DE60027695T2

DE60027695T2 - Verfahren zur herstellung von fibrinogen und fibronectin sowie proteinzusammesetzungen, welche damit herstellbar sind

Info

Publication number: DE60027695T2
Application number: DE60027695T
Authority: DE
Inventors: Thomas Seelich; Ralf Broermann
Original assignee: Baxter AG
Current assignee: Baxter AG
Priority date: 1999-02-12
Filing date: 2000-02-10
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2020-02-11
Also published as: EP1151007A1; EP1151007B1; SI1151007T1; AU2004201982A1; DE60027695D1; CA2362513A1; AU2004201982B2; PT1151007E; AU774118B2; ATE325133T1; CA2362513C; JP2007131638A; US6579537B2; WO2000047621A1; ES2263451T3; AU2804100A; US7241603B2; DK1151007T3; US20020172718A1; US20030077270A1

Description

Ein Verfahren zur Herstellung eines Präparates auf Fibrinogen- und Fibronectinbasis sowie eine gemäß diesem Verfahren erhältliche Proteinzusammensetzung.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Proteinzusammensetzungen umfassend Fibronectin und Fibrinogen und gegebenenfalls auch weitere Inhaltsstoffe und betrifft auch gemäß diesem Verfahren erhältliche Proteinzusammensetzungen.
Gewebeklebstoffe auf Fibrinogenbasis (Fibrinkleber) sind schon seit geraumer Zeit bekannt. Sie dienen als nahtlose oder nahtunterstützende Verbindung von menschlichen oder tierischen Geweben oder Organteilen, zur Wundversiegelung, zur Blutstillung und als Unterstützung bei der Wundheilung.
Ihre Wirkungsweise basiert auf einer Imitation der letzten Phase der Blutgerinnung.
Durch die Wirkung von Thrombin wird (lösliches) Fibrinogen zuerst in Fibrinmonomere umgewandelt, die spontan aggregieren und eine klebrige Masse bilden, einen so genannten Fibrinclot. Gleichzeitig wird der vorhandene Faktor XIII (F XIII) durch das Thrombin in Gegenwart von Calciumionen zu Faktor XIIIa aktiviert. Durch letzteren werden die aggregierten Fibrinmonomere und auch das gegebenenfalls vorhandene Fibronectin durch die Bildung neuer Peptidbindungen zu einem Hochpolymer vernetzt. Durch diese Vernetzungsreaktion wird die Festigkeit des gebildeten Clots (Gerinnsels) wesentlich gesteigert. Im Allgemeinen haftet der Clot gut an Wund- und an Gewebsflächen, wodurch unter anderem die klebende und blutstillende Wirkung zustande kommt.
Aus diesem Grund werden Fibrinkleber oft als Zweikomponentenkleber verwendet, welche die Fibrinogenkompontente gemeinsam mit einer Thrombinlösung, die zusätzlich Calciumione enthält, umfasst.
Ein besonderer Vorteil eines Fibrinklebers besteht darin, dass letzterer an der Anwendungsstelle nicht als Fremdkörper zurückbleibt, sondern wie bei der natürlichen Wundheilung vollständig resorbiert und durch neugebildetes Gewebe ersetzt wird. Verschiedene Zellen, wie zum Beispiel Makrophagen and folglich Fibroblasten wandern in den Clot, lösen das Clotmaterial auf, resorbieren es und bilden neues Gewebe.
Obwohl die komplizierten Prozesse der Wundheilung bei weitem noch nicht vollständig klar sind, wird es als sicher erachtet, dass das Vorhandensein von Fibronectin im Clot von entscheiden der Bedeutung für das Einwachsen von Zellen und somit für die Wundheilung ist.
Ein Fibrinclot von optimaler Zusammensetzung sollte deswegen zusätzlich zu seiner Hauptkomponente Fibrinogen auch einen Gehalt an Fibronectin umfassen.
Obwohl die Wirkungsweise von Fibrinkleber im Wesentlichen dem natürlichen Prozess der Blutgerinnung entspricht, ist eine bedeutend höhere Konzentration der wirksamen Komponenten (besonders von Fibrinogen) notwendig, als im Blut vorhanden ist, um genügend Wirkung zu erzielen (Klebefestigkeit und blutstillende Wirkung), die Fibrinogenkonzentration im menschlichen Blut beträgt ungefähr 2,5 bis 3 mg/ml.
Es wurde berichtet, dass durch PEG-Fällung eine Fibrinogenlösung erhalten werden kann, mit der eine zufriedenstellende Klebefestigkeit bereits bei Fibrinogenkonzentrationen von unter 30 mg/ml in einem künstlichen Testsystem (WO 92/13495) erreicht werden konnte, wobei mit diesem für viele Zwecke der Gewebeklebung eine hohe Dichte des Fibrinnetzwerkes (und letzteres ist im Wesentlichen nur durch hohe Fibrinogenkonzentrationen im Gewebeklebstoff erzielbar) nicht gewährleistet werden konnte.
Um eine optimale Wirkung zu gewährleisten, sollte der Fibrinogengehalt in einem Fibrinkleber deshalb zumindest 70 mg/ml betragen. Bei der Herstellung eines solchen konzentrierten, gebrauchsfertigen Fibrinogens bzw. solcher Fibrinkleberlösungen gibt es jedoch einige Schwierigkeiten:
Da die gebrauchsfertigen Lösungen für längere Zeiträume nicht lagerstabil sind, müssen sie bei Bedarf entweder durch Rekonstitution aus lyophilisierten Präparaten oder durch Auftauen von flüssig-tiefgefrorenen Lösungen hergestellt werden.
Aufgrund der relativ schlechten Löslichkeit von Fibrinogen und der gleichzeitig benötigten hohen Fibrinogenkonzentration in einem wirksamen Fibrinkleber, ist dies generell immer noch mühsamer und zeitaufwendiger als von den Benützern erwünscht, obwohl es verschiedene Verbesserungsvorschläge gibt. Es ist verständlich, dass speziell im Bereich der Notfallchirurgie eine besonders schnelle und leichte Verfügbarkeit eines Fibrinklebers von Nöten ist.
Darüber hinaus sind konzentrierte Fibrinkleberlösungen aufgrund ihrer hohen Fibrinogenkonzentrationen im Allgemeinen hochviskos. Eine relativ niedrige Viskosität ist jedoch nicht nur für eine einfachere Handhabung wünschenswert, sondern auch für spezielle Anwendungsweisen eines Fibrinklebers, zum Beispiel wenn er durch Sprühgeräte (wie zum Beispiel Duploject^® mit dem dazugehörigen Sprayset) oder durch einen Katheder aufgetragen wird.
Beide Anforderungen, d.h. schnelle Verfügbarkeit und geringe Viskosität der gebrauchsfertigen Fibrinkleberlösungen, können sogar noch schwerer erfüllt werden, wenn deren Herstellung (Auflösung bzw. Auftauen) ohne weitere Hilfsmittel, wie zum Beispiel Heiz- und/oder Rühreinrichtungen, bei Raumtemperatur erfolgen soll und wenn die Fibrinkleberpräparate zusätzlich hochmolekulare Substanzen, insbesondere Fibronectin, enthalten. Denn auch Fibronectin – insbesondere in Kombination mit Fibrinogen – ist relativ schwer löslich und führt generell zu einer noch schlechteren Löslichkeit und einer erhöhten Viskosität von Fibrinklebern.
Verfahren zur Herstellung von fibrinogenhaltigen Präparaten, die als Gewebeklebstoffe verwendet werden können, umfassen unter anderem ihre Herstellung aus Kryopräzipitat, gegebenenfalls mit weiteren Wasch- und Fällungsschritten mit Ethanol, Ammoniumsulfat, Polyethylenglykol, Glycin oder β-Alanin, bzw. ihre Herstellung aus Plasma im Rahmen der bekannten Plasmafraktionierungsmethoden (vgl. z.B. „Methods of plasma protein fractionation", 1980, Herausgeber: Curling, Academic Press, Seiten 3–15, 33–36 und 57–74, oder Blombäck B. und M., „Purification of human und bovine fibrinogen", Arkiv Kemi 10, 1959, Seite 425 ff.).
Im Stand der Technik wurden auch verschiedene Vorschläge vorgebracht, um die Viskosität von hochkonzentrierten Fibrinogenlösungen zu reduzieren. Somit ist zum Beispiel der Zusatz von Lösungsmitteln, wie zum Beispiel von Substanzen, die einen Harnstoff- oder Guanidinrest, zum Beispiel Arginin (siehe DE 3203775-A1), enthalten, oder der Zusatz von unphysiologisch hohen Salzkonzentrationen bekannt. Jedoch hat sich gezeigt, dass solche Gewebeklebstoffe zytotoxische bzw. proliferationshemmende Eigenschaften aufweisen (Redl et al., Med. Welt 36, 1985, Seiten 769–776).
Gemäß der EP 0 804 933 wird der Zusatz von Substanzen, die die Löslichkeit von Fibrinogen verbessern, vorgeschlagen. Solche Substanzen sind zum Beispiel Vitamine, aromatische Verbindungen, wie von Benzol oder Phenol abgeleitete Verbindungen, oder jene, die von heterozyklischen Verbindungen, wie zum Beispiel Piperidin, Pyridin oder Pyrimidin, abgeleitet sind. Die WO 95/23167 A beschreibt zwei Komponenten (Salz und Amino-6-Hexansäure), die zu einem Konzentrat von aus gefrorenem Vollplasma erhaltenen Proteinen zugefügt werden, wobei Amino-6-Hexansäure verwendet wird, um die Affinität von Plasminogen zu Fibrinogen zu beseitigen, und nicht als Fällungsmittel.
In der EP 0373044 A ist ein Plasmakonzentrat geoffenbart, das durch die Fällung von Plasma mit Ethanol erhalten wird.
Die EP 0059265 beschreibt eine Zusammensetzung zur Wundversiegelung und Wundheilung, umfassend einen Kollagenträger, Fibrinogen, Faktor XIII und Thrombin. Die Herstellung einer solchen Zusammensetzung beinhaltet die Bildung einer Emulsion durch Zusammenmischen der Komponenten gemeinsam mit Ethanol und das folgende Abdampfen von Ethanol.
Somit ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Nachteile bekannter Präparate auszuräumen bzw. die bekannten Präparate weiter zu verbessern und Proteinzusammensetzungen bereitszustellen, die einen hohen Fibrinogengehalt und ein leicht regulierbares Verhältnis von Fibrinogen zu Fibronectin umfassen, sowie gegebenenfalls weitere Inhaltsstoffe, die zum Beispiel für eine verbesserte Herstellung von gebrauchsfertigen Gewebeklebstoffen geeignet sind, während insbesondere Eigenschaften, wie zum Beispiel eine gute Zellkompatibilität oder die Bildung einer physiologischen Fibrinstruktur nach dem Mischen mit einer Thrombinlösung, erhalten bleiben. Gleichzeitig sollen auch die Viskositätseigenschaften solcher Proteinzusammensetzungen oder pharmazeutischer Präparate verbessert werden.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein vereinfachtes und schnelleres Herstellungsverfahren für solche Proteinzusammensetzungen zur Verfügung zu stellen. Insbesondere soll das Verfahren auch im industriellen Maßstab leicht durchführbar sein.
Diese Ziele werden erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung von Proteinzusammensetzungen erreicht, die Fibrinogen und Fibronectin umfassen, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Fibrinogen und Fibronectin umfassende Ausgangslösung mit einer Fällungszusammensetzung behandelt wird, die ein Polyol, insbesondere Polyalkylenglykol, oder einen Alkohol mit bis zu vier Kohlenstoffatomen, insbesondere Ethanol, oder ein anorganisches Salz, insbesondere Ammonium- oder Alkalisulfat, und eine Aminosäure, insbesondere Glycin oder Alanin, umfasst, so dass mit einer Einschritt-Fällung ein Niederschlag gebildet wird, der Fibrinogen und Fibronectin umfasst. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ein effizientes und Protein-erhaltendes Präparat, das große Ausbeuten ergibt, durch die Fällungszusammensetzung mittels einer Einschritt-Fällung hergestellt werden kann.
Nach der Einschritt-Fällung kann der erhaltene Niederschlag mittels an sich bekannter Methoden weiter verarbeitet werden, vorzugsweise zu einem pharmazeutischen Präparat, insbesondere einem Gewebeklebstoff (Fibrinkleber).
Unter einer löslichkeitsverändernden Komponente wird eine Substanz verstanden, die unter den gegebenen anderen Bedingungen, wie zum Beispiel Temperatur, pH-Wert, Ionenstärke etc., einen Fällungseffekt oder einen löslichkeitsverbessernden Effekt auf zumindest eines der Proteine, das Fibrinogen oder das Fibronectin, hat.
Es hat sich nämlich gemäß der Erfindung ganz überraschend gezeigt, dass die gemeinsame Verwendung von zwei löslichkeitsverändernden Komponenten, die sich (voneinander) unterscheiden, eine Gewinnung von Fibrinogen und Fibronectin im Niederschlag in hohen Ausbeuten ermöglicht, wobei sich erstaunlicherweise die Einschritt-Fällung der Erfindung als wesentlich weniger Protein schädigend erwies als die individuelle Fällung der entsprechenden Substanzen.
Darüber hinaus wurde auch gezeigt, dass eine Zusammensetzung, die gemäß der Erfindung ausgefällt wurde und Fibrinogen und Fibronectin enthält, enorm verbesserte Eigenschaften auch hinsichtlich ihrer praktischen Anwendung aufweist, insbesondere bezüglich ihrer Viskosität und Rekonstitution, wodurch eine leichtere Anwendung dieser Präparate ermöglicht wird.
Als Ausgangsmaterialien für die Herstellung der Ausgangslösung können prinzipiell all jene genutzt werden, die bislang verwendet wurden bzw. die gemäß dem Stand der Technik für die Herstellung solcher Proteinzusammensetzungen möglich sind.
Als Ausgangsmaterial wird vorzugsweise Plasma, insbesondere Humanplasma, oder eine Fibrinogen und Fibronectin umfassende Plasmafraktion, vorzugsweise eine aus Kryopräzipitat abgeleitete Fraktion, für die Herstellung der Ausgangslösung verwendet bzw. direkt als Ausgangslösung verwendet.
Andere Fibrinogen und Fibronectin umfassende Ausgangsmaterialien bzw. Ausgangslösungen, wie zum Beispiel Zellkulturüberstände, können jedoch auch gemäß der Erfindung verwendet werden.
Die löslichkeitsverändernden Komponenten sind so gewählt, dass ein Niederschlag in einer Einschritt-Fällung gebildet wird, welcher Fibrinogen und Fibronectin in einem gewünschten und vorher bestimmten Mengenverhältnis enthält.
Gemäß der Erfindung sind die in der Fällungszusammensetzung enthaltenen Komponenten so gewählt, dass sie sich unter den gegebenen Bedingungen von einander bezüglich ihrer löslichkeitsverändernden, d.h. löslichkeitsverbessernden oder fällenden Wirkung auf Fibrinogen bzw. Fibronectin unterscheiden. Eine Komponente kann zum Beispiel einen Fällungseffekt auf im Wesentlichen lediglich eines der zwei Proteine haben, d.h. auf Fibrinogen oder auf Fibronectin.
Es ist allerdings auch möglich, dass eine der beiden Komponenten eine Fällungswirkung auf beide Proteine ausübt, wobei die andere Komponente lediglich auf eine der zwei Proteine eine Fällungswirkung hat bzw. sogar die Löslichkeit des anderen Proteins erhöht, d.h. nicht als ein Fällungsmittel, sondern als ein Lösungsvermittler wirkt.
Insbesondere ist die löslichkeitsverändernde Komponente eine Substanz ausgewählt aus der Gruppe von Alkohol, insbesondere Alkohol mit bis zu vier Kohlenstoffatomen, anorganischem Salz, organischem Salz, Polyol, insbesondere Polyalkylenglykol, Polyether und Aminosäure. Es können auch Ether, Ketone und zyklische, heterozyklische oder polyzyklische organische Verbindungen verwendet werden.
Als die löslichkeitsverändernden Komponenten werden vorzugsweise inbesondere Ethanol, Polyethylenglykol, Ammonium- bzw. Alkalisalze, wie zum Beispiel Ammonium- oder Alkalisulfat, oder die Aminosäuren Glycin und (β-)Alanin verwendet.
Unter diesen organischen Polymeren befinden sich insbesondere die linearen Polymere, inbesondere jene, die ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen etwa 200 und 20.000 haben, zum Beispiel Polyalkylenglykole. Polyethylenglykol hat sich als besonders geeignet herausgestellt. Diese nicht toxischen, wasserlöslichen synthetischen Polymere, insbesondere jene, die ein Molekulargewicht zwischen 400 und 10.000, vorzugsweise circa 4.000, haben, werden vorzugsweise in der Fällung verwendet, da sie eine konservierende Wirkung auf Fibrinogen und Fibronectin haben. Zusätzlich zu der besonders sanften und konservierenden Wirkung der in der Fällungszusammensetzung zu verwendenden Komponenten wird auch ihre Sicherheit hinsichtlich der Anwendung beim Menschen bei ihrer Auswahl berücksichtigt.
Als ein gemäß der Erfindung verwendbares Komponentenpaar kann zum Beispiel Polyethylenglykol (PEG), insbesondere PEG 4000, das einen Fällungseffekt sowohl auf Fibrinogen als auch auf Fibronectin hat, verwendet werden, und als zweite Komponente Glycin, das überraschenderweise in der Anwesenheit einer weiteren Komponente, zum Beispiel Polyethylenglykol, nicht nur im Vergleich zu Fibronectin vorzugsweise Fibrinogen fällt, sondern sogar als ein Lösungsvermittler für Fibronectin wirkt. Glycin in einem Konzentrationsbereich von mehr als 0,6 M, in welchem Glycin bisher nur als ein proteinfällendes Mittel bekannt war, weist eine besonders gute, die Löslichkeit von Fibronectin steigernde Wirkung auf.
Natürlich ist die vorliegende Erfindung nicht auf Kombinationen von PEG und Glycin beschränkt, da es dem Durchschnitts-Fachmann ein Leichtes sein wird, auch andere Komponenten bzw. Komponentenpaare, die gemäß der Erfindung geeignet sind, durch einfache systematische Tests zu finden.
Um das erfindungsgemäße Verfahren durchführen zu können, kann der Fachmann zum Beispiel geeignete Komponenten bzw. Komponentenpaare gemäß dem folgenden Testschema finden. Bei bestimmten Bedingungen, wie zum Beispiel Temperatur, pH-Wert, Ionenstärke etc., und unter Rühren werden Aliquots einer durch übliche Verfahren hergestellten Ausgangslösung Fällungszusammensetzungen zugesetzt, die eine erste löslichkeitsverändernde Komponente, zum Beispiel eine Aminosäure, und eine zweite, davon unterschiedliche Komponente, zum Beispiel PEG 4000, Ethanol oder Ammoniumsulfat, enthalten. Fällungsreihen werden durchgeführt, bei denen die Konzentration einer der Komponente immer gleich gehalten wird und die andere verändert wird. Die gebildeten Niederschläge werden abzentrifugiert, und der gesamte Proteingehalt sowie der relative Gehalt an Fibrinogen (Fbg), Fibronectin (Fn) und Albumin (Alb) werden bestimmt, zum Beispiel durch SDS-PAGE der nicht reduzierten und reduzierten Proben, Färbung mit Coomassie-Blau und densitometrische Auswertung.
Jene Komponenten, die zu der gewünschten fibrinogen- und fibronectinhältigen Proteinzusammensetzung führen, werden dann für die Fällungszusammensetzung gemäß der Erfindung ausgewählt. Die Optimierung des entsprechenden Komponentensystems wird durch leicht kontrollierbare Parameter vollzogen, wie zum Beispiel Ausbeute, relativer Gehalt an Fibrinogen und Fibronectin bzw. Viskosität des erhaltenen Präparates bei einem vorher bestimmten Fibrinogengehalt (zum Beispiel 70 oder 100 mg Fibrinogen pro ml).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Fällungszusammensetzung Polyalkylenglykol, das der Ausgangslösung zugesetzt wird, insbesondere bis zu einer Endkonzentration von 1 bis 12% Gew./Vol., vorzugsweise von 4 bis 8% Gew./Vol..
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Fällungszusammensetzung eine oder mehrere Aminosäuren, die der Ausgangslösung zugesetzt wurden, insbesondere bis zu einer Endkonzentration von 0,5 bis 3 M, vorzugsweise von 0,75 bis 2 M, insbesondere von 0,75 bis 1,5 M.
Ein organisches oder anorganisches Salz, zum Beispiel Ammoniumsulfat, kann bei einer Konzentration bis 20% Gew./Vol., vorzugsweise zwischen 2 und 20% Gew./Vol., am meisten bevorzugt zwischen 5 und 15% Gew./Vol., inkludiert werden.
Die Fällungszusammensetzung wird vorzugsweise in flüssiger Form zugesetzt.
Auch andere Inhaltsstoffe des Ausgangsmaterials können durch die Fällungszusammensetzung ausgefällt werden, wie zum Beispiel insbesondere Faktor XIII. Ebenso kann die Fähigkeit der löslichkeitsverändernden Zusammensetzung zur Mitfällung solcher weiterer Substanzen die endgültige Wahl der individuellen Komponenten in der Fällungszusammensetzung beeinflussen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird versucht, das Plasminogen in der ausgefällten Proteinzusammensetzung bzw. im pharmazeutischen Präparat ziemlich gering zu halten. Demgemäß wird vorzugsweise eine Fällungszusammensetzung verwendet, bei der das Plasminogen größtenteils im Überstand bleibt, das heißt, dass in dem erhaltenen Niederschlag das Plasminogen relativ zum Fibrinogen und/oder Fibronectin, verglichen mit dem Ausgangsmaterial, abgereichert wird.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können weitere Inhaltsstoffe, insbesondere Fibrinolyse-Inhibitoren, Faktor XIII, Antibiotika, Wachstumsfaktoren, schmerzlindernde Substanzen, entzündungshemmende Mittel oder Mischungen davon der Proteinzusammensetzung hinzugefügt werden. Solche Zugaben können vor, während und auch nach dem Fällungsschritt erfolgen und werden vorzugsweise nach dem Fällungsschritt durchgeführt.
Im Laufe der weiteren Verarbeitung, insbesondere während der endgültigen Formulierung, wird die Proteinzusammensetzung gemäß der Erfindung oder das pharmazeutische Präparat gemäß der Erfingung vorzugsweise tiefgefroren oder lyophilisiert, insbesondere wenn eine verbesserte Lagerstabilität erreicht werden soll. Das gebrauchsfertige pharmazeutische Präparat gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise in flüssiger Form vorgesehen.
Inbesondere hat das Verfahren gemäß der Erfindung den Vorteil, dass gut definierte Proteinzusammensetzungen direkt auf einfache Weise erhältlich sind, wohingegen die bisher verwendeten Verfahren der Proteinfraktionierung, insbesondere der Plasmafraktionierung, immer auf das Erhalten von individuellen, möglichst reinen Proteinen und gegebenenfalls auf ein abermaliges Vermischen dieser danach, um die gewünschte Mischung zu bekommen, abzielten.
Durch die Einfachheit und Kürze des Verfahrens gemäß der Erfindung wird auch das Risiko einer mikrobiellen Kontaminiation und der Bildung von Pyrogenen während der Produktion verringert. Darüber hinaus bleiben empfindliche Plasmaproteine, wie zum Beispiel Fibrinogen oder Fibronectin, erhalten und sind weitgehend vor Denaturierung geschützt, und darin liegt wahrscheinlich der Grund für die verbesserten Eigenschaften der Präparate gemäß der Erfindung.
Überraschenderweise wurde gezeigt, dass die Proteinzusammensetzungen bzw. pharmazeutischen Präparate, die durch die Einschritt-Kombinations-Fällung der Erfindung erhältlich sind, bei ähnlich hohen Fibrinogenkonzentrationen eine ungefähr um 25%, vorzugsweise sogar 30%, am meisten bevorzugt 40% geringere Viskosität als vergleichbare Präparate aufweisen, zum Beispiel Fibrinkleber, die durch die klassischen Produktionsverfahren hergestellt wurden, insbesondere durch Fällung mit nur einem Mittel.
Unter vergleichbaren Präparaten werden Präparate verstanden, welche einen ähnlichen Gehalt an Fibrinogen, Fibronectin und gegebenenfalls weiteren Inhaltsstoffen haben, und einen vergleich baren Reinheitsgrad, der eine ähnlich gute Zellkompatibilität aufweist und welche nach dem Mischen mit einer Thrombinlösung Clots von physiologischer Fibrinstruktur bilden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Proteinzusammensetzung bzw. das gebrauchsfertige pharmazeutische Präparat im Wesentlichen keine Substanzen, die die Löslichkeit des Fibrinogens verbessern bzw. werden keine solchen Substanzen zugesetzt.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass flüssige Zusammensetzungen gemäß der Erfindung verglichen mit vergleichbaren bekannten Präparaten eine merklich geringere Viskosität aufweisen, wodurch insbesondere die Handhabung und die Verwendung von Fibrinklebern erleichtert wird. Insbesondere bei Raumtemperatur können die lyophilisierten Zusammensetzungen gemäß der Erfindung leichter und schneller als vergleichbare Präparate rekonstituiert werden.
Insbesondere wenn das Verfahren gemäß der Erfindung großtechnisch angewendet wird, das – und dies ist ein weitere Vorteil der vorliegenden Erfindung – sehr effizient und kostensparend in großem Umfang angewendet werden kann, ist es bevorzugt, die Fällungszusammensetzung in flüssiger Form beizumischen. Dies kann eine Lösung oder Suspension sein.
Es hat sich ebenfalls als geeignet erwiesen, dass das nach der Einschritt-Fällung erhaltene Präzipitat zumindest einmal mit einem Waschpuffer gewaschen wird. Zusätzlich zu einem passendem Puffersystem enthält der Waschpuffer vorzugsweise Tranexamsäure, Lysin, ε-Aminocapronsäure, Detergentien oder Mischungen dieser Substanzen. Auch Fibrinolyse-Inhibitoren bzw. Protease-Inhibitoren plasmatischen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs bzw. gentechnisch oder synthetisch hergestellte Inhibitoren können enthalten sein. Derartige Substanzen können getrennt zugesetzt werden oder können bereits im Ausgangsmaterial enthalten sein.
Ein bevorzugter Protease-Inhibitor ist zum Beispiel Aprotinin, insbesondere gentechnisch hergestelltens Aprotinin. Ein weiterer bevorzugter Fibrinolyse-Inhibitor ist Tranexamsäure (trans-4-(Aminomethyl)-cyclohexancarbonsäure, t-AMCHA).
Das erhaltene Proteinpräzipitat kann als solches verwendet werden, oder auch zu einer weiteren Proteinzusammensetzung bzw. zu einem pharmazeutischen Präparat durch an sich bekannte Metho den weiterverarbeitet werden. Solche Methoden zur Verarbeitung inkludieren zum Beispiel diverse Reinigungsschritte, wie zum Beispiel die Behandlung (das Waschen) mit einer Pufferlösung in der Kälte, bzw. die Formulierung als ein pharmazeutisches Präparat.
Solche Endzusammensetzungen bzw. -präparate der Erfindung sind insbesondere für die Gewebeklebung, Blutstillung und als Hilfe oder Unterstützung in der Wundheilung geeignet.
Plasma, welches vorzugsweise als Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung verwendet wird, ist vorzugsweise ausreichend vorselektiert, zum Beispiel gemäß dem Verfahren der WO 96/35437, so dass Viruskontamination nahezu ausgeschlossen werden kann. Vorzugsweise wird nur ein solches Ausgangsmaterial verwendet, das auf die Abwesenheit von Pathogenen, insbesondere Viren und/oder Prionen, überprüft wurde.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist zumindest ein Schritt zur Inaktivierung oder Abreicherung von gegebenenfalls vorhandenen Pathogenen vorgesehen.
Zur Inaktivierung von Pathogenen wird vorzugsweise eine Tensid- und/oder Hitzebehandlung (Trocken- oder Dampfbehandlung) durchgeführt, zum Beispiel eine Hitzebehandlung im festen Zustand, insbesondere eine Dampfbehandlung gemäß der EP-0 159 311 oder EP-0 519 901, oder EP-0 674 531.
Weitere Behandlungen zur Inaktivierung von Pathogenen umfassen auch die Behandlung mit chemischen oder chemisch/physikalischen Methoden, zum Beispiel mit chaotropen Stoffen gemäß der WO94/13329, DE 4434538 oder EP-0131740 (Lösungsmittel), oder die Photoinaktivierung.
Auch die Abreicherung durch Filtration, inbesondere Ultrafiltration, vorzugsweise in Anwesenheit von virusbindenden Mitteln, wie zum Beispiel Aerosil, ist ein bevorzugtes Verfahren zur Abreicherung von Viren im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Gemäß der Erfindung ist die Inaktivierung durch eine Hitzebehandlung, eine Lösungsmittelbehandlung, eine Detergensbehandlung oder eine Kombination (gleichzeitig oder aufeinanderfolgend) dieser Behandlungen, genauso wie gegebenenfalls eine Filtration, besonders bevorzugt.
Die Inaktivierung kann vor oder nach der Fällung erfolgen. Vorzugsweise werden zwei unabhängige Inaktivierungen durchgeführt, zum Beispiel eine Behandlung vor der Einschritt-Fällung und eine zweite Behandlung danach.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Proteinzusammensetzung dadurch gekennzeichnet, dass Faktor XIII enthalten ist. Vorzugweise wird Faktor XIII zugesetzt, und der Faktor-XIII-Gehalt beträgt beispielsweise mindestens 80 Einheiten pro g Fibrinogen, vorzugsweise mindestens 100 E/g Fibrinogen. Falls auch die die Fibrin-Vernetzungsreaktion hemmenden Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika, in dem Präparat vorhanden sind, wird der Faktor-XIII-Gehalt vorzugsweise auf mindestens 500 E/g Fibrinogen erhöht. Vorzugsweise wird der Faktor XIII als ein gereinigtes, separat virusinaktiviertes Produkt (besonders bevorzugt ein Faktor-XIII-Präparat hergestellt gemäß der EP 0 637 541 ), zugesetzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Proteinzusammensetzung durch einen niedrigen Plasminogengehalt gekennzeichnet. Der Gehalt an Plasminogen beträgt vorzugsweise höchstens 1,6 mg/g Fibrinogen, mehr bevorzugt weniger als 0,8 mg/g Fibrinogen, am meisten bevorzugt weniger als 0,3 mg/g Fibrinogen.
Die Proteinzusammensetzung gemäß der Erfindung umfasst vorteilhafterweise Fibronectin und Fibrinogen in einem Verhältnis von zwischen 0,02 und 0,5, vorzugsweise zwischen 0,02 und 0,25, ebenfalls bevorzugt zwischen 0,02 und 0,2, mehr bevorzugt zwischen 0,04 und 0,16, am meisten bevorzugt circa 0,1 (zwischen 0,05 und 0,15), d.h. im Gegensatz zu hochreinen Fibrinogenpräparaten (WO 94/20524) enthält sie immer noch wesentliche Teile an Fibronectin.
Die Proteinzusammensetzung kann weiters aktive Inhaltsstoffe, wie beispielsweise Antibiotika, Wachstumsfaktoren, schmerzlindernde Substanzen oder Kombinationen davon umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Proteinzusammensetzung gemäß der Erfindung, die Fibrinogen und Fibronectin in einem Verhältnis von Fibronectin zu Fibrinogen im Bereich von 0,02 bis 0,5 umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass sie

a) als Lösung mindestens 70 mg Fibrinogen/ml enthält oder zu einer solchen Lösung rekonstituierbar bzw. verflüssigbar ist,
b) bei 20°C eine Viskosität von höchstens 350 cSt aufweist, vorzugsweise bei einer Osmolarität von weniger als 500 mOsm, am meisten bevorzugt von weniger als 400 mOsm,
c) nach Mischen mit einer Thrombin-CaCl₂-Lösung einen undurch sichtigen Clot mit physiologischer Fibrinstruktur bildet, und
d) keinen Zusatz einer löslichkeitsverbessernden Substanz mit einer Benzol-, Pyridin-, Piperdin-, Pyrimidin-, Morpholin-, Pyrrol-, Imdazol-, Pyrazol-, Furan-, Thiazol- oder Purin-enthaltenden Gruppe enthält.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Proteinzusammensetzung gemäß der Erfindung, die Fibrinogen und Fibronectin in einem Verhältnis von Fibrinogen zu Fibronectin im Bereich von 0,02 bis 0,5 umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass sie

a) als Lösung mindestens 70 mg Fibrinogen/ml enthält oder zu so einer Lösung rekonstituierbar bzw. verflüssigbar ist,
b) bei 20°C eine Viskosität von höchstens 150 cSt aufweist, vorzugsweise bei einer Osmolarität von weniger als 500 mOsm, am meisten bevorzugt von weniger als 400 mOsm,
c) nach Mischen mit einer Thrombin-CaCl₂-Lösung einen undurchsichtigen Clot mit physiologischer Fibrinstruktur bildet, und
d) eine oder mehrere löslichkeitsverbessernde Substanzen mit einer Benzol-, Pyridin-, Piperidin-, Pyrimidin-, Morpholin-, Pyrrol-, Imdazol-, Pyrazol-, Furan-, Thiazol- oder Purin-enthaltenden Gruppe in einer Konzentration von insgesamt höchstens 150 mM enthält.

Die erfindungsgemäßen Proteinzusammensetzungen bzw. pharmazeutischen Präparate sind vielseitig verwendbar. Insbesondere werden die Präparate gemäß der Erfindung für Gewebeklebung, Blutstillung und/oder Wundheilung eingesetzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Proteinzusammensetzungen bzw. Präparate auch für die Herstellung einer Biomatrix auf Fibrinbasis verwendet werden. Hierzu wird die Lösung einer Proteinzusammensetzung bzw. eines pharmazeutischen Präparats der Erfindung mit einem für die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin geeigneten Enzym, vorzugsweise mit Thrombin, versetzt, und das gebildete Fibrin wird entweder im frischen Zustand oder nach der Lyophilisierung und Wiederbefeuchtung als das Trägermaterial zum Züchten von Zellen oder als so genannte Biomatrix (siehe zum Beispiel WO 99/15209) verwendet.
Die Biomatrix der Erfindung kann in verschiedenen Formen vorliegen, zum Beispiel als Schwamm, Folie, Micro-beads oder Flocken.
Die Biomatrix auf Fibrinbasis ist zum Züchten von Zellen be sonders geeignet, insbesondere von menschlichen Zellen. Keratinozyten, Fibroblasten, Chondrozyten sollen als ein Beispiel für mittels dieser Fibrinmatrix kultivier- oder züchtbare Zellen genannt werden. Eine derartige Biomatrix ist auch zur Wundversorgung bzw. als Gewebeersatz geeignet, insbesondere als Hautersatz. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein pharmazeutisches Präparat, das eine Proteinzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die Erfindung wird nun anhand der nachfolgenden Beispiele und Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, näher erläutert.
1 zeigt die Abhängigkeit des Verhältnisses von Fibronectin zu Fibrinogen (Fn/Fbg) im Niederschlag von der PEG-Konzentration in der Fällungsmischung (Glycinkonzentration: 1 M).
2 zeigt die Abhängigkeit des Verhältnisses von Fibronectin zu Fibrinogen (Fn/Fbg) im Niederschlag von der Glycinkonzentration in der Fällungsmischung (PEG-Konzentration: 6,5% Gew./V).
3 zeigt die Abhängigkeit des Verhältnisses von Fibronectin zu Fibrinogen (Fn/Fbg) im Niederschlag von der β-Alaninkonzentration in der Fällungsmischung (Ethanolkonzentration: 2% V/V).
4 zeigt die Abhängigkeit des Verhältnisses von Fibronectin zu Fibrinogen (Fn/Fbg) im Niederschlag von der Ammoniumsulfat-konzentration in der Fällungsmischung (β-Alaninkonzentration: 1 M).
5 zeigt die Abhängigkeit des Verhältnisses von Fibronectin zu Fibrinogen (Fn/Fbg) im Niederschlag von der β-Alaninkonzentration in der Fällungsmischung (Ammoniumssulfatkonzentration: 5% Gew./V).
BEISPIELE
Beispiel 1:
Ein nach an sich bekannten Methoden hergestelltes Humanplasmakryopräzipitat wurde mit der vierfachen Menge einer Pufferlösung, die 20 mM Natriumcitrat, 120 mM Natriumchlorid, 5 mM Tranexamsäure sowie 1200 IE Heparin/l enthielt, aufgelöst, der pH-Wert wurde auf 7,3 eingestellt und klärfiltriert. Aliquots dieser Lösung wurden mit Lösungen enthaltend Glycin und Polyethy lenglykol 4000 (PEG 4000) unter Rühren bei Raumtemperatur versetzt, so dass in jedem Fall eine Endkonzentration von 1 M Glycin, jedoch unterschiedliche Endkonzentrationen von PEG 4000 zwischen 1 und 10% (Gew./V) erhalten wurden.
Die gebildeten Niederschläge wurden abzentrifugiert, und der relative Gehalt an Fibrinogen (Fbg), Fibronectin (Fn) und Albumin (Alb) wurde durch SDS-PAGE der nicht reduzierten und redzierten Proben, Färbung mit Coomassie-Blau und densitometrische Auswertung bestimmt (siehe auch EP 0 345 246 , Beispiele 1–37).
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst; das Verhältnis von Fibronectin : Fibrinogen in Abhängigkeit von der PEG-Konzentration ist in 1 auch graphisch dargestellt.
Tabelle 1: Abhängigkeit der Proteinzusammensetzung des Niederschlags vom PEG-Gehalt in der Fällungsmischung (Glycinkonzentration: 1 M)
Das Beispiel zeigt, wie gemäß der Erfindung durch eine einmalige Fällung mit einer Mischung aus zwei Komponenten (hier Glycin und PEG) aus einer Plasmaproteinmischung Protein-Niederschläge erhalten werden können, die unterschiedliche Mengen an Fibronectin zusätzlich zur Hauptkomponente Fibrinogen enthalten, wobei das Verhältnis Fibronectin : Fibrinogen durch eine geeignete Auswahl der Konzentrationen der Mittel bzw. deren Verhältnis zueinander wunschgemäß innerhalb gewisser Grenzen eingestellt werden kann (zum Beispiel durch Selektion der Mittel gemäß Beispiel 1 in einem Bereich zwischen 0,02 bis 0,2). Solche Protein-Niederschläge sind beispielsweise zur Herstellung von Gewebeklebstoffen auf Basis von Fibrinogen (Fibrinklebern) geeignet.
Beispiel 2:
Humanplasma-Kryopräzipitat wurde analog zu Beispiel 1 gelöst, der pH-Wert auf 7,3 eingestellt und klärfiltriert. Aliquots dieser Lösung wurden analog zu Beispiel 1 mit Lösungen enthaltend Glycin und PEG 4000 versetzt, so dass in jedem Fall eine PEG-Endkonzentration von 6,5% (Gew./V), jedoch verschiedene Glycinkonzentrationen im Bereich von 0,2 bis 1 M erhalten wurden. Die gebildeten Niederschläge wurden analog zu Beispiel 1 abzentrifugiert und analysiert.
Bei allen Varianten betrug die Proteinausbeute ungefähr 95%. Das Verhältnis Fibronectin : Fibrinogen in Abhängigkeit von der Glycinkonzentration ist in Tabelle 2 zusammengefasst und ist zusätzlich in 2 graphisch dargestellt.
Tabelle 2: Die Abhängigkeit der Proteinzusammensetzung des Niederschlags von dem Glycingehalt in der Fällungsmischung (PEG-Konzentration: 6,5% Gew./V).
Ergänzend zu Beispiel 1 zeigt dieses Beispiel, dass an sich bekannte Protein-Fällungsmittel, wie beispielsweise Glycin, bei Anwendung in Kombination mit PEG keineswegs nur als Fällungsmittel wirken, sondern dass unter bestimmten Bedingungen Glycin zum Beispiel auch als Lösungsvermittler für Fibronectin wirken kann, und zwar in einem Konzentrationsbereich, in welchem Glycin bisher nur als Protein-Fällungsmittel bekannt war.
Die nachfolgenden Beispiele 3–5 zeigen vergleichbare Zusammensetzungen von gemäß dem Stand der Technik erhaltenen Präparaten.
Beispiel 3:
Ein Plasma-Kryopräzipitat wurde wie in Beispiel 1 gelöst. Unter Rühren bei Raumtemperatur wurde Glycin bis zu einer Endkonzentration von 2 mol/l zugesetzt. Der entstandene Protein-Niederschlag wurde abzentrifugiert und wie in Beispiel 1 analysiert. Fibrinogen wurde nahezu vollständig ausgefällt. Der Relativgehalt an Fibrinogen betrug 86% des Gesamtproteins, der Relativgehalt an Fibronectin 1,5%. Das Verhältnis Fibronectin Fibrinogen war somit 0,017.
Beispiel 4:
Ein Plasma-Kryopräzipitat wurde wie in Beispiel 1 aufgelöst. Unter Rühren bei Raumtemperatur wurde PEG 4000 bis zu einer Endkonzentration von 10% Gew./V zugesetzt. Der entstandene Protein-Niederschlag wurde abzentrifugiert und wie in Beispiel 1 analysiert. Fibrinogen wurde nahezu vollständig ausgefällt. Der Relativgehalt an Fibrinogen betrug 72% des Gesamtproteins, der Relativgehalt an Fibronectin 16%. Das Verhältnis Fibronectin Fibrinogen war somit 0,22.
Beispiel 5:
Ein Plasma-Kryopräzipitat wurde wie in Beispiel 1 gelöst. Unter Rühren bei Raumtemperatur wurde PEG 4000 bis zu einer Endkonzentration von 10% (Gew./V) zugesetzt. Der entstandene Protein-Niederschlag wurde abzentrifugiert, abermals gelöst, und Glycin wurde bis zu einer Endkonzentration von 2 M der Lösung unter Rühren bei Raumtemperatur zugesetzt. Der entstandene Protein-Niederschlag wurde abermals abzentrifugiert und wie in Beispiel 1 analysiert. Der Relativgehalt an Fibrinogen betrug 93% des Gesamtproteins, der Relativgehalt an Fibronectin 1,5%. Das Verhältnis Fibronectin : Fibrinogen war somit 0,016.
Die Beispiele 3–5 zeigen, dass es mit den aus dem Stand der Technik bekannten Methoden nicht möglich ist, in einem oder auch mehreren aufeinanderfolgenden Schritten zu Proteinmischungen mit einem definierten Verhältnis von Fibronectin : Fibrinogen zu gelangen, beispielsweise bei Verwendung einer Kombination von Glycin und PEG in den in Beispiel 1 oder 2 verwendeten Konzen trationen zu einem Verhältnis im Bereich von 0,02 bis 0,2.
Beispiel 6:
Herstellung eines erfindungsgemäßen lyophilisierten Präparates mit zwei voneinander unabhängigen Virusinaktivierungsschritten:
Ein nach an sich bekannten Methoden hergestelltes Humanplasma-Kryopräzipitat wurde mit der vierfachen Menge einer Pufferlösung (LP1), die 20 mM Natriumcitrat, 120 mM Natriumchlorid, 5 mM Tranexamsäure (t-AMCHA) sowie 1200 IE Heparin/l enthielt, gelöst und klärfiltriert. Danach wurde eine so genannte Solvens-Detergens-(SD)-Behandlung durchführt, um möglicherweise vorhandene umhüllte Viren zu inaktivieren. Dazu wurde eine Mischung aus Triton X-100, Tween 80 (Polysorbat-80K) und Tri-n-Butylphosphat (TNBP) zugesetzt, um eine Endkonzentration von 1%, 0,3% bzw. 0,3% (V/V) zu erlangen. Nach 1 h Rühren bei RT wurde erneut klärfiltriert. Die Lösung wurde unter Rühren bei Raumtemperatur mit dem gleichen Volumen einer Lösung versetzt, die 2 M Glycin und 13% (Gew./V) PEG 4000 (Fällungszusammensetzung) enthält, 30 min gerührt und zentrifugiert. Das Sediment wurde zerkleinert und abermals in 1% Tween 80 enthaltendem LP1 gelöst, und die Fällung wurde in gleicher Weise wiederholt. Zur Entfernung der SD- und Fällungreagenzien wurde das Sediment dann zerkleinert und in der Kälte (0–2°C) 2× mit der zehnfachen Menge einer Pufferlösung, enthaltend 10 mM Na₃-Citrat und 5 mM t-AMCHA, in Gegenwart kleiner Mengen an Tween 80 behandelt. Das gewaschene Sediment wurde sodann in einer Pufferlösung enthaltend 10 mM Na₃-Citrat und 5 mM t-AMCHA gelöst. Nach Einstellung der Proteinkonzentration auf 40 g/l wurde die Lösung im Ganzen lyophilisiert. Zur weiteren Virusinaktivierung wurde das lyophilisierte Material auf eine Restfeuchte von 7–8% eingestellt und unter Ausschluss von Sauerstoff 10 h auf 60°C + 1 auf 80°C erhitzt. Das so behandelte Lyophilisat wurde in 20 mM Niacinamidlösung zu einer Proteinkonzentration von 38 g/l gelöst, mit 6 g pasteurisiertem Humanalbumin/l versetzt, und der pH-Wert wurde auf 7,3 eingestellt.
Die Lösung wurde sterilfiltriert, unter sterilen Bedingungen á 5,0 ml in Endbehälter (Glasfläschchen) verfüllt und lyophilisiert.
Das so erhaltene Endprodukt ergab nach Lösen mit 2,0 ml Wasser für Injektionszwecke (Water for Injection, WFI) oder mit 2,0 ml einer 50 mM t-AMCHA-Lösung eine gebrauchsfertige Lösung mit einem Fibrinogengehalt von über 70 mg/ml. Diese Lösung kann zum Beispiel als Gewebeklebstoff verwendet werden.
Grundsätzlich kann das lyophilisierte Endprodukt anstatt mit reinem Wasser auch mit wässrigen Lösungen gelöst werden, die zusätzliche Wirkstoffe enthalten, wie zum Beispiel Fibrinolyse-Inhibitoren, Gerinnungsfaktor XIII, Antibiotika, Wachstumsfaktoren, schmerzlindernde Substanzen etc.
Das gemäß dem oben beschriebenen Verfahren hergestellte Produkt entsprach in Proteingehalt und -zusammensetzung im Wesentlichen dem in der EP 804933 A2 (Beispiel 2) beschriebenen Gewebeklebstoff-Präparat. Das Verhältnis Fibronectin : Fibrinogen betrug etwa 0,09, der Plasminogengehalt nur etwa 0,15 mg/g Fibrinogen. Nach dem Mischen der gebrauchsfertigen Gewebeklebstofflösung mit dem gleichen Volumen einer Thrombin-CaCl₂-Lösung wurden physiologische, undurchsichtige, zäh-elastische Clots gebildet.
Trotz der großen Übereinstimmung mit dem in der EP 804933 beschriebenen Produkt zeichnet sich der Gewebeklebstoff gemäß der Erfindung bei identischem Gehalt an einer die Löslichkeit von Fibrinogen verbessernden Substanz (50 mM Niacinamid) durch eine merklich verringerte Viskosität aus.
Das ist umso erstaunlicher, als das erfindungsgemäße Präparat nicht nur einem, sondern zwei unabhängigen Virusinaktivierungs-Schritten unterzogen wurde, und darüber hinaus die Dampfbehandlung unter verschärften Bedingungen (10 Stunden 60°C, +1 Stunde 80°C) durchgeführt wurde. Erfahrungsgemäß führt eine solche Hitzebehandlung zu verschlechterter Löslichkeit und erhöhter Viskosität.
Darüberhinaus wurde überraschenderweise festgestellt, dass t-AMCHA zusätzlich zu seiner bekannten antifibrinolytischen Wirkung die Viskosität von fibrinogenhaltigen Lösungen verringert. Insbesondere wird durch t-AMCHA die Viskosität der gemäß der Erfindung erhaltenen Gewebeklebstofflösungen weiter verringert (siehe Tabelle 3).
Tabelle 3: Viskosität (cSt) in der Anwesenheit von 50 mM Niacinamid
Beispiel 7:
Herstellung eines erfindungsgemäßen flüssig-tiefgefrorenen Gewebeklebstoffes mit zwei voneinander unabhängigen Virusinaktivierungsschritten:
Die Herstellung bis zur Sterilfiltration erfolgte analog Beispiel 6. Danach wurde die sterilfiltrierte Lösung unter sterilen Bedingungen nochmals lyophilisiert, zu einer konzentrierten Gewebeklebstofflösung aufgelöst, in Endbehälter (Einmalspritzen) verfüllt und tiefgefroren gelagert. Vor der Verwendung braucht ein solches Präparat lediglich aufgetaut zu werden.
Die gebrauchsfertige Gewebeklebstofflösung wies dieselben Eigenschaften wie das aufgelöste Präparat aus Beispiel 6 auf.
Anstatt die sterilfiltrierte verdünnte Gewebeklebstofflösung nochmals zu lyophilisieren und in ihren konzentrierten Zustand aufzulösen, kann sie auch direkt unter mildem Vakuum zu einer konzentrierten Gewebeklebstofflösung eingeengt werden.
Methodik der Viskositätsmessung
Zur Standardisierung der Messmethode wird eine Probe der Gewebeklebstofflösung zunächst bei ≤ –20°C eingefroren. Zur Bestimmung ihrer Viskosität wird die Probe in einem Wasserbad bei der gewünschten Messtemperatur aufgetaut, circa 30 min bei dieser Temperatur inkubiert, und danach wird ihre Viskosität in einem temperierten Kapillarviskosimeter bestimmt. Anschließend kann die Probe bei einer höheren Temperatur im Viskosimeter inkubiert werden, und die Messung kann bei dieser Temperatur wiederholt werden. Die einzelnen Messungen erfolgen der Reihe nach bei steigenden Temperaturen. Bei Messung in umgekehrter Reihen folge können verfälschte (zu niedrige) Werte erhalten werden, da das Gleichgewicht nur langsam bei sinkenden Temperaturen erreicht wird.
Beispiel 8:
Ein Plasmakryopräzipitat wurde gemäß Beispiel 1 gelöst, der pH-Wert auf 7,3 eingestellt und klärfiltriert. Analog zu Beispiel 1 wurden Aliquots dieser Lösung mit Lösungen enthaltend β-Alanin und Ethanol jedoch nicht bei RT, sondern bei 0°C versetzt, so dass in jedem Fall eine Ethanolkonzentration von 2% (V/V), jedoch unterschiedliche β-Alaninkonzentrationen zwischen 0–1 M erhalten wurden. Die gebildeten Niederschläge wurden abzentrifugiert und analog zu Beispiel 1 analysiert. In 3 ist das Verhältnis Fn/Fbg in Abhängigkeit von der β-Alaninkonzentration graphisch dargestellt.
Tabelle 4: Abhängigkeit der Proteinzusammensetzung des Niederschlags vom β-Alaningehalt in der Fällungsmischung (Ethanolkonzentration: 2%)
Analog zu Beispiel 2 zeigt dieses Beispiel, dass an sich bekannte Protein-Fällungsmittel, wie zum Beispiel β-Alanin, bei Verwendung in Kombination mit Ethanol keineswegs nur als Fällungsmittel wirken, sondern unter bestimmten Bedingungen β-Alanin zum Beispiel auch als Lösungsvermittler für Fibronectin wirken kann.
Die folgenden Beispiele 9–11 zeigen vergleichbare Zusammensetzungen der gemäß dem Stand der Technik erhaltenen Präparate.
Beispiel 9:
Ein Plasma-Kryopräzipitat wurde wie in Beispiel 1 gelöst.
Unter Rühren bei 0°C wurde β-Alanin bis zu einer Endkonzentration von 2 M zugesetzt. Der gebildete Protein-Niederschlag wurde abzentrifugiert und wie in Beispiel 1 analysiert. Der Relativgehalt an Fibrinogen betrug 74% des Gesamtproteins, der Relativgehalt an Fibronectin 16%. Das Verhältnis Fn/Fbg war somit 0,22.
Beispiel 10:
Ein Plasma-Kryopräzipitat wurde wie in Beispiel 1 gelöst. Unter Rühren bei 0°C wurde Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 2% (V/V) zugesetzt. Der gebildete Protein-Niederschlag wurde abzentrifugiert und wie in Beispiel 1 analysiert. Der Relativgehalt an Fibrinogen betrug 67% des Gesamtproteins, der Relativgehalt an Fibronectin 29%. Das Verhältnis Fn/Fbg war somit 0,43.
Beispiel 11:
Ein Plasma-Kryopräzipitat wurde wie in Beispiel 1 gelöst. Unter Rühren bei 0°C wurde Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 2% (V/V) zugesetzt. Der gebildete Protein-Niederschlag wurde abzentrifugiert, abermals gelöst, und β-Alanin wurde der Lösung unter Rühren bei 0°C bis zu einer Endkonzentration von 2 M zugesetzt. Der gebildete Protein-Niederschlag wurde abermals abzentrifugiert und wie in Beispiel 1 analysiert. Der Relativgehalt an Fibrinogen betrug 77% des Gesamtproteins, der Relativgehalt an Fibronectin 16%. Das Verhältnis Fn/Fbg war somit 0,21.
Die Beispiele 9–11 zeigen, dass es mit aus dem Stand der Technik bekannten Methoden nicht möglich ist, in einem oder auch mehreren aufeinanderfolgenden Schritten zu Proteinmischungen mit einem definierten Verhältnis von Fn/Fbg zu gelangen, beispielsweise bei Verwendung einer Kombination von β-Alanin und Ethanol in den in Beispiel 8 verwendeten Konzentrationen zu einem Verhältnis im Bereich von 0,23 bis 0,34.
Beispiel 12:
Ein Plasmakryopräzipitat wurde wie in Beispiel 1 gelöst, der pH-Wert auf 7,3 eingestellt und klärfiltriert. Analog zu Beispiel 1 wurden Aliquots dieser Lösung mit Lösungen enthaltend β-Alanin und Ammoniumsulfat versetzt, so dass in jedem Fall eine β-Alaninkonzentration von 1 M, jedoch unterschiedliche Ammoniumsulfatkonzentrationen im Bereich von 5–15% (Gew./V) erhalten wurden. Die gebildeten Niederschläge wurden abzentrifugiert analog zu Beispiel 1 und analysiert. Die Ergebnise sind in Tabelle 5 zusammengefasst; in 4 ist das Verhältnis Fn/Fbg in Abhängigkeit von der Ammoniumsulfatkonzentration graphisch darge stellt.
Tabelle 5: Abhängigkeit der Proteinzusammensetzung des Niederschlags vom Ammoniumsulfatgehalt in der Fällungsmischung (β-Alaninkonzentration: 1 M)
Ähnlich zu Beispiel 1, zeigt dieses Beispiel, wie Protein-Niederschläge durch eine einmalige Fällung mit einer Fällungszusammensetzung mit zwei Komponenten (hier β-Alanin und Ammoniumsulfat) aus einer Plasmaproteinmischung erhalten werden können, welche Protein-Niederschläge unterschiedliche Mengen an Fibronectin enthalten, wobei das Verhältnis Fn/Fbg durch eine geeignete Auswahl der Konzentrationen der Komponenten bzw. deren Verhältnis zueinander wunschgemäß innerhalb gewisser Grenzen eingestellt werden kann (zum Beispiel durch Selektion der Komponenten gemäß Beispiel 12 in einem Bereich von 0,07 bis 0,21).
Beispiel 13:
Ein Plasmakryopräzipitat wurde wie in Beispiel 1 gelöst, der pH-Wert auf 7,3 eingestellt und klärfiltriert. Analog zu Beispiel 1 wurden Aliquots dieser Lösung mit Lösungen enthaltend β-Alanin und Ammoniumsulfat versetzt, so dass in jedem Fall eine Ammoniumsulfatkonzentration von 5% (Gew./V), jedoch unterschiedliche β-Alaninkonzentrationen im Bereich von 0,6 bis 1,4 M erhalten wurden. Die gebildeten Niederschläge wurden abzentrifugiert analog zu Beispiel 1 und analysiert. In 5 ist das Verhältnis Fn/Fbg in Abhängigkeit von der β-Alaninkonzentration graphisch dargestellt.
Tabelle 6: Abhängigkeit der Proteinzusammensetzung des Niederschlags vom β-Alaningehalt in der Fällungsmischung (Ammoniumsulfatkonzentration: 5%)
Analog zu Beispiel 2 zeigt dieses Beispiel, dass an sich bekannte Protein-Fällungsmittel, wie zum Beispiel β-Alanin, bei Verwendung in Kombination mit Ammoniumsulfat keineswegs nur als Fällungsmittel wirken, sondern β-Alanin unter gewissen Bedingungen zum Beispiel auch als Lösungsvermittler für Fibronectin wirken kann.
Die nachfolgenden Beispiele 14–16 zeigen vergleichbare Zusammensetzungen von gemäß dem Stand der Technik erhaltenen Präparaten.
Beispiel 14:
Ein Plasma-Kryopräzipitat wurde wie in Beispiel 1 gelöst. Unter Rühren bei RT wurde β-Alanin bis zu einer Endkonzentration von 2 M zugesetzt. Der gebildete Protein-Niederschlag wurde abzentrifugiert und wie in Beispiel 1 analysiert. Der Relativgehalt an Fibrinogen betrug 82% des Gesamtproteins, der Relativgehalt an Fibronectin 1%. Das Verhältnis Fn/Fbg war somit 0,01.
Beispiel 15:
Ein Plasma-Kryopräzipitat wurde wie in Beispiel 1 gelöst. Unter Rühren bei RT wurde Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 15% (Gew./V) zugesetzt. Der gebildete Protein-Niederschlag wurde abzentrifugiert und wie in Beispiel 1 analysiert. Der Relativgehalt an Fibrinogen betrug 76% des Gesamtproteins, der Relativgehalt an Fibronectin 16%. Das Verhältnis Fn/Fbg war somit 0,21.
Beispiel 16:
Ein Plasma-Kryopräzipitat wurde wie in Beispiel 1 gelöst. Unter Rühren bei RT wurde Ammoniumsulfat bis zu einer Ammoniumsulfatkonzentration von 5% (Gew./V) zugesetzt. Der gebildete Pro tein-Niederschlag wurde abzentrifugiert, erneut gelöst, und β-Alanin wurde der Lösung unter Rühren bei RT bis zu einer Endkonzentration von 2 M zugesetzt. Der gebildete Protein-Niederschlag wurde abermals abzentrifugiert und wie in Beispiel 1 analysiert. Der Relativgehalt an Fibrinogen betrug 84% des Gesamtproteins, der Relativgehalt an Fibronectin 1%. Das Verhältnis Fn/Fbg war somit 0,01.
Die Beispiele 14–16 zeigen, dass es mit aus dem Stand der Technik bekannten Methoden nicht möglich ist, in einem oder auch mehreren aufeinanderfolgenden Schritten zu Proteinmischungen mit einem definierten Verhältnis von Fn/Fbg zu gelangen, beispielsweise bei Verwendung einer Kombination von β-Alanin und Ammoniumssulfat in den in Beispiel 13 verwendeten Konzentrationen zu einem Verhältnis im Bereich von 0,04 bis 0,19.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Proteinzusammensetzungen, die Fibrinogen und Fibronectin umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Fibrinogen und Fibronectin enthaltende Ausgangslösung mit einer Fällungszusammensetzung behandelt wird, die eine Kombination von a) einem Polyol, insbesondere Polyalkylenglykol, oder b) einem Alkohol mit bis zu vier Kohlenstoffatomen, insbesondere Ethanol, oder c) einem anorganischen Salz, insbesondere Ammonium- oder Alkalisulfat, und einer Aminosäure, insbesondere Glycin oder Alanin umfasst, so dass in einer Einschritt-Fällung ein Niederschlag gebildet wird, welcher Fibrinogen und Fibronectin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Proteinzusammensetzungs-Niederschlag mittels an sich bekannter Methoden zu einem pharmazeutischen Präparat, insbesondere zu einem Gewebekleber, formuliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Plasma, insbesondere Humanplasma, oder eine Fibrinogen und Fibronectin umfassende Plasmafraktion, vorzugsweise eine aus Kryopräzipitat abgeleitete Lösung, als Ausgangsmaterial zur Herstellung der Ausgangslösung eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Fällungszusammensetzung Polyalkylenglykol umfasst, und Polyalkylenglykol der Ausgangslösung auf eine Endkonzentration von 1 bis 12% Gew./Vol. zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyalkylenglykol der Ausgangslösung zu einer Endkonzentration von 4 bis 8% Gew./Vol. zugesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren der Ausgangslösung zu einer Endkonzentration von 0,5 bis 3 M, vorzugsweise 0,75 bis 2 M, zugesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren auf eine Endkonzentration von 0,75 bis 1,5 M zugesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Fällungszusammensetzung in flüssiger Form zugesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Fällungszusammensetzung verwendet wird, in welcher Plasminogen in Bezug auf Fibrinogen und/oder Fibronectin im Vergleich zum Ausgangsmaterial im Niederschlag abgereichert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass auch weitere Inhaltsstoffe des Ausgangsmaterials, insbesondere Faktor XIII, durch die Fällungszusammensetzung ausgefällt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangsmaterial und/oder die Ausgangslösung auf Abwesenheit von Krankheitserregern, insbesondere Viren und/oder Prionen, überprüft wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass vor oder nach der Fällung mindestens ein Schritt zur Inaktivierung oder Abreicherung von gegebenenfalls vorhandenen Krankheitserregern durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass zur Inaktivierung eine Hitzebehandlung, eine Behandlung mit einem Lösungsmittel, eine Behandlung mit einem Detergens oder eine Kombination dieser Behandlungen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Abreicherung mittels Filtration, insbesondere Ultrafiltration, vorzugsweise in Gegenwart von virusbindenden Mitteln, durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Proteinzusammensetzung nach der Einschritt-Fällung weitere Inhaltsstoffe zugesetzt werden, insbesondere Fibrinolyse-Inhibitoren, Faktor XIII, Antibiotika, Wachstumsfaktoren, schmerzlindernde Substanzen, entzündungshemmende Mittel oder Mischungen davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinzusammensetzung oder das pharmazeutische Präparat im Zuge der Weiterverarbeitung tiefgefroren oder lyophilisiert wird.
Proteinzusammensetzung, welche Fibrinogen und Fibronectin mit einem Verhältnis von Fibronectin zu Fibrinogen in einem Bereich von 0,02 bis 0,5 umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass sie a) als Lösung mindestens 70 mg Fibrinogen/ml enthält oder zu einer solchen Lösung rekonstituierbar bzw. verflüssigbar ist, b) bei 20°C eine Viskosität von höchstens 350 cSt aufweist, vorzugsweise bei einer Osmolarität von weniger als 500 mOsm, am meisten bevorzugt von weniger als 400 mOsm, c) nach Mischen mit einer Thrombin-CaCl₂-Lösung einen undurchsichtigen Clot mit physiologischer Fibrinstruktur bildet, und d) keinen Zusatz einer löslichkeitsverbessernden Substanz mit einer Benzol-, Pyridin-, Piperidin-, Pyrimidin-, Morpholin-, Pyrrol-, Imidazol-, Pyrazol-, Furan-, Thiazol- oder Purin-enthaltenden Gruppe enthält.
Proteinzusammensetzung, umfassend Fibrinogen und Fibronectin mit einem Verhältnis von Fibronectin zu Fibrinogen in einem Bereich von 0,02 bis 0,5, dadurch gekennzeichnet, dass sie a) als Lösung mindestens 70 mg Fibrinogen/ml enthält oder zu einer solchen Lösung rekonstituierbar bzw. verflüssigbar ist, b) bei 20°C eine Viskosität von höchstens 150 cSt aufweist, vorzugsweise bei einer Osmolarität von weniger als 500 mOsm, am meisten bevorzugt von weniger als 400 mOsm, c) nach Mischen mit einer Thrombin-CaCl₂-Lösung einen undurchsichtigen Clot mit physiologischer Fibrinstruktur bildet, und eine oder mehrere löslichkeitsvermittelnde Substanzen mit einer Benzol-, Pyridin-, Piperidin-, Pyrimidin-, Morpholin-, Pyrrol-, Imidazol-, Pyrazol-, Furan-, Thiazol- oder Purin-enthaltenden Gruppe in einer Konzentration von insgesamt höchstens 150 mM enthält.
Proteinzusammensetzung nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 erhältlich ist.
Proteinzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie in lyophilisierter, flüssiger oder in flüssig-tiefgefrorener Form vorliegt.
Proteinzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Fibrinolyse-Inhibitor darin enthalten ist.
Proteinzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass Faktor XIII darin enthalten ist.
Proteinzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Verhältnis von Fibronectin zu Fibrinogen in einem Bereich von 0,02 bis 0,25, auch bevorzugt von 0,02 bis 0,2, mehr bevorzugt von 0,04 bis 0,16, insbesondere von 0,1, aufweist.
Proteinzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass ihr Gehalt an Plasminogen höchstens 1,6 mg/g Fibrinogen, vorzugsweise weniger als 0,8 mg/g Fibrinogen, am meisten bevorzugt weniger als 0,3 mg/g Fibrinogen beträgt.
Proteinzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass aktive Substanzen, wie Antibiotika, Wachstumsfaktoren oder schmerzlindernde Substanzen oder Kombinationen davon darin enthalten sind.
Verwendung einer Proteinzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 25 zur Herstellung eines Medikaments für Gewebeklebung, Blutstillung und/oder Wundheilung.
Verwendung einer Proteinzusammensetzung nach einem der An sprüche 17 bis 26 zur Herstellung eines Trägermaterials auf Fibrinbasis zur Züchtung von Zellen (Biomatrix).
Verwendung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomatrix als Folie, Vlies und/oder Schwamm ausgebildet ist.
Verwendung nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomatrix zur Züchtung von Zellen, insbesondere humanen Zellen, geeignet ist.
Verwendung der Biomatrix nach einem der Ansprüche 27 bis 29 zur Herstellung eines Medikaments zur Wundversorgung und/oder als Gewebeersatz, insbesondere als Hautersatz.
Biomatrix, erhältlich aus einer Proteinzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 25.
Pharmazeutisches Präparat, umfassend eine Proteinzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 26.