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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inaktivierung von vermehrungsfähigen Krankheits- erregern in Präparationen, die Blutgerinnungsfaktoren, welche plasmatische Proenzyme sind, ent- halten, insbesondere die Faktoren I, II, V, VII, IX, X, XIII und"FEIBA"sowie Prothrombin- komplexpräparationen.
Aus der veröffentlichten Patentanmeldung 0018561 ist es bekannt, Gerinnungsfaktoren ent- haltende Präparationen, die praktisch fibrinogenfrei sind, gegen Hitzeeinwirkung zu stabilisieren, indem der Lösung der Gerinnungsfaktoren Aminosäure und ein Mono-, Oligosaccharid oder Zucker- alkohol zugesetzt wird. Nach einer solchen Behandlung kann die Präparation 10 h bei 600C er- hitzt werden, wobei es bekannt ist, dass eine solche Behandlung bei Humanalbumin eine Inaktivie- rung von Hepatitisviren bewirkt. Das bekannte Verfahren hat den Nachteil, dass die Ausbeute an den Gerinnungsfaktoren nicht zufriedenstellend ist. Weiters wurde das Verfahren gegenüber
Modellviren nicht erprobt, so dass das Wirkungsspektrum dieser Stabilisierungsbehandlung auf verschiedene Krankheitserreger unbekannt ist.
In der veröffentlichten europäischen Pententanmeldung 0035204 ist weiters ein Verfahren zur Herstellung einer Proteinkomposition beschrieben, welches Verfahren darin besteht, dass die Komposition mit einem Polyol gemischt und die Mischung erhitzt wird, während einer Dauer, die ausreicht, um die Proteinkomposition zu pasteurisieren. Auch bei diesem Verfahren ist das Wirkungsspektrum der Behandlung nicht bekannt und die Ausbeute nicht zufriedenstellend.
Nach der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung 0052827 ist des weiteren ein Verfahren zur Herstellung einer Präparation der Gerinnungsfaktoren II und/oder VII bekanntgeworden, welches hepatitissicher sein soll ; das Verfahren besteht im Erwärmen der Präparation in Gegenwart einer Aminosäure, eines Saccharids oder Zuckeralkohols und eines Chelatbildners, wie eines Salzes der Äthylendiaminotetraessigsäure. Auch bei diesem Verfahren, welches eine Modifikation des ersterwähnten ist, ist das Wirkungsspektrum gegenüber Krankheitserregern allgemein nicht bekannt.
Gemäss einem weiteren bekannten Verfahren nach der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung 0053338 wird bei einem Verfahren zur Herstellung eines die Blutgerinnungsfaktoren IX und/oder X enthaltenden Präparation, die hepatitissicher sein soll, die Präparation in Gegenwart einer Aminosäure, eines Saccharids oder Zuckeralkohols und Ca-Ionen erwärmt, wobei den Ca-Ionen eine wärmestabilisierende Wirkung auf die Faktoren IX und X zugeschrieben wird. Auch dieses Verfahren ist als Modifikation des vorangeführten Standes der Technik anzusehen. Es sind die gleichen Nachteile anzunehmen, und der Wirkungsmechanismus auf die Inaktivierung vermehrungsfähiger Krankheitserreger ist unbekannt. Der Zusatz von Ca-Ionen ist bei der Herstellung gewisser Gerinnungsfaktoren, wie z.
B. bei der Herstellung von Gerinnungsfaktorenkomplexen, sogar von ausgesprochenem Nachteil, da Calcium aktivierend auf solche Komplexe wirkt.
Die Erfindung bezweckt die Vermeidung dieser Nachteile und Schwierigkeiten. Sie beruht auf einer neuen Erkenntnis, nämlich, dass die Inaktivierung von Krankheitserregern in biologischen und pharmazeutischen Medien von in den Präparationen enthaltenen Proteinen gehemmt wird. Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, diese Schutzwirkung der Proteine auf Krankheitserreger zu durchbrechen bzw. zu überwinden, - unter gleichzeitiger Erhaltung der biologischen Aktivität und der molekularen Integrität der Proteine -, um auf diese Weise sichere Blutgerinnungsfaktoren enthaltende Präparationen zur Verfügung zu stellen.
Alle zu dem Stand der Technik gehörenden Massnahmen, wie die Zugabe von Zuckeralkoholen oder Aminosäuren, lösen diese Aufgabe nicht, sondern sie haben eine zusätzliche Stabilisierungsbzw. Schutzwirkung auf Krankheitserreger gegenüber Hitzeeinwirkung.
Die Erfindung besteht bei einem Verfahren der eingangs beschriebenen Art darin, dass die Blutgerinnungsfaktor-Präparationen in Abwesenheit von Calciumionen durch Zusatz von Salzen oder Salzgemischen auf eine Salzkonzentration von mehr als 0,5 molar gebracht und wärmebehandelt werden, worauf die Salze aus der Fraktion bzw. Präparation entfernt werden.
Weitere Merkmale und bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens sind in den Unteransprüchen angeführt.
Wie schon erwähnt, ist eine der Grundlagen, auf der die Erfindung fusst, die Erkenntnis, dass die Schutzwirkung von Proteinen auf Krankheitserreger durch Salze und Wärmebehandlung
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aufgehoben wird. Diese Tatsache ist in den folgenden Modellversuchen am Beispiel verschiedener Viren veranschaulicht :
Versuch 1 :
Poliomyelitis-Virus Typ I wurde einerseits in physiologische Kochsalzlösung, anderseits in eine 5% ige Plasmaproteinlösung eingebracht. Die beiden mit Poliovirus versetzten Lösungen wurden
EMI2.1
Gewebekulturansätze einen cytopathogenen Effekt zeigten.
EMI2.2
<tb>
<tb>
Titer <SEP> nach <SEP> 10 <SEP> stündiger
<tb> Erhitzung <SEP> bei <SEP> 45 C
<tb> Virus <SEP> in <SEP> physiologischer <SEP> Kochsalzlösung <SEP> 3, <SEP> 9 <SEP>
<tb> Virus <SEP> in <SEP> Plasmaproteinlösung <SEP> 7,8
<tb>
Der Versuch wurde mit dem gleichen Virus wiederholt, jedoch wurden beide Lösungen vor der Erhitzung mit Ammoniumsulfat (AMS) bis zur annähernden Salzsättigung versetzt (0, 7 g Ammoniumsulfat/ml), wobei ein PH-Wert von 7, 3 resultierte. Nach 10 stündiger Erhitzung bei 45 C wurde der Virustiter wie folgt bestimmt.
EMI2.3
<tb>
<tb>
Titer <SEP> nach <SEP> 10 <SEP> stündiger
<tb> Erhitzung <SEP> bei <SEP> 450C
<tb> Virus <SEP> in <SEP> AMS-haltiger <SEP> physiologischer
<tb> Kochsalzlösung <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Virus <SEP> in <SEP> AMS-haltiger <SEP> Plasmaproteinlösung <SEP> < <SEP> 3
<tb>
Versuch 2 :
Poliomyelitis-Virus Typ I, Rotavirus und Coxsackie-Virus wurden jeweils einer Plasmaproteinlösung mit einem Gehalt von 54 mg Protein/ml zugesetzt. Zu je 10 ml dieser mit Viren versetzten Plasmaproteinlösungen wurden 7 g Ammoniumsulfat zugefügt und der PH-Wert auf 7,0 gestellt.
In Parallelversuchen wurden die virus-und ammoniumsulfathaltigen Lösungen einmal während 10 h auf 4 C gehalten und einmal während 10 h auf 60 C erhitzt. Anschliessend wurde das Salz aus den Proben durch Dialyse entfernt und eine Virustiterbestimmung vorgenommen. Die in der folgenden Tabelle angegebenen Werte sind dekadische Logarithmen der TCID,,/0, 1 ml.
EMI2.4
<tb>
<tb>
Titer
<tb> 10 <SEP> h/4 C <SEP> 10 <SEP> h/600C
<tb> Poliomyelitis-Virus <SEP> Typ <SEP> I <SEP> + <SEP> AMS
<tb> in <SEP> Plasmaproteinlösung <SEP> 7, <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 1 <SEP>
<tb> Rotavirus <SEP> + <SEP> AMS <SEP> in <SEP> Plasmaproteinlösung <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP> < <SEP> 1
<tb> Coxsackie-Virus <SEP> + <SEP> AMS <SEP> in
<tb> Plasmaproteinlösung <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP> < <SEP> 1
<tb>
EMI2.5
LAktivitätlegungsschrift der Patentinhaberin 3127318 im einzelnen beschrieben.
Beispiel 1 : Frisch gefrorenes menschliches Citratplasma wird aufgetaut und das dabei anfallende Kryopräzipität abgetrennt. Dem Kryoüberstand wied DEAE-Sephadex zugesetzt und während
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einer Kontaktzeit von 12 h wird die FEIB-Aktivität generiert. Alle Gerinnungsfaktoren werden sodann vom DEAE-Sephadex mit einem Puffer eluiert. Nach einem Lyophilisationsschritt steht ein Bulkmaterial zur Verfügung. Von diesem Pulver werden 312 mg mit 10 ml H20 gelöst. Diese Lösung enthält 20 ml Protein, 24 E FEIBA und 28 E Faktor VII/ml.
Zur Veranschaulichung der Inaktivierungswirkung der erfindungsgemäss anzuwendenden Massnahmen wurde nun diesem Produkt absichtlich ein Virus, nämlich ein Virus von Poliomyelitis Typ I zugefügt. Sodann wurde zu einer Probe des virusversetzten Produktes Ammoniumsulfat (AMS) in einer Menge von 0, 8 g/ml zugefügt, während eine Kontrollprobe salzfrei blieb. Beide Proben wurden auf PH 7 gestellt. Die salzhältige Probe wurde 10 h bei 60 C erhitzt und anschliessend bei beiden Proben der Virustiter bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angeführt.
EMI3.1
<tb>
<tb>
Virustiter
<tb> Probe <SEP> nach <SEP> Salz- <SEP> Unbehandelte <SEP> KonHitzeinaktivierung <SEP> trollprobe <SEP> (+4 C)
<tb> Präparation <SEP> enthaltend <SEP> die <SEP> Faktoren <SEP> II, <SEP> VII, <SEP> IX, <SEP> X, <SEP> FEIBA <SEP> < 2, <SEP> 5 <SEP> 7, <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Die erfindungsgemässe kombinierte Salz-Hitze-Behandlung bewirkt nicht nur eine zuverlässige Inaktivierung von Krankheitserregern, wie Viren, sondern ein ebenso bedeutsamer Effekt ist die Erhaltung der biologischen Aktivität und der molekularen Integrität der Proteine. Um dies zu zeigen, wurde die wie im vorhergehenden beschriebene FEIBA-Präparation der Gerinnungsfaktoren einer Aktivitätsbestimmung vor und nach der Salz-Hitze-Behandlung unterzogen, wobei das AMS durch Dialyse entfernt wurde. Die Aktivitätsbestimmung erfolgte nach den in der genannten DE-OS 3127318 beschriebenen Methoden.
Die Ergebnisse sind der folgenden Tabelle zu entnehmen.
EMI3.2
<tb>
<tb>
F. <SEP> II <SEP> F. <SEP> VII <SEP> F. <SEP> IX <SEP> F. <SEP> X <SEP> FEIBA
<tb> Restaktivität <SEP> nach <SEP> der <SEP> Salz-Hitze-Behandlung, <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> g <SEP> AMS/ml <SEP> 10 <SEP> h <SEP> 600C <SEP> 61 <SEP> 43 <SEP> 41 <SEP> 27 <SEP> 39
<tb>
Beispiel 2 : Entsprechend der in Vox Sang. 33 : 3750 p. 37 - 50 (1977) beschriebenen Methode wurden die Gerinnungsfaktoren II, IX und X aus menschlichem Plasma über eine Adsorption an DEAE-Sephadex einer Waschung des Anionenaustauschers und einer Elution des partiellen Prothrombinkomplexes gewonnen. Das Eluat wurde einem Dialyse- und Gefriertrocknungsprozess unterworfen.
Von diesem Bulkpulver wurden 467 mg mit 10 ml H20 gelöst. Diese Lösung enthielt 35 mg Protein, 70 E Faktor II, 42 E Faktor IX und 61 E Faktor X/ml und stellte somit eine Präparation eines partiellen Prothrombinkomplexes dar.
Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde der Präparation absichtlich Poliomyelitis-Virus Typ I zugefügt und die Präparation mit AMS einer 10 stüdigen Hitzebehandlung bei 60 C unterworfen. Anschliessend erfolgte die Virustiterbestimmung und nach einer Dialyse die Bestimmung der Aktivität der Gerinnungsfaktoren.
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EMI4.1
<tb>
<tb>
Virustiter
<tb> Probe <SEP> nach <SEP> Salz- <SEP> Unbehandelte <SEP> Kon-- <SEP>
<tb> Hitzeinaktivierung <SEP> trollprobe <SEP> (+4 C)
<tb> Präparation <SEP> enthaltend <SEP> partiellen <SEP> Prothrombinkomplex <SEP> < <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 6, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Aktivität <SEP> Faktor <SEP> II <SEP> IX <SEP> X
<tb> % <SEP> Restaktivität <SEP> nach <SEP> Salz-Hitze-Behandlung <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> g <SEP> AMS/ml, <SEP> 10h60 C <SEP> 66 <SEP> 39 <SEP> 28
<tb>
Beispiel 3 : Entsprechend der in der AT-PS Nr. 359, 646 beschriebenen Methode wurde Gerinnungsfaktor VII-Präparation aus menschlichem Citratplasma hergestellt. Nach Abtrennung des Kryopräzipitates und einer DEAE-Sephadexbehandlung wurde Faktor VII an AI (OH) 3 adsorbiert.
Al (OH) 3 wurde einem Waschprozess und einem Faktor VII-Elutionsprozess bei erhöhter Ionenstärke unterworfen. Das Faktor VII-hältige Eluat wurde dialysiert und lyophilisiert. 192 mg des Bulkpulvers wurden mit 10 ml H20 gelöst. Diese Lösung enthielt 10, 3 mg Protein und 21 E Faktor VII/ml.
Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde auch hier absichtlich Poliomyelitis-Virus Typ I zugefügt und die Präparation mit AMS einer 10 stündigen Hitzebehandlung bei 60 C unterworfen. Anschliessend erfolgte die Virustiterbestimmung und nach einer Dialyse die Bestimmung der Aktivität der Gerinnungsfaktoren.
EMI4.2
<tb>
<tb>
Virustiter
<tb> Probe <SEP> nach <SEP> Salz-Unbehandelte <SEP> KonHitzeinaktivierung <SEP> trollprobe <SEP> (+4 C)
<tb> Präparation <SEP> enthaltend <SEP> Faktor <SEP> VII <SEP> < <SEP> 3 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Aktivität <SEP> Faktor <SEP> VII
<tb> %. <SEP> Restaktivität <SEP> nach <SEP> Salz-Hitzebehandlung <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> gAMS/mI <SEP> 10 <SEP> h <SEP> 60 C <SEP> 58
<tb>
PATENTANSPRÜCHE :
EMI4.3
gekennzeichnet, dass die Blutgerinnungsfaktor-Präparationen in Abwesenheit von Calciumionen durch Zusatz von Salzen oder Salzgemischen auf eine Salzkonzentration von mehr als 0, 5 molar gebracht und wärmebehandelt werden, worauf die Salze aus der Fraktion bzw. Präparation entfernt werden.