AT405739B - Verfahren zur reinigung von antithrombin iii - Google Patents
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Description
ΑΤ 405 739 Β
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Reinigung von Antithrombin III.
Antithrombin III (ΑΤ III) ist ein plasmatisches Protein, das gerinnungshemmend wirkt, indem es Thrombin, die Faktoren IXa, Xa, Xla und Xlla inhibiert. AT Ill-Mangel oder hereditäre Thrombophilie ist eine autosomaldominante erbliche Erkrankung mit Thrombose- bzw. Embolieneigung infolger verminderter Bildung von ΑΤ III.
Erworbener AT Ill-Mangel kann z.B. bei Verbrauchskoagulopathien (DIC), Sepsis, Leberzirrhose oder beim nephrotischen Syndrom auftreten.
Ebenso kann es bei Herzklappenprothesen, postoperativen, thromboembolischen Komplikationen, bei der Östrogentherapie oder bei der Asparaginasetherapie zu AT Ill-Mangelerscheinungen kommen. AT III hat eine hohe Affinität zu Heparin und Heparinoiden, weshalb bei der Herstellung von reinen Antithrombin Ill-Präparaten eine Abtrennung des Heparins oder des Heparinoids erforderlich ist.
Gemäß der EP 0 307 002-A1 wird die Spaltung dieses AT Ill/Heparin- bzw. AT Ill/Heparinoid-Komplexes mit immobilisiertem Protamin vorgenommen, wobei Heparin am immobilisierten Protamin gebunden und AT III aus dem Überstand gewonnen wird. Der AT Ill/Heparin- bzw. AT Ill/Heparinoid-Komplex wird vor der Behandlung mit dem immobilisierten Protamin durch Adsorption an einem Ionenaustauscher und Eluierung von unerwünschten Proteinen mittels einer Salzlösung bei pH 7,5 gereinigt. Es zeigte sich, daß mit der lonenaustauscherchromatographie keine Spaltung des Komplexes erzielt wurde, sondern eine Abtrennung von unerwünschten Begleitproteinen, wobei der Komplex als solcher unverändert adsorbiert blieb.
Eine weitere Reinigungsmöglichkeit für AT III stellt die Affinitätschromatographieüber Heparinsepharose dar.
Beispielsweise ist in Prep. Biochem. 13 (1) (1983), Seiten 1 bis 20, ein Verfahren zur Reinigung von AT III beschrieben, bei welchem AT III zunächst über Affinitätschromatographie mit Heparinsepharose und anschließend mit lonenaustauscherchromatographie und Gelchromatographie gereinigt wurde, wobei die Elution von AT III von der Heparinsepharose bei pH 7,4 erfolgt ist. Die lonenaustauscherchromatographie wurde an der DEAE-Sepharose durchgeführt, wobei AT III bei einem pH von 8,6 gebunden worden ist.
In Thrombosis Research 5 (1974), Seiten 431 bis 452 wird ebenfalls die Reinigung von AT III über Heparinsepharose beschrieben, wobei die Adsorption bei pH 8,5 und die Desorption, also die Spaltung des Komplexes aus immobilisierten Heparin und AT III, bei pH 7,5 erzielt wurde. Bei der anschließenden lonenaustauscherchromatographie an DEAE-Sephadex wurde AT III bei pH 8,0 gebunden und bei pH 7,4 eluiert.
Ein ähnliches Verfahren wird in der DE 2 243 688 beschrieben; auch hier wird die Reinigung von AT III an einem vernetzten Heparin-Agarosegel offenbart, wobei die Adsorption an das HeparinGel bei pH 8,5 durchgeführt wurde und die Desorption, also die Spaltung des AT III vom immobilisierten Heparin, bei pH 7,3.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Herstellung von Antithrombin Ill-Präparationen mit hoher Reinheit und Ausbeute herzustellen, wodurch ein möglichst Heparin- bzw. Heparinoid-freies AT III gewonnen werden soll.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelost durch ein Verfahren zur Reinigung von AT III aus einem Ausgangsmaterial, enthaltend einen AT Ill/Heparin- oder AT Ill/Heparinoid-Komplex, welches sich dadurch auszeichnet, daß der AT Ill/Heparin- oder AT Ill/Heparinoid-Komplex an ein Anionenaustauschermaterial adsorbiert wird und anschließend AT III aus dem adsorbierten Komplex abgespalten und eluiert wird. Heparin verbleibt bei dieser Abspaltung am Anionenaustauscher, es erfolgt also eine selektive Elution von AT III.
Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Spaltung mit einem Puffer bei einem pH-Bereich von 8,5 bis 10,5 durchgeführt. Überraschenderweise hat sich nämlich herausgestellt, daß die Spaltung des Heparin/AT III- bzw. Heparinoid/AT Ill-Komplexes im Zuge einer Anionenaustauscherchromatographie gelingt und dies sogar bei einem pH, der größer als 8,5 ist.
Es wurde gefunden, daß AT III von einem Anionenaustauscher selektiv gegenüber Heparin eluiert bzw. die Komplexbindung zwischen AT III und Heparin bzw. Heparinoid gelöst werden kann, während gleichzeitig die (im Gegensatz zur Heparinsepharose nicht kovalente) Bindung von Heparin zum Adsorptionsmaterial bestehen bleibt. Obwohl im Stand der Technik die Affinität von AT III zu Heparin vor allem bei einem derartigen pH für sehr hoch erachtet worden ist (vgl. Thrombosis Research (1974) oder DE 2 243 688) und die Spaltung des Komplexes (i.e. die Spaltung von AT III vom immobilisierten Heparin) selbst bei kovalent gebundenem Heparin immer bei niedrigeren pH's vorgenommen wurde, zeigte sich, daß mittels Anionenaustauscherchromatographie eine selektive Elution des AT III vom adsorbierten AT Ill/Heparin- bzw. AT Ill/Heparinoid-Komplex möglich ist. 2
AT 405 739 B
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung stellte sich aber heraus, daß sogar bei derart hohen pH-Werten eine Spaltung des Komplexes erzielt werden konnte und trotzdem Heparin im wesentlichen am Anionenaustauscher gebunden blieb.
Bevorzugterweise wird beim erfindungsgmäßen Verfahren die Elution mit einem Puffer durchgeführt, der eine Leitfähigkeit zwischen 15 und 50 mS aufweist. Bei dieser Leitfähigkeit wird ein Optimum an Spezifität der Elution erzielt, d.h., daß sie einerseits ausreichend ist, um eine im wesentlichen vollständige Spaltung des Komplexes zu ermöglichen, aber auf der anderen Seite nicht so hoch, daß auch das Heparin bzw. Heparinoid miteluiert. Die Bedingungen für die Adsorption bzw. Desorption hängen im allgemeinen vom verwendeten Anionenaustauschermaterial ab und sind im wesentlichen eine Funktion der Leitfähigkeit und des pH-Wertes des Puffers.
Insbesondere ist der Zusammenhang zwischen pH und Leitfähigkeit derart, daß bei niedriger Leitfähigkeit, z.B. um 20 mS, auch der pH der Pufferlösung niedriger sein kann, z.B. 8,5, und umgekehrt. Als Puffer werden beispielsweise Tris-, Phosphat- oder Glydn-hältige Lösungen verwendet.
Bevorzugterweise wird vor der Adsorption Heparin bzw. Heparinoid in einer Menge zwischen 30 und 3000 E/ml zugesetzt. Mit dieser Maßnahme wird gewährleistet, daß sämtliches AT III im Ausgangsmaterial als Komplex vorliegt und somit kein Ausbeuteverlust bedingt durch freies AT III vorkommt.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugterweise in einer zweistufigen chromatographischen Reinigung durchgeführt, wobei in einer ersten Stufe der Komplex an einem Anionenaustauschermaterial adsorbiert und bei einem pH im Bereich von 6,0 bis 7,5 der stabile Komplex eluiert wird. Anschließend erfolgt die erfindungsgemäße Adsorption des Komplexes und die Spaltung bzw. Elution von AT III aus dem Komplex. Bei einem pH-Wert zwischen 8,5 und 10,5 wird bevorzugterweise eine höhere Leitfähigkeit des Puffers eingestellt, z.B. 10-60 mS, vorzugsweise zwischen 15-50 mS, am meisten bevorzugt zwischen 20 - 35 mS, bei der Elution.
Da AT III vorzugsweise als Therapeutikum eingesetzt wird, ist meist eine Behandlung zur Virusinaktivierung notwendig. Diese Behandlung wird bevorzugterweise auf der Stufe des AT Ill/Heparin- bzw. AT Ill/Heparinoid-Komplexes durchgeführt, da AT III in komplexierter Form stabiler ist als in freier Form. Vorzugsweise wird die Virusinaktivierungsbehandlung auch zweistufig, und zwar mit Zwei voneinander unabhängigen Virusinaktivierungsverfahren durchgeführt.
Diese Inaktivierungsbehandlung wird vorzugsweise durch eine Tensid- und/oder Hitzebehandlung gewährleistet, beispielsweise durch eine Hitzebehandlung in festem Zustand, insbesondere eine Dampfbehandlung gemäß der EP-0 1 59 311, der EP-0 519 901 oder der EP-0 674 531.
Weitere Verfahren zur Inaktivierung von Viren umfassen auch die Behandlung mit chemischen oder chemisch/physikalischen Methoden, z.B. mit chaotropen Stoffen gemäß der W094/13329, der DE 44 34 538 oder der EP-0 131 740 (Lösungsmittel) oder die Photoinaktivierung.
Die Nanofiltration stellt ebenfalls ein bevorzugtes Verfahren zur Abreicherung von Viren im Rahmen der vorliegenden Erfindung dar.
Als Anionenaustauscher kommen im Prinzip alle Anionenaustauscher in Frage, die eine Affinität zu Heparin bzw. Heparinoiden aufweisen, wie z.B. Anionenaustauscher auf Zellulosebasis mit Diethylaminoeth-yl-Gruppen (DEAE-Sephacell®, DE32, DE52 u.8. bzw. Express Ion D; alle Fa. Whatman) oder mit 0ΗϊΝ+-(CH3>3-Gruppen (QA52 bzw. Express Ion Q; Fa. Whatman), Anionenaustauscher auf Basis von quervernetztem Dextran mit Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE-Sephadex®), Anionenaustauscher auf Agarosebasis mit Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE-Sepharose CL6B®, DEAE-Sepharose Fast Flow®), Anionenaustauscher auf Basis von quervernetztem Dextran mit Diethyl[2-hydroxypropylJaminoethyl-Gruppen (QAE-Sephadex®), Anionenaustauscher auf Agarosebasis mit CH2N+ (CH3)3-Gruppen (Q-Sepharose Fast Flow®, Q-Sepharose High Performance®, Q-Sepharose Big Beads·) Oder Copolymere von Agarose und Dextran (Q-Sepharose XL) (alle Fa. Pharmacia), sphärische Chromatographiegele, hergestellt durch Copolymerisation von N-acryloyl-2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol und einem anionischen Acrylderivat mit Diethylaminoethyl-Gruppen als funktionellem Anionenaustauacher (DEAE-Tris-Acryl®), nicht kompressible Silica-Dextran-Matrizes, bei welchen poröses Silicagel in einer (piervernetzten Dextranmatrix eingebettet ist, mit reaktiven Diethylaminoethylanionenaustauschergruppen (DEAE-Spherodex®), Gele aus rigiden Polystyrolpartikeln, deren Poren mit einem Hydrogel gefüllt sind, welches quarternäre Amingruppen mit starker Anionenaus-tauscherwirkungträgt (Q-Hyper-D®) (alle Fa. Sepracor); rigide macroporöse hydrophile Oberflächen mit N+-(C2Hs)2 oder N+(CH3)3-Gruppen (Macroprep DEAE®, Macroprep Q® (alle Fa. BioRad);
Anionenaustauscher mit Diethylaminoethyl-Diethyl(2-hydroxypropyl)aminoethyl und CH2N+(CH3)3-Gruppen (DEAE-Toyopearl®, QAE-Toyopearl®, Toyopearl Super-Q® (alle Fa. Tosohaas), Anionenaustauscherharze bestehend aus porösem Polymethacrylat/Polyacrylat-Gel (Protein PAK DEAE®, Fa. Waters); Anionenaustauscher auf Basis von Copolymeren bestehend aus Oligoethylenglycol-dimethylacrylat, Glyci-dyl-methacrylat und Pentaerythrit-Dimethylacrylat mit einer hydrophoben Oberfläche (Fractogel EMD- 3
AT 405 739 B TM AE®, Fractogel EMD-DEAE®, Fractogel EMD-DMAE®), Anionenaustauscher auf Kieselgeibasis mit porösen kugelförmigen druckstabilen Chromatographiepartikel (Licrospher 1000 TMAE®, Licrospher 1000 DEAE® und Licrospher 4000 DMAE®) (alle Fa. MERCK).
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird menschliches Plasma oder eine AT III enthaltende Plasmafraktion mit Heparin oder einem Heparinoid versetzt, wobei ein AT Ill/Heparin- bzw. AT Ill/Heparinoid-Komplex gebildet wird, und dieser Komplex einer Hitzebehandlung zur Inaktivierung von infektiösen Agenzien unterworfen wird. Diese Behandlung erfolgt gegebenenfalls in Anwesenheit von stabilisierenden, organischen mehrwertigen Salzen, wie z.B. Citrat und/ oder Ammoniumsulfat, und vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 40 bis 70 *C während einer Zeitdauer zwischen 3 und 30 Stunden, wobei die Behandlung bei einer Temperatur um 60 *C während etwa 10 Stunden besonders bevorzugt wird.
Bevorzugterweise wird beim erfindungsgemäßen Verfahren von menschlichem Plasma oder einer [menschlichen] Plasmafraktion enthaltend AT III, vorzugsweise von Kryopräzipitat-armem Plasma, ausgegangen oder von einer Cohn-Fraktion, vorzugsweise von einer Cohn-Fraktion IV.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert, ohne diese jedoch darauf zu beschränken.
Beispiel 1 : 93,2 I Kryopräzipitat-armes Plasma wurden mit 7,5 x 106 E Heparin versetzt, i h gerührt und 1 g DEAE-Sephadex A50 (Fa. Pharmacia) pro Liter zugesetzt. Durch Abtrennung des Gels und nachträgliche Entfernung der nichtgebundenen Proteine durch eine Citrat gepufferte NaCI-Lösung (1 g/l NaCI, pH 7,5) wurde der AT Ill/Heparin-Komplex durch Eluieren mit einer Pufferlösung, die eine Leitfähigkeit von 44 mS und einen pH von 7,5 besitzt, gewonnen. Anschließend wurde die Lösung 10 h bei 60* C in Anwesenheit von stabilisierenden, organischen mehrwertigen Salzen (160 g/l Na-Citrat) erhitzt, um eventuelle pathogene Mikroorganismen zu inaktivieren.
Der entstandene Niederschlag wurde durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt und verworfen. Die klare Lösung wurde auf pH 9,0 und auf 12,2 mS Leitfähigkeit umgepuffert. Der AT Ill/Heparin-Komplex wurde an einer chromatographischen Kolonne bestehend aus 1000 ml Q-Sepharose Fast Flow® (Fa. Pharmacia) gebunden und AT III selektiv mittels einer Pufferlösung bei pH 9,0 und einer Leitfähigkeit von 26 mS eluiert.
Ergebnis AT III E/ml Heparin E/ml AT III/Protein DEAE- Sephadex- Eluat 7,3 30,5 1,6 E/mg Q-Sepharose- Eluat 7,2 0,5 3,9
Beispiel 2 : 24,5 I Plasma wurde nach Entfernung des Kryopräzipitats und Prothrombinkomplexes mit 1,85 x 10® E Heparin versetzt. 15 g DE 52 Cellulose (Fa. Whatman) pro Liter wurden zur Adsorption des AT Ill/Heparin-Komplexes verwendet und das Produkt durch Elution mit einer Pufferlösung, die eine Leitfähigkeit von 45 mS und einen pH von 8,0 aufweist, gewonnen. Nach der Pasteurisierung (60 *C, 10 h) wurde die Lösung umgepuffert und mit Triton® X 100 (Polyethylenglykol-tert.octylphenylether, Tween® 80 (Polyoxyethylensor-bitanmonooleat), sowie Tri-(n-butyl)phosphat (TNBP) bei 25* C gemäß US-PS 4 540 573 behandelt.
Das AT III wurde chromatographisch über eine 25 ml Q-Sepharose Fast-Flow® (Fa. Pharmacia)-Kolonne gereinigt und durch Elution mit einer Pufferlösung bei pH 9,8 und 23 mS-Leitfähigkeit gewonnen. Durch 4
Claims (5)
- ΑΤ 405 739 Β Ultrafiltration und Diafiltration wurde das ΑΤ III auf 100 E/ml eingestellt, anschließend durch Filtration steril verfällt und gegebenenfalls gefriergetrocknet. Ergebnis nach der Gefriertrocknung: AT III 96 E/ml Heparin 0,8 E/ml AT Ill/Protein 6,2 E/mg Triton, Tween, TNBP < Nachweisgrenzen Heparinbindung des AT III > 95 % *) ’) gemäß Europ. Pharmacopoeia Beispiel 3 : Beispiel 2 wurde wiederholt, allerdings wurde statt Q-Sepharose Toyopearl® 0650 Th® (Toso Haas) verwendet. Ergebnis (Eluat): AT III 4,5 E/ml Heparin 0,1 E/ml AT Ill/Protein 3,2 E/mg Beispiel 4 : Beispiel 2 wurde wiederholt, allerdings wurde anstelle von Q-Sepharose Express Ion Q (Whatman) verwendet. Ergebnis (Eluat): ATIII 8,0 E/ml Heparin 0,8 E/ml AT Ill/Protein 5,5 E/mg Patentansprüche 1. Verfahren zur Reinigung von Antithrombin III aus einem Ausgangsmaterial enthaltend einen AT Ill/Heparin- bzw. AT Ill/Heparinoid-Komptex, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex an ein Anionenaustauschermaterial adsorbiert wird, worauf der Komplex durch Elution von AT III gespalten wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elution mit einem Puffer bei einem pH-Bereich von 8,5 bis 10,5 durchgeführt wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer für die Elution eine Leitfähigkeit zwischen 10 und 60 mS, vorzugsweise zwischen 15 und 50 mS, am meisten bevorvorzugt zwischen 20 und 35 mS, aufweist.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß einem AT lll-haltigen Ausgangsmaterial Heparin bzw. ein Heparinoid in einer Menge zwischen 30 und 3000 E/ml zugesetzt wird, worauf ein AT Ill/Heparin- bzw. AT Ill/Heparinoid-Komplex gebildet wird.
- 5 AT 405 739 B Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der AT Ill/Heparin- bzw. AT Ill/Heparinoid-Komplex einer zweistufigen chromatographischen Reinigung unterworfen wird, wobei in einer ersten Stufe der Komplex an ein Anionenaustauschermaterial adsorbiert und bei einem pH im Bereich von 6,0 bis 7,5 eluiert wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Virusinaktivierungsschritt vorgesehen wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß menschlichem Plasma oder einer AT III enthaltenden Plasmafraktion Heparin oder ein Heparinoid zur Bildung eines Hepa-rin/AT III- bzw. Heparinoid/AT Ill-Komplexes zugesetzt wird und dieser Komplex einer Hitzebehandlung zur Inaktivierung von infektiösen Agenzien, gegebenenfalls in Anwesenheit von stabilisierenden, organischen mehrwertigen Salzen, vorzugsweise Citrat und/oder Ammoniumsulfat, bei einer Temperatur im Bereich von 40 bis 70 ”C für eine Zeitdauer zwischen 3 und 30 Stunden, vorzugsweise bei einer Temperatur um 60 °C für eine Zeitdauer von 10 Stunden, unterworfen wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß von menschlichem Plasma oder einer Plasmafraktion enthaltend AT III, vorzugsweise von Kryopräzipitat-armem Plasma, ausgegangen wird. 6
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| EP0307002A1 (de) * | 1983-05-20 | 1989-03-15 | IMMUNO Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung eines Antithrombin III-Konzentrates |
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