DE102004037805B3 - Verfahren zur Hitzebehandlung fibrinogenhaltiger pharmazeutischer Zubereitungen - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Verminderung der Aggregatbildung bei der Hitzebehandlung von fibrinogenhaltigen wässrigen Lösungen beschrieben, bei dem der fibrinogenhaltigen Lösung neben üblichen Fibrinogenstabilisatoren eine oder mehrere carboxylgruppenfreie Verbindungen der Formeln N-H¶3¶·+· X·-· und/oder R-NH¶2¶, in denen R Wasserstoff oder ein Alkyl-, Aryl- oder ein gemischter Alkyl-/Arylrest ist, der mit Hydroxyl-, Halogen- oder Aminogruppen substituiert sein kann, und X·-· ein Anion ist, in einer Menge von 1 bis 500 mM zugesetzt wird.

Description

• Die Erfindung betrifft Verfahren zur Hitzebehandlung von fibrinogenhaltigen Präparationen, die neben üblichen Stabilisatoren eine oder mehrere Ammonium- und/oder Aminoverbindungen enthalten, sowie fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitungen, zu deren Herstellung das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt wurde und deren Verwendung. Die Erfindung betrifft weiterhin fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitungen die NH₄ ⁺ X^– und/oder R-CH₂-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-CH₂-NH₂ Verbindungen enthalten und deren Verwendung.
• Viele verschiedene therapeutisch wertvolle Proteine können aus humanem Blutplasma gewonnen werden. Eines dieser Proteine ist Fibrinogen, das eine Schlüsselrolle bei der Blutgerinnung einnimmt. Bei der Blutgerinnung wird das im Blutplasma enthaltene lösliche Fibrinogen in Anwesenheit von Thrombin in das fibrillenbildende, unlösliche Fibrin umgewandelt und schützt den Körper damit vor hohen Blutverlusten bei Verwundungen. Fehlt es an Fibrinogen, so funktioniert die Blutgerinnung nicht korrekt. Man kann den Mangel ausgleichen, indem man Fibrinogen, isoliert aus z.B. menschlichem Blutplasma, verabreicht. Große Bedeutung kommt Fibrinogen auch als Komponente von Fibrinklebern zu, wobei derartige Kleber z.B. zum Abdichten von Nähten bei chirurgischen Eingriffen oder zur Haemostase bei parenchymatösen Organen verwendet werden. Wegen seines Beitrages zur Blutstillung und Wundheilung hat Fibrinogen eine große Bedeutung in der klinischen Anwendung.
• Wie bei allen aus Blutplasma gewonnenen Proteinen birgt auch die Verabreichung von fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen ein theoretisches Infektionsrisiko aufgrund der im Spenderplasma potentiell vorhandenen pathogenen Agenzien, wie beispielsweise Hepatitis oder AIDS Viren. Um eine möglichst hohe Virussicherheit zu erreichen, sind verschiedene Maßnahmen zur Inaktivierung infektiöser Agenzien eingeführt worden. Eine dieser Möglichkeiten, die auch bei der Herstellung von fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen Anwendung findet, ist die Erhitzung in wässriger Lösung, auch als Pasteurisierung bekannt. Derartige Hitzebehandlungen bewirken zwar eine effektive Inaktivierung der infektiösen Agenzien, bedingen aber gleichzeitig einen Ausbeuteverlust bei der Herstellung der therapeutischen Proteine, da diese häufig thermisch instabil sind. Insbesondere beim Fibrinogen handelt es sich um ein sehr hitzeempfindliches Protein, was sich schon dadurch äußert, dass man Blutplasma bereits durch Erhitzen auf 56°C (3 min) defibrinieren kann und Hitzefällung von Fibrinogen zur Abreicherung von Fibrinogen bei der Isolation von Gerinnungsfaktoren genutzt wird (siehe z.B. die EP 0 018 561 A2 und EP 0 637 451 A1 Eine Hitzebehandlung von fibrinogenhaltigen, wässrigen Lösungen, die zu einer fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung führen soll, ist deshalb überhaupt nur möglich in Gegenwart von geeigneten Stabilisatoren, die Fibrinogen vor einer thermischen Inaktivierung verbunden mit Aggregatbildung schützen. Bei den bekannten Stabilisatoren, die einem Verlust an therapeutischer Wirksamkeit entgegenwirken, handelt es sich zumeist um Kohlenhydrate, Carbonsäuren (insbesondere Aminosäuren), zweiwertige Metallsalze oder Mischungen davon.
• Die EP 0 137 428 A2 beschreibt ein Verfahren zur Pasteurisierung von Plasma oder Konzentraten der Blutgerinnungsfaktoren II, VII, IX und X in wässrigen Flüssigkeiten in Gegenwart von Calciumionen und einem Chelat-Bildner, gegebenenfalls in Kombination mit einer Aminosäure, einem Saccharid oder Zuckeralkohol.
• Bei der EP 1 153 608 A1 ist ein therapeutisches Proteinpräparat, das kein Antithrombin III enthält und das durch Zusatz von Stabilisatoren vor Wirkungsverlust oder Denaturierung bei der Pasteurisierung geschützt wird, Gegenstand der Erfindung. Bei den hier verwendeten Stabilisatoren handelt es sich um ein oder mehrere Saccharide in Kombination mit einer oder mehreren Aminosäuren.
• Die EP 0 683 678 B1 beschreibt Pasteurisierungen von Protein enthaltenden Zusammensetzungen aus Blut oder Blutplasma in Gegenwart von Di- oder Trialkylphosphaten zur verbesserten Inaktivierung von Viren. Als Stabilisatoren werden Saccharose, Sorbitol oder kurzkettige Aminosäuren vorgeschlagen.
• In der EP 0 035 204 A2 oder US 4,440,679 A ist z.B. die Pasteurisierung von thermisch sensitiven, therapeutisch aktiven Proteinen in wässrigen Lösungen in Gegenwart von Polyolen wie z.B. Zuckern oder reduzierten Zuckern gegebenenfalls zusammen mit Aminosäuren als Stabilisatoren beschrieben.
• In der europäischen Anmeldung EP 0 436 712 B1 wird ein Verfahren zur Pasteurisierung von Proteinmischungen, die hauptsächlich Fibrinogen enthalten, in Gegenwart eines Monosaccharides (z.B. Glucose) und eines Zuckeralkohols (z.B. Sorbitol) vorgeschlagen.
• Die Nationale Schottische Blutbank (RD 244027) berichtet von der Hitzebehandlung von Fibrinogen in Gegenwart von Sorbitol und gegebenenfalls in Gegenwart von Glycin.
• Die EP 0 103 196 A2 beschreibt ein Pasteurisierungsverfahren für humanes Fibrinogen in Anwesenheit von Kohlenhydraten (z.B. Saccharose), Aminosäuren (z.B. Glycin) und Calcium Ionen als Stabilisatoren.
• Die deutsche Offenlegungsschrift DE 3813464 A1 (oder US 5,116,950 A ) beschreibt die Wärmebehandlung wässriger Fibrinogen-Lösungen enthaltend eine Zucker-Komponente, eine Aminosäure sowie ein Magnesium-Salz.
• Die europäische Patentanmeldung EP 0 124 506 A2 beschreibt den Einsatz von Ammoniumsulfat in Konzentrationen über 0,5 M in einem Verfahren zur Inaktivierung von Viren durch Wärmebehandlung in Präparationen, die Blutprodukte enthalten. Das Ammoniumsulfat liegt vorzugsweise bei Konzentrationen von 2 bis 4 molar vor und wird anschließend aus der Präparation entfernt. Die Erfindung beruht auf der Vermutung, dass die Inaktivierung von Krankheitserregern durch Proteine in der Präparation gehemmt sein kann und dies durch hohe Ammoniumsulfatkonzentrationen, unter Beibehaltung der biologischen Aktivität, überwunden werden kann. Für das spezielle Protein Fibrinogen werden allerdings keine Daten gezeigt und ein solches Verfahren zur Wärmebehandlung von Fibrinogen in wässriger Lösung wäre auch gänzlich ungeeignet, da es bei solch hohen Ammoniumsulfatkonzentrationen zu einer starken Aggregation von Fibrinogen kommen und die Fibrinogenlösung bereits Ausfällungen bilden würde. Eine entsprechende Wärmebehandlung in einem heterogenen System ist jedoch generell nicht wünschenswert, da dies die Durchführbarkeit und die Reproduzierbarkeit negativ beinträchtigt.
• Von einem anderen aus humanem Plasma zu gewinnenden Protein – dem gereinigten Faktor XIII – ist aus der EP 0 637 451 A1 bekannt, dass bei Erhitzung zum Zwecke der Virusinaktivierung auf übliche Stabilisatoren vollständig verzichtet werden kann oder diese zumindest auf unter 10% reduziert werden können. Dieses Patent erwähnt, dass die zu erhitzende Lösung ferner weniger als 0,5 M Ammoniumsulfat enthalten kann. Es wird allerdings nicht dargelegt, ob Ammoniumsulfat in Konzentrationen unterhalb von 0,5 M überhaupt einen stabilisierenden Effekt während der Pasteurisierung auf F XIII haben könnte. Darüber hinaus handelt es sich bei Faktor XIII um ein strukturell und funktional völlig anderes Protein als Fibrinogen, auch wenn beide aus Blut isoliert werden können und beide eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung spielen. Bei Fibrinogen handelt es sich im Vergleich zu anderen an der Blutgerinnung beteiligten Faktoren um ein nicht-enzymatisch aktives Protein, das nach Aktivierung durch Thrombin ein dreidimensionales Netzwerk bildet. Demgegenüber ist Faktor XIII ein globuläres Proenzym, eine so genannte Transglutaminase, die in ihrer aktivierten Form die aus Fibrinogen gebildeten Fibrin-Fibrillen durch eine enzymatische Reaktion kovalent vernetzt.
• Zudem ist aus der EP 0 637 451 A1 bekannt, dass Faktor XIII durch eine Hitzefällung von Fibrinogen abgetrennt werden kann, da Faktor XIII im Gegensatz zu Fibrinogen nicht zur Aggregatbildung neigt und somit im Hitzefällungsüberstand verbleibt. In der EP 0 637 451 A1 wird empfohlen, Fibrinogen vor Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Pasteurisierung von Faktor XIII durch kurzzeitiges Erhitzen (etwa einige Minuten bei 56°C bis 60°C) zu denaturieren und als Präzipitat abzutrennen. Aufgrund völlig anderer Eigenschaften wie z.B. Aggregatbildungs- und Fällungseigenschaften beider Proteine, lassen sich Stabilisationsverfahren nicht übertragen.
• Schließlich ist auch aus der DE 199 23 027 A1 ein Verfahren zur Inaktivierung und/oder Eliminierung von umhüllten oder nicht-umhüllten Viren aus einer Plasmaproteinlösung durch Zusatz eines Ammoniumsalzes beschrieben, bei dem man eine chromatographisch vorgereinigte Plasmaproteinlösung bei einer Ammoniumsalzkonzentration von 30 bis 39 Gew.-% einer Inkubation unterwirft und nach Abtrennung der Ausfällungen und Entfernung des Ammoniumsalzes bis auf einen Restgehalt von weniger als 0,5 mol/l mehrere Stunden bei etwa 60°C pasteurisiert und sie dann zu einer therapeutisch einsetzbaren Plasmaproteinzubereitung verarbeitet.
• All den für Fibrinogen beschriebenen Verfahren, bei den zur Inaktivierung von Viren eine Wärmebehandlung eingesetzt wird, ist gemeinsam, dass trotz der verwendeten Stabilisatoren ein noch immer deutlicher Protein- oder Aktivitätsverlust bei der Hitzebehandlung oder den nachfolgenden Schritten nicht verhindert werden konnte. Ein Grund für diesen Verlust liegt u.a. darin, dass die Hitzebehandlungen zu strukturellen Änderungen führen können und sich dies beim Fibrinogen in der Bildung von Aggregaten äußern kann. Die Bildung von Proteinaggregaten führt direkt, aber auch indirekt zu einem Verlust an Protein bzw. Aktivität z.B. durch Ausfällungen. Die Virusinaktivierung geht also nachteilig einher mit einem Verlust an Fibrinogen. Die üblichen im Stand der Technik bekannten Stabilisatoren können dem nur ungenügend entgegenwirken. Es ist jedoch im höchsten Maße wünschenswert, die Aggregatbildung so weit wie möglich zu verringern, da die Aggregatbildung zu einem Verlust an Ausbeute führen kann. Wegen des breiten therapeutischen Anwendungsgebietes von fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen besteht ein hoher Bedarf an Verfahren, mit denen die Aggregatbildung vermindert und die Qualität bei gleich bleibend hoher oder gesteigerter Virussicherheit verbessert werden kann. Insbesondere da Fibrinogen zum überwiegenden Teil aus humanem Blutplasma gewonnen wird, ist es wünschenswert, eine möglichst hohe Ausbeute an Fibrinogen hoher Qualität zu erreichen um eine maximale Ausnutzung vorhandener Blutspenden zu gewährleisten.
• Überraschenderweise konnte mit der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, dass durch Einsatz von Ammonium- oder Amino-Verbindungen zusätzlich zu den üblichen Stabilisatoren eine Aggregatbildung bei Hitzebehandlungen signifikant reduziert werden kann.
• Die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren zur Pasteurisierung von Fibrinogen haben zudem den Nachteil, dass die üblichen Stabilisatoren wie Kohlenhydrate und Aminosäuren in sehr hohen Konzentrationen zugesetzt werden müssen, um Fibrinogen im ausreichenden Maße zu stabilisieren. Könnten diese Konzentrationen abgesenkt werden, wären positive Effekte auf die Abreicherungsfaktoren verschiedener Viren zu erwarten. Überraschenderweise konnte mit der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, dass durch Zusatz von Ammonium- oder Amino-Verbindungen der Zusatz üblicher Stabilisatoren wie Zucker und Aminosäuren, unter gleichbleibender oder sogar verringerter Proteinaggregation, reduziert werden kann. Da die verwendeten Ammonium-Verbindungen die Virusinaktivierungskinetik in dem verwendeten Konzentrationsbereich nicht signifikant beeinflussen, führt dies aufgrund der Reduktion der anderen Stabilisatoren zu einer verbesserten Virusabreicherung.
• Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es somit, ein Verfahren bereit zu stellen, das bei einer Hitzebehandlung eine Verminderung der Aggregatbildung in fibrinogenhaltigen Lösungen erlaubt und damit die Herstellung einer fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung mit hoher Qualität ermöglicht. Ziel der vorliegenden Erfindung ist es außerdem, eine fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitung mit hoher Virussicherheit zu erhalten.
• Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Verminderung der Aggregatbildung bei der Hitzebehandlung von fibrinogenhaltigen Lösungen, bei dem man den Lösungen neben üblichen Fibrinogenstabilisatoren eine oder mehrere carboxylgruppenfreie Verbindungen der Formeln R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ in einer Menge von 0,001 bis 0,5 Mol pro Liter Lösung (0,001–0,5 M) zusetzt.
• Bei dem Rest R handelt es sich um ein H- oder einen Alkyl-, Aryl- oder einen gemischten Alkyl-/Arylrest, wobei die Alkyl- und/oder Arylreste durch Halogen, Amino- oder Hydoxylgruppen substituiert sein können. Der Alkylrest umfasst acyclische sowie cyclische Kohlenwasserstoffe, die durch ein oder mehrere Einfach- und/oder Doppelbindungen verbunden sein können. Verzweigtkettige Kohlenwasserstoffe sind ebenfalls geeignet. Bei dem Arylrest handelt es sich um eine aromatische Verbindung, die eine oder mehrere aromatische Ringstrukturen enthält. Der Rest R kann auch aus gemischten Aryl und Alkylanteilen bestehen. Die Alkyl- und/oder Arylreste können mit ein oder mehreren verschiedenen funktionellen Gruppen substituiert sein, wobei auch heterocyclische Verbindungen umfasst sind. Mögliche funktionelle Gruppen sind beispielsweise OH-Gruppen, NR₂-Gruppen (wobei R der obigen Definition entspricht), CONH₂-Gruppen (Säureamide) oder SO₃-Gruppen. Ausgenommen unter dem Begriff Substituierung im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Substituierungen mit COOH-Gruppen, die zu Bildung von Carbonsäuren führen. Carbonsäuren wie z.B. Aminosäuren sind als Stabilisatoren bei Pasteurisierungen von Fibrinogen im Stand der Technik bekannt. Verwiesen sei hierzu beispielsweise auf die bereits erwähnten EP 0 035 204 , EP 103 196 und US 5,116,950 . Bevorzugt befindet sich zwischen dem Rest R und der NH₂-Gruppe noch eine CH₂-Gruppe. Bevorzugte funktionelle Gruppen in dem Falle, dass R ≠ H ist, sind die NH₂- und OH-Gruppen und bevorzugt sind Verbindungen wie z.B. Ethanolamin.
• In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist R identisch mit Wasserstoff, d.h. insbesondere bevorzugt sind Ammoniumverbindungen, die das NH₄ ⁺ Ion (Ammoniumion) enthalten.
• Liegen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in ihrer protonierten Form mit einer positiven Ladung vor, so wird der Ladungsausgleich durch ein entsprechendes Anion (X^–) geschaffen. Mögliche bevorzugte Beispiele für Anionen sind Sulfate, Acetate, Chloride, Phosphate, Nitrate. Vorteilhaft im Sinne dieser Erfindung einzusetzen und damit insbesondere bevorzugt sind Sulfat-, Acetat- und Chlorid-Ionen. Demnach sind in der vorliegenden Erfindung als R-NH₃ ⁺ X^– Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und/oder Ammoniumacetat besonders bevorzugt.
• Die Konzentration der R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindungen in der fibrinogenhaltigen Lösung zum Zeitpunkt der Hitzebehandlung muss unterhalb von 0,5 M liegen. Bei zu hohen Konzentrationen ist keine vorteilhafte Verbesserung der Verminderung der Aggregatbildung mehr festzustellen. Im Gegenteil kann, in Abhängigkeit von der jeweiligen Verbindung, sogar eine verstärkte Aggregation von Fibrinogen resultieren.
• In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindungen in einer Konzentration von 1 bis 150 mMol pro Liter stabilisierter fibrinogenhaltiger Lösung, die einer Hitzebehandlung unterzogen wird, vor. Insbesondere bevorzugt sind Mengen von 2–60 mMol pro Liter stabilisierter, fibrinogenhaltiger Lösung. Die am besten geeigneten Konzentrationen sind der jeweiligen Verbindung anzupassen und können leicht durch Vergleichsversuche, wie sie auch in den Beispielen gezeigt sind, vom Fachmann festgestellt werden. Die R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindungen können direkt vor der Hitzebehandlung oder zu einem früheren Zeitpunkt zugesetzt werden.
• Unter Hitzebehandlung ist eine Erwärmung der fibrinogenhaltigen Lösung auf über 30°C zu verstehen. Hitzebehandlungen können beispielsweise bei der Herstellung von fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen auftreten z.B. beim Lösen von zugesetzten Substanzen für Fällungs- oder Reinigungsschritte oder beim Einlösen von Fibrinogen-Niederschlägen. Vorzugsweise handelt es sich hierbei aber um eine Hitzebehandlung, die zur Inaktivierung von potentiell vorhandenen infektiösen Agenzien wie beispielsweise Viren eingesetzt wird, auch bekannt als Pasteurisierung. Bekannte Pasteurisierungsbedingungen für fibrinogenhaltige Lösungen liegen vorzugsweise bei 55–65°C für 10 bis 15 Stunden. Eine wässrige Lösung, die für z.B. etwa 10 Stunden bei 60°C gehalten wurde, gilt nach dem Stand des heutigen Wissens als frei von vermehrungsfähigen Hepatitisviren. Höhere Temperaturen (z.B. 80 oder 100°C) für kürzere Zeiten oder tiefere Temperaturen (z.B. 50°C) für längere Zeiten können ebenfalls verwendet werden. Geeignete Pasteurisierungsbedingungen sind Bedingungen, bei denen die Temperatur und Dauer der Hitzebehandlung ausreichend sind, vorhandene Viren weitestgehend, d.h. mehr als 4 Log¹⁰-Stufen, zu inaktivieren. Die Pasteurisierungsbedingungen können beispielsweise auch angepasst werden an die Zusammensetzung der Stabilisatoren. Eine Reduktion von üblichen Stabilisatoren kann gegebenenfalls eine Reduktion der Temperatur und/oder Dauer der Hitzebehandlung bei gleich bleibender Virusinaktivierung ermöglichen. Geeignete Bedingungen für die Pasteurisierung können im Einzelfall leicht vom Fachmann durch Zusetzen von Testviren und Bestimmung des Reduktionsfaktors nach bekannten Methoden festgelegt werden.
• Bei einer wässrigen fibrinogenhaltigen Lösung handelt es sich um eine flüssige Zusammensetzung, die mindestens Fibrinogen und Wasser enthält. Dabei kann Fibrinogen im Gemisch mit anderen Proteinen, in teilgereinigter oder aufgereinigter Form vorliegen.
• Unter dem Begriff Fibrinogen ist vorzugsweise humanes Fibrinogen zu verstehen, das z.B. aus einer aus humanem Blut gewonnenen Mischung, die Fibrinogen enthält, aufgereinigt werden kann. Unter dem Begriff „aus Blut gewonnene Mischung" sind beispielsweise Gesamtblut, Blutplasma, Plasmafraktionen oder Plasmapräzipitate zu verstehen. Bevorzugt wird Fibrinogen aus humanem Plasma, Plasmafraktionen, Cryopräzipitat oder einer 8% Ethanol Fällung nach Cohn gewonnen. Fibrinogen kann sowohl aus gepoolten Plasmaspenden als auch aus Einzelspenden isoliert sein. Humanes Fibrinogen kann auch aus der Milch transgener Tiere gewonnen werden, siehe beispielsweise US 5,639,940 A . Auch Fibrinogen, das durch rekombinante Expression aus Zellkultur gewonnen wird, siehe beispielsweise US 6,037,457 A , ist umfasst. So ist es möglich, Fibrinogen aus den entsprechenden Fermentationsüberständen oder daraus hergestellten Fraktionen zu isolieren. Auch bei gentechnologisch hergestelltem Fibrinogen können potentiell infektiöse Agenzien vorliegen, die durch eine Pasteurisierung inaktiviert werden müssen, gegebenenfalls auch durch eine Hitzebehandlung während der Reinigung. Umfasst ist auch Fibrinogen isoliert aus einer aus tierischem Blut gewonnen Mischung, die Fibrinogen enthält, vorzugsweise von Tieren wie Säugetieren (z.B. Schwein, Pferd, Rind, Ziege und Schaf). Bei der Fraktionierung, Präzipitation und/oder chromatographischen Reinigung treten jeweils wässrige Lösungen auf, die Fibrinogen enthalten und unter den Begriff fibrinogenhaltige Lösung fallen. Derartige Verfahren zur Gewinnung von Fibrinogen sind im Stand der Technik bekannt.
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt die Fibrinogenmenge in der fibrinogenhaltigen Lösung vor dem Zusatz von Stabilisatoren zwischen 0,1 und 10 % (0,1 bis 10 g/100 ml Lösung), insbesondere bevorzugt zwischen 1 und 5 % (1 bis 5 g/100 ml Lösung).
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform findet das Verfahren zur Hitzebehandlung einer fibrinogenhaltigen Lösung in einer wässrigen Lösung statt, deren pH-Wert im Bereich von 5 bis 9 liegt. Bevorzugt sind pH-Werte zwischen 6 und 8.
• Die beiden Verbindungen R-NH₃ ⁺ X^– und R-NH₂ liegen in einer wässrigen Lösung in einem Gleichgewicht vor. Durch den pH-Wert kann das Gleichgewicht unterschiedlich stark zu Gunsten jeweils einer Verbindung verschoben werden. Insbesondere bevorzugt ist ein pH-Wert, bei dem die R-NH₂ Verbindungen zu mehr als 50% protoniert vorliegen.
• Die R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zusammen mit üblichen Stabilisatoren eingesetzt. Ein völliger Verzicht auf übliche Stabilisatoren ist nicht möglich. Die üblichen Stabilisatoren können einzeln oder in verschiedenen Kombinationen vor der Hitzebehandlung zugesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den üblichen Stabilisatoren um Kohlenhydrate, Carbonsäuren, zweiwertige Metallionen oder Mischungen davon. Zu den Kohlenhydraten zählen Zucker wie vorzugsweise Mono, Di und Oligosaccharide sowie Zuckeralkohole. Beispiele für Zucker sind Galaktose, Mannose, Saccharose, Maltose, Laktose oder Rhamnose. Beispiele für Zuckeralkohole sind Mannit, Sorbit oder Xylit.
• Bei den zweiwertigen Metallionen handelt es sich zum Beispiel um Calcium- oder Magnesiumionen, die bevorzugt als anorganische Salze vorliegen.
• Zu den Carbonsäuren zählen vorzugsweise Aminosäuren, wie insbesondere Glycin, möglich sind aber auch saure, basische, oder andere neutrale, z.B. aromatische Aminosäuren, wie beispielsweise Glutaminsäure, Asparaginsäure, α-, β-, γ-Aminobuttersäure, Lysin, Arginin, Histidin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Alanin, Prolin, Serin, Cystein sowie weitere Aminosäuren oder deren Salze und Derivate.
• Zu üblichen Stabilisatoren zählen aber auch Peptide oder so genannte Hilfsstabilisatoren. Darunter sind Verbindungen zu verstehen, die eine Fibrinolyse hemmen wie z.B. die ε-Aminocapronsäure, p-Aminomethylbenzoesäure oder ihre Salze oder Derivate. Auch Salze von Carbonsäuren (insbesondere mit 3 bis 10 Kohlenwasserstoffatomen) sind als Hilfsstabilisatoren anzusehen.
• Eine insbesondere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Kombination von üblichen Stabilisatoren wie Saccharose, Glycin, Calciumchlorid oder Mischungen davon.
• Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Kombination der üblichen Stabilisatoren Saccharose und Calciumchlorid.
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die fibrinogenhaltige Lösung auch Salze wie beispielsweise Natriumchlorid. Gegebenenfalls kann auch eine zusätzliche Puffersubstanz enthalten sein. Mögliche bekannte Puffersubstanzen sind Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), 4-(2-Hydroxyäthyl)-piperazin-1-äthan-sulfonsäure (HEPES), 3-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) oder andere physiologische Puffersysteme.
• Kohlenhydrate werden vorzugsweise in einer Menge von oberhalb 10%, besonders bevorzugt von 500 bis 1500 g pro Liter fibrinogenhaltiger Lösung (vor Zusatz von Stabilisatoren) eingesetzt, insbesondere bevorzugt sind Mengen von 800–1000 g pro Liter fibrinogenhaltiger Lösung (vor Zusatz von Stabilisatoren). Aminosäuren können bevorzugt in Mengen zwischen 0 und 2 Mol pro Liter fibrinogenhaltiger Lösung (vor Zusatz von Stabilisatoren) zugegeben werden. Salze enthaltend zweiwertige Metallionen können vorzugsweise in Mengen von 0 bis 5 g pro Liter fibrinogenhaltiger Lösung (vor Zusatz von Stabilisatoren) eingesetzt werden, insbesondere bevorzugt sind 50 bis 1000 mg pro Liter fibrinogenhaltiger Lösung (vor Zusatz von Stabilisatoren). Da die zugesetzten Stabilisatoren eine Volumenzunahme verursachen, liegen die Stabilisatoren in der stabilisierten fibrinogenhaltigen Lösung während der Hitzebehandlung in einer entsprechend niedrigeren Endkonzentration vor.
• Ein Zusatz von R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindungen bei der Hitzebehandlung von fibrinogenhaltigen Lösungen, ermöglicht vorteilhafterweise einen reduzierten Einsatz von üblichen Stabilisatoren. So kann z.B. auf Stabilisatoren wie Glycin auch vollständig verzichtet werden.
• Durch den erfindungsgemäßen Zusatz von R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindungen ist es möglich, den Anstieg von Fibrinogenaggregaten während der Hitzebehandlung zu vermindern. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Aggregatanstieg im Vergleich zum Kontrollansatz (ohne Zusatz von R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindungen) um mindestens 10% reduziert, insbesondere bevorzugt wird der Aggregatanstieg um mehr als 30% reduziert. Der Aggregatanstieg kann wie in den Beispielen beschrieben bestimmt werden.
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die biologische Aktivität von Fibrinogen, bestimmt nach Clauss (A. Clauss; Acta Haematol 17: 237–246 (1957)) an einem Gerinnungsautomaten wie dem Behring Coagulation Timer (Dade Behring), bei einer Hitzebehandlung unter dem erfindungsgemäßen Zusatz von R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindungen und anschließender Aufarbeitung durch (fraktionierte) Fällung zu mehr als 50% und insbesondere bevorzugt zu mehr als 65% wieder gefunden.
• Weiterhin ist es überraschenderweise möglich, fibrinogenhaltige Präparate auch in fester Form zu erhitzen (Trockenerhitzung) und den positiven Effekt von NH₄ ⁺ X^– und/oder R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindungen zu nutzen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist damit ein Verfahren zur Hitzebehandlung von fibrinogenhaltigen Lyophilisaten, bei dem die fibrinogenhaltige Lösung vor Lyophilisation neben üblichen Hilfsstoffen ein oder mehrere R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindungen in einer Konzentration unterhalb 0,5 Mol pro Liter enthält, wobei R und X^– den bisherigen Definitionen entsprechen. Bevorzugt liegt der Restwassergehalt des Lyophilisates bei ≥0,1% (w/w). Mögliche übliche Hilfsstoffe für die Lyophilisation sind z.B. Zucker, Zuckeralkohole, Aminosäuren, Carbonsäuren, anorganische Salze, Puffersubstanzen, Komplexbildner, oberflächenaktive Verbindungen oder Mischungen davon.
• Das erfindungsgemäße Verfahren kann ein Schritt innerhalb eines Verfahrens zur Herstellung einer fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung sein. Mögliche Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind also fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitungen, die nach einem Verfahren hergestellt wurden, das ein oder mehrere erfindungsgemäße Verfahren zur Hitzebehandlung einer fibrinogenhaltigen Lösung oder/und eines fibrinogenhaltigen Lyophilisates beinhaltet. Für die Herstellung der fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung können die R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindung im Verlauf des weiteren Verfahrens nach der Hitzebehandlung ganz oder teilweise durch konventionelle Techniken und bekannte Reinigungsverfahren aus der fibrinogenhaltigen Lösung oder dem gelösten fibrinogenhaltigen Lyophilisat entfernt werden. Bei der Hitzebehandlung noch auftretende restliche hochmolekulare Bestandteile lassen sich gegebenenfalls durch bekannte Reinigungsschritte entfernen. So können beispielsweise, wie in der EP 0 103 196 A2 beschrieben, auftretende restliche Aggregate durch eine Vorfällung (z.B. 0,25 bis 1,5 M Glycin) abgetrennt werden und das verbleibende Fibrinogen anschließend durch Erhöhung der Konzentration des Fällungsmittels (z.B. 2,2 M Glycin) ausgefällt werden, so dass es von vorhandenen Stabilisatoren einschließlich der R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindungen, abgetrennt wird. Die fibrinogenhaltige Lösung kann gegebenenfalls nach konventionellen Techniken bis zum Erhalt einer fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung zur therapeutischen oder diagnostischen Anwendung aufgereinigt werden.
• Handelt es sich bei den R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindung um pharmazeutisch verträgliche Verbindungen, so kann es auch vorteilhaft sein, diese Verbindungen vollständig oder zum Teil in der fertigen fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung zu belassen. Unter pharmazeutisch verträglichen Verbindungen sind Verbindungen zu verstehen, die in den verwendeten Konzentration zu keinen ersichtlichen oder gravierenden nachteiligen oder toxischen Nebenwirkungen oder Unverträglichkeitsreaktionen beim Patienten führen.
• Im Falle von lyophilisierten fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen, die pharmazeutisch verträgliche R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindungen enthalten, kann es auch von besonderen Vorteil sein, erst die fertige fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitung in Form eines Lyophilisates zu erhitzen, um potentiell infektiöse Agentien zu inaktivieren.
• Bei der Lagerung in flüssiger Form kann es für Fibrinogen ebenfalls von Vorteil sein, wenn die pharmazeutische Zubereitung ein oder mehrere R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindungen enthält. Wie bereits ausführlich beschrieben, können die Ammonium- und/oder Aminoverbindungen die Aggregatbildung bei Hitzebehandlung, die auch bei einer Lagerung auftreten kann, signifikant vermindern. Gerade bei medizinischen Endprodukten, bei denen keine Abreicherung von auftretenden Aggregaten durch Reinigungsschritte mehr erfolgen kann, ist das vermehrte Auftreten von Aggregaten unerwünscht. Aggregate können bei intravenöser Gabe im Patienten zu Nebenwirkungen führen, ein Grund, warum auch Zulassungsbehörden den Aggregatgehalt häufig begrenzen. Da R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindungen die Aggregatbildung auch bei Hitzebehandlungen vermindern, besteht die Möglichkeit einer Flüssiglagerung von fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen zumindest für eine bestimmte Zeit, auch bei Raumtemperatur oder höheren Temperaturen, womit sich z.B. die Anwendungseigenschaften in Notfallsituationen verbessern lassen. Auch auf längeren Versandwegen, wo tiefe Temperaturen nicht durchgehend gewährleistet werden können, ist es von Vorteil, wenn die Stabilität auch bei höheren Temperaturen gesichert ist. Eine stabile Lagerung von Fibrinogen ohne signifikante Aggregatbildung in Lösungen erleichtert also in vielerlei Hinsicht die Herstellung, den Gebrauch, Transport und die Verabreichung am Patienten, da die sofortige Einsatzmöglichkeit des Wirkstoffes am Patienten möglich ist und sich somit der zeitliche Aufwand der Rekonstitution lyophilisierter Zubereitungen bzw. das Auftauen und Erwärmen eingefrorener Zubereitungen erübrigt. Aber auch bei einer Lagerung als Lyophilisat oder im gefrorenen Zustand ist es von Vorteil, wenn das rekonstituierte bzw. aufgetaute Fibrinogen noch länger eine verminderte Aggregatbildung aufweist. Dies zeigt sich beispielsweise in Situationen, wo für Operationen vorsorglich Material rekonstituiert wurde, dann aber aus medizinischen Erwägungen heraus der Einsatz nicht notwendig wurde. Dieses Material müsste bei nur kurzfristiger Stabilität verworfen werden und könnte nicht mehr zu einem späteren Zeitpunkt zum Einsatz kommen. Bei Verwendung von Fibrinklebern ist es insbesondere von Vorteil, wenn Fibrinogen in flüssiger Form vorliegt. Ein Rekonstituienen, um den Kleber einsatzbereit zu machen, würde relativ viel Zeit benötigen, zumal Fibrinogen in hohen Konzentrationen vorliegt.
• Da sich Ammonium- und Aminoverbindung auch für die Lagerung von fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen als vorteilhaft erweisen, können sie auch einer pharmazeutischen Zubereitung zugesetzt werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit auch eine fibninogenhaltige pharmazeutische Zubereitung, die für die Lagerung, neben anderen üblichen Hilfsstoffen, ein oder mehrere NH₄ ⁺ X^– und/oder R-CH₂-NH₃ ⁺ und/oder R-CH₂-NH₂ Verbindungen in einer Konzentration von unterhalb 0,5 Mol pro Liter enthält. Bevorzugt sind Konzentrationen von 1 bis 480 mMol pro Liter fibrinogenhaltiger pharmazeutischer Zubereitung, besondere bevorzugt sind 1 bis 300 mMol pro Liter fibrinogenhaltiger pharmazeutischer Zubereitung, insbesondere bevorzugt sind 1 bis 150 mMol pro Liter fibrinogenhaltiger pharmazeutischer Zubereitung und ganz besonders bevorzugt sind 2 bis 100 mMol pro Liter fibrinogenhaltiger pharmazeutischer Zubereitung. Die Konzentration ist der jeweiligen Verbindung und ihrer physiologischen Verträglichkeit anzupassen. R und X^– entsprechen den bisherigen Definitionen unter der zusätzlichen Vorrausetzung, dass die resultierenden Verbindungen physiologisch verträglich sind, und in den eingesetzten Konzentrationen keine nachteiligen Nebenwirkungen erwarten lassen. Besonders bevorzugte Verbindungen sind auch in diesem Fall Ammoniumverbindung. Insbesondere bevorzugt sind Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und Ammoniumacetat.
• Die üblichen Hilfsstoffe richten sich nach der geplanten Verwendung. Für eine intravenöse Verabreichung von Fibrinogen sind andere dem Fachmann bekannte Zusätze angeraten wie für einen Einsatz als Fibrinkleber. Zu berücksichtigen sind auch bestimmte Zusätze bei einer geplanten Zwischenlagerung als Lyophilisat oder im gefrorenen Zustand. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die üblichen Hilfsstoffe einwertige Metallsalze (beispielsweise Natrium- oder Kaliumchlorid), zweiwertige Metallsalze (beispielsweise Magnesium- oder Calciumchlorid), Aminosäuren (beispielsweise Glycin, Arginin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glutamin, Histidin, Lysin, Isoleucin, Cystein), Kohlenhydrate (beispielsweise Glucose, Saccharose, Trehalose, Laktose, Cellulose, Stärke, Sorbitol, Mannitol und Glykosaminoglykane), Detergenzien (beispielsweise Poloxamere oder Polysorbate), Harnstoff, Guanidin, Inhibitoren wie Fibrinolyse- oder Fibrinogenolyseinhibitoren (beispielsweise Aprotinin, Antiplasmine, wie Alpha-2-Antiplasmin, Alpha-2-Makroglobulin, Alpha-1-Antiplasmin, Plasminogenaktivatorinhibitoren (PAI), Thrombin-aktivierbarer-Fibrinolyse-Inhibitor (TAFI), Epsilonaminocapronsäure, C1-Inhibitor und Antithrombin), Plasmaproteine (z.B. FXIII, Fibronektin), Antioxidantien (beispielsweise Ascorbinsäure), Puffersubstanzen (z.B. Aminosäuren wie Arginin, Puffersysteme wie Citrat, Phosphat, Acetat, Succinat, Glycylglycin, Carbonat und Bicarbonat) oder Mischungen davon. Der pH-Wert liegt zwischen 5 und 9, bevorzugt zwischen 6 und 8.
• Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung, die nach einem Verfahren hergestellt wurde, das das erfindungsgemäße Verfahren zur Hitzebehandlung von fibrinogenhaltigen Lösungen oder/und fibrinogenhaltigen Lyophilisaten enthält.
• Ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung ist die Verwendung einer fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung, die neben üblichen Hilfsstoffen eine oder mehrere NH₄ ⁺ X^–, R-CH₂-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-CH₂-NH₂ Verbindungen in pharmazeutisch verträglicher Form enthält.
• Mögliche Verwendungen sind dem Fachmann bekannt und die erfindungsgemäßen fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen können für alle bekannten Verwendungen von Fibrinogen vorteilhaft eingesetzt werden. Dabei ist eine Verwendung sowohl als Therapeutikum als auch als Komponente eines Diagnostikums möglich. Die medizinische Anwendung bezieht sich vorzugsweise auf den Menschen, aber auch in der Tiermedizin sind Anwendungen umfasst. Generell ist die erfindungsgemäße fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitung für die Therapie von Fibrinogenmangelzuständen geeignet. Zu diesen Mangelzuständen kann es beispielsweise bei großflächigen Wunden, bei starken Blutungen, bei großflächigen Verbrennungen, krankhafter Aktivierung der Blutgerinnung (Verbrauchskoagulopathie auch DIC (disseminated intravascular coagulation) genannt), durch Medikamente oder schwere Lebererkrankungen (z.B. bei Synthesestörung durch Leberparenchymschaden) kommen. Neben den beschriebenen erworbenen Hypofibrinogenämien (vermindertes Fibrinogen im Blut) bzw. Afibrinogenämien (fehlendes oder hochgradig vermindertes Fibrinogen im Blut) gibt es in seltenen Fällen auch eine angeborene Afibrinogenämie bzw. Hypofibrinogenämie, die durch fehlende oder verminderte Fibrinogensynthese in der Leber verursacht sein kann.
• Bei Hypofibrinogenämien bzw. Afibrinogenämien wird die erfindungsgemäße fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitung dem Patienten vorzugsweise intravenös injiziert, um entsprechende Mangelzustände an Fibrinogen zu kompensieren. Dosierungen orientieren sich an der Höhe des auftretenden Mangels.
• Eine hohe Bedeutung kommt Fibrinogen bei der Fibrintherapie als wichtige Komponente so genannter Fibrinkleber zu. Ein Fibrinkleber simuliert den letzten Schritt der Blutgerinnung, indem es bei Kombination von Fibrinogen mit Thrombin und weiteren Komponenten wie Calcium und Faktor XIII zur Bildung von stabilisiertem Fibrin kommt.
• In der Medizin gibt es vielfältige Anwendungsmöglichkeiten für Fibrinkleber, die weitreichend bekannt sind (siehe z.B. Sierra, Journal of Biomaterials Applications 7 (1993) 309–352; Martinowitz & Spotnitz, Thrombosis and Haemostasis 78 (1997) 661–666; Radosevich et al. Vox Sanguinis 72 (1997) 133–143). Wichtig zu nennen sind die Wundheilung, der Wundverschluss, Abdichten von Nähten und die Blutstillung. Die örtliche intraoperative Blutstillung ist insbesondere an parenchymatösen Organen sowie im kardiovaskulären Bereich von Bedeutung. Selbst starke Blutungen nach schweren Leber- oder Milzverletzungen sind so zu stillen. Auch für den Verschluss und die Fixierung von Hautwunden (einschließlich Hauttransplantaten), für die Abdichtung von Nähten (z.B. am Duodenalstumpf) werden Fibrinkleber eingesetzt. Beispielhaft genannt sei auch die Verwendung bei der Abdichtung eines plastischen Duraersatzes und zur Hohlraumversiegelung sowie zur Verklebung der Pleurablätter zur Palliativbehandlung von Pleuraergüssen. Zum Kleben können die Fibrinkleber auch vorteilhaft bei Bindegeweben wie Knochen, Knorpel und Sehnen eingesetzt werden.
• Die erfindungsgemäßen fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitungen können aber auch als eine Komponente zur Herstellung einer Fibrin-Matrix verwendet werden. Ein solches Trägermaterial kann u.a. zur langsamen Freisetzung von Wirkstoffen, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren (z.B. mit osteoinduktiven Proteinen als Matrix für Knochen- und/oder Knorpelregeneration), Antibiotika, entzündungshemmende Zusätze und/oder wundheilungsfördernde Zusätze verwendet werden. Der Träger kann auch aus einer Mischung von Fibrin mit anderen Materialien bestehen.
• Eine Fibrin-Matrix findet darüber hinaus weitreichende Verwendungsmöglichkeiten in der Biotechnologie, wie beispielsweise als Trägermaterial und Kulturmedium für Zellen und Gewebe im Tissue Engineering oder zum Umhüllen von Implantaten wie beispielsweise Biosensoren.
• Weiterhin soll die Erfindung durch die folgenden Beispiele veranschaulicht werden, die jedoch in keiner Weise einschränkende Wirkung haben sollen.
• Beispiel 1:
• Eine fibrinogenhaltige Lösung wurde pro Liter mit 80 ml einer Aluminiumhydroxid-Lösung versetzt und gerührt. Anschließend wurde das Aluminiumhydroxid durch Zentrifugation abgetrennt und verworfen. Die fibrinogenhaltige Lösung wurde mit physiologischer NaCl Lösung auf eine optische Dichte bei 280–320 nm (OD_280-320) von ca. 50 verdünnt. Die so erhaltene fibrinogenhaltige Lösung, im Folgenden auch als fibrinogenhaltige Ausgangslösung bezeichnet, wurde mit unterschiedlichen Arten und Mengen von Stabilisatoren, wie Tabelle 1 zu entnehmen ist, versetzt. Die Mengenangaben beziehen sich dabei auf 1 Liter der fibrinogenhaltigen Ausgangslösung (zugesetzte Stabilisatoren pro Liter fibrinogenhaltiger Ausgangslösung). Die fibrinogenhaltige Lösung wurde bis zur vollständigen Lösung der Stabilisatoren bei 30°C gerührt. Der pH-Wert wurde mit einer 2 M Natriumhydroxid-Lösung auf pH 7,5 eingestellt. Die durch Zugabe der Stabilisatoren erfolgte Volumenzunahme ist in Tabelle 1 aufgeführt.
• Für die anschließende Hitzebehandlung wurden die stabilisierten fibrinogenhaltigen Lösungen (Ansätze) für 10 h bei 60°C inkubiert.
• Vor und nach dieser Pasteurisierung wurde eine Probe zur Analyse der Aggregatbildung mittels Größenausschlußchromatographie (SEC-HPLC, siehe weiter unten) entnommen.
• Nach Abkühlen und Verdünnung auf das vierfache Volumen mit Verdünnungslösung (3,5 g/L NaCl; 6 g/L tri-Natriumcitrat-dihydrat in Wasser) wurden pro Liter pasteurisierter fibrinogenhaltiger Lösung 90 g Glycin (Ansatz 1 und 2) bzw. 90 g zuzüglich der Glycin-Menge, die notwendig war, um die gesamte in Ansätzen 1 und 2 enthaltene Glycin Konzentration zu erreichen, (Ansätze 3 und 4) unter Rühren zugesetzt. Das entstandene Präzipitat wurde mittels Zentrifugation oder Filtration abgetrennt und verworfen. Die Hauptfällung erfolgte durch langsame Zugabe von weiterem Glycin, um insgesamt eine Konzentration von 175 g/L zu erreichen. Der fibrinogenreiche Niederschlag wurde isoliert und zur Ausbeutebestimmung in einem definierten Puffervolumen gelöst. Die Fibrinogenbestimmung nach Clauss (A. Clauss; Acta Haematol 17: 237–246 (1957)) erfolgte an einem Gerinnungsautomaten (Behring Coagulation Timer). Tabelle 1 zeigt in Spalte 4 die so ermittelte, verbleibende Ausbeute an biologisch aktiven Fibrinogen in Prozent bezogen auf die Fibrinogenmenge vor der Hitzebehandlung.
• In Tabelle 1 sind auch die Ergebnisse der SEC-HPLC Analyse zur Feststellung der Aggregatbildung gezeigt. Bei der SEC-HPLC handelt es sich um eine Size Exclusion Chromatography, die Fibrinogen und Aggregate entsprechend ihres Molekulargewichtes auftrennt. Hochmolekulare Anteile wie Aggregate eluieren noch vor dem Fibrinogen-Hauptpeak und finden sich im Elutionsprofil als Peak 1 und 2 wieder. Die Summe der Flächen unter Peak 1 und Peak 2 der Proben vor und nach der Hitzebehandlung wurde bestimmt und als Prozentanteil der Peaks 1–3 berechnet. Der Wert von SEC Peak 1+2 nach der Hitzebehandlung wurde um den Wert vor Beginn der Pasteurisierung (liegt normalerweise zwischen 10 und 20%) verringert und die hieraus ermittelten Werte sind als Ergebnis in Tabelle 1 unter δ (Peak 1+2) gezeigt. Sie geben den Anstieg an Aggregaten während der Pasteurisierung wieder. Je höher dieser Wert liegt, umso mehr Aggregate haben sich während der Pasteurisierung gebildet.
• Für die Durchführung wurde ein entsprechendes HPLC-System mit einer SEC-Säule (TSK Gel G 4000 SWXL, 7,5 × 300 mm von TOSO HAAS) verwendet. Die Auftrennung der Proteine und Aggregate erfolgte bei einer Flussrate von 0,5 ml/min in einem geeigneten Laufpuffer (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05% NaN₃ pH 7,0) bei Raumtemperatur. Die Detektion der Proteine bzw. Aggregate erfolgte bei 280 nm.
• Tabelle 1: Pasteurisierung bei 60°C für 10 Stunden

  
• Das Ergebnis zeigt, dass durch Zusatz von Ammoniumsulfat ((NH₄)₂SO₄) die Aggregatbildung signifikant reduziert werden kann (um 15 % bzw. 27 %) und eine erhöhte Fibrinogen-Ausbeute zu erzielen ist (vergleiche Ansatz 2 mit 1 bzw. Ansatz 4 mit 3). Außerdem ist ersichtlich, dass die Menge an Saccharose und Glycin im Vergleich zum Standardansatz (Ansatz 1) reduziert werden kann und trotzdem noch reduzierte Aggregatbildung beobachtet wird (vergleiche Ansatz 4 mit Ansatz 1). Dies ist zusätzlich von Vorteil, da die verminderte Menge an Saccharose und Glycin mit einer verbesserten Virusinaktivierung einhergeht.
• Beispiel 2:
• Eine fibrinogenhaltige Ausgangslösung, hergestellt entsprechend Beispiel 1, wurde mit den Stabilisatoren entsprechend Tabelle 2 versetzt und unter Beibehaltung eines pH-Wertes von 7,5 bis zur vollständigen Lösung bei ca. 30°C gerührt. Anschließend wurde die stabilisierte fibrinogenhaltige Lösung für 10 Stunden bei 61°C pasteurisiert. Der Aggregatgehalt wurde vor und nach Pasteurisierung durch SEC-HPLC, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt und der ermittelte Aggregatanstieg wird in Tabelle 2 gezeigt.
• Tabelle 2: Pasteurisierung bei 61°C für 10 Stunden

  
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• Das Ergebnis zeigt, dass nicht nur Ammoniumsulfat ((NH₄)₂SO₄) sondern auch Ammoniumacetat (NH₄Ac) und Ammoniumchlorid (NH₄Cl) die Aggregatbildung signifikant reduzieren können. Das beste Ergebnis zeigt hierbei der Zusatz von 30 mMol NH₄Cl (Ansatz 7), bei dem im Vergleich zum Kontrollansatz (Ansatz 1) der Aggregatanstieg um 76% reduziert werden konnte (während der Hitzebehandlung also nur ca. ¼ der Aggregate wie im Kontrollansatz gebildet werden). Aber selbst der Zusatz so geringer Mengen wie 3,75 mMol (NH₄)₂SO₄ (Ansatz 2) vermag den Aggregatanstieg noch um 16 % zu reduzieren.
• Gezeigt ist ebenfalls, dass nicht nur Ammoniumsalze, sondern auch Aminoverbindungen wie Ethanolamin sich reduzierend auf die Aggregatbildung (um 57% weniger Aggregate gebildet) bei einer Pasteurisierung auswirken.
• Die Zusätze des Typs R-NH₃ ⁺ X^– reduzieren die Aggregatbildung bereits sehr gut, wenn sie in geringen Mengen (ca. 3 bis 60 mMol pro Liter fibrinogenhaltige Ausgangslösung) zugesetzt werden. Dabei müssen höhere Konzentrationen nicht zwangsweise vorteilhaft sein, wie beim Vergleich von Ansatz 4 und 5 oder Ansatz 11 und 12 feststellbar ist.
• Die für die jeweilige Ammoniumverbindung optimale Konzentration neben bestimmten üblichen Stabilisatoren, kann von dem Fachmann leicht durch entsprechende vergleichende Versuche herausgefunden werden.
• Der Versuch zeigt auch, dass auf den üblichen Stabilisator Glycin vollständig verzichtet werden kann (vergleiche Ansatz 10 und Ansatz 3).
• Beispiel 3:
• Eine fibrinogenhaltige Ausgangslösung, hergestellt entsprechend Beispiel 1, wurde mit den Stabilisatoren entsprechend Tabelle 3 versetzt und unter Beibehaltung eines pH-Wertes von 7,5 bis zur vollständigen Lösung bei ca. 30°C gerührt. Anschließend wurde die stabilisierte fibrinogenhaltige Lösung für 10 Stunden bei 60°C pasteurisiert. Der Aggregatgehalt wurde vor und nach Pasteurisierung durch SEC-HPLC, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt und in Tabelle 3 als Aggregatanstieg aufgeführt.
• Tabelle 3: Pasteurisierung bei 60°C für 10 Stunden

  
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• Das Ergebnis zeigt, dass die Zusätze des Typs R-NH₃ ⁺ X^– auch bei unterschiedlicher Zusammensetzung und Menge der üblichen Stabilisatoren die Aggregatbildung wesentlich reduzieren.
• Beispiel 4:
• Eine fibrinogenhaltige Ausgangslösung, hergestellt entsprechend Beispiel 1, wurde mit den Stabilisatoren entsprechend Tabelle 4 versetzt und unter Beibehaltung eines pH-Wertes von 7,5 bis zur vollständigen Lösung bei ca. 30°C gerührt. Anschließend wurde die stabilisierte fibrinogenhaltige Lösung für 11 Stunden bei 61°C pasteurisiert. Der Aggregatgehalt wurde vor und nach Pasteurisierung durch SEC-HPLC, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt und in Tabelle 4 aufgeführt.
• Tabelle 4: Pasteurisierung bei 61°C für 11 Stunden

  
• Das Ergebnis zeigt, dass auch unter verschärften Pasteurisierungsbedingungen (61°C für 11 Stunden anstelle von 60°C für 10 Stunden) der Aggregatgehalt durch Zusätze des Typs R-NH₃ ⁺ X^– deutlich (um 11% bzw. 27%) reduziert werden kann (vergleiche Ansatz 2 mit 1 und Ansatz 4 mit 3).

Claims (14)

1. Verfahren zur Hitzebehandlung von fibrinogenhaltigen Lyophilisaten, dadurch gekennzeichnet, dass der fibrinogenhaltigen Lösung vor der Lyophilisation neben üblichen Hilfsstoffen ein oder mehrere R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindungen in einer Konzentration unterhalb 0,5 Mol/l zugesetzt werden, wobei R ein Wasserstoff oder ein Alkyl-, Aryl- oder gemischtem Alkyl-/Arylrest ist und die Alkyl- und/oder Arylreste mit Halogen, Hydroxyl- oder Aminogruppen substituiert sein können und X^– ein Anion ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der fibrinogenhaltigen Lösung Ammoniumsalze (NH₄ ⁺) zugesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der fibrinogenhaltigen Lösung ein oder mehrere Amine zugesetzt werden.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der fibrinogenhaltigen Lösung Ammoniumsalze zugesetzt werden, die als Anionen (X^–) Sulfat-, Chlorid- oder Acetat-Ionen enthalten.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die R-NH₃ ⁺ X^– und R-NH₂ Verbindungen neben üblichen Stabilisatoren bis zu einer Konzentration von 1 bis 150 mMol pro Liter der fibrinogenhaltigen Lösung zugesetzt werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als übliche Stabilisatoren Zucker, Zuckeralkohole, Aminosäuren, zweiwertige Metall-Ionen oder Mischungen davon zugesetzt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als übliche Stabilisatoren Saccharose, Glycin, Calciumchlorid oder Mischungen davon der fibrinogenhaltigen Lösung zugesetzt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als übliche Stabilisatoren Saccharose und Calciumchlorid der fibrinogenhaltigen Lösung zugesetzt werden.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂ Verbindungen Ammonium chlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat und/oder Ethanolamin zugesetzt werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hitzebehandlung eine Erwärmung auf 30°C bis 100°C bedeutet.
11. Verfahren zur Verminderung der Aggregatbildung bei der Hitzebehandlung von fibrinogenhaltigen wässrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, dass der fibrinogenhaltigen Lösung neben üblichen Fibrinogenstabilisatoren ein oder mehrere carboxylgruppenfreie Verbindungen der Formeln R-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-NH₂, in denen R Wasserstoff oder ein Alkyl-, Aryl- oder ein gemischter Alkyl- /Arylrest ist, der mit Hydroxyl-, Halogen oder Aminogruppen substituiert sein kann und X^– ein Anion ist, in einer Menge von 1 bis 500 mM/l zugesetzt werden.
12. Fibrinogenhaltige pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass sie neben üblichen Hilfsstoffen, eine oder mehrere carboxylgruppenfreie Verbindungen der Formeln NH₄ ⁺ X^–, R-CH₂-NH₃ ⁺ X^– und/oder R-CH₂-NH₂ in einer Konzentration unterhalb 0,5 Mol/l enthält, wobei R ein Wasserstoff oder ein Alkyl-, Aryl- oder gemischter Alkyl-/Arylrest ist und die Alkyl- und/oder Arylreste mit Halogen, Hydroxyl- oder Aminogruppen substituiert sein können und X^– ein Anion ist und die Verbindung physiologisch verträglich ist.
13. Verwendung einer fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung nach Anspruch 12 als Therapeutikum oder Diagnostikum.
14. Verwendung einer fibrinogenhaltigen pharmazeutischen Zubereitung nach Anspruch 12 als Komponente eines Fibrinklebers.