cinéticas de inativação comparáveis.

[00226] O tratamento em pH baixo em temperatura elevada demonstrou inativação eficaz de BVDV depois da armazenagem por 20 dias ± 4 horas, com um fator de redução médio calculado de 5,4 log10. Depois de 27 dias de armazenagem no pH baixo e temperatura elevada, a inativação completa de BVDV até abaixo do limite de detecção foi obtido, onde um fator de redução média de >6,6 log10 foi calculado. MMV

[00227] Para os fatores de redução de MMV de 2,9 log10 e 3,1 log10 foram calculados para as rodadas 1 e 2, respectivamente, depois de 20 dias de armazenagem em pH baixo e temperatura elevada. O fator de redução médio calculado é 3,0 log10. Depois de 27 dias de tratamento os fatores de redução em pH baixo de 3,4 log10 e 3,7 log10 foram obtidos, onde o fator de redução média calculado é de 3,6 log10. Estes fatores de redução demonstram uma contribuição substancial desta etapa de processo para o perfil de segurança viral do processo de fabricação com respeito ao Parvovírus, que são muito resistentes à inativação físico-química. As cinéticas de inativação viral em ambas as rodadas foi bifásica, com a inativação mais rápida durante os primeiros 7 dias e uma inativação um pouco mais lenta durante as seguintes três semanas. Controles de manutenção

[00228] Para investigar o mecanismo de inativação viral, isto é, seja mediado pelo pH ou pela temperatura ou por uma combinação dos dois, três controles de manutenção foram mantidos sob as respectivas condições.

[00229] Titulação do “Controle de Contenção combinado” (pH 7,0 ± 0,1) que foram mantidos de 2° C a 8° C por 27 dias ± 5 horas resultante tanto para vírus investigado em um título de vírus comparável com o material de partida reforçado em vírus, exceto para MMV na rodada 2, onde uma perda pequena no título (1,6 log10) foi observada.

[00230] A armazenagem a 30 ± 1° C e pH 7,0 ± 0,1 (“Controle de Contenção de pH”) mostrou que o vírus envelopado em lipídeo BVDV foi muito sensível à armazenagem em temperatura elevada. BVDV foi inativado por 4,6 log10 em ambas as rodadas. Também, o vírus não envelopado em lipídeo MMV foi inativado por 3,3 e 3,8 log10, na rodada 1 e rodada 2, respectivamente.

[00231] A titulação dos “Controles de Manutenção de Temperatura” (t HC) depois de uma armazenagem de 27 dias ± 5 horas em pH baixo e de 2° C a 8° C resultou para ambos os vírus investigados em um título viral comparável com o material de partida reforçado em vírus. Estes resultados demonstram que BVDV assim como MMV foram resistentes à armazenagem em pH baixo na faixa de 4,4 a 4,9 em temperatura baixa.

[00232] Quando juntos, os resultados dos três Controles de Manutenção sugerem que: • A temperatura seria o fator mais significante para a inativação de BVDV, com alguma contribuição do pH baixo (com base no fato de que o controle a 30 ± 1° C e pH neutro foi substancialmente, mas não completamente inativado depois de 27 dias). • Para a inativação de MMV, a temperatura julgada ser o único fator relevante como os títulos virais das amostras cinéticas de pH baixo depois de 27 dias foi virtualmente idêntico com o controle no pH neutro e 30° C. SUMÁRIO E CONCLUSÕES

[00233] No curso do presente estudo, um modelo em escala reduzida da armazenagem em pH baixo e temperatura elevada na fabricação de Subcuvia NG foi estabelecido e a sua equivalência para o procedimento de fabricação foi demonstrada pela determinação de vários parâmetros de processo. Além disso, uma comparação de parâmetros bioquímicos de intermediários do modelo em escala reduzida e o processo de fabricação sustentou ainda a equivalência de ambos os processos, indicando que os fatores de redução obtidos durante a escala reduzida são também válidos para a larga escala. Para investigar a robustez com respeito à inativação viral, o impacto de concentrações de proteína diferentes de Subcuvia NG foi investigado, o pH do material de partida reforçado foi ajustado ao limite superior comparado com o processo de fabricação, e o impacto de diminuições periódicas na temperatura foi investigado. Os fatores de redução viral e as cinéticas de inativação obtidos no corrente estudo demonstram que o vírus envelopado em lipídeo BVDV é eficaz e robustamente inativado pela armazenagem em pH baixo e temperatura elevada dentro de 27 dias. Também, depois da armazenagem em pH baixo e temperatura elevada por 20 dias uma inativação significante de BVDV com um fator de redução calculado médio de 5,4 log10 foi obtido para BVDV. Os fatores de redução médios calculados para o modelo de parvovírus MMV, isto é, 3,0 log10 depois de 20 dias de armazenagem e 3,6 log10 depois de 20 dias de armazenagem, mostram que esta etapa de processo contribui ainda para a segurança viral do processo de fabricação com respeito ao vírus de DNA não envelopado em lipídeo pequeno quanto à resistência psicoquímica alta [2], para um tempo de armazenagem de 20 assim como de 27 dias.

[00234] As concentrações de proteína investigadas mostraram as mesmas cinéticas de inativação tanto para MMV quanto para BVDV, sugerindo que o impacto da concentração de proteína sobre a capacidade de inativação viral não é significante para as soluções de imunoglobulina concentradas e os vírus BVDV e MMV.

[00235] É entendido que os exemplos e formas de realização aqui descritas são apenas para os propósitos ilustrativos e que as várias modificações ou mudanças à luz destes serão sugeridas às pessoas habilitadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido e escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes, e pedidos de patente aqui citados são por meio deste incorporados por referência em sua totalidade para todos os propósitos.

Claims

1. Método para preparar uma composição de imunoglobulina G (IgG) concentrada, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (A) concentrar uma primeira solução compreendendo IgG a uma concentração de proteína de 2% a 10% (p/v) por ultrafiltração utilizando um primeiro sistema de ultra-/diafiltração compreendendo uma primeira membrana de ultrafiltração, formando assim um primeiro concentrado de IgG; (B) diafiltrar o primeiro concentrado de IgG contra um tampão de diafiltração utilizando o primeiro sistema de ultra-/diafiltração compreendendo a primeira membrana de ultrafiltração, formando assim um primeiro diafiltrado de IgG; (C) concentrar o primeiro diafiltrado de IgG a uma concentração de proteína maior do que 20 % (p/v) por ultrafiltração, utilizando o primeiro sistema de ultra-/diafiltração compreendendo a primeira membrana de ultrafiltração, formando assim um segundo concentrado de IgG; (D) coletar o segundo concentrado de IgG a partir do primeiro sistema de ultra-/diafiltração; (E) lavar a primeira membrana de ultrafiltração pela recirculação de um tampão pós-lavagem através do primeiro sistema de ultra- /diafiltração, em que o primeiro sistema de ultra-/diafiltração é lavado com um volume de tampão pós-lavagem igual a pelo menos duas vezes o volume morto do primeiro sistema de ultra-/diafiltração, formando assim uma primeira solução de pós-lavagem de IgG; (F) transferir a primeira solução de pós-lavagem de IgG do primeiro sistema de ultra-/diafiltração para um segundo sistema de ultra- /diafiltração compreendendo uma segunda membrana de ultrafiltração, em que a área superficial da segunda membrana de ultrafiltração é menor do que a área superficial da primeira membrana de ultrafiltração; (G) concentrar a primeira solução de pós-lavagem de IgG a uma concentração de proteína maior do que 20% (p/v) por ultrafiltração, utilizando o segundo sistema de ultra-/diafiltração compreendendo uma segunda membrana de ultrafiltração, formando assim um terceiro concentrado de IgG; e (H) combinar o terceiro concentrado de IgG do segundo sistema de ultra-/diafiltração com o segundo concentrado de IgG, formando assim uma composição concentrada de IgG.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira solução compreendendo IgG é concentrada em (A) a uma concentração de proteína de 5 + 1% (p/v).

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira membrana de ultrafiltração é uma membrana com tela aberta.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira ou a segunda membrana de ultrafiltração apresenta um corte de peso molecular nominal (NMWCO) de 100 KDa ou menos.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira e a segunda membrana de ultrafiltração apresentam um corte de peso molecular nominal (NMWCO) de 100 KDa ou menos.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira ou a segunda membrana de ultrafiltração apresenta um corte de peso molecular nominal (NMWCO) de 90 KDa ou menos.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira e a segunda membrana de ultrafiltração apresentam um corte de peso molecular nominal (NMWCO) de 90 KDa ou menos.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira e a segunda membrana de ultrafiltração apresentam um mesmo corte de peso molecular nominal (NMWCO).

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tampão de diafiltração compreende de 0,2 M a 0,3 M de glicina e um pH 4,2 + 0,1.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo concentrado de IgG apresenta uma concentração de proteína de pelo menos 22% (p/v).

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a área superficial da segunda membrana de ultrafiltração não é maior do que um décimo da área superficial da primeira membrana de ultrafiltração.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de proteína da composição concentrada de IgG formada em (H) é maior do que 20% (p/v), e em que o método compreende ainda o ajuste da concentração da composição concentrada de IgG formada em (H) a cerca de 20% (p/v).

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH da composição formada em (H) é de 4,0 a 6,0.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda as etapas de: (I) lavar a segunda membrana de ultrafiltração pela recirculação de um tampão pós-lavagem através do segundo sistema de ultra- /diafiltração, formando assim uma segunda solução de pós-lavagem de IgG; e (J) ajustar a concentração de proteína da composição concentrada de IgG formada em (H) pela mistura de pelo menos uma porção da segunda solução de pós-lavagem de IgG na composição concentrada de IgG formada em (H).

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a IgG é IgG humana.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de: (A) concentrar uma primeira solução compreendendo IgG a uma concentração de proteína de 5 + 1% (p/v) por ultrafiltração utilizando um primeiro sistema de ultra-/diafiltração compreendendo uma primeira membrana de ultrafiltração, formando assim um primeiro concentrado de IgG, a primeira membrana de ultrafiltração apresentado um NMWCO de 60 KDa ou menos; (B) diafiltrar o primeiro concentrado de IgG contra um tampão de diafiltração utilizando o primeiro sistema de ultra-/diafiltração compreendendo a primeira membrana de ultrafiltração, formando assim um primeiro diafiltrado de IgG, o tampão de diafiltração compreendendo glicina e um pH de 4,2 + 0,1; (C) concentrar o primeiro diafiltrado de IgG a uma concentração de proteína maior do que 20 % (p/v) por ultrafiltração, utilizando o primeiro sistema de ultra-/diafiltração compreendendo a primeira membrana de ultrafiltração, formando assim um segundo concentrado de IgG; (D) coletar o segundo concentrado de IgG a partir do primeiro sistema de ultra-/diafiltração; (E) lavar a primeira membrana de ultrafiltração pela recirculação de um tampão pós-lavagem através do primeiro sistema de ultra- /diafiltração, formando assim uma primeira solução pós-lavagem de IgG, o tampão de pós-lavagem tendo um volume igual a pelo menos duas vezes o volume morto do primeiro sistema de ultra-/diafiltração; (F) coletar a primeira solução de pós-lavagem de IgG do primeiro sistema de ultra-/diafiltração em um segundo sistema de ultra- /diafiltração compreendendo uma segunda membrana de ultrafiltração, a segunda membrana de ultrafiltração apresentado um NMWCO de 60 KDa ou menos; (G) concentrar a primeira solução de pós-lavagem de IgG a uma concentração de proteína maior do que 20% (p/v) por ultrafiltração, utilizando o segundo sistema de ultra-/diafiltração compreendendo uma segunda membrana de ultrafiltração, em que a área superficial da segunda membrana de ultrafiltração não é maior do que um décimo da área superficial da primeira membrana de ultrafiltração, formando assim um terceiro concentrado de IgG; (H) combinar o terceiro concentrado de IgG do segundo sistema de ultra-/diafiltração com o segundo concentrado de IgG, formando assim uma composição concentrada de IgG; (I) lavar a segunda membrana de ultrafiltração pela recirculação de um tampão pós-lavagem através do segundo sistema de ultra- /diafiltração, formando assim uma segunda solução de pós-lavagem de IgG; e (J) ajustar a concentração de proteína da composição concentrada de IgG formada em (H) pela mistura de pelo menos uma porção da segunda solução de pós-lavagem de IgG na composição concentrada de IgG formada em (H).