DE69736115T2

DE69736115T2 - Verfahren zur herstellung von gereinigtem transferrin

Info

Publication number: DE69736115T2
Application number: DE69736115T
Authority: DE
Inventors: M. John Los Angeles ROLF; Akimasa Arcadia OHMIZU; D. Shawn Sierra Madre LATHAM; Prabir Walnut BHATTACHARYA
Original assignee: Grifols Shared Services North America Inc
Current assignee: Grifols Shared Services North America Inc
Priority date: 1996-06-26
Filing date: 1997-06-18
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2017-06-19
Also published as: JP2002509521A; AU729682B2; EP0934072A1; AU3303397A; WO1997049414A1; ES2264167T3; CA2258740C; CA2258740A1; DE69736115D1; ATE329602T1; EP0934072B1; US5744586A; EP0934072A4

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Transferrin, das in einem Produkt resultiert, das für medizinische Verwendungen adäquat ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Transferrin ist ein eisenbindendes Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 76-81 kD. Eisenfreies Transferrin wird auch als „apo-Transferrin" bezeichnet, wohingegen eisengesättigtes Transferrin als „holo-Transferrin" bezeichnet wird. Sowohl apo-Transferrin als auch holo-Transferrin werden für therapeutische Zwecke verwendet.
In Blutplasma wirkt Transferrin als Eisentransportprotein, das dreiwertiges Eisen sicher sequestriert, so wie es an das Zellcytoplasma über Transferrinrezeptoren an der Zelloberfläche abgegeben wird. Den Neuronen des Zentralen Nervensystems (ZNS) fehlen Transferrinrezeptoren, während Tumorzellen gewöhnlich einen Überschuss haben. Ein Konjugat aus Transferrin und einem Protein oder einem kleinen Molekül kann eine nützliche Behandlung für ZNS-Tumore durch selektive Abgabe an die Zellen bereitstellen, auf die abgezielt wird. Solche Proteine können Toxine einschließen. Solche Moleküle können chemotherapeutische Mittel, Radioisotope und Nucleinsäuren einschließen. Zum Beispiel offenbart das US-Patent Nr. 5,352,447 ein Konjugat aus Transferrin und Diphterietoxin zur Behandlung von intracranialen Schädigungen.
Einige andere medizinische Anwendungen beinhalten ebenfalls die Verwendung von gereinigten Transferrin-Produkten. Zum Beispiel werden Transferrin-Produkte als Zellwachstumsfaktoren in serumfreien Zellkulturmedien verwendet. Gereinigte Transferrin-Produkte können auch als Reagenzien in diagnostischen Kits verwendet werden.
Daher besteht ein andauernder Bedarf an hochgereinigten und sterilen Transferrin-Produkten, die frei von umhüllten und nichtumhüllten Viren sind. Darüber hinaus besteht der Bedarf für die Fähigkeit, diese hochgereinigten Produkte in einem industriellen Maßstab in einer einfachen und kosteneffizienten Weise herzustellen.
Fraktion IV wird häufig als ein Abfallprodukt des Cohn-Fraktionierungsverfahrens betrachtet. Es ist jedoch auch bekannt, dass Fraktion IV eine Reihe nützlicher Plasmaproteine, einschließlich Albumin, Alpha-1-Proteinaseinhibitor (auch bekannt als Alpha-1-Antitrypsin) und Transferrin, enthält. Daher kann die Fraktion IV des Cohn-Fraktionierungsverfahrens (speziell die Fraktionen IV₁ und IV₄) als eine Quelle einer Transferrin-enthaltenden Flüssigpräparation in der vorliegenden Erfindung dienen.
Verfahren zum Erhalten teilweise gereinigter Transferrinfraktionen sind im Fachgebiet bekannt.
Zum Beispiel offenbart US-Patent Nr. 3,850,903 ein Verfahren zum Herstellen eines Proteinkonzentrats, das reich an Albumin, Transferrin und anderen α- und β-Globulinmolekülen ist. Speziell das '903 Patent offenbart ein Cohn-IV₄-Präzipitat, das mit Calciumphosphat behandelt wird, gefolgt von selektiver Präzipitation mit Blockcopolymeren von Ethylenoxid und Polyoxypropylenpolymer. Da das Endprodukt eine Vielzahl von Plasmaproteinen enthält, offenbart '903 kein Verfahren zum Erhalten eines hochgereinigten Transferrin-Produktes per se.
US-Patent Nr. 4,841,026 beschreibt ein Verfahren zum Herstellen einer sterilen Virus-inaktivierten, nichttoxischen Transferrinzubereitung zur Verwendung in Zellkultursystemen. Das darin offenbarte Verfahren umfasst die Sättigung einer Cohn-Fraktion, die Transferrin enthält, mit einem Überschuss an Eisen, gefolgt von der Entfernung freier Eisenradikale und unerwünschter Proteine mittels Filtration und Ionenaustauschchromatographie. Um das endgültige Transferrin-Produkt zu erhalten, erfordert das offenbarte Verfahren eine Pasteurisierungsdauer von 10 Stunden bei 60°C.
US-Patent Nr. 5,041,537 offenbart ein Verfahren zum Herstellen biologisch aktiven Transferrins, umfassend die Präzipitation von γ-Globulin aus der Cohn-Fraktion IV, Ultrafiltration und Einstellung von Ionen/Protein-Konzentration, gefolgt von Behandlung mit spezifischen Detergenzien. Die Fraktion wird dann einer Ionenaustauschchromatographie unterzogen, in der alle Proteine außer dem Transferrin absorbiert werden, d.h. das Transferrin ist in der Durchflussfraktion enthalten. Die Transferrin-enthaltende Fraktion wird nachfolgend konzentriert und steril filtriert.
Verfahren zum Inaktivieren von Viren, die mit Plasmaproteinen assoziiert sind, sind im Fachgebiet ebenfalls bekannt. Zum Beispiel ist es im Fachgebiet bekannt, dass Plasmaproteine unter Verwendung von (1) Hitzeinaktivierung im feuchten und trockenen Zustand, (2) Detergenzien und (3) einer Kombination aus Behandlung mit β-Propiolactum und Ultraviolettbestrahlung sterilisiert werden können. Plasmaproteine sind jedoch hitzeempfindlich und müssen daher in Verbindung mit Stabilisatoren hitzeinaktiviert werden. Bestimmte Stabilisatoren können so wirken, dass eine vollständige Sterilisation verhindert wird. Dem gemäß werden Sterilisationsvorgehensweisen unter Verwendung von Chemikalien und/oder Bestrahlung für Anwendungen, die eine vollständige Sterilisation erfordern, als bevorzugt betrachtet. Darüber hinaus ist es möglich, dass die Hitzebehandlung von Transferrin-enthaltenden Zubereitungen in der Bildung von Aggregaten resultieren wird, wodurch möglicherweise die Reinigung und letztendliche Verwendung des Transferrin-Produktes behindert wird. Es ist auch bekannt, dass Viren umhüllt oder nichtumüllt sein können und dass Virusinaktivierungsverfahren für einen Virustyp wirksam sein können aber für einen anderen nicht.
Zum Beispiel offenbart US-Patent Nr. 4,540,573 („das '573-Patent") ein allgemeines Verfahren zum Erhalten von im Wesentlichen virusfreien biologisch aktiven Proteinderivaten, die im Wesentlichen frei von umhüllten Viren sind, aber nicht durch das Virusinaktivierungsverfahren denaturiert sind. Speziell wird darin ein Verfahren offenbart, wobei eine Proteinenthaltende Zusammensetzung, z.B. Vollblut, mit einem organischen Lösungsmitteldetergens („organic solvent detergent") („OSD"-Verfahren) in Kontakt gebracht wird, um darin enthaltene umhüllte Viren zu inaktivieren. Das OSD-Verfahren hat den Vorteil, dass Hepatitisviren, die in der Proteinenthaltenden Zusammensetzung vorhanden sind, ohne wesentliche Denaturierung der Proteine darin inaktiviert werden. Das '573-Patent offenbart nicht die Reinigung einer Transferrinenthaltenden Fraktion.
Daneben offenbaren Soliman et al., U.A.R.J. CHEM., 1971, Bd. 14, Nr. 2, Seiten 177-183, ein Verfahren in mittlerem Maßstab zur Reinigung von humanem Serumtransferrin und IgG-Globulin durch eine Chromatographietechnik und lehren die Abtrennung von γ-Globulinen von β-Globulinen (Transferrin) durch Verwendung von Chromatographiesäulen.
In ihrer Abhandlung „Protein Purification Methods: A Practical Approach", NEW YORK: OXFORD UNIVERSITY PRESS, 1989, Seiten 4-9 und 126-151, offenbaren Harris et al. unter anderem Pufferkonzentrationen und das Anpassen der Größe der Filter. Jedoch geben sie keine Richtlinie dazu, wie eine Säule hergestellt/verwendet werden soll, die Transferrin absorbiert.
Schließlich betrifft WO 96/14862 A gepoolte Transferrine und offenbart eine biologisch aktive Zusammensetzung, die bei der Kontrolle der Immunreaktion eines Wirts gegen Antigenzellen eines Spenders wirksam ist, oder Gewebe, das durch aktives Prinzip gekennzeichnet ist, welches aus gepoolten Transferrinen besteht, erhalten von einer Anzahl von Spendern, die ausreichend ist, um zu ermöglichen, dass die gepoolten Transferrine all die Phenotyp-Informationen enthalten, die benötigt werden, um eine nicht-spezifische Induktion immunspezifischer Toleranz gegen Antigene eines bestimmten allogenen Spenders bei einem immunsuprimierten Wirt, der mit den Antigenen transplantiert wurde, sicherzustellen, nachdem diesem Wirt eine Menge solcher gepoolten Transferrine verabreicht worden war, die wirksam ist, um die immunspezifische Toleranz zu induzieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zum Herstellen von Transferrin-Produkten mit einer hohen Ausbeute und hoher Reinheit bereitzustellen. Dieses Verfahren ist einfach und ökonomisch für eine Produktion in industriellem Maßstab von Hochreinheitstransferrin-Produkten.
Es ist eine weiter Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zum Herstellen von hochgereinigten Transferrin-Produkten bereitzustellen, die im Wesentlichen von umhüllten und nichtumhüllten viralen Kontaminanten frei sind.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, in dem das Transferrin-Produkt vor dem Platzieren in einem letztendlichen Behälter gereinigt und sterilisiert werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung einer Transferrin-enthaltenden Flüssigzubereitung, wobei das Verfahren das Beginnen mit einer teilweise gereinigten Transferrinflüssigzubereitung umfasst. Die teilweise gereinigte Transferrin-enthaltende Fraktion wird dann konzentriert und die Ionenstärke davon wird verringert. Die Transferrinenthaltende Fraktion wird chemisch behandelt, um umhüllte Viren zu inaktivieren. Danach wird die Transferrin-enthaltende Fraktion auf ein Ionenaustauschmedium aufgebracht, an welchem das Transferrin adsorbiert wird. Eine Fraktion, umfassend Transferrin, wird dann aus der Ionenaustauschsäule eluiert. In bevorzugten Ausführungsformen ist bzw. wird das Transferrin mit Eisen gesättigt und nanofiltriert, um nichtumhüllte Viren zu entfernen und ein steriles Produkt vor dem Verpacken zu erhalten und, falls ein Trockenprodukt gewünscht ist, wird das Transferrin in einem letztendlichen Behälter lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt kann zu einem späteren Zeitpunkt rekonstituiert werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Ausgangsproteinfraktion der vorliegenden Erfindung ist eine Transferrin-enthaltende Proteinfraktion, die teilweise gereinigt wurde, wie oben beschrieben. Vorzugsweise ist es eine teilweise gereinigte Cohn-Fraktion IV₁ und IV₄.
Die erforderlichen und optimalen Verfahrensstufen der vorliegenden Erfindung sie wie folgt:

1. Konzentrierung – Das Ausgangsmaterial, das aus den Fraktionen IV₁ und IV₄ stammt, umfassend eine teilweise gereinigte flüssige Transferrinzubereitung, wird zuerst vor einer weiteren Verarbeitung konzentriert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die teilweise gereinigte flüssige Transferrinzubereitung durch tangentiale Strömungsultrafiltration konzentriert, wie erhältlich von FILTRON. Die teilweise gereinigte flüssige Transferrinzubereitung wird konzentriert bis zwischen 15 mg/ml und 40 mg/ml Transferrin oder vorzugsweise 30 mg/ml. Diese Stufe kann eine optionale Stufe sein, wenn das Ausgangsmaterial dieses Konzentrationsniveau hat.
2. Diafiltration – Nach dem Konzentrieren der teilweise gereinigten flüssigen Transferrinzubereitung wird die Ionenstärke der Zubereitung auf weniger als 5 mS herabgesetzt. Die Ionenstärke wird ausreichend verringert, sodass das Transferrin an eine Chromatographiesäule absorbiert werden wird, die während der späteren Chromatographiestufe verwendet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Ionenstärke durch die Diafiltration verringert, z.B. unter Verwendung eines 22,5 mM bis 27,5 mM Tris-Puffers bis zu einer Leitfähigkeit von etwa 2 mS. In der am Stärksten bevorzugten Ausführungsform wird die Ionenstärke unter Verwendung eines 25 mM Tris-Puffers, ph 7,5, verringert.
3. Chemische Virusinaktivierungsbehandlung – Die flüssige Transferrinzubereitung wird mit Chemikalien behandelt, um umhüllte Viren an einem Punkt vor der Ionenaustauschchromatographie zu inaktivieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wir die Zubereitung mit bekannten organischen Lösungsmitteln mit oder ohne Detergenzien behandelt, um Viren zu inaktivieren. In einer stärker bevorzugten Aus führungsform wird die Zubereitung mit dem organischen Lösungsmittel Tri-n-butylphosphat behandelt, am Stärksten bevorzugt wird die Zubereitung mit 0,3 ± 0,015 Tri-n-butylphosphat und 1,0 ± 0,05 Polysorbat 80 behandelt, um Viren zu inaktivieren.
4. Ionenaustauschchromatographie – Die Zubereitung wird dann einer Ionenaustauschchromatographie unterworfen, wobei das Transferrin an ein Anionenaustauscherharz adsorbiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Anionenaustausch-Chromatographieharz DEAE-650 (Toso Hass) oder ein beliebiges anderes DEAE-Harz (DEAE = Diethylaminoethyl). In der am Stärksten bevorzugten Ausführungsform ist das Anionenaustausch-Chromatographieharz DEAE-650. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Transferrin mit einem Puffer, der NaCl enthält, eluiert, wie 30 bis 40 mM NaCl in 25 mM Tris-Puffer. In einer am Stärksten bevorzugten Ausführungsform wird das Transferrin mit 40 mM NaCl, 25 mM Tris-Puffer eluiert.
5. Zweite Konzentrierung – Das Transferrin-enthaltende Eluat wird dann konzentriert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Eluat durch tangentiale Strömungsultrafiltration wie in Stufe (1) konzentriert. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird das Eluat auf 9-11 mg/ml Transferrin konzentriert. In der am Stärksten bevorzugten Ausführungsform wird das Eluat auf etwa 10 mg/ml Transferrin konzentriert, wobei dessen Gesamtproteingehalt 95% Transferrin, vorzugsweise mindestens 99% Transferrin ist, wie in der Produktspezifikation in Tabelle 1 beschrieben.
6. Umwandlung – Das Transferrin-enthaltende Konzentrat kann dann mit Eisen (Umwandlung von apo-Transferrin zu holo-Transferrin) gesättigt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Konzentrat mit Eisen, entweder mit tels Eisendreichlorid oder Eisenzweichlorid, gesättigt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird das Konzentrat mit Eisen durch Hinzufügen von Eisendreichlorid gesättigt, sodass Eisen/Tf = 1,4 μg/mg bis 5,0 μg/mg in Gegenwart von 10 mM bis 50 mM Natriumhydrogencarbonat, wobei 2 bis 16 Stunden lang gemischt wird. In der am Stärksten bevorzugten Ausführungsform wird das Konzentrat mit Eisen durch Hinzufügen von Eisendreichlorid gesättigt, sodass Eisen/Tf = 3,0 μg/mg in Gegenwart von 10 mM Natriumhydrogenkarbonat, wobei 2 Stunden lang gemischt wird.
7. Zweite Diafiltration – Die Ionenstärke des gesättigten Produkts wird auf weniger als 5 mS herabgesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform wir die Ionenstärke des gesättigten Produkts durch Diafiltration herabgesetzt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wir die Ionenstärke unter Verwendung von 22,5 mM bis 27,5 mM Tris-Puffer herabgesetzt. In der am Stärksten bevorzugten Ausführungsform wird die Ionenstärke unter Verwendung von 25 mM Tris-Puffer herabgesetzt.
8. Sterilfiltration – Das gesättigte Produkt kann weiterhin durch Filtration sterilisiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das gesättigte Produkt durch einen Filter mit nicht mehr als 0,22 μm filtriert. In der am Stärksten bevorzugten Ausführungsform wird das gesättigte Produkt durch einen 0,22-μm-Filter filtriert.
9. Virusfiltration – Das gesättigte Produkt wird dann nanofiltriert, um Viren zu entfernen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das gesättigte Produkt durch einen 15 nm oder kleineren Filter filtriert. Derzeit wird das gesättigte Produkt in der am Stärksten bevorzugten Ausführungsform durch ein 15-nm-Filter filtriert.
10. Lyophilisierung – Das letztendliche Hauptmassenprodukt (bulk product) kann in einen letztendlichen Behälter abgefüllt und lyophilisiert werden.

Wie durch Fachleute auf dem Gebiet erkannt werden wird, stellt das gegenwärtig offenbarte Verfahren ein einfaches und ökonomisches Verfahren zum Herstellen hochgereinigten Transferrins bereit. Das Verfahren benötigt nur 2 Hauptausrüstungsgegenstände und 3 Puffer.
BEISPIELE
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen veranschaulicht.
A. Beispiel 1
Eine Fraktion, umfassend Transferrin, kann unter Verwendung eines Verfahrens zur Reinigung von α-1-Proteinaseinhibitor (hierin nachstehen „α₁-PI") erhalten werden. Speziell kann α₁-PI aus den Cohn-Fraktionen IV₁ und IV₄ unter Befolgen der unten beschriebenen Schritte aufgereinigt werden. Die anfängliche Chromatographiestufe mit einem quaternären Amin-Anionenaustauscher (QAE) erzeugt eine Transferrin-enthaltende Durchflusszubereitung. Obwohl die Zubereitung in Wesentlichen frei von Albumin ist, ist sie kein hochgereinigtes Transferrin und wird gewöhnlich als Abfallprodukt verworfen. Ein Verfahren zur Reinigung von α₁-PI und dadurch zum Erhalten eines Ausgangsmaterials für die vorliegende Erfindung lautet wie folgt:

1. Cohn-Fraktion IV₁ und IV₄;
2. Wasserextraktion aus Cohn-Fraktionen (ph etwa 8,0)
3. Fraktionierung mit 15% PEG und 0,5 mM ZnCl₂
4. Unterwerfen des Überstands der Fraktionierung aus Stufe (3) einer zweiten Fraktionierung unter Verwendung von ZnCl₂ (10 mM);
5. Präzipitat aus Stufe (4) wird mit EDTA resolubilisiert;
6. Resolubisiertes Präzipitat wird über Anionenaustausch-Adsoprtionsmedium zur Adsorption von α₁-PI geleitet.
7. Durchfluss der Anionenaustauscherchromatographie aus Stufe (6) umfasst eine teilweise gereinigte Transferrin-Fraktion.

Die teilweise gereinigte Transferrin-Fraktion, die wie oben erhalten wurde, kann weiter unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung gereinigt werden, um ein steriles und im Wesentlichen virusfreies Transferrin-Produkt zu erhalten.
B. Beispiel 2
Ein spezielles Beispiel eines Verfahrens zum Herstellen einer Transferrin-enthaltenden Zubereitung zur Verwendung als Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung hierin ist das Folgende:
20 kg des Präzipitats der Cohn-Fraktionen IV₁ und IV₄ wurden in 180 kg Wasser zur Injektion („water for injection") („WFI") bei 3,8°C resuspendiert und der pH wurde auf 8,94 eingestellt. Nachdem das Präzipitat resuspendiert worden war, wurden 242,3 g Tris, 6,7 kg 1 M NaCl, und 35,4 kg Polyethylenglycol („PEG") hinzugefügt und die Lösung wurde 60 Minuten lang gemischt. Dann wurden 2,2 kg 100 mM ZnCl₂ hinzugefügt und die Suspension wurde auf pH 7,92 eingestellt und für weitere 60 Minuten bei 0-8°C gemischt.
Das PEG/ZnCl₂-Präzipitat, welches gebildet wurde, wurde entfernt, indem die Suspension durch eine Filterpresse bei 0- 8°C, nach der Zugabe von 977 g Filtrazell BH 20 Filter Aid (geliefert von Celite aus Deutschland), hindurchgeleitet wurde. Die Filterpresse wurde vor und nach dem Filtrieren mit 30 kg von 150 mM NaCl, 15% G/G PEG, 0,5 mM ZnCl₂, pH 8,0, gewaschen.
27,8 kg 100 mM ZnCl₂ wurden zu dem Überstand hinzugefügt und die Lösung wurde auf pH 8 eingestellt. Das Präzipitat, das in Gegenwart des ZnCl₂ gebildet wurde, wurde mittels Zentrifugation in einer Sharples-Zentrifuge gewonnen. Das ZnCl₂-Präzipitat wurde in 20 kg von 50 mM EDTA resolubilisiert und auf eine Leitfähigkeit von 6,48 mS und einen pH von 7,97 eingestellt.
Das resolubilisierte ZnCl₂-Präzipitat wurde dann auf ein QAE-Chromatographiemedium (geliefert von Toso Hass), gepackt in eine 20 L-Säule mit einem Innendurchmesser von 250 cm, aufgegeben. Das QAE-Medium wurde bei 4°C mit kaltem Wasser zur Injektion („cold water for injection") („CWFI") äquilibriert. Das α₁-PI wurde dann in dem Chromatographiemedium absorbiert. Das Chromatographiemedium wurde dann mit 60 L von 50 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,92, gewaschen. Das teilweise gereinigte Transferrin-Produkt ist in dem Durchfluss und den Waschfraktionen in der oben beschriebenen Chromatographiestufe enthalten. Obwohl es häufig als Abfallprodukt angesehen wird, kann dieses teilweise gereinigte Transferrin-Produkt weiter unter Verwendung der Verfahren der hierin beanspruchten Erfindung gereinigt werden.
C. Beispiel 3
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Verfahren der vorliegenden Erfindung. Eine teilweise gereinigte Transferrin-Fraktion, die aus der Cohn-Fraktion IV₁ oder IV₄ stammt, wird als Ausgangsmaterial verwendet. Es wurde den folgenden Schritten gefolgt.
2 L des Ausgangsmaterials wurden auf etwa 400 ml mittels tangentialer Strömungsultrafiltration (UF) mit einer Membran mit einem nominalen Molekulargewichtsausschluss („nominal melecular weight cutoff") (NMWC) von 10 bis 30 kD konzentriert (5×). Das Konzentrat wurde mit 5 Teilen des Volumens („parts to volume")(„p.v.")von 25 mM Tris-Puffer, pH 7,5, diafiltriert. Dies verringerte seine Ionenstärke in der Vorbereitung für die Ionenaustauschchromatographie. Eine OSD-Lösung mit 3% Tri-n-butylphosphat (TNBP) und 10% Polysorbat-80 wurde dem Virusinaktivierungsprotokoll folgend, das in dem US-Patent Nr. 4,450,573 offenbart wurde, dem Produkt hinzugefügt und es wurde bei 26°C für 6 Stunden oder mehr inkubiert. Die Endkonzentrationen in der Zubereitung waren wie folgt: TNBP = 0,3%, Polysorbat 80 = 1,0%.
500 ml DEAE-650-Harz, gepackt in eine Chromatographiesäule, wurden mittels Äquilibrierung mit dem Produktpuffer zur Verwendung vorbereitet. 4 Säulenvolumina („column volumes") (c.v.) von 25 mM Tris-Puffer, pH 7,5, (2L) wurden bei einer LFR von 0,5 (Läufe 1 & 2) und 0,8 (Lauf 3) ml/cm²/min durch die Säule gepumpt. Diese Flussraten wurden für die gesamte Chromatographiestufe in jedem Lauf aufrechterhalten. Für Lauf (1) wurde das Chromatographieverfahren bei 5°C durchgeführt, die verbleibenden Läufe wurden bei Raumtemperatur (23–25°C) durchgeführt.
330 ml des Transferrinkonzentrats wurden auf die Säule aufgegeben. Um kontaminierende Proteine und restliches OSD zu entfernen, wurde die Säule mit 4, 8 und 12 c.v. von 25 mM Tris-Puffer, pH 7,5, für die Läufe 1, 2 bzw. 3 gewaschen. Das Säulenwascheluat wurde spektrophotometrisch bei 280 nm überwacht und auf einem Schreiber verfolgt.
Transferrin wurde unter Verwendung von 25 mM Tris-Puffer, pH 7,5, mit 40 mM NaCl eluiert. Um das Transferrin-reiche Eluat zu sammeln, wurde das Eluat beim ersten Nadelausschlag auf dem Schreiber in ein Sammelgefäß abgeleitet. Die Sammlung des Eluats wurde gestoppt, wenn die Nadel zur Basislinie zurückkehrte. Etwa 1,6 L Transferrin-reiches Eluat wurde für jeden Lauf gesammelt. Nach der Gewinnung des Transferrins wurde die Säule mit 4 c.v. von 25 mM Tris-Puffer, pH 7,5, enthalten 2 M NaCl, gereinigt.
Das Transferrineluat wurde dann mittels einer 30 kD-Ultrafiltration auf etwa 300 ml mit 10 mg Transferrin/ml konzentriert. Um das Produkt in holo-Transferrin (eisengesättigt) umzuwandeln, wurden eine Lösung von 7,2 mM Eisendreichlorid-Hexahydrat, pH 2,7, und eine Lösung von 200 mM Natriumhydrogencarbonat, pH 8,0, zu dem Produkt hinzugefügt, um Eisen/Transferrin = 3 μg/mg und Natriumhydrogencarbonat = 10 mM zu erhalten. Das Produkt wurde dann bei Raumtemperatur (23–25°C) 2 Stunden lang inkubiert.
Die Diafiltration des Produktes mit 6 c.v. von 25 mM Tris, pH 7,5, wurde durchgeführt, um überschüssiges Eisen- und Elutionspuffersalz zu entfernen. Das Produkt wurde dann durch ein 0,22 μm Millipore-Filter mit 100 cm² Oberflächenfläche bei einer Flussrate von 4 ml/min filtriert. Diese Filtration entfernte Bakterien und andere Micropartikel in der Vorbereitung für die nano-Filtration. Der Asahi Planova 15 nm-Filter wurde für eine statische („dead-end") Filtration aufgebaut und das Produkt wurde mit 0,5 bis 1,0 ml/min hindurchgepumpt. Dies produzierte ein Endvolumen von etwa 300 ml.
Die letztendlichen Behälter dieser Charge wurden hergestellt, indem 10 ml (100 mg Transferrin) der letztendlichen Hauptmassenlösung in 20 ml-Phiolen gefüllt wurden und lyophilisiert wurden. Das Produkt wurde insgesamt 90 Stunden lyophilisiert.

Die Versuchsdaten zur Verfahrensoptimierung aus den Chroma tographie-, Diafiltrations- und Umwandlungsstufen führten zur Festsetzung des folgenden Verfahrens. Ausgangsmaterial mit Tf-Konzentration von 3 mg/ml wird mittels OF mit einer 30 Kd-Membran auf 15 mg/ml konzentriert. Dies wird anschließend mit 5 p.v. von 25 mM Tris-Puffer, pH 7,5, diafiltriert. Das Konzentrat wird dann nach dem in dem US-Patent Nr. 4,540,573 offenbarten Protokoll folgend mit OSD behandelt und auf eine DEAE-650-Harz-Säule aufgegeben. Die Chromatographie wird bei Raumtemperatur (23–25°C) bei einer LFR von 1,0 cm/min durchgeführt. Tf wird mit 0,04 M NaCl, 25 mM Tris-Puffer, pH 7,5, eluiert. Das Eluat wird mittels OF bis zu einer Tf-Konzentration von 10 mg/ml konzentriert und mit Eisen- und Natriumhydrogencarbonatlösungen bis zu einem Eisen-/Tf-Verhältnis von 3 mg/mg und 10 mM Hydrogencarbonat bei Raumtemperatur vermischt. Das Produkt wird dann mit 5 p.v. von 25 mM Tris-Puffer, pH 7,5, diafiltriert. Das Material wird dann durch einen 0,22-μm-Filter sterilfiltriert und durch einen 15-nM-Filter unter Bildung des Endvolumens virusfiltriert. 20-ml-Phiolen werden dann mit 5 ml des Endvolumens mit 10 mg/ml gefüllt und über 90 Stunden dem Lyophilisierungsverfahren folgend lyophilisiert, um den letztendlichen Behälter zu bilden. Die Spezifikationen des Produkts, das unter Verwendung des offenbarten Verfahrens erhalten wird, sind in Tabelle 1 aufgelistet. Das Transferrin-Produkt ist zu mindestens 95% rein und enthält ein molares Verhältnis Eisen/Transferrin von 2 μg/mg mit einer Tf-Konzentration von etwa 10 mg/ml. Tabelle 1 Produktspezifikation

Aussehen	Rötlicher Feststoff
Löslichkeit	< 5 min
Partikel	Nicht sichtbar
pH	7,5 ± 0,3
Eisen	1,2 ± 0,2 μg/mg Tf
SDS-PAGE	Eine Hauptbande
Western Blot	Eine Hauptbande
HPLC	> 95% Fläche
Zink	0,8 μg/mg
PEG	≤ 20 μg/mg Tf
TNBP	≤ 0,16 μg/mg Tf
Tween-80	≤ 30 μg/mg Tf
Endotoxin	< 1 EU/mg Tf
Feuchtigkeit	< 3%
Transferrin	50 mg Phiolen
	5 mg/ml

Es wird verstanden, dass die Beschreibung und die Beispiele dazu gedacht sind die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen.

Claims

Verfahren zur Reinigung von Transferrin, umfassend die Stufen a.) Konzentrieren einer teilweise gereinigten Transferrinzubereitung b.) Herabsetzung der Ionenstärke der Transferrinzubereitung, die für die anschließende Adsorption des Transferrins an einem Ionenaustausch-Chromatographiemedium ausreichend ist c.) Behandeln der Transferrinzubereitung vor der folgenden Stufe (d) mit einer organischen Verbindung zur Inaktivierung umhüllter Viren d.) Unterwerfen der Zubereitung einem Ionenaustausch-Chromatographiemedium mit einer Ionenstärke, die ausreichend ist, um sicherzustellen, dass das Transferrin adsorbiert wird e.) Eluieren des Transferrins aus dem Ionenaustauschmedium von Stufe (d) f.) Konzentrieren des resultierenden Eluats und g.) Filtration des konzentrierten Eluats zur Entfernung von Virusteilchen zum Erhalt einer sterilen Transferrinzubereitung, die im Wesentlichen von umhüllten und nichtumhüllten Viren frei ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das an Transferrin angereicherte Eluat aus Stufe (e) mit Eisen gesättigt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Ionenstärke des gesättigten Eluats herabgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die teilweise gereinigte Transferrinzubereitung von Stufe (a) um das 5-fache konzentriert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Ionenstärke durch Diafiltration herabgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die Ionenstärke durch Diafiltration herabgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, worin die Ionenstärke der Transferrinzubereitung durch Diafiltration mit einem 25 mM Tris-Puffer herabgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Ionenstärke der Transferrinzubereitung durch Diafiltration mit einem 25 mM Tris-Puffer herabgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die organische Verbindung zur Inaktivierung von Viren ein organisches Lösungsmitteldetergens ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin Transferrin in Stufe (d) unter Verwendung von 0,04 M NaCl, 25 mM Tris-Puffer eluiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Konzentration in Stufe (a) durch tangentiale Strömungsultrafiltration durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Eluat nach Anspruch 1 in Stufe (e) auf 10 mg/ml Protein konzentriert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, worin Eisen(III)chlorid zur Sättigung der Transferrinzubereitung verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Filtration der Transferrinzubereitung in Stufe (g) unter Verwendung eines 0,22 μm-Filters zum Erhalt einer sterilen Transferrinzubereitung durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Filtration der Transferrinzubereitung in Stufe (g) unter Verwendung eines 15 nm-Filters zum Erhalt einer Transferrinzubereitung, die im Wesentlichen frei von nichtumhüllten Viren ist, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Konzentration in Stufe (f) durch eine tangentiale Strömungsultrafiltration durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Konzentration in Stufen (a) und (f) durch tangentiale Strömungsultrafiltration durchgeführt wird.