DE3813464A1

DE3813464A1 - Verfahren zur waermebehandlung von fibrinogen

Info

Publication number: DE3813464A1
Application number: DE3813464A
Authority: DE
Inventors: Kenmi Miyano; Kenji Tanaka; Hideo Nishimaki; Yoshiro Iga
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1987-04-21
Filing date: 1988-04-21
Publication date: 1988-11-10
Also published as: US5116950A; ES2006632A6

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Wärmebehandlung einer wäßrigen Lösung, die Fibrinogen enthält, um dadurch ein darin enthaltenes Virus bzw. Viren zu inaktivieren.

Um Viren zu inaktivieren, die möglicherweise ein Plasmaprotein, wie Albumin, kontaminieren, wurde von Murray et al ein Verfahren vorgeschlagen, das die Erwärmung einer wäßrigen Lösung des genannten Proteins umfaßt (im folgenden bezeichnet als Flüssigerwärmen) [s. The New York Academy of Medicine, 31 (5), 341-358 (1955)]. Von diesem Verfahren des Flüssigerwärmens nimmt man an, daß es eine sehr wirksame Methode zur Virusinaktivierung darstellt; die Wirkung auf die Inaktivierung eines Virus hat man epidemiologisch nachgewiesen. Aus diesem Grunde wurde bis heute die Flüssigerwärmung routinemäßig angewendet.

Unter den Plasmaproteinen eignen sich jedoch nur einige wenige, darunter Albumin, für das vorstehend genannte Verfahren der Flüssigerwärmung; viele Proteine, die eine hohe physiologische oder biologische Aktivität besitzen, sind gegenüber Wärme empfindlich und neigen dazu, thermisch denaturiert zu werden, was häufig zu einer Abnahme oder zu einem Verlust ihrer Aktivität führt.

Fibrinogen, ein Plasmaprotein, ist häufig durch ein Virus bzw. Viren kontaminiert, insbesondere dem Hepatitis- oder AIDS-Virus. Aus diesem Grunde sollte es zur Inaktivierung dieser Viren wärmebehandelt werden. Fibrinogen ist jedoch gegenüber Wärme instabil und wird während der üblichen Verfahren des Flüssigerwärmens inaktiviert. Aus diesem Grunde besteht ein Bedarf nach einem Verfahren zur Wärmebehandlung von Fibrinogen, um dadurch kontaminierende Viren zu inaktivieren, ohne dabei das Fibrinogen selbst zu inaktivieren.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Wärmebehandlung einer wäßrigen Lösung, die Fibrinogen enthält, zur Verfügung zu stellen, bei welchem das Fibrinogen selbst nicht in signifikanter Weise inaktiviert wird, wobei jedoch die darin enthaltenen kontaminierenden Viren vollständig oder zumindest im wesentlichen vollständig inaktiviert werden.

Aus diesem Grunde haben die Erfinder zahlreiche Verfahren untersucht und gefunden, daß, wenn man eine wäßrige, Fibrinogen-haltige Lösung erwärmt, um darin enthaltene Viren zu inaktivieren, wie das Hepatitisvirus oder das AIDS-Virus, die Wärmestabilität des Fibrinogens durch Zugabe von mindestens einem Zucker, einer Aminosäure und einem Magnesiumsalz in starkem Maße erhöht wird.

Somit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erwärmung von Fibrinogen, das darin besteht, daß man eine wäßrige Fibrinogen-haltige Lösung in Gegenwart von mindestens einem Zucker, einer Aminosäure und einem Magnesiumsalz erwärmt, bis das Virus oder die Viren, die möglicherweise das genannte Fibrinogen kontaminieren, inaktiviert sind.

Das Fibrinogen, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wärmebehandelt wird, stellt eine Substanz dar oder enthält eine Substanz, die als Fibrinogen biologische oder physiologische Aktivität aufweist, wie Substanzen, die durch Fraktionierung von Plasmaproteinen erhalten werden.

Beispiele derartiger Fibrinogen-haltiger Fraktionen umfassen Plasma, die erste Fraktion, die durch Cohn-Fraktionierung mit Ethanol erhalten wird, Cryopaste, eine Abfallfraktion, die nach Extrahieren von Antihämophiliefaktor aus Cryopaste verbleibt, und Fibrinogenpräparationen, einschließlich solcher Präparationen, die den biologischen Produktstandards entsprechen.

Die Konzentration an Fibrinogen oder Fibrinogen-haltigem Protein in der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erwärmenden Lösung liegt im allgemeinen im Bereich von 0,2 bis 6 G/V-%, vorzugsweise von 1 bis 4 G/V-%. Die Bestimmung der Fibrinogenkonzentration erfolgt mit Hilfe des Fibrinogenbestimmungs-Sets, wie es von American Dade Inc. erhältlich ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden als Stabilisatoren mindestens ein Zucker, eine Aminosäure und ein Magnesiumsalz eingesetzt.

Als Zucker werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als Stabilisator Monosaccharide, Disaccharide und Zuckeralkohole verwendet.

Beispiele von Monosacchariden umfassen Glucose, Galactose und Mannose.

Beispiele von Disacchariden umfassen Sucrose, Lactase und Maltose.

Beispiele von Zuckeralkoholen umfassen Xylit, Sorbit und Mannit. Unter diesen ist Xylit am meisten bevorzugt.

Als Aminosäure kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren entweder eine neutrale, saure oder basische Aminosäure eingesetzt werden.

Beispiele von neutralen Aminosäuren umfassen Glycin, Alanin, Prolin, Tryptophan und Serin. Unter diesen Aminosäuren ist Alanin am meisten bevorzugt.

Beispiele von sauren Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure.

Beispiele von basischen Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin.

Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende Magnesiumsalz ist keiner besonderen Beschränkung unterworfen, solange es ein anorganisches Salz darstellt und in Wasser bei einer Konzentration löslich ist, die ausreicht, um den gewünschten Stabilisierungseffekt zu erzielen. Beispiele umfassen Magnesiumchlorid, Magnesiumhydroxid, Magnesiumsulfat, Magnesiumnitrat und Magnesiumphosphat. Unter diesen Magnesiumsalzen ist Magnesiumchlorid besonders bevorzugt.

Diese Stabilisatoren können z. B. in den folgenden Mengen zugegeben werden: 20 bis 100 G/V-%, vorzugsweise 60 bis 100 G/V-% Zucker; 0,1 bis 15 G/V-%, vorzugsweise 5 bis 10 G/V-% einer Aminosäure; und 0,01 mM bis 3 M, vorzugsweise 1 bis 100 mM eines Magnesiumsalzes, bezogen auf 0,2 bis 6 G/V-% Fibrinogenlösung.

Weitere Stabilisierungszusätze, die z. B. aus Neutralsalzen, wie Kalziumchlorid und Natriumchlorid, und organischen Säuresalzen, wie Natriumcaproat und Natriumcitrat, ausgewählt sind, können im weiteren als Hilfsstabilisatoren zu der wäßrigen Fibrinogenlösung zugegeben werden. Diese Zusätze werden im allgemeinen in einer Konzentration von 0,001 bis 1 M der Fibrinogenlösung zugegeben.

Der pH-Wert der Lösung wird vorzugsweise auf ca. 5 bis 8, besonders bevorzugt auf 6 bis 7 eingestellt.

Da die Reinheit des Fibrinogens die Wärmebeständigkeit desselben kaum beeinflußt, ist der Stabilisierungseffekt des erfindungsgemäßen Verfahrens im wesentlichen konstant, ungeachtet der Reinheit des Fibrinogens. Deshalb kann das erfindungsgemäße Verfahren sowohl an einem Fibrinogen-Rohprodukt im Verlaufe der Reinigung bzw. Präparation desselben, oder an einer endgültigen Fibrinogen-Präparation angewendet werden.

Die Bedingungen bei der Erwärmung unterliegen keinen besonderen Beschränkungen, so lange das Fibrinogen selbst nicht inaktiviert, sondern lediglich das Virus bzw. die Viren, die dasselbe kontaminieren, inaktiviert werden.

Die Erwärmung erfolgt üblicherweise bei einer Temperatur von ca. 50 bis 80°C über einen Zeitraum von etwa 10 min bis 40 h.

Es ist bevorzugt, die Fibrinogenlösung ca. 10 bis 40 h auf ca. 50°C; ca. 5 bis 30 h auf ca. 60°C; oder ca. 1 bis 15 h auf ca. 70 bis 80°C zu erwärmen.

Es ist besonders bevorzugt, die genannte Lösung ca. 5 bis 30 h lang auf ca. 60°C zu erwärmen. Routinemäßige Experimente können dazu dienen, für eine spezifische Fibrinogensubstanz die geeignete Zeit-Temperatur-Kombination zu bestimmen.

Beispiele vo Viren, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens inaktiviert werden können, umfassen solche, die wahrscheinlich menschliche Plasmaproteine kontaminieren, insbesondere Hepatitisvirus und AIDS-Virus.

Die auf diese Weise wärmebehandelte wäßrige Fibrinogenlösung kann gegebenenfalls in üblicher Weise weiter gereinigt und weiteren Verfahrensschritten unterworfen werden, wie z. B. einer Dialyse, einer Sterilisationsfiltration, Pipettierung oder Lyophilisierung. Es können auch mehrere Waschschritte eingesetzt werden, um die Stabilisierungshilfsmittel zu entfernen.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Stabilisatoren erweisen sich bei der Flüssigerwärmung von Fibrinogen als in hohem Maße stabilisierend.

Wie dies vorstehend beschrieben ist, erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Inaktivierung von Viren, die wahrscheinlich Fibrinogen kontaminieren, während dabei die Aktivität des Fibrinogens selbst fast vollständig beibehalten wird; auf diese Weise wird ein Fibrinogen zur Verfügung gestellt, das hohe Sicherheit bietet und ausgezeichnete Qualität aufweist.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können, und dies ist besonders wertvoll, Fibrinogenpräparationen im industriellen Maßstab hergestellt werden.

Die folgenden Beispiele und Testbeispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne diese zu beschränken.

Beispiele 1

Eine Fibrinogenpaste wurde aus der ersten Fraktion hergestellt, die durch Fraktionierung von normalem menschlichen Plasma mit Ethanol nach dem Verfahren von Cohn erhalten worden war. Die erhaltene Paste wurde in einer 65 mM Citrat-Pufferlösung (pH 6,8), die 80 G/V-% Xylit, 7 G/V-% Alanin und 55 mM Magnesiumchlorid enthielt, so aufgelöst, daß eine Fibrinogenkonzentration von 1 G/V-% erhalten wurde. Dann wurde die erhaltene Lösung 10 h auf 60°C erwärmt.

Nach Beendigung der Erwärmung wurde die Fibrinogenmenge und die Löslichkeit desselben, i. e. der Zustand der Lösung, untersucht. Außerdem wurde die erwärmte Lösung einer Celluloseacetat-Elektrophorese und einer Gelfiltration unterworfen. Bei einem Vergleich der Daten mit denen von nicht-erwärmter Fibrinogenlösung (gleiche Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben) wurde kein signifikanter Unterschied festgestellt. Diese Tatsache weist darauf hin, daß das Fibrinogen unter den vorstehenden Erwärmungsbedingungen stabil bleibt.

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß zusätzlich 90 mM Kalziumchlorid zu der Lösung als Stabilisator zugegeben wurden. Es zeigte sich, daß das Fibrinogen nach 10stündigem Erwärmen auf 60°C, ähnlich wie im Falle von Beispiel 1, stabil blieb.

Beispiel 3

Es wurde eine Fibrinogenlösung auf die gleiche Weise hergestellt, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist, und 20 h bei 60°C wärmebehandelt. Es konnte festgestellt werden, ähnlich wie im Beispiel 1, daß das Fibrinogen stabil blieb.

Testbeispiel 1

Es wurde eine Fibrinogenpaste auf die gleiche Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Dann wurden verschiedene Stabilisatoren, wie sie in den Tabellen 1 bis 5 aufgeführt sind, zugegeben und 1 G/V-%ige Fibrinogenlösungen in destilliertem Wasser (pH 5,0 bis 7,4) hergestellt. Jede Lösung wurde 20 h lang auf 60°C erwärmt. Dann wurde das verbleibende Fibrinogen bestimmt und das Restverhältnis (%) auf der Basis des Fibrinogengehaltes vor der Erwärmung berechnet. Die Bestimmung erfolgte durch Verwendung eines Sets zur Fibrinogenbestimmung (hergestellt von American Dade Inc.) gemäß den Instruktionen des Herstellers. Es wurde auch das Aussehen der Proben bewertet. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 bis 5 wiedergegeben.

Tabelle 1: Stabilisierende Wirkung verschiedener Zucker

Wie aus Tabelle 1 deutlich hervorgeht, ist die Zugabe von Zucker wirksam im Hinblick auf die Wärmestabilität von Fibrinogen; Xylit, Mannit und Sucrose bewirken dabei einen besonders guten Stabilisierungseffekt.

Tabelle 2: Stabilisierende Wirkung verschiedener Zuckerkonzentrationen

Aus Tabelle 2 geht hervor, daß die zur Stabilisierung von Fibrinogen beim Erwärmen wirksame Zuckerkonzentration nicht weniger als 40 G/V-% beträgt, und insbesondere im Bereich von ca. 80 bis 100 G/V-% liegt.

Tabelle 3: Stabilisierende Wirkung verschiedener Aminosäuren

Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen deutlich, daß die Zugabe von Aminosäure wirksam ist zur Wärmestabilisierung von Fibrinogen; Alanin und Arginin stellen dabei besonders bevorzugte Stabilisatoren dar.

Tabelle 4: Stabilisierende Wirkung verschiedener Konzentrationen von Aminosäure

Aus Tabelle 4 geht hervor, daß die wirksame Aminosäurekonzentration, die dem Fibrinogen eine Wärmestabilität verleiht, nicht unter 1 G/V-% liegt; besonders geeignet ist der Bereich von ca. 4 bis 10 G/V-%.

Tabelle 5: Stabilisierende Wirkung verschiedener Konzentrationen von Magnesiumsalz

Wie aus Tabelle 5 hervorgeht, liegt die wirksame Magnesiumsalz-Konzentration zur Wärmestabilisierung von Fibrinogen nicht unterhalb 3 mM; besonders geeignet ist der Bereich von ca. 27 bis 110 nM.

Testbeispiel 2

Es wurden Fibrinogenlösungen auf die gleiche Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.

Zu diesen Lösungen wurde jeweils das Virus, wie in Tabelle 6 aufgeführt, suspendiert in einer 10 mM isotonischen Phosphat-Pufferlösung, die Natriumchlorid enthielt (pH 7,0), zugegeben.

Nach Wärmebehandlung des Gemisches bei 60°C für den jeweils in Tabelle 6 angegebenen Zeitintervall wurde die Infektiosität (infectivity) mit Hilfe der Plaque-Technik (wie in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 38, 747-752 (1952)) beschrieben, bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengestellt.

Tabelle 6

Aus Tabelle 6 geht hervor, daß mit Hilfe der erfindungsgemäßen Wärmebehandlungen verschiedene Viren inaktiviert werden. Daraus ist abzuleiten, daß das Hepatitis-Virus oder AIDS-Virus, welche möglicherweise ein Plasmaprotein kontaminieren, durch Wärmebehandlung gemäß der vorliegenden Erfindung inaktiviert werden können.

Testbeispiel 3

Es wurde eine Fibrinogenlösung auf die gleiche Weise hergestellt, wie in Beispiel 1 angegeben.

Die erhaltene Lösung wurde 24 h lang auf 60°C erwärmt. Daraufhin wurde das verbleibende Fibrinogen bestimmt und das Restverhältnis (%) berechnet, und zwar auf der Basis des Fibrinogengehaltes vor der Erwärmung.

Die Ergebnisse gehen aus Tabelle 7 hervor.

Tabelle 7

Erwärmungszeit (h)Rest-Fibrinogen (%) 0100 5 98 14 88 24 85

Aus Tabelle 7 geht hervor, daß Fibrinogen gegenüber einer 24stündigen Erwärmung auf 60°C gemäß der Erfindung stabil ist.

Claims

1. Verfahren zur Wärmebehandlung einer wäßrigen Fibrinogenlösung zur Inaktivierung eines Virus bzw. Viren in derselben, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung, die Fibrinogen enthält, in Gegenwart einer Stabilisatorkombination aus mindestens einem Zucker, einer Aminosäure und einem Magnesiumsalz erwärmt, bis das Virus bzw. die Viren, welche das genannte Fibrinogen kontaminieren, inaktiviert sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Erwärmung bei einer Temperatur von ca. 50 bis 80°C etwa 10 min bis 40 h lang durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker ein Monosaccharid, Disaccharid oder einen Zuckeralkohol darstellt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker ein Monosaccharid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glucose, Galactose und Mannose, darstellt.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker ein Disaccharid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glucose, Lactose und Maltose, darstellt.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker einen Zuckeralkohol, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Xylit, Sorbit und Mannit, darstellt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure eine neutrale Aminosäure, eine saure Aminosäure oder eine basische Aminosäure darstellt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure eine neutrale Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycin, Alanin, Prolin, Trypthophan und Serin, darstellt.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure eine saure Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Asparaginsäure und Glutaminsäure, darstellt.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure eine basische Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin und Hystidin, darstellt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Magnesiumsalz ein anorganisches Magnesiumsalz darstellt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Magnesiumsalz ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Magnesiumchlorid, Magnesiumhydroxid, Magnesiumsulfat, Magnesiumnitrat und Magnesiumphosphat.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Fibrinogenlösung 20 bis 100 G/V-% Zucker, 0,1 bis 15 G/V-% Aminosäure und 0,01 mM bis 3 M Magnesiumsalz umfaßt, wobei diese Komponenten jeweils auf 0,2 bis 6 G/V-% Fibrinogenlösung bezogen sind.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Fibrinogenlösung 60 bis 100 G/V% Zucker, 5 bis 10 G/V% Aminosäure und 1 bis 100 mM Magnesiumsalz umfaßt, wobei diese Komponenten jeweils auf 0,2 bis 6 G/V-%ige Fibrinogenlösung bezogen sind.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH der Lösung zwischen ca. pH 5 bis 8 liegt.

16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Erwärmung auf ca. 60°C für ca. 5 bis 30 h durchgeführt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Erwärmung auf ca. 70 bis 80°C für etwa 1 bis 15 h durchgeführt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zu inaktivierende Virus Hepatitisvirus oder AIDS-Virus umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß auch ein Hilfstabilisator vorliegt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Hilfsstabilisator ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Kalziumchlorid, Natriumchlorid, Natriumcaproat und Natriumcitrat.

21. Virus-inaktiviertes Fibrinogen, hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 1.