WO1999015562A1 - Verfahren zur reinigung von antithrombin iii - Google Patents

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WO1999015562A1
WO1999015562A1 PCT/AT1998/000223 AT9800223W WO9915562A1 WO 1999015562 A1 WO1999015562 A1 WO 1999015562A1 AT 9800223 W AT9800223 W AT 9800223W WO 9915562 A1 WO9915562 A1 WO 9915562A1
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iii
heparin
complex
heparinoid
elution
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Yendra Linnau
Ernst Hetzl
H. Peter Matthiessen
Silvia Neppl
Wolfgang Schönhofer
Hans-Peter Schwarz
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Baxter Aktiengesellschaft
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C07K14/8128—Antithrombin III
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to a new process for the purification of antithrombin III.
  • Antithrombin III is a plasmatic protein that has an anticoagulant effect by inhibiting thrombin, the factors IXa, Xa, XIa and Xlla.
  • AT III deficiency or hereditary thrombophilia is an autosomal dominant hereditary disease with a tendency to thrombosis or embolism, which means that AT III has less formation.
  • Acquired AT III deficiency can e.g. with consumption coagulopathy (DIC), sepsis, cirrhosis of the liver or with nephrotic syndrome.
  • DIC consumption coagulopathy
  • sepsis sepsis
  • cirrhosis of the liver or with nephrotic syndrome.
  • AT III deficiency symptoms can occur with heart valve prostheses, postoperative, thromboembolic complications, with estrogen therapy or with asparagine therapy.
  • AT III has a high affinity for heparin and heparinoids, which is why it is necessary to separate the heparin or heparinoid when producing pure antithrombin III preparations.
  • this AT III / heparin or AT III / heparinoid complex is cleaved with immobilized protamine, heparin being bound to the immobilized protamine and AT III being obtained from the supernatant.
  • the AT 111 / heparin or AT III / heparinoid complex is cleaned before treatment with the immobilized protamine by adsorption on an ion exchanger and elution of unwanted proteins using a salt solution at pH 7.5. It was found that no ion cleavage of the complex was achieved by ion exchange chromatography, but rather a separation of undesired accompanying proteins, the complex as such remaining adsorbed unchanged.
  • a further purification option for AT III is affinity chromatography using heparin sepharose.
  • pages 1 to 20 described a process for the purification of AT III, in which AT III was first purified via affinity chromatography with heparin sepharose and then with ion exchange chromatography and gel chromatography, the elution of AT III from the heparin sepharose pH 7.4 has occurred. Ion exchange chromatography was performed on the DEAE-Sepharose, with AT III bound at a pH of 8.6.
  • AT III via heparin sepharose is also described in Thrombosis Research 5 (1974), pages 431 to 452, the adsorption at pH 8.5 and the desorption, ie the cleavage of the complex from immobilized heparin and AT III, at pH 7 , 5 was achieved.
  • AT III was bound at pH 8.0 and eluted at pH 7.4.
  • the present invention is based on the object of producing a new process for the preparation of antithrombin III preparations with high purity and yield, as a result of which a heparin or heparinoid-free AT III should be obtained.
  • This object is achieved according to the invention by a process for the purification of AT III from a starting material containing an AT III / heparin or AT III / heparinoid complex, which is characterized in that the AT III / heparin or AT 111 / heparinoid complex Complex is adsorbed on an anion exchange material and then AT III is cleaved from the adsorbed complex and eluted. During this cleavage, heparin remains on the anion exchanger, so there is a selective elution. t ion of AT III.
  • the cleavage according to the invention is preferably carried out with a buffer at a pH range from 8.5 to 10.5.
  • AT III can be selectively eluted from an anion exchanger for heparin or the complex bond between AT III and heparin or heparinoid can be released, while at the same time the (in contrast to heparin sepharose not covalent) binding of heparin to the adsorbent material remains.
  • affinity of AT III for heparin was considered to be very high, especially at such a pH (cf.
  • the elution is preferably carried out with a buffer which has a conductivity between 15 and 50 mS. With this conductivity, an optimal specificity of the elution is achieved, ie that it is sufficient on the one hand to enable an essentially complete cleavage of the complex, but on the other hand not so high that the heparin or heparinoid also co-elutes .
  • the conditions for the adsorption or desorption generally depend on the anion exchange material used are essentially a function of the conductivity and pH of the buffer.
  • the relationship between pH and conductivity is such that at low conductivity, e.g. by 20 mS, the pH of the buffer solution can also be lower, e.g. 8.5, and vice versa.
  • solutions containing tris, phosphate or glycine are used as buffers.
  • Heparin or heparinoid is preferably added in an amount between 30 and 3000 U / ml before the adsorption. This measure ensures that all AT III is present in the starting material as a complex and thus there is no loss of yield due to free AT III.
  • the process according to the invention is preferably carried out in a two-stage chromatographic purification, the complex being adsorbed on an anion exchange material in a first stage and the stable complex being eluted at a pH in the range from 6.0 to 7.5. This is followed by the adsorption of the complex according to the invention and the cleavage or elution of AT III from the complex.
  • a higher conductivity of the buffer is preferably set, e.g. 10-60 mS, preferably between 15-50 mS, most preferably between 20-35 mS, in the elution.
  • AT III is preferably used as a therapeutic agent
  • treatment for virus inactivation is usually necessary. This treatment is preferably carried out at the level of the AT III / heparin or AT III / heparinoid complex, since AT III is more stable in complex form than in free form.
  • the virus inactivation treatment is preferably also carried out in two stages, namely with two mutually independent virus inactivation methods.
  • This inactivation treatment is preferably ensured by a tenside and / or heat treatment, for example by a heat treatment in the solid state, in particular one Steam treatment according to EP-0 159 311, EP-0 519 901 or EP-0 674 531.
  • inactivating viruses also include treatment with chemical or chemical / physical methods, e.g. with chaotropic substances according to W094 / 13329, DE 44 34 538 or EP-0 131 740 (solvent) or photo inactivation.
  • chemical or chemical / physical methods e.g. with chaotropic substances according to W094 / 13329, DE 44 34 538 or EP-0 131 740 (solvent) or photo inactivation.
  • Nanofiltration is also a preferred method for depleting viruses in the context of the present invention.
  • anion exchanger in principle, all anion are suitable, which have an affinity for heparin or heparinoids, such as anion exchangers based on cellulose with di- ethylaminoethyl groups (DEAE-Sephacell ®, DE32, DE52, inter alia, or Express Ion D; all Fa. Whatman) or CH 2 N + (CH 3) 3 groups (QA52 or Express Ion Q; Fa.
  • anion exchangers based on cross-linked dextran with diethylaminoethyl groups (DEAE-Sephadex ®), agarose-based anion exchangers with diethylaminoethyl Groups (DEAE-Sepharose CL6B ® , DEAE-Sepharose Fast Flow ® ), anion exchangers based on cross-linked dextran with diethyl [2-hydroxypropyl] aminoethyl groups (QAE-Sephadex ® ), anion exchangers based on agarose with CH 2 N + (CH 3 ) 3 groups (Q-Sepharose Fast Flow ® , Q-Sepharose High Performance ® , Q-Sepharose Big Beads ® ) or copolymers of agarose and dextran (Q-Sepharose XL) (all from Pharmacia), spherical chromatographic gels , forth by copolymerization of N-acrylate,
  • Anion exchanger with diethylaminoethyl-diethyl (2-hydroxypropyl) aminoethyl and CH 2 N + (CH 3 ) 3 groups (DEAE-Toyopearl ® , QAE-Toyopearl ® , Toyopearl Super-Q ® (all from Tosohaas), anion exchange exchanger resins consisting of porous polymethacrylate / polyacrylate gel (protein PAK DEAE ® , from Waters);
  • Anion exchanger based on copolymers consisting of oligoethylene glycol dimethylacrylate, glycidyl methacrylate and pentaerythritol dimethylacrylate with a hydrophobic surface Fractogel EMD-TMAE ® , Fractogel EMD-DEAE ® , Fractogel EMD-DMAE ®
  • anion base exchanger with silica gel porous spherical pressure-stable chromatography particles Lirospher 1000 TMAE ® , Licrospher 1000 DEAE ® and Licrospher 4000 DMAE ® ) (all from MERCK).
  • heparin or a heparinoid is added to human plasma or a plasma fraction containing AT III, an AT III / heparin or AT III / heparinoid complex being formed, and this complex is one Heat treatment to inactivate infectious agents.
  • This treatment is optionally carried out in the presence of stabilizing, organic polyvalent salts, such as e.g. Citrate and / or ammonium sulfate, and preferably at a temperature in the range of 40 to 70 ° C for a period of between 3 and 30 hours, with treatment at a temperature around 60 ° C for about 10 hours being particularly preferred.
  • the process according to the invention is preferably based on human plasma or a [human] plasma fraction containing AT III, preferably low-cryoprecipitate plasma, or a Cohn fraction, preferably a Cohn fraction IV.
  • Example 1 The present invention is explained in more detail by the examples below, but without restricting it thereto.
  • Example 1 The present invention is explained in more detail by the examples below, but without restricting it thereto.
  • Example 1 Example 1 :
  • the resulting precipitate was separated by centrifugation or filtration and discarded.
  • the clear solution was buffered to pH 9.0 and to 12.2 mS conductivity.
  • a T 111 / heparin complex was eluted on a chromatographic column consisting of 1000 ml Q-Sepharose Fast Flow ® (Fa. Pharmacia), and AT III selectively by means of a buffer solution at pH 9, 0 and a conductivity of 26 mS.
  • the AT III was purified by chromatography on a 25 ml Q-Sepharose Fast- Flow® (Pharmacia) column and obtained by elution with a buffer solution at pH 9.8 and 23 mS conductivity.
  • the AT III was adjusted to 100 U / ml by ultrafiltration and diafiltration, then filled sterile by filtration and optionally freeze-dried.
  • Example 2 was repeated, but 650 Q-Th ® (Toso Haas) was used instead of Q-Sepharose ® Toyopearl.
  • Q-Th ® Toso Haas
  • Example 2 was repeated, but instead of Q-Sepharose Express Ion Q (Whatman) was used. Result (eluate)

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Reinigung von Antithrombin III aus einem Ausgangsmaterial enthaltend einen AT III/Heparin- bzw. AT III/Heparinoid-Komplex, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex an ein Anionenaustauschermaterial adsorbiert wird, worauf der Komplex durch Elution von AT III gespalten wird.

Description

Verfahren zur Reinigung von Antithrombin III
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Reinigung von Antithrombin III.
Antithrombin III (AT III) ist ein plasmatisches Protein, das gerinnungshemmend wirkt, indem es Thrombin, die Faktoren IXa, Xa, XIa und Xlla inhibiert.
AT III-Mangel oder hereditäre Thrombophilie ist eine autosomal- dominante erbliche Erkrankung mit Thrombose- bzw. Embolieneigung infoiger verminderter Bildung von AT III.
Erworbener AT III-Mangel kann z.B. bei Verbrauchskoagulopathien (DIC) , Sepsis, Leberzirrhose oder beim nephrotischen Syndrom auftreten.
Ebenso kann es bei Herzklappenprothesen, postoperativen, throm- boembolischen Komplikationen, bei der Östrogentherapie oder bei der Asparaginasetherapie zu AT III-Mangelerscheinungen kommen.
AT III hat eine hohe Affinität zu Heparin und Heparinoiden, weshalb bei der Herstellung von reinen Antithrombin III-Präparaten eine Abtrennung des Heparins oder des Heparinoids erforderlich ist.
Gemäß der EP 0 307 002-A1 wird die Spaltung dieses AT III/Hepa- rin- bzw. AT III/Heparinoid-Komplexes mit immobilisiertem Prot- amin vorgenommen, wobei Heparin am immobilisierten Protamin gebunden und AT III aus dem Überstand gewonnen wird. Der AT 111/ Heparin- bzw. AT III/Heparinoid-Komplex wird vor der Behandlung mit dem immobilisierten Protamin durch Adsorption an einem Ionenaustauscher und Eluierung von unerwünschten Proteinen mittels einer Salzlösung bei pH 7,5 gereinigt. Es zeigte sich, daß mit der Ionenaustauscherchromatographie keine Spaltung des Komplexes erzielt wurde, sondern eine Abtrennung von unerwünschten Begleitproteinen, wobei der Komplex als solcher unverändert adsorbiert blieb. Eine weitere Reinigungsmöglichkeit für AT III stellt die Affinitätschromatographie über Heparinsepharose dar.
Beispielsweise ist in Prep. Biochem. 13 (1) (1983) , Seiten 1 bis 20, ein Verfahren zur Reinigung von AT III beschrieben, bei welchem AT III zunächst über Affinitätschromatographie mit Heparinsepharose und anschließend mit Ionenaustauscherchromatographie und Gelchromatographie gereinigt wurde, wobei die Elution von AT III von der Heparinsepharose bei pH 7,4 erfolgt ist. Die Ionenaustauscherchromatographie wurde an der DEAE-Sepharose durchgeführt, wobei AT III bei einem pH von 8,6 gebunden worden ist.
In Thrombosis Research 5 (1974) , Seiten 431 bis 452 wird ebenfalls die Reinigung von AT III über Heparinsepharose beschrieben, wobei die Adsorption bei pH 8,5 und die Desorption, also die Spaltung des Komplexes aus immobilisierten Heparin und AT III, bei pH 7,5 erzielt wurde. Bei der anschließenden Ionenaustauscherchromatographie an DEAE-Sephadex wurde AT III bei pH 8,0 gebunden und bei pH 7,4 eluiert.
Ein ähnliches Verfahren wird in der DE 2 243 688 beschrieben; auch hier wird die Reinigung von AT III an einem vernetzten He- parin-Agarosegel offenbart, wobei die Adsorption an das Heparin- Gel bei pH 8 , 5 durchgeführt wurde und die Desorption, also die Spaltung des AT III vom immobilisierten Heparin, bei pH 7,3.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Herstellung von Antithrombin Ill-Präparationen mit hoher Reinheit und Ausbeute herzustellen, wodurch ein möglichst Heparin- bzw. Heparinoid-freies AT III gewonnen werden soll.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Reinigung von AT III aus einem Ausgangsmaterial, enthaltend einen AT III/Heparin- oder AT III/Heparinoid-Komplex, welches sich dadurch auszeichnet, daß der AT III/Heparin- oder AT 111/ Heparinoid-Komplex an ein Anionenaustauschermaterial adsorbiert wird und anschließend AT III aus dem adsorbierten Komplex abgespalten und eluiert wird. Heparin verbleibt bei dieser Abspaltung am Anionenaustauscher, es erfolgt also eine selektive Elu- t ion von AT I I I .
Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Spaltung mit einem Puffer bei einem pH-Bereich von 8,5 bis 10,5 durchgeführt.
Überraschenderweise hat sich nämlich herausgestellt, daß die Spaltung des Heparin/AT III- bzw. Heparinoid/AT III-Komplexes im Zuge einer Anionenaustauscherchromatographie gelingt und dies sogar bei einem pH, der größer als 8,5 ist.
Es wurde gefunden, daß AT III von einem Anionenaustauscher selektiv gegenüber Heparin eluiert bzw. die Komplexbindung zwischen AT III und Heparin bzw. Heparinoid gelöst werden kann, während gleichzeitig die (im Gegensatz zur Heparinsepharose nicht kovalente) Bindung von Heparin zum Adsorptionsmaterial bestehen bleibt. Obwohl im Stand der Technik die Affinität von AT III zu Heparin vor allem bei einem derartigen pH für sehr hoch erachtet worden ist (vgl. Thrombosis Research (1974) oder DE 2 243 688) und die Spaltung des Komplexes (i.e. die Spaltung von AT III vom immobilisierten Heparin) selbst bei kovalent gebundenem Heparin immer bei niedrigeren pH 's vorgenommen wurde, zeigte sich, daß mittels Anionenaustauscherchromatographie eine selektive Elution des AT III vom adsorbierten AT III/Heparin- bzw. AT III/Heparinoid-Komplex möglich ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung stellte sich aber heraus, daß sogar bei derart hohen pH-Werten eine Spaltung des Komplexes erzielt werden konnte und trotzdem Heparin im wesentlichen am Anionenaustauscher gebunden blieb.
Bevorzugterweise wird beim erfindungsgmäßen Verfahren die Elution mit einem Puffer durchgeführt, der eine Leitfähigkeit zwischen 15 und 50 mS aufweist. Bei dieser Leitfähigkeit wird ein Optimum an Spezifität der Elution erzielt, d.h., daß sie einerseits ausreichend ist, um eine im wesentlichen vollständige Spaltung des Komplexes zu ermöglichen, aber auf der anderen Seite nicht so hoch, daß auch das Heparin bzw. Heparinoid mitelu- iert. Die Bedingungen für die Adsorption bzw. Desorption hängen im allgemeinen vom verwendeten Anionenaustauschermaterial ab und sind im wesentlichen eine Funktion der Leitfähigkeit und des pH- Wertes des Puffers.
Insbesondere ist der Zusammenhang zwischen pH und Leitfähigkeit derart, daß bei niedriger Leitfähigkeit, z.B. um 20 mS, auch der pH der Pufferlösung niedriger sein kann, z.B. 8,5, und umgekehrt. Als Puffer werden beispielsweise Tris-, Phosphat- oder Glycin-hältige Lösungen verwendet.
Bevorzugterweise wird vor der Adsorption Heparin bzw. Heparinoid in einer Menge zwischen 30 und 3000 E/ml zugesetzt. Mit dieser Maßnahme wird gewährleistet, daß sämtliches AT III im Ausgangs- material als Komplex vorliegt und somit kein Ausbeuteverlust bedingt durch freies AT III vorkommt.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugterweise in einer zweistufigen chromatographischen Reinigung durchgeführt, wobei in einer ersten Stufe der Komplex an einem Anionenaustauschermaterial adsorbiert und bei einem pH im Bereich von 6,0 bis 7,5 der stabile Komplex eluiert wird. Anschließend erfolgt die erfindungsgemäße Adsorption des Komplexes und die Spaltung bzw. Elution von AT III aus dem Komplex. Bei einem pH-Wert zwischen 8,5 und 10,5 wird bevorzugterweise eine höhere Leitfähigkeit des Puffers eingestellt, z.B. 10 - 60 mS, vorzugsweise zwischen 15 - 50 mS, am meisten bevorzugt zwischen 20 - 35 mS, bei der Elution.
Da AT III vorzugsweise als Therapeutikum eingesetzt wird, ist meist eine Behandlung zur Virusinaktivierung notwendig. Diese Behandlung wird bevorzugterweise auf der Stufe des AT III/Heparin- bzw. AT III/Heparinoid-Komplexes durchgeführt, da AT III in komplexierter Form stabiler ist als in freier Form. Vorzugsweise wird die Virusinaktivierungsbehandlung auch zweistufig, und zwar mit zwei voneinander unabhängigen Virusinaktivierungsverfahren durchgeführt .
Diese Inaktivierungsbehandlung wird vorzugsweise durch eine Ten- sid- und/oder Hitzebehandlung gewährleistet, beispielsweise durch eine Hitzebehandlung in festem Zustand, insbesondere eine Dampfbehandlung gemäß der EP-0 159 311, der EP-0 519 901 oder der EP-0 674 531.
Weitere Verfahren zur Inaktivierung von Viren umfassen auch die Behandlung mit chemischen oder chemisch/physikalischen Methoden, z.B. mit chaotropen Stoffen gemäß der W094/13329, der DE 44 34 538 oder der EP-0 131 740 (Lösungsmittel) oder die Photoinaktivierung .
Die Nanofiltration stellt ebenfalls ein bevorzugtes Verfahren zur Abreicherung von Viren im Rahmen der vorliegenden Erfindung dar.
Als Anionenaustauscher kommen im Prinzip alle Anionenaustauscher in Frage, die eine Affinität zu Heparin bzw. Heparinoiden aufweisen, wie z.B. Anionenaustauscher auf Zellulosebasis mit Di- ethylaminoethyl-Gruppen (DEAE-Sephacell®, DE32, DE52 u.a. bzw. Express Ion D; alle Fa. Whatman) oder mit CH2N+ (CH3 ) 3 -Gruppen (QA52 bzw. Express Ion Q; Fa. Whatman) , Anionenaustauscher auf Basis von quervernetztem Dextran mit Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE-Sephadex®) , Anionenaustauscher auf Agarosebasis mit Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE-Sepharose CL6B®, DEAE-Sepharose Fast Flow®) , Anionenaustauscher auf Basis von quervernetztem Dextran mit Diethyl [2-hydroxypropyl] aminoethyl-Gruppen (QAE- Sephadex®) , Anionenaustauscher auf Agarosebasis mit CH2N+ (CH3 ) 3 -Gruppen (Q-Sepharose Fast Flow®, Q-Sepharose High Performance®, Q-Sepharose Big Beads®) oder Copolymere von Agaro- se und Dextran (Q-Sepharose XL) (alle Fa. Pharmacia) , sphärische Chromatographiegele, hergestellt durch Copolymerisation von N- acryloyl-2-amino-2-hydroxymethyl-l, 3-propandiol und einem anionischen Acrylderivat mit Diethylamino-ethyl-Gruppen als funktio- nellem Anionenaustauscher (DEAE-Tris-Acryl®) , nicht kompressible Silica-Dextran-Matrizes, bei welchen poröses Silicagel in einer quervernetzten Dextranmatrix eingebettet ist, mit reaktiven Di- ethylaminoethylanionenaustauschergruppen (DEAE-Spherodex®) , Gele aus rigiden Polystyrolpartikeln, deren Poren mit einem Hydrogel gefüllt sind, welches quarternäre Amingruppen mit starker Anio- nenaustauscherwirkung trägt (Q-Hyper-D®) (alle Fa. Sepracor) ; rigide macroporöse hydrophile Oberflächen mit N+(C2H5)2 oder N+ (CH3 ) 3 -Gruppen (Macroprep DEAE®, Macroprep Q® (alle Fa. BioRad) ;
Anionenaustauscher mit Diethylaminoethyl-Diethyl (2-hydroxypro- pyl) aminoethyl und CH2N+ (CH3 ) 3 -Gruppen (DEAE-Toyopearl® , QAE- Toyopearl®, Toyopearl Super-Q® (alle Fa. Tosohaas) , Anionenaus- tauscherharze bestehend aus porösem Polymethacrylat/Polyacrylat- Gel (Protein PAK DEAE®, Fa. Waters) ;
Anionenaustauscher auf Basis von Copolymeren bestehend aus Oli- goethylenglycol-dimethylacrylat, Glycidyl-methacrylat und Penta- erythrit-Dimethylacrylat mit einer hydrophoben Oberfläche (Fractogel EMD-TMAE®, Fractogel EMD-DEAE®, Fractogel EMD-DMAE®) , Anionenaustauscher auf Kieselgelbasis mit porösen kugelförmigen druckstabilen Chromatographiepartikel (Licrospher 1000 TMAE®, Licrospher 1000 DEAE® und Licrospher 4000 DMAE®) (alle Fa. MERCK) .
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungs- gemäßen Verfahrens wird menschliches Plasma oder eine AT III enthaltende Plasmafraktion mit Heparin oder einem Heparinoid versetzt, wobei ein AT III/Heparin- bzw. AT III/Heparinoid-Kom- plex gebildet wird, und dieser Komplex einer Hitzebehandlung zur Inaktivierung von infektiösen Agenzien unterworfen wird. Diese Behandlung erfolgt gegebenenfalls in Anwesenheit von stabilisierenden, organischen mehrwertigen Salzen, wie z.B. Citrat und/ oder Ammoniumsulfat, und vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 40 bis 70°C während einer Zeitdauer zwischen 3 und 30 Stunden, wobei die Behandlung bei einer Temperatur um 60°C während etwa 10 Stunden besonders bevorzugt wird.
Bevorzugterweise wird beim erfindungsgemäßen Verfahren von menschlichem Plasma oder einer [menschlichen] Plasmafraktion enthaltend AT III, vorzugsweise von Kryopräzipitat-armem Plasma, ausgegangen oder von einer Cohn-Fraktion, vorzugsweise von einer Cohn-Fraktion IV.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert, ohne diese jedoch darauf zu beschränken. B e i s p i e l 1 :
93,2 1 Kryopräzipitat-armes Plasma wurden mit 7,5 x 106 E Heparin versetzt, X h gerührt und 1 g DEAE-Sephadex A50 (Fa. Pharmacia) pro Liter zugesetzt. Durch Abtrennung des Gels und nachträgliche Entfernung der nichtgebundenen Proteine durch eine Citrat gepufferte NaCl-Lösung (1 g/1 NaCl, pH 7,5) wurde der AT III/Heparin-Komplex durch Eluieren mit einer Pufferlösung, die eine Leitfähigkeit von 44 mS und einen pH von 7,5 besitzt, gewonnen. Anschließend wurde die Lösung 10 h bei 60°C in Anwesenheit von stabilisierenden, organischen mehrwertigen Salzen (160 g/1 Na-Citrat) erhitzt, um eventuelle pathogene Mikroorganismen zu inaktivieren.
Der entstandene Niederschlag wurde durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt und verworfen. Die klare Lösung wurde auf pH 9,0 und auf 12,2 mS Leitfähigkeit umgepuffert. Der AT 111/ Heparin-Komplex wurde an einer chromatographischen Kolonne bestehend aus 1000 ml Q-Sepharose Fast Flow® (Fa. Pharmacia) gebunden und AT III selektiv mittels einer Pufferlösung bei pH 9,0 und einer Leitfähigkeit von 26 mS eluiert.
Figure imgf000009_0001
B e i s p i e l 2 : (Derzeit nach Ansicht der Anmelderin der beste Weg zur Ausführung der Erfindung)
24,5 1 Plasma wurde nach Entfernung des Kryopräzipitats und Pro- thrombinkomplexes mit 1,85 x 106 E Heparin versetzt. 15 g DE 52 Cellulose (Fa. Whatman) pro Liter wurden zur Adsorption des AT III/Heparin-Komplexes verwendet und das Produkt durch Elution mit einer Pufferlösung, die eine Leitfähigkeit von 45 mS und einen pH von 8,0 aufweist, gewonnen. Nach der Pasteurisierung (60°C, 10 h) wurde die Lösung umgepuffert und mit Triton® X 100 (Polyethylenglykol-tert .octylphenylether, Tween® 80 (Polyoxy- ethylensorbitanmonooleat) , sowie Tri- (n-butyl)phosphat (TNBP) bei 25°C gemäß US-PS 4 540 573 behandelt.
Das AT III wurde chromatographisch über eine 25 ml Q-Sepharose Fast-Flow® (Fa. Pharmacia) -Kolonne gereinigt und durch Elution mit einer Pufferlösung bei pH 9,8 und 23 mS-Leitfähigkeit gewonnen. Durch Ultrafiltration und Diafiltration wurde das AT III auf 100 E/ml eingestellt, anschließend durch Filtration steril verfüllt und gegebenenfalls gefriergetrocknet .
Ergebnis nach der Gefriertrocknung:
AT III 96 E/ml
Heparin 0,8 E/ml
AT III/Protein 6 , 2 E/mg
Triton, Tween, TNBP < Nachweisgrenzen
Heparinbindung des AT III > 95 % *)
*) gemäß Europ. Pharmacopoeia
B e i s p i e l
Beispiel 2 wurde wiederholt, allerdings wurde statt Q-Sepharose Toyopearl® Q-650 Th® (Toso Haas) verwendet.
Ergebnis (Eluat) :
AT III 4,5 E/ml
Heparin 0,1 E/ml
AT III/Protein 3 , 2 E/mg
B e i s p i e l
Beispiel 2 wurde wiederholt, allerdings wurde anstelle von Q- Sepharose Express Ion Q (Whatman) verwendet. Ergebnis (Eluat)
AT III 8,0 E/ml
Heparin 0,8 E/ml
AT HI/Protein 5,5 E/mg

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e :
1. Verfahren zur Reinigung von Antithrombin III aus einem Ausgangsmaterial enthaltend einen AT III/Heparin- bzw. AT III/Heparinoid-Komplex, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex an ein Anionenaustauschermaterial adsorbiert wird, worauf der Komplex durch Elution von AT III gespalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elution mit einem Puffer bei einem pH-Bereich von 8,5 bis 10,5 durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet , daß der Puffer für die Elution eine Leitfähigkeit zwischen 10 und 60 mS, vorzugsweise zwischen 15 und 50 S, am meisten bevor- vorzugt zwischen 20 und 35 mS, aufweist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, daß einem AT III-haltigen Ausgangsmaterial Heparin bzw. ein Heparinoid in einer Menge zwischen 30 und 3000 E/ml zugesetzt wird, worauf ein AT III/Heparin- bzw. AT III/Heparinoid- Komplex gebildet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der AT III/Heparin- bzw. AT III/Heparinoid-Komplex einer zweistufigen chromatographischen Reinigung unterworfen wird, wobei in einer ersten Stufe der Komplex an ein Anionenaustauschermaterial adsorbiert und bei einem pH im Bereich von 6,0 bis 7,5 eluiert wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Virusinaktivierungsschritt vorgesehen wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 , dadurch gekennzeichnet, daß menschlichem Plasma oder einer AT III enthaltenden Plasmafraktion Heparin oder ein Heparinoid zur Bildung eines Heparin/AT III- bzw. Heparinoid/AT III-Komplexes zugesetzt wird und dieser Komplex einer Hitzebehandlung zur Inaktivierung von infektiösen Agenzien, gegebenenfalls in Anwesenheit von stabilisierenden, organischen mehrwertigen Salzen, vorzugsweise Citrat und/oder Ammoniumsulfat, bei einer Temperatur im Bereich von 40 bis 70°C für eine Zeitdauer zwischen 3 und 30 Stunden, vorzugsweise bei einer Temperatur um 60°C für eine Zeitdauer von 10 Stunden, unterworfen wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß von menschlichem Plasma oder einer Plasmafraktion enthaltend AT III, vorzugsweise von Kryoprazipitat-armem Plasma, ausgegangen wird.
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