PT2271382E - Ultrafiltração em dois andares/diafiltração - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ULTRAFILTRAÇÃO EM DOIS ANDARES/DIAFILTRAÇÃO"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A invenção presente diz respeito a métodos para preparar uma formulação proteica concentrada e composições que incluam uma tal preparação, em especial a métodos para preparar uma formulação concentrada de um produto de plasma, em especial a métodos para preparar e a composições concentradas que contenham IgG.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Utiliza-se tipicamente apenas um tipo de membrana de ultrafiltração para se conseguirem concentrações finais de produtos de plasma para formulação. A investigação demonstra que uma cassete de ultrafiltração consegue produzir concentrações mais elevadas. No entanto, devido a uma viscosidade mais elevada e uma maior concentração proteica, a recuperação do produto sofre uma forte diminuição uma vez que a membrana tende a colmatar-se ou a adquirir muitos resíduos. Também foram feitos estudos Também se demonstrou em estudos que alvejarem-se concentrações elevadas evita a recuperação da membrana por lavagem. 2 ΡΕ2271382

Seria portanto desejável proporcionar-se um método para se concentrar um produto de plasma de modo a se conseguirem concentrações elevadas enquanto se minimizariam as perdas de rendimento e o impacto sobre o período de processamento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Num aspecto, a invenção presente proporciona um método para se concentrar uma proteína a partir de uma solução que inclua a proteína. 0 método inclui: a) ultrafiltrar a solução utilizando uma primeira membrana para formar uma primeira solução de retentado incluindo a proteína a uma primeira concentração, em que a primeira membrana tenha um valor de corte em massa molecular suficiente para reter pelo menos uma parte da proteína presente na solução; b) diafiltrar a primeira solução de retentado com uma solução aquosa utilizando a primeira membrana para formar uma segunda solução de retentado incluindo a proteína a uma concentração semelhante à primeira; c) formular o segundo retentado incluindo a proteína diafiltrada com glicina e ajustar o pH; e 3 ΡΕ2271382 d) ultrafiltrar o segundo retentado utilizando uma segunda membrana para formar uma solução de retentado final incluindo a proteína a uma segunda concentração, em que a segunda membrana apresente um valor de corte a uma massa molecular de cerca do dobro do valor de corte da primeira membrana, e em que a segunda concentração é maior do que a primeira concentração.

Noutro aspecto, a invenção presente proporciona um método para concentrar uma proteína a partir de uma solução que a contenha. Este método inclui: a) ultrafiltrar a solução utilizando uma primeira membrana para formar uma primeira solução de retentado incluindo o produto do plasma a uma primeira concentração de cerca de 5 %, em que a primeira membrana apresente um valor de massa molecular de corte suficiente para reter pelo menos cerca de 90 % do produto do plasma; b) diafiltrar a primeira solução de retentado utilizando a primeira membrana com água para formar uma segunda solução de retentado incluindo o produto de plasma a uma concentração semelhante à da primeira; c) formular os cerca de 5 % de produto de plasma diafiltrado do passo b) a entre cerca de 0,16 e ΡΕ2271382 4 cerca de 0,30 M em glicina, em que a formulação também inclua ajustar-se o pH a cerca de 4,3; e d) ultrafiltrar-se a segunda solução de reten-tado utilizando uma segunda membrana para formar uma solução de retentado final incluindo o produto de plasma a uma segunda concentração de entre cerca de 19 e cerca de 21 %, em que a segunda membrana apresente um valor de corte em massa molecular de cerca do dobro do valor de corte em massa molecular apresentado pela primeira membrana, em que a segunda concentração seja maior do que a primeira concentração.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um exemplo ilustrando algumas concretizações de um diagrama de fluxo de processo representando esquematicamente um método em dois andares, de ultrafiltração/diafiltração para produzir uma formulação de alta concentração em IgG. A, esquema baseado em cromatografia de alta eficiência; e B, esquema baseado em tratamento com solvente/detergente (S/D). A Figura 2 mostra a viscosidade de uma solução de proteina como função da concentração em sal. A Figura 3 mostra a viscosidade de uma solução ΡΕ2271382 5 de proteína como função da concentração em proteína . A Figura 4 mostra a viscosidade de uma solução de proteína como função da temperatura. A Figura 5 mostra a viscosidade de uma solução de proteína como função da concentração em proteína . A Figura 6 mostra a viscosidade de uma solução de proteína como função do pH em diversos momentos . A Figura 7 mostra a extensão da formação de agregados como função do tempo, para diversas concentrações de proteína. A Figura 8 mostra a alteração da formação de agregados como função do pH em diversos momentos . A Figura 9 mostra a formação de dímero em função do pH em diversos momentos. A Figura 10 mostra a fragmentação de uma proteína em função do pH em diversos momentos. ΡΕ2271382 6

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

De acordo com a invenção presente, verificou-se surpreendentemente que uma metodologia progressiva em dois andares, de ultrafiltração/diafiltração, para concentrar uma proteina, consegue proporcionar composições que incluem a proteina concentrada. Por exemplo, em algumas concretizações, a invenção presente proporciona um novo conceito de concentração para se conseguir uma formulação final mais concentrada de um produto do plasma que pode ser adequada para utilização terapêutica ou profiláctica e/ou para administração por diversos métodos incluindo injecções subcutâneas.

Tal como se utiliza neste documento, pretende-se que o termo "proteina" inclua qualquer polipéptido recom-binante ou purificado, incluindo, mas não se limitando a, um polipéptido que ocorra naturalmente, modificado, ou sintetizado, e os seus multimeros, fragmentos (por exemplo, um fragmento biologicamente activo), ou variantes. A proteina pode ser derivada de um ser humano ou não humano incluindo, mas não se limitando a, cães, gatos, porcos, cavalos, vacas, aves, peixes, anfibios, répteis, transgénicos, etc. 0 termo "fragmento biologicamente activo" refere-se a um fragmento de uma proteina que mantenha pelo menos uma das funções da proteina da qual ele é derivado. Por 7 ΡΕ2271382 exemplo, um fragmento biologicamente activo de um anticorpo inclui um fragmento do anticorpo que se ligue a antigénio; um fragmento biologicamente activo de um receptor inclui um fragmento do receptor que ainda se ligue ao seu ligando; um fragmento biologicamente activo de um ligando a porção de um ligando que ainda se consiga ligar ao seu receptor; e um fragmento biologicamente activo de um enzima inclui a parte do enzima que ainda consegue catalisar uma reacção catalisada pelo enzima de comprimento inteiro.

Numa concretização, a proteína é um produto do plasma.

Tal como se utiliza neste documento, o termo "produto do plasma" refere-se a uma proteína que pode em geral ser caracterizada como uma componente do sangue ou de uma fracção do sangue de um ser humano ou de um não humano. Por exemplo, a fracção de γ-globulina do sangue inclui proteínas tais como imunoglobulinas e proteína C-reactiva. A fracção de globulina-αΐ contém proteínas tais como glicoproteína ácida al, al-antitripsina, e al-lipopro-teína. A fracção de globulina a2 contém proteínas tais como a2-macroglobulina, haptoglobulina, ceruloplasmina, e complemento específico para o grupo. A fracção de β-globulina contém proteínas tais como a transferrina, a hemopexina, a βΐ -lipoproteína, a β2-microglobulina, e componentes do complemento.

Em algumas concretizações, a proteína a ser ΡΕ2271382 concentrada é um anticorpo. 0 termo "anticorpo", tal como se utiliza neste documento, inclui, mas não se limita a, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, composições de anticorpos com especificidades poliepitópicas, anticorpos biespecificos, e diacorpos. Os anticorpos podem ser anticorpos inteiros, por exemplo, de um qualquer isotipo (por exemplo, IgG, IgA, IgE, IgM, IgD), ou seus fragmentos que se liguem a antigénios. Em geral, um fragmento de anticorpo inclui a região que se liga a antigénio e/ou a região variável de um anticorpo intacto. Deste modo, o termo fragmento de anticorpo inclui segmentos de uma molécula de anticorpo proteoliticamente clivados ou preparados de modo recombinante, que estejam/possam ligar-se selecti-vamente a uma proteina seleccionada. Incluem-se n os exemplos não limitativos destes fragmentos proteoliticos e/ou recombinantes, Fab, F(ab')2/ Fab', Fv, e anticorpos de cadeia singela (scFv) contendo um domínio V[L] e/ou V[H] ligado por um agente de ligação peptídico. Os scFv podem ser ligados por ligações covalentes ou não covalentes para formarem anticorpos contendo dois ou mais locais de ligação.

Podem preparar-se imunoglobulinas a partir do plasma de doadores normais não seleccionados, enquanto se podem preparar hiperimunoglobulinas a partir do plasma de doadores com elevados títulos em anticorpos contra antigénios específicos. Estes doadores hiperimunes podem ser identificados durante períodos de convalescença após uma infecção ou uma transfusão, ou eles podem ser especi-ficamente imunizados para produzirem os anticorpos pretendidos . 9 ΡΕ2271382

Em algumas concretizações, o produto de plasma é a imunoglobulina G (IgG). Um processo para a purificação de anticorpos a partir de fontes humanas ou de outras fontes está descrito na Patente U.S. No. 5.886.154 a favor de Lebing et al.,.

Para além da albumina e das imunoglobulinas, as lipoproteinas são outra classe de componentes do sangue. Por exemplo, podem distinguir-se três classes de lipoproteinas no sangue humano, αΐ-lipoproteína, pré-p-lipopro-teína, e Pi -lipoproteina, por exemplo de acordo com o seu comportamento numa electroforese. As apolipoproteínas, que são as componentes proteicas das lipoproteinas incluem as apolipoproteínas A-l, A-2, A-4, B-48, B-100, C, D, e E.

Diversas proteinas do sangue actuam como veículos, incluindo as que transportam iões metálicos, tais como a proteína que se liga a ferro, transferrina, e a proteína que se liga a cobre, ceruloplasmina, bem como a 9,5 S-al-glicoproteína. A pré-albumina e a globulina que se liga à tiroxina transportam a hormona da tiróide, e a transcortina transporta as hormonas esteróides. A hemoglobina é eliminada da circulação pela haptoglobina, e o heme está ligado à hemopexina. A globulina que se liga ao retinol liga-se à vitamina A. As transcobalaminas I, II, e III ligam-se à vitamina B12. As globulinas Go ligam-se às vitaminas D2 e D3. 10 ΡΕ2271382

Uma série de proteínas do sangue são enzimas, pró-enzimas, ou inibidoras de enzimas. As proteínas do sangue que são enzimas (por exemplo, proteinases) incluem, por exemplo, colinesterase, ceruloplasmina, plasminogénio, proteína C, e p2-glicoproteína I. Os pró-enzimas (isto é, zimogénios) são transformados em enzimas pela acção de enzimas específicos. Os inibidores de proteinases controlam este processo diminuindo ou eliminando a actividade destes enzimas específicos. O principal inibidor de proteinase no sangue humano é a αΐ-antitripsina (isto é, inibidor de al-proteinase; inibidor de αΐ-tripsina, prolastina) que protege os tecidos de uma digestão pela elastase. Outra classe de inibidores de proteinase que existem no sangue humano são as antitrombinas, tais como a antitrombina III, que evitam os efeitos da trombina. Ainda outro inibidor de proteinase que existe no sangue humano é o inibidor da Cl- esterase, que diminui ou elimina a actividade da Cl- esterase, que é a primeira componente do complemento, Cl, activada. Incluem-se em outras proteínas do sangue que são inibidores de enzimas a αΐ-antiquimotripsina, o inibidor de inter-a-tripsina, a a2-macroglobulina, e a a2-antiplasmina.

Algumas proteínas do sangue estão envolvidas no processo de coagulação (isto é, factores de coagulação). Os coágulos de sangue são formados através de uma cascata de enzimas, em que a forma activada de um factor catalisa a activação do factor seguinte resultando numa forte amplificação e numa resposta rápida a um traumatismo. Incluem-se 11 ΡΕ2271382 nos exemplos de factores de coagulação inactivados e activados, por exemplo, XII e Xlla; XI e Xla; IX e IXa; X e Xa; VII e Vila; II (protrombina) e Ia (trombina); I (fibri-nogénio) e Ia (fibrina). Outros factores de coagulação incluem quininogénio, calicreína, e os factores VIII, VlIIa, V, Va, XIII, e XlIIa. Diversos factores de coagulação também são referidos como proteínas dependentes da vitamina K, incluindo, por exemplo, o Factor II (protrombina), o Factor VII, o Factor IX, o Factor X, a Proteína C, e a Proteína S.

Algumas proteínas do sangue são componentes do complemento e constituem em conjunto o sistema complemento, que lisa micro-organismos e células infectadas formando cavidades na sua membrana plasmática. São conhecidas mais de 15 proteínas do complemento, incluindo Cl, Clq, Clr, Cls, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 e C9.

Incluem-se nos exemplos das glicoproteínas que se podem purificar a partir do sangue humano a glicoproteína ácida al, a2-glicoproteína, a2-macroglobulina, a2-HS-glicoproteína, αΐ-antiquimotripsina, al-antitripsina, fibrinogénio, fibronectina, pré-albumina, hemopexina, haptoglobina, transferrina, ceruloplasmina, muitos factores de coagulação, e muitas componentes do sistema complemento.

Num aspecto, a invenção presente proporciona um método para concentrar uma proteína de uma solução que inclua a proteína. 0 método inclui os seguintes passos: ΡΕ2271382 12 a) ultrafiltrar a solução utilizando uma primeira membrana para formar uma primeira solução de retentado incluindo a proteína a uma primeira concentração, em que a primeira membrana tenha um valor de corte em massa molecular suficiente para reter pelo menos uma parte da proteína presente na solução; b) diafiltrar a primeira solução de retentado com uma solução aquosa utilizando a primeira membrana para formar uma segunda solução de retentado incluindo a proteína a uma concentração semelhante à primeira; c) formular o segundo retentado incluindo a proteína diafiltrada com glicina e ajustar o pH; e d) ultrafiltrar o segundo retentado utilizando uma segunda membrana para formar uma solução de retentado final incluindo a proteína a uma segunda concentração, em que a segunda membrana apresente um valor de corte a uma massa molecular de cerca do dobro do valor de corte da primeira membrana, e em que a segunda concentração é maior do que a primeira concentração .

Numa concretização, a primeira concentração é de 13 ΡΕ2271382 pelo menos 1 % de proteína (peso/volume) , de um modo ilustrativo, entre cerca de 1 % e cerca de 15 %, entre cerca de 2 % e cerca de 12%, entre cerca de 3 % e cerca de 10 %, entre cerca de 4 % e cerca de 8 %, e entre cerca de 5 % e cerca de 6 % de proteína (peso/volume). Noutra concretização, a primeira concentração é de cerca de 5 % de proteína (peso/volume).

Numa concretização, a primeira membrana apresenta um corte a uma massa molecular suficiente para reter pelo menos 90 % da proteína presente na solução.

Noutra concretização, a solução aquosa é em água para injecção fria (CWFI).

Noutras concretizações, no passo c), formula-se a proteína diafiltrada a entre cerca de 0,16 e cerca de 0,30 M em glicina e ajusta-se o pH a cerca de 4,3.

Numa concretização, a segunda concentração é de entre cerca de 19 % e cerca de 21 %.

Em algumas concretizações, a proteína é IgG. I. A Solução A solução incluindo a proteína pode ser uma solução diluída contendo proteína, em que a proteína contida na solução tem que ser concentrada antes da 14 ΡΕ2271382 utilização em aplicações a jusante. Por exemplo, seguindo a concentração da proteina de acordo com a invenção presente, a solução de retentado final incluindo a proteina concentrada pode ser utilizada para preparar formulações adequadas para proporcionar uma injecção (por exemplo, subcutânea, intramuscular, endovenosa) da proteina a um sujeito (por exemplo, um ser humano ou não humano, incluindo, mas não se limitando a, cães, gatos, porcos, cavalos, vacas, aves, peixes, anfíbios, répteis, etc.). Preferivelmente, a solução incluindo a proteína que se pretende concentrar é um produto de pelo menos um esquema de purificação a montante de que resulta a solução (por exemplo, uma solução diluída contendo a proteína) com o teor pretendido em pureza de proteína e isenta de vírus. Numa concretização, a pureza da proteína da solução é de pelo menos cerca de 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 98 %, 99 %, ou mais.

Em algumas concretizações, a solução incluindo a proteína que se pretende concentrar é um eluído ou um permeado de uma cromatografia de uma matéria-prima que inclua a proteína.

Por exemplo, são bem conhecidas técnicas cromatográficas para purificar um produto de plasma e nelas se incluem, por exemplo, a cromatografia de permuta iónica (por exemplo, de permuta aniónica), a cromatografia de interacção hidrofóbica, a cromatografia de afinidade, a cromatografia de imuno-afinidade, e a cromatografia de 15 ΡΕ2271382 exclusão por dimensão. A matéria-prima pode ser uma fracção de plasma precipitada por um álcool/ρΗ tal como, por exemplo, uma fracção de Cohn, que é conhecida dos indivíduos com conhecimentos médios da técnica. Preferivelmente, a fracção de Cohn é a Fracção II + III, ou uma fracção obtida por subfraccionamento de II+III (por exemplo, a Fracção II) . Uma fonte da matéria-prima pode ser qualquer fonte que inclua o produto de plasma, incluindo, mas não se limitando a, fluido de ascites, meios de cultura de tecidos contendo o produto do plasma, fracções de plasma humano, e fracções de plasma de animal.

Numa concretização, a solução incluindo a proteína que se pretende concentrar é obtida após uma cromatografia de permuta aniónica da matéria-prima. Noutra concretização, utilizam-se diversas combinações de resinas de permuta aniónica dependendo da selectividade das resinas. Por exemplo, as resinas de permuta aniónica podem ser seleccionadas pela sua capacidade de remover selecti-vamente as impurezas existentes na matéria-prima (por exemplo, uma fracção de plasma precipitada com um álco-ol/pH) incluindo um produto de plasma. Numa concretização, a fracção de plasma precipitada com um álcool/ρΗ é a fracção de Cohn II+III ou a Fracção II, sob a forma de uma pasta.

Numa concretização, a matéria-prima inclui o produto do plasma, IgG. Preferivelmente, a matéria-prima (por exemplo, uma pasta de Fracção II+III) que inclui IgG e 16 ΡΕ2271382 se vai purificar é passada através de duas colunas de cromatografia de permuta aniónica ligadas em série (por exemplo, combinações de resinas Pharmacia Biotech Q & ANX e/ou de E. Merck TMAE Fractogel) para se obter a solução incluindo o produto de plasma. Podem seleccionar-se os materiais de permuta aniónica face à sua capacidade para removerem IgA, IgM, albumina e outras impurezas adicionais de proteína, da matéria-prima. Depois de carregadas, podem lavar-se as colunas com tampão de equilibragem. Podem recolher-se as fracções permeada e de lavagem a título de IgG purificado. Podem equilibrar-se ambas as colunas com o mesmo tampão e ao mesmo pH. Antes da cromatografia, pode submeter-se a matéria-prima a outros processos. A cromatografia de permuta iónica tira partido da distribuição superficial e da densidade da carga tanto sobre a proteína como sobre os meios de permuta iónica. Sem qualquer sujeição a nenhuma teoria, crê-se que a resina de permuta iónica apresenta uma superfície com carga positiva. A densidade de carga é específica da resina e é em geral independente do pH (adentro da gama de pH de trabalho da resina). Um permutador aniónico típico ligar-se-á a proteínas que têm uma carga líquida negativa (isto é, quando o pH da solução está acima do ponto isoeléctrico da proteína) . De facto, a superfície de uma proteína não apresenta uma carga singela; é em vez disso um mosaico de cargas positivas, negativas, e neutras. A estrutura da superfície é específica de uma dada proteína e será afectada por condições da solução tais como a força iónica 17 ΡΕ2271382 e o pH. Esta especificidade pode ser explorada para estabelecer condições especificas nas quais as proteínas individuais se ligarão ou se libertarão da resina de permuta aniónica. Ao estabelecer estas condições, as proteínas com superfícies ou propriedades de carga apresentando apenas ligeiras diferenças podem ser eficazmente separadas com elevado rendimento (por exemplo, >95 %).

As melhorias na estrutura dos suportes em resina para cromatografia têm tornado a cromatografia em larga escala numa alternativa prática face a métodos de purificação mais convencionais. As resinas rígidas permitem processar grandes volumes rapidamente (<5 horas), e a alta densidade de ligandos proporciona o aumento de capacidade necessário para processar grandes volumes.

Noutra concretização, a solução que inclui a proteína que se pretende concentrar é uma solução tratada com solvente/detergente incluindo a proteína. Por exemplo, pode isolar-se IgG a partir de Fracção II de Cohn dissolvida e tratada com um sistema de solvente/detergente para inactivação virai. Incluem-se nos sistemas de solvente/detergente, por exemplo, fosfato de tri-n-butilo/colato de sódio (TNBP/colato de sódio) e TWEEN/fosfato de tri-n-butilo (TNBP).

Numa concretização, o solvente/detergente é TNBP/colato de sódio. Por exemplo, pode ajustar-se uma solução de Fracções II+III ou de Fracção II, de Cohn, a uma 18 ΡΕ2271382 concentração final de 0,3 % em fosfato de tri-n-butilo (TNBP) e 0,2 % de colato de sódio. Depois da adição de solvente (TNBP) e de detergente (colato de sódio), pode aquecer-se uma solução da Fracção II+III ou da II, de Cohn, a uma temperatura óptima, por exemplo a 30°C, e manter-se a esta temperatura durante um período de tempo adequado talo como, por exemplo, não menos do que cerca de 6 horas. Depois do passo de tratamento com solvente/detergente, que envolve uma inactivação virai, podem remover-se os reagentes por precipitação e filtração, por exemplo, através de uma série de filtros graduados em porosidade até a um filtro de 0,2 ym para forma uma solução que contenha um produto do plasma (por exemplo, IgG). II. A primeira membrana

De acordo com a metodologia de filtração progressiva em dois andares da invenção presente, a solução incluindo a proteína é ultrafiltrada utilizando a primeira membrana para formar o primeiro retentado que tem a proteína à primeira concentração. Em geral, a retenção de uma molécula alvo por uma membrana de ultrafiltração é determinada por uma série de factores, incluindo a massa molecular do produto do plasma que se pretende concentrar. Outros factores, tais como por exemplo a forma molecular, a carga eléctrica, e as condições operativas, podem influenciar a determinação da massa molecular de corte da membrana. Preferivelmente, a primeira membrana apresenta um corte a uma massa molecular suficiente para reter pelo 19 ΡΕ2271382 menos uma parte da proteína presente na solução incluindo a proteína, por exemplo entre pelo menos 10 % e pelo menos cerca de 90 % ou mais da proteína presente na solução.

Em algumas concretizações, em que a proteína a concentrar é a IgG com uma massa molecular de cerca de 150 kilo Dalton (kDa), a solução incluindo a IgG é ultrafil-trada utilizando uma primeira membrana com um corte a uma massa molecular não superior a cerca de 100 kDa, ilustrativamente, não superior a cerca de 100, a cerca de 75, e a cerca de 50 kDa, para formar uma primeira solução de reten-tado incluindo o produto de plasma. Numa concretização, a primeira membrana apresenta um corte a uma massa molecular não superior a cerca de 50 kDa.

Após a ultrafiltração recorrendo à primeira membrana, preferivelmente, a primeira concentração da proteína na primeira solução de retentado é de cerca de 5 % de proteína (em peso/volume). Deste modo, quando a concentração da proteína na solução for inferior a cerca de 5 % de proteína (em peso/volume), a ultrafiltração da solução utilizando a primeira membrana é suficiente para se formar a primeira solução de retentado incluindo cerca de 5 % de proteína (em peso/volume). A primeira membrana pode ser qualquer membrana de ultrafiltração adequada, que pode ser seleccionada com base nas suas características de rejeição para a proteína que se pretende concentrar de acordo com a invenção presente. Em 20 ΡΕ2271382 algumas concretizações, a primeira membrana é feita de poliétersulfona (PES) ou de celulose regenerada. Incluem-se nos exemplos não limitativos da primeira membrana, as membranas BIOMAX™ e Ultracel de ultrafiltração, do módulo Pellicon, as membranas de purificação PT e PL do módulo Prostak, as membranas PT, PL, e Helicon de ultrafiltração do módulo de Ultrafiltração Spiral Wound, manufacturado pela Millipore Co., Sartocon™, e a membrana de ultra-filtração Ultrasart™, manufacturada pela Sartorius AG, as membranas de ultrafiltração NOVA™, OMEGA™, ALPHA™, REGEN™, SUPOR™, manufacturadas pela Pall Co., a membrana de ultrafiltração Filmtec™, manufacturada pela Dow Chemical Co., e a membrana de ultrafiltração Kvick™ manufacturada pela Amersham Pharmacia Biotech Inc. Numa concretização, a primeira membrana é uma membrana PES com um corte a uma massa molecular de 50 kDa, em que a proteína é IgG.

Em geral, um processo de ultrafiltração do tipo descontínuo ou um processo de ultrafiltração contínuo é levado a cabo de acordo com a estrutura da membrana de filtração e com a do dispositivo de filtração. E pode alimentar-se continuamente água purificada ao retentado para se manter um volume constante. Numa concretização, ultrafiltra-se a solução utilizando a primeira membrana por um tipo de ultrafiltração contínua em fluxo cruzado. Noutra concretização, leva-se a cabo o processo de ultrafiltração a entre cerca de 2°C e cerca de 15°C.

Numa concretização, a ultrafiltração através da 21 ΡΕ2271382 primeira membrana é baseada em tecnologia de caudal tan- gencial, que é bem conhecida na técnica. 0 caudal tan- gencial produz uma acção de "varrimento " utilizando a superfície da membrana, evitando deste modo que as macro-moléculas retidas na fase do retentado se acumulem à superfície da membrana, e minimizando deste modo a polarização da concentração e as incrustações na membrana. Em algumas concretizações, a solução que inclui a proteína é recir-culada através do topo da membrana, isto é, "tangencialmente" à superfície da membrana. III. Diafiltração

Depois da ultrafiltração utilizando a primeira membrana, diafiltra-se a primeira solução de retentado que inclui a proteína à primeira concentração (por exemplo, de cerca de 5 % em proteína (em peso/volume)), com uma solução aquosa utilizando a primeira membrana, para se formar uma segunda solução de retentado que inclui a proteína substancialmente à mesma primeira concentração, para se removerem quaisquer vestígios dos tampões cromatográficos. A solução aquosa pode ser água (por exemplo, água fria para injecção (CWFI)) ou um tampão adequado. A diafiltração do primeiro retentado pode ser um processo contínuo ou descontínuo. No método da diafiltração contínua, que também é referido como diafiltração a volume constante, a concentração da proteína no retentado não se altera substancialmente durante o processo de dialfil- 22 ΡΕ2271382 tração. Deste modo, o volume do retentado e a concentração da proteína não se alteram significativamente, se é que se alteram, durante o passo de diafiltração.

Numa concretização, a diafiltração da primeira solução de retentado utilizando a primeira membrana inclui utilizar-se um processo de diafiltração contínuo ou descontínuo por lavagem através de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7 volumes de retentado (isto é, pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7 "volumes de diafiltração (DV)") com, por exemplo, CWFI.

Opcionalmente, a seguir ao passo da diafiltração, da primeira solução de retentado, pode lavar-se a primeira membrana para se recuperar qualquer proteína residual que reste do lado do retentado da primeira membrana. A proteína residual, caso exista, pode ser combinada com o segundo retentado antes da ultrafiltração do segundo retentado, utilizando a segunda membrana.

Numa concretização, a diafiltração utilizando a primeira membrana é baseada em tecnologia de caudal tangencial tal como se descreveu acima.

IV. Ajustamento da glicina e/ou do pH A adição de glicina à solução diafiltrada incluindo a proteína pode proporcionar um efeito beneficiai em relação à tamponização e ao controlo do pH da solução em 23 ΡΕ2271382 processamento, embora a proteína ela própria também possa exercer a sua capacidade tamponizante. Outro benefício da introdução da glicina nesta altura é diminuir ou elimi9nar a criação de espécies agregadas por efeito de qualquer ajustamento do pH.

Antes de se ultrafiltrar a segunda solução de retentado incluindo a proteína diafiltrada, formula-se o segundo retentado com glicina e ajusta-se-lhe o pH. Preferivelmente, ajusta-se o pH do segundo retentado abaixo de um valor para o pH alvejado final (por exemplo, cerca de 0,25 unidades abaixo do pH alvejado). Numa concretização, o pH do segundo retentado é ajustado a um pH de entre cerca de 4,2 e cerca de 4,3.

Em determinadas concretizações, uma composição farmacêutica é uma formulação aquosa ou líquida incluindo um tampão acetato com um pH de cerca de 4,0-5,5, um poliol (poliálcool), e opcionalmente, um tensioactivo, em que a composição não inclua um sal, por exemplo, cloreto de sódio, e em que a composição seja isotónica com o paciente. V. A segunda membrana

Preferivelmente, o passo de se ultrafiltrar o segundo retentado, que foi formulado com glicina e cujo pH foi ajustado após a diaf iltração, é levado a cabo recorrendo a uma unidade de ultraf iltração que em geral inclui cartuchos de fibras ocas da segunda membrana, em que - 24 - ΡΕ2271382 a segunda membrana tem um corte a uma massa molecular de cerca do dobro da massa molecular de corte da primeira membrana. Numa concretização, em que a proteína é IgG, a massa molecular de corte da segunda membrana é de cerca de 100 kDa, em que a primeira membrana apresenta uma massa molecular de corte de 50 kDa. Noutra concretização, em que a proteína é IgG, a solução do retentado final inclui IgG à sua segunda concentração, em que a segunda concentração seja de pelo menos o dobro, o triplo, o quádruplo, ou mais, do valor da primeira concentração. Numa concretização, em que a proteína é IgG, a solução de retentado final inclui pelo menos 19 % de IgG (em peso/volume).

Opcionalmente, enxagua-se a segunda membrana e recupera-se também qualquer proteína residual retida pela segunda membrana. A solução final de retentado incluindo a proteína concentrada pode ser mais processada até à formulação de um líquido estável. Por exemplo, nos casos em que a solução final de retentado inclua IgG concentrado de acordo com a invenção presente, pode processar-se mais a solução até a formulação de um líquido estável, por exemplo, tal como se descreveu na Patente U.S. N°. 4.396.608 a favor de Tenold et al., ou outra formulação final apropriada (por exemplo uma formulação liofilizada). A título de mais um exemplo de uma formulação líquida incluindo IgG, o volume do retentado final incluindo IgG concentrado pode ser ajustado para se obter um valor de pelo menos 16 % de IgG (em peso/volume) , 25 ΡΕ2271382 e, opcionalmente, pode armazenar-se este material estéril durante um periodo de tempo, por exemplo não menos de 21 dias, suficiente para diminuir a actividade anti-comple-mento ou para inactivar vírus envolvidos.

Numa concretização, a ultrafiltração recorrendo à segunda membrana é baseada na tecnologia do caudal tangencial tal como se descreveu acima. A invenção presente será ilustrada em mais pormenor através de Exemplos,

EXEMPLOS

Exemplo 1

Purificação de IgG a partir da pasta com fracções II+III de Cohn

Dissolve-se a pasta das fracções II+III em 12 volumes de água purificada a 5°C. Ajusta-se o pH da mistura a 4,2 com ácido acético, e misturou-se durante 1 hora. Neste passo dissolve-se o IgG.

Ajusta-se então o pH da mistura a pH 5,2 com NaOH e caprilato de sódio (a "alteração do pH"). Proteínas e lipidos precipitam. Clarifica-se a mistura por filtração para remover os precipitados que interfeririam com a inactivação de virus. Ajusta-se a concentração em caprilato 26 ΡΕ2271382 a 20 mM a pH 5,1, e incuba-se a mistura durante 1 hora a 25°C para se inactivarem virus envoltos.

Filtra-se a mistura para se produzir uma solução limpida para cromatografia. Ajusta-se a condutividade da solução limpida a entre 2,0 e 3,0 mS/cm utilizando água purificada. Ajusta-se o pH da solução limpida a entre 5,0 e 5,2 seguindo o ajustamento da condutividade.

Exemplo 2

Cromatografia

Carrega-se directamente a solução limpida acima sobre duas colunas de permuta aniónica (uma de permuta aniónica forte, seguida por uma de permuta aniónica fraca) ligadas em série. 0 IgG flui através da coluna enquanto as impurezas (incluindo o caprilato) ficam ligadas às duas colunas aniónicas. Obtêm-se purificações satisfatórias com combinações das resinas Pharmacia Biotech Q & ANX e E. Merck TMAE Fractogel.

Aplica-se directamente a solução limpida que inclui o IgG a purificar sobre o primeiro permutador aniónico que se equilibra com acetato de sódio 20 mM a pH 5,1. Segue-se uma aplicação da fracção que não se liga (e que flui pela coluna) da primeira coluna de permuta aniónica directamente sobre uma segunda coluna de permuta aniónica. Esta coluna também é equilibrada com tampão de 27 ΡΕ2271382 acetato de sódio 20 mM a pH 5,1. Carrega-se tipicamente a solução de proteina sobre a primeira coluna a uma razão de 50-110 mg IgG/mL de resina empacotada na coluna. Carrega-se tipicamente a solução de proteína sobre a segunda coluna a uma razão de 75-95 mg IgG/ml de resina empacotada. Também se ajustam as razões de proteína em relação a resina para além destes limites, mas isto pode ter um impacto sobre o rendimento e o grau de pureza. À solução de proteína seguem-se cerca de 2 volumes de coluna do tampão para a equilibrar, que lava todo o IgG não ligado separando-o das colunas. A fracção não ligada incluindo IgG altamente purificado é recolhida numa solução incluindo o produto do plasma (isto é, o IgG) que se pretende concentrar.

Exemplo 3

Ultrafiltração/Diafiltração em dois andares (UF/DF) A solução incluindo o IgG (isto é, a solução que passa pela primeira coluna de cromatografia) é concentrada a cerca de 5 % de IgG (em peso/volume), a título de material a granel, utilizando uma membrana de separação grosseira em poliétersulfona com um corte a uma massa molecular de4 50 kDa. A temperatura da solução concentrada é mantida a entre 2°C e 12 °C. Após a diafiltração da solução a 5 % com CWFI, enxagua-se o sistema e adiciona-se o material recuperado ao material a granel. Formula-se então a solução concentrada a 0,25 M em glicina, por adição 28 ΡΕ2271382 de glicina seca em pós, e ajusta-se o pH consoante necessário. 0 desempenho da membrana filtrante não é afectado (por incrustação ou entupimento) uma vez que a proteína apenas tem uma concentração de 5 % (em peso/volume). A seguir ao passo de formulação, transfere-se então a solução a 5 % em glicina 0,25 M para uma segunda unidade de ultrafiltração para uma concentração adicional utilizando uma membrana de fibras ocas com corte a uma massa molecular de 100 kDa. Concentra-se o material até pelo menos 19 o 0 em IgG (em peso/volume). Antes da formulação final (por exemplo, ajustamento da formulação líquida a á 16 % de IgG (em peso/volume), da adição das lavagens e do ajustamento do pH, caso seja necessário) filtra-se a IgG de modo a esterilizá-la.

Exemplo 4

Fluido passando uma UF/DF em dois passos, à Macroescala laboratorial com Coluna Q/ANX

Concentrou-se o fluido passando através de uma coluna Q/ANX a uma concentração de cerca de 5 % de IgG. Diafiltrou-se o material com pelo menos 7 volumes de água para injecção.

Transferiu-se o diafiltrado a 5 % para um recipiente de formulação para o ajustamento do pH e a adição da glicina. O alvo para ajustamento do pH era de 29 ΡΕ2271382 entre 4,15 e 4,25. Ajustando o material a um pH neste intervalo, permitia conseguir-se consistentemente um pH de 4,50 (na gama de entre 4,0 e 5,0) para o material a granel estéril. As soluções para ajustamento do pH incluiam soluções de HC1 0,5 Me de NaOH 0,5 M.

Durante o processo de formulação, adicionou-se glicina seca ao material proveniente da diafiltração para se levar a concentração da solução a cerca de 0,25 M em glicina. A concentração em glicina de 0,25 M no passo de pré-final de ultrafiltração (UF) permitia obter-se a gama isotónica alvejada de 240 - 400 mOsm/Kg para o material a granel estéril. O pH e os parâmetros de glicina no passo pré-final de UF evitava a necessidade de se reajustar o pH ou a de se adicionar mais glicina em alturas mais a jusante no processo.

Uma vez completado o processo de formulação, filtrou-se o material através de um filtro KWSS Millipore, um filtro Milligard comercialmente disponível de 0,5 + 0,2 micron utilizado para remover quaisquer detritos antes da concentração final com os cartuchos Koch de fibras ocas (Koch Membrane Systems, Inc., Wilmington, MA). Filtrou-se o material formulado com glicina através do filtro KWSS e para o recipiente de fornecimento da ultrafiltração (UF) pelos cartuchos de fibras ocas Koch. Completada a filtração, utilizou-se um tampão de enxaguação com glicina para lavar o recipiente de formulação, as condutas, e o filtro, para se recuperar material residual com proteína. O 30 ΡΕ2271382 tampão com glicina utilizado durante este processo era 0,25 M em glicina ajustado a um pH alvo de entre 4,0 e 5,0.

Completou-se o passo de concentração final por UF utilizando cartuchos Koch de fibras ocas (Modelo # CTG.1"HF1.0-43-PM100-PB). A escala utilizada para este trabalho de desenvolvimento em macroescala laboratorial assegurava uma área de membrana de 0,lm2. Concentrou-se o material formulado até cerca de 20 %. A gama de pressões de alimentação estabelecida para o processo foi de 25 a 27 psig (alvo: 26 psig) . A gama de pressões do retentado era de 10 a 12 psig (alvo: 11 psig). A gama de temperaturas era de entre 2°C e 20°C.

Utilizou-se um banho de glicol para controlar a temperatura. Durante a parte terminal do passo de concentração final, em que o material do retentado se tornava mais viscoso, as temperaturas do processo atingiram valores de 18°C mas nunca excederam 20°C. Não se observaram condições adversas enquanto se operava na parte superior da gama de entre 2°C e 20°C.

Depois de se concentrar o material a cerca de 20 %, drenou-se o sistema e depois enxaguou-se com o tampão com glicina 0,25 M para se recuperar proteína residual. 0 método de lavagem que se utilizou recorria a uma passagem simples enxaguando-se com uma quantidade especificada do tampão 0,25 M em glicina. A quantidade de fluido de lavagem pode depender da escala a que o processo é conduzido e pode 31 ΡΕ2271382 ser limitada a um volume que não dilua demais o material no processo. A concentração pretendida para o concentrado de UF depois de diluido era de 18 %. Esta concentração alvo permitia utilizar-se mais tampão de lavagem nos passos de Granel Estéril Inicial (ISB) e de Granel Estéril Final (FSB) do processo. Levaram-se a cabo duas lavagens do sistema em separado após a concentração. A maior quantidade de proteína residual foi recuperada durante a primeira enxaguação. Os fluidos das enxaguações 1 e 2 foram adicionados de novo ao material concentrado de UF para se levar a concentração até cerca de 17,5 %.

Misturou-se então o concentrado por UF diluído e filtrou-se para o esterilizar utilizando um filtro Millipore Express de Esterilização com Alta Capacidade (SHC) . Incluem-se nas opções para esterilização por filtração pré-clínica, clínica e em produção comercial, a utilização de uma versão do filtro SHC que seja autoclavável ou tratável por irradiação gama. Além disto, pode combinar-se ISB e filtrar-se para esterilização uma maior quantidade de granel estéril final. Misturarem-se granéis para se fazer a alimentação da Máquina para Enchimento Estéril (SFF) vai diminuir as perdas de rendimento para as operações de enchimento.

Completadas as operações de enchimento, pode incubar-se o material a entre 23°C e 27°C (alvo: 24°C) durante no mínimo 21 dias mas não excedendo 28 dias. 0 32 ΡΕ2271382 processo de incubação pode ser o mesmo ou ser alterado dependendo, por exemplo, dos resultados de validação virai.

Exemplo 5

Avaliação das Cassetes de Filtração A escala utilizada para o trabalho de desenvolvimento/macroescala laboratorial foi de uma área de membrana de 0,lm2 e a gama operacional de temperaturas para a UF/DF era de entre 2°C e 20°C. Utilizou-se no processo material proveniente de um processo de produção IGIV. A matéria-prima incluia o fluido proveniente de uma coluna Q/ANX, materiais 5 % pré-diafiltração, e 5 % após a diafiltração.

Incluiram-se nas cassetes avaliadas cassetes Millipore 50 kD e 100 kD com diferentes opções de grelhas. Também se examinaram filtros de 70 kD (Pall Inc., East Hills, NY) . A Pressão Trans Membrana (TMP) óptima determinada foi de 15 psig (pressão de alimentação de 25 psi e pressão do retentado de 5 psi) . A Pressão Trans Membrana (TMP) óptima determinada para as cassetes Millipore de 50 kD era de 17,5 psig (pressão de alimentação de 25 psi e pressão do retentado de 10 psi) . A Pressão Trans Membrana (TMP) óptima determinada para as cassetes Pall de 70 kD era de 20 psid (pressão de alimentação de 20 psi e pressão do retentado de 0 psi). 33 ΡΕ2271382

Exemplo 6

Purificação de IgG a partir do meio de cultura de células

Ajustam-se em primeiro lugar os meios de crescimento de linhas de células contendo anticorpos monoclonais segregados aos valores mais apropriados de pH e de condutividade. Isto é conseguido por diafiltração contra água purificada enquanto se ajusta o pH a 4,2 com ácido acético. Ajusta-se a condutividade da solução a menos do que 1,0 mS. Consegue-se a purificação e a concentração do anticorpo monoclonal seguindo os passos acima.

Exemplo 7

Efeito de Diversos Parâmetros sobre a Viscosidade, a Formação de Agregados, a Fragmentação, e a Formação de Dímeros

Com base nos dados gerados, verificou-se que aumentando a quantidade de glicina na formulação não se afectava a concentração final em proteina. Consegue atingir-se aproximadamente a mesma concentração mais elevada em proteina na solução formulando a solução utilizando glicina numa gama de entre 0,05 M e 0,3 M. Quando a concentração da solução de proteina é conseguida na presença de água em vez de glicina, a solução final de proteina é cerca de 3-4 % unidades, em peso/volume, menos concentrada. 34 ΡΕ2271382

Além disto, não houve alteração da viscosidade de uma solução da proteína IgG quando foi formulada com glicina adentro da gama de 0,05 M a 0,5 M. Por exemplo, as viscosidades das diversas formulações de soluções de IgG, com uma concentração de 16 % em peso/volume e pH 4,2, a entre 0,2 M e 0,5 M em glicina, permaneciam iguais a 7,9 centipoise (cP) (veja-se, por exemplo, a Figura 2).

Além disto, outros propuseram que a adição de NaCl a um tampão de formulação pode diminuir apreciavelmente a viscosidade de uma solução. No exemplo apresentado neste documento, com anticorpos derivados do plasma (IgG), a adição de NaCl ao tampão de formulação, em quantidades de entre 0,05 M e 0,3 M, aumentava a viscosidade da solução de proteína em até 2,6 cP (de 7,9 cP -sem NaCl- a 10,5 cP com NaCl 0,3 M, numa solução a 16 % em peso/volume em glicina 0,2 M, a pH 4,2, de IgG) (Figura 2).

Tal como se ilustra na Figura 3, a viscosidade de uma solução de proteína pode ser expressa como uma função polinomial da 3a ordem, dependente da concentração em proteína. Para se determinar a dependência da viscosidade em função da temperatura, testaram-se duas concentrações de proteína que tinham o mesmo pH e a mesma composição de tampão. Tal como se ilustra na Figura 4, a dependência da viscosidade em relação à temperatura é afectada pela concentração em proteína (por exemplo, existe uma dependência mais pronunciada da viscosidade para a amostra a uma maior concentração do que para o produto diluído). 35 ΡΕ2271382

Além disto, a presença de glicina permitiu atingir concentrações maiores em proteína. 0 ponto final da concentração conseguida na presença de quer água, quer glicina, está ilustrada na Figura 5 (DF = diafiltrada) , em que se mostra que a presença de glicina proporciona atingir-se uma muito maior concentração final em proteína. 0 pH da solução foi mantido igual em ambos os processos (cerca de 4,2), enquanto a viscosidade as medições era sempre medida a 20°C. A concentração do ponto final foi atingida quando o caudal do retentado no sistema UF/DF parava. em peso/volume) e a mesma

Além disto, a dependência da viscosidade em função do pH da proteína está ilustrada na Figura 6 para diversas soluções contendo as mesmas concentrações em proteína (17 % em peso/volume). Ao longo do tempo, a viscosidade da amostra não se alterou, mantendo-se praticamente no mesmo valor, excepto quanto às variações normais de esperar quando se manipulam soluções com concentrações elevadas em proteína nas condições experimentais de medição. Por outro lado, crê-se que a formação de agregados é pelo menos dependente da concentração em proteína, a temperaturas semelhantes, do pH e das condições de composição do tampão. Portanto, a Figura 7 mostra os resultados de experiências conduzidas a diversas concentrações em proteína, destinadas a avaliar a extensão da formação de agregados em condições controladas. E a Figura 8 mostra a dependência da formação de agregados em relação ao pH da formulação para diversas amostras contendo a mesma concentração em proteína (17 % 36 ΡΕ2271382 composição do tampão (0,2 M em Gly) , o longo do período de um ano. Estes resultados sugeriam pelo menos que a formação de agregados consegue ser reprimida pelo pH da formulação. As formulações a pH mais elevados podem ser menos favoráveis face à formação de agregados.

Além disto, tal como consta da Figura 9, o teor em dímeros presentes correlaciona-se com o aumento do pH das formulações. Para uma série de amostras em condições semelhantes de concentração em proteína, em composição do tampão e em temperatura, a população de dímero presente numa amostra pode ser praticamente triplicada modificando o pH da formulação em 1 unidade. Além disto, o teor de dimerização mudou ao longo do tempo de um modo previsível, em função do pH e do período de tempo de armazenagem decorrido.

Por último, controlando o pH da solução de proteína, os teores de fragmentação da molécula de IgG podem ser manipulados. A Figura 10 mostra a resposta em função do período de tempo decorrido (de até um ano) em termos de fragmentação das moléculas de IgG numa solução a 17 % (em peso/volume) armazenada a 25°C, em função do seu pH. Para além de retardar o aparecimento de fragmentos, um aumento do pH também diminuía a velocidade actual de formação dos fragmentos.

Lisboa, 30 de abril de 2013

Claims (12)

1. ΡΕ2271382 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para concentrar uma proteína de uma solução que inclui a proteína, em que o método compreende: a) ultrafiltrar a solução utilizando uma primeira membrana para formar uma primeira solução de retentado incluindo o produto do plasma a uma primeira concentração de cerca de 5 %, em que a primeira membrana apresente um valor de massa molecular de corte suficiente para reter pelo menos cerca de 90 % do produto do plasma; b) diafiltrar a primeira solução de retentado utilizando a primeira membrana com água para formar uma segunda solução de retentado incluindo o produto de plasma a uma concentração semelhante à da primeira; c) formular os cerca de 5 % de produto de plasma diafiltrado do passo b) a entre cerca de 0,16 e cerca de 0,30 M em glicina, em que a formulação também inclua ajustar-se o pH a cerca de 4,3; e d) ultrafiltrar-se a segunda solução de retentado utilizando uma segunda membrana para formar uma solução de retentado final incluindo o produto de plasma a uma segunda concentração de 2 ΡΕ2271382 entre cerca de 19 e cerca de 21 %, em que a segunda membrana apresente um valor de corte em massa molecular de cerca do dobro do valor de corte em massa molecular apresentado pela primeira membrana, em que a segunda concentração seja maior do que a primeira concentração. 2. 0 método da reivindicação 1, em que a proteina seja um produto do plasma. 3. 0 método da reivindicação 1, em que a primeira membrana seja uma membrana grosseira em poliéter-sulfona, com corte a uma massa molecular de 50 kDa.
2. 4. O método da reivindicação 1, em que a primeira concentração seja de cerca de 5 % de proteina (em peso/volume).
3. 5. O método da reivindicação 1, em que a primeira solução seja uma água.
4. 6. O método da reivindicação 1, em que o exci-piente seja glicina.
5. 7. O método da reivindicação 1, em que a segunda membrana seja uma membrana de fibras ocas.
6. 8. O método da reivindicação 1, em que a segunda membrana apresente um corte a uma massa molecular de 100 kDa. 3 ΡΕ2271382 9. 0 método da reivindicação 1, em que a segunda concentração seja de pelo menos cerca de 19 % de proteína (em peso/volume).
7. 10. O método da reivindicação 1, em que a primeira membrana apresente uma massa molecular de corte suficiente para reter pelo menos 90 % da proteína presente na solução.
8. 11. O método da reivindicação 4, em que a primeira concentração seja de cerca de 5 %, em que, no passo c) , a proteína diafiltrada que seja de cerca de 5 % seja formulada a entre cerca de 0,16 e cerca de 0,30 M em glicina, e o pH seja ajustado a cerca de 4,3.
9. 12. Um método para concentrar uma proteína a partir de uma solução que inclua a proteína de acordo com o método 1, em que o método compreende: a) ultrafiltrar a solução utilizando uma primeira membrana para formar uma primeira solução de retentado incluindo o produto do plasma a uma primeira concentração de cerca de 5 %, em que a primeira membrana apresente um valor de massa molecular de corte suficiente para reter pelo menos cerca de 90 % do produto do plasma; b) diafiltrar a primeira solução de retentado utilizando a primeira membrana com água para 4 ΡΕ2271382 formar uma segunda solução de retentado incluindo o produto de plasma a uma concentração semelhante à da primeira; c) diafiltrar a solução de retentado utilizando uma primeira membrana com água para formar uma segunda solução de retentado incluindo a proteína aproximadamente a uma primeira concentração; d) formular a proteína diafiltrada a cerca de 5 % do passo b) a entre cerca de 0,16 e cerca de 0,30 M em glicina, em que a formulação inclua ajustar-se o pH a cerca de 4,3; e
10. 13. O método da reivindicação 1 ou 12, em que a proteína seja IgG.
11. 14. O método da reivindicação 13, em que a primeira membrana apresente um corte a uma massa molecular de entre cerca de 25 kDa e cerca de 75 kDa.
12. 15. O método da reivindicação 14, em que a primeira membrana apresente um corte a uma massa molecular de cerca de 50 kDa, em que a segunda membrana apresente um corte a uma massa molecular de cerca de 100 kDa. Lisboa, 30 de abril de 2013