CN117794516A - 纤维蛋白原组合物和制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及血液产品领域，特别涉及纤维蛋白原和纤维蛋白原药物产品。本发明提供了具有2‑5％(w/w)的残留水分含量的干燥例如冻干形式的纤维蛋白原药物产品。发明人已发现所述水分含量有利于通过干热的病毒灭活，这造就特别病毒安全且稳定的产品。本发明还提供了干燥例如冻干形式的纤维蛋白原药物产品，其具有极其低数量的亚可见颗粒(SVP)，以及此类药物产品的分批。其适于在注射用水中重构1g纤维蛋白原，以获得包括6000个或更少的具有10‑100μm尺寸的SVP以及600个或更少的具有25‑100μm尺寸的SVP的纤维蛋白原溶液。还公开了制备本发明的所述药物产品的方法，以及这些药物产品用于纤维蛋白原缺乏症的治疗。

Description

纤维蛋白原组合物和制备方法
本发明涉及血液产品领域，特别涉及纤维蛋白原和纤维蛋白原药物产品。本发明提供了具有2-5％(w/w)的残留水分含量的干燥例如冻干形式的纤维蛋白原药物产品。发明人已发现所述水分含量有利于通过干热的病毒灭活，这造就了对传染性病毒具有高安全裕度的稳定产品，以及包含所述药物产品的容器。本发明还提供了干燥例如冻干形式的纤维蛋白原药物产品，其具有极其低数量的亚可见颗粒(SVP)，以及包含所述药物产品的容器。还提供了这样的容器或药物产品的分批。所述药物产品适于在水溶液(例如注射用水)中重构包含例如所述药物产品的1g纤维蛋白原的一个容器，以获得包含不超过6000个具有10-100μm尺寸的SVP以及不超过600个具有25-100μm尺寸的SVP的纤维蛋白原溶液。还公开了制备本发明的所述药物产品的方法，以及这些药物产品用于治疗纤维蛋白原缺乏症。
纤维蛋白原是血液中负责形成血凝块的主要结构蛋白。在组织和血管损伤期间，纤维蛋白原被凝血酶酶促转化为纤维蛋白，然后转化为形成血凝块基础的基于纤维蛋白的网状物。纤维蛋白凝块主要用于阻塞受损的血管以止血。纤维蛋白也结合并降低凝血酶的活性。该活性提供了限制过度凝血的反馈机制。纤维蛋白还介导血小板和内皮细胞扩散、组织成纤维细胞增殖、毛细管形成和血管生成，从而促进血管再生和伤口愈合。其可用于治疗止血障碍。
纤维蛋白原分子作为由两个三聚体组成的可溶性血浆糖蛋白进行循环，每个三聚体由三个不同的多肽链构成：纤维蛋白原α链、纤维蛋白原β链和纤维蛋白原γ链。纤维蛋白原具有～340kDa的典型分子量。人血浆中纤维蛋白原的正常浓度为150-400mg/dl，明显低于或高于该范围的水平与病理性出血和/或血栓形成相关(维基百科)。
在纤维蛋白原缺乏症的情况下，血液形成凝块的能力受损，从而导致严重出血的风险大大增加，并还导致止血延迟。
在严重先天性纤维蛋白原缺乏症的情况下，患者产生足够水平的功能性纤维蛋白原的能力受损或缺乏。这些患者需要频繁注射纤维蛋白原浓缩物。在获得性纤维蛋白原缺乏症中，患者丧失内源性纤维蛋白原，这可导致失控的出血。常见的原因是复杂手术过程中的大量失血，也可能是严重外伤造成的。在这种情况下，必须静脉施予纤维蛋白原，通过将纤维蛋白原增加到临界水平以上来止血。
因此，纤维蛋白原产品及制备其的方法是本领域公知的。例如，由CSL Behring(德国马尔堡)生产。WO00/47621A1教导了制备包括纤维蛋白原和纤连蛋白的组合物的方法。WO2018/115800A1、WO2008/117746A1、EP0085923A1、EP0804933A2、WO95/26749A1、WO98/55105A1和EP0345246A2涉及具有不同稳定剂的纤维蛋白原组合物。
WO01/48016A1、WO2004/007533A1、WO2012/038410A1、WO2009/155626A2教导了生产纤维蛋白原组合物的方法。例如，由于纤维蛋白原是相当敏感的蛋白质，具有形成聚集体的趋势，WO2006/015704涉及纤维蛋白原产品的热处理，其中聚集体的形成被最小化。
通常，含蛋白质的制剂可含有颗粒物质，其中制剂的蛋白质可自聚集以形成颗粒(Carpenter et al.,J Pharm Sci.2009Apr:98(4):1201–1205)。颗粒可以是可见的或亚可见的。亚可见颗粒(SVP)通常具有至多100μm的直径。上限尺寸代表人裸眼的检测极限。因此，≤100μm的颗粒被称为“亚可见”。
因此，产品稳定性和质量的一个方面是SVP的存在(Abraham et al.,2011.BioPharm International 24(4))。这种颗粒可能由聚集的蛋白质和/或从加工材料或容器封闭系统中脱落的成分组成，可直接影响药物产品的功效和免疫原性。此外，它们通常作为进一步蛋白质聚集的成核位点和/或通过集聚导致更大颗粒的形成。测量制剂内SVP的尺寸和浓度是其有效控制的必要前提，且因工业力求实现“零缺陷”和“基本无颗粒”的产品而日益重要(Carpenter et al.,2015,www.europeanpharmaceuticalreview.com/article/35952/meeting-biophar maceutical-analytical-requirements-for-subvisible-particle-sizing-and-co unting/)。现行美国药典(USP)对遮光测试<788>(SVP分析的标准测试)的要求规定，尺寸>10μm的颗粒控制在6000个颗粒/容器或以下，且>25μm的颗粒限制在600个颗粒/容器或以下。这些限制与注射时颗粒堵塞毛细管(平均直径约为7μm)的担忧相关。各种尺寸的SVP还可能伴随其他健康问题，例如免疫原性增加(Carpenter et al.2009.Journal of Pharmaceutical Sciences 98(4):1201-1205)。
目前，血浆蛋白和用于肌内和皮下施用的蛋白存在例外，其可包括较高数量的SVP。然而，显然这不是因为缺乏关注，而是因为迄今为止还不可能可重复地和常规地生产包括足够低数量SVP的血浆产品。
WO2013/106772A2公开了使用颗粒分析仪表征颗粒群的方法，并描述了SVP的产生可能是由制备和/或包装过程的条件引起的。
WO2016/057739A1、WO2014/100143A2和WO2019/060062A1教导了包括少量SVP和脂肪酸酯例如聚山梨醇酯和/或表面活性剂的抗体组合物。
仍然非常需要包括少量SVP的血浆产品，例如纤维蛋白原产品。
纤维蛋白原通常从血浆中纯化出来，尽管有严格的供体筛选和捐献测试要求，但不能保证血浆中不含传染性病毒，另一个常见问题是病毒污染。这需要集成到制造过程中的病毒去除或病毒灭活步骤。去除可以例如通过纳滤进行(例如，就来自法国CourtaboeufCedex的LFB SA的而言)，其缺点是过滤器价格昂贵并且经常被堵塞。也可使用色谱法。病毒灭活可以基于溶剂/去污剂(S/D)处理、巴氏灭菌或热处理(例如，在WO97/42980A1中)、以酸性pH或以照射(例如以UV光)灭活。由于对糖尿病患者产生的问题，蔗糖存在下的热灭活(如CSL Behring产品/>所进行的)可能被认为是不可取的。本领域中也经常使用用于病毒灭活/去除的有效方法的组合，因为欧洲药品管理局(EMA)对其强制要求，以对抗脂包膜病毒。
因子VIII产品中的病毒，例如，用EP0844005A1中的冻干组合物在0.8％的残留水分含量下的热处理所灭活。JPS6289628A描述了干燥纤维蛋白原直至残留水分含量为0.05-3％，并在二糖存在下在60℃热处理65-90h。WO93/05067A1教导了聚山梨醇酯80作为局部纤维蛋白原复合物中的抗病毒物质和增溶剂。病毒灭活的成功取决于药物产品的组成和制备中的若干因素，并且需要实验验证，例如通过病毒掺入实验。
鉴于现有技术，发明人解决了提供有利的纤维蛋白原药物产品的问题，其解决了这些问题中的一个或多个。特别是，本发明人解决了该问题以提供用于例如静脉内施用的特别安全的产品，所述产品是有活性的、长时间稳定的和病毒安全的纤维蛋白原产品。优选地，纤维蛋白原产品应该以良好的溶解性、非常低的SVP含量为特征，并且应该基本上不含用于稳定化等的次级蛋白。此外，血液制品应该以良好可重复的方式在良好标准化的方法下生产。
本发明的纤维蛋白原药物产品
该问题通过本发明的主题、例如权利要求的主题来解决。有利地，本发明提供了就病毒安全性和/或SVP的数量或二者而言使用特别安全的纤维蛋白原药物产品，以及包括此类药物产品的容器。
在一个实施方案中，本发明提供了包括干燥、优选冻干形式的具有2-5％(w/w)、优选2.5-4％(w/w)的残留水分含量的纤维蛋白原药物产品的容器。已显示2.5-3.5％，例如约3％(w/w)的残留水分含量在病毒灭活和稳定性二者的优化方面特别有利。因此，更优选地，本发明的纤维蛋白原药物产品是干燥的，优选是冻干的，并且具有2.5-3.5％(w/w)、优选约3％(w/w)的残留水分含量。水分含量优选地根据NIR光谱法测定。替代性地，可以用卡尔费休(Karl Fischer)法测定。如果没有另外说明，％残留水分含量涉及w/w(H2O重量/药物产品重量)。
如本领域技术人员已知的，药物产品是药物组合物，即准备好作为药品用于施用(如果需要，在进一步于溶剂中重构后)于患者，和/或准备好销售和/或分配给患者或执业医师的最终剂型。通常，药物产品由原料药物质制备。在本公开中，本发明的药物产品或包括其的容器也称为本发明的产品。
根据本发明，药物产品是干燥的，这并不意指水的绝对不存在，而是限定所述产品是固体形式的，并且通常已被干燥。与现有技术的其它纤维蛋白原药物产品相比，如上所述，它具有相对高的2-5％(w/w)的水分含量。冻干是干燥的优选选择，然而，产品也可替代性地是喷雾干燥的或喷雾冷冻干燥的。水分是指水。药物产品不包括显著量的任何其它溶剂，特别是没有与药物用途(例如静脉内施用)不相容的量的溶剂(或其它成分)。
发明人惊奇地发现，通过干热的病毒灭活的效力，特别是针对无包膜病毒的病毒灭活的效力，随着指定的水分含量而显著增加，并且由所述病毒生产的指定水分含量的药物产品仍然具有高稳定性和良好的溶解性。特别有效的病毒灭活和高稳定性和溶解性在以下实例和附图中说明。因此，本发明的药物产品是特别病毒安全的、是高度稳定的并且在重构中具有良好的溶解性。
如本文所用，术语“纤维蛋白原”是指血浆中存在的负责形成凝块的主要结构蛋白，并且优选是指纤维蛋白原的完整糖蛋白形式。优选地，它是指血浆纤维蛋白原，即来源于血浆的纤维蛋白原。更优选地，纤维蛋白原是人血浆纤维蛋白原。替代性地，本发明中使用的纤维蛋白原可以是重组产生的。
优选地，药物产品以剂量单位形式包装。通常，对于纤维蛋白原，这意味着包装约1g纤维蛋白原。在施用于患者之前，通常将干燥的(例如冻干的)纤维蛋白原药物产品在溶剂(特别是水性溶剂)中重构以获得溶液。1g纤维蛋白原可以在其通常50mL的例如注射用水、缓冲液或血浆中重构以提供约20g/L的总蛋白(主要是纤维蛋白原)的溶液。
在另一个实施方案中，本发明提供了包括干燥形式的纤维蛋白原药物产品的容器，其中所述纤维蛋白原药物产品适于在水溶液、优选注射用水中重构，并且其中由所述药物产品的1g纤维蛋白原的所述重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过6000个具有10-100μm尺寸的SVP和不超过600个具有25-100μm尺寸的SVP。“适于重构”是指，一个容器的内容物在溶剂中(尤其是在注射用水中)重构时，获得包括不超过6000个或更少的具有10-100μm尺寸的SVP和不超过600个具有25-100μm尺寸的SVP的纤维蛋白原溶液。在此，SVP的量是指容器内分别在相应剂量单位(例如，50mL或50-100mL)内SVP的绝对量。
通常，纤维蛋白原药物产品包括约50-98％(w/w)，优选70-95％，例如80-90％的活性纤维蛋白原。因此，通常，如果需要包装1g(活性)纤维蛋白原，则容器中包括多于1g的药物产品，例如约1.5-2g纤维蛋白原药物产品。药物产品通常还包括赋形剂，例如如下所述。优选地，所述SVP的最大浓度适用于一个包括例如1g纤维蛋白原的纤维蛋白原药物产品的容器的重构。所述SVP的最大浓度也可适用于一个包括例如2g纤维蛋白原或更多、任选地3g或5g纤维蛋白原的纤维蛋白原药物产品的容器的重构。
在一个实施方案中，本发明提供了干燥、优选冻干形式的纤维蛋白原药物产品，其具有2-5％(w/w)的残留水分含量，任选地，2.5-3.5％(w/w)，例如约3％(w/w)的残留水分含量，其中所述纤维蛋白原药物产品适于在水溶液、优选注射用水中重构，并且其中由所述药物产品的1g纤维蛋白原的所述重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过6000个具有10-100μm尺寸的SVP和不超过600个具有25-100μm尺寸的SVP。
凭借本发明的产品，纤维蛋白原药物产品首次满足了欧洲药典2.9.19和USP 788(其提供了注射剂中颗粒物质的标准)对SVP的官方要求。欧洲药典2.9.19和USP 788通常要求对于≥10μm的颗粒，每50mL容器≤6000个颗粒，以及对于≥25μm的颗粒，每50mL容器≤600个颗粒，相当于每毫升120个≥10μm的颗粒以及每毫升12个≥25μm的颗粒。
长度为0.05μm的纤维蛋白原分子(重构药物产品(DP)中的纤维蛋白原浓度：20g/L，分子量约340kDa，浓度约60μmol/L)的数量(Hall et al,1959)可以是例如约每毫升17.7*1018。
重构以药学上可接受的溶剂(通常是水性溶剂)进行。优选地，使用注射用水，但也可以例如在生理盐水或缓冲液如PBS中重构。重构期间，纤维蛋白原药物产品溶解在溶剂中。重构可以例如通过将溶剂添加到容器中来进行，任选地包括混合，例如通过使用涡旋混合器，通过摇动或通过抽入注射器中，任选地重复。为了分析SVP的数量而进行的重构不包括过滤。
根据欧洲药典2.9.19和USP 788，SVP的量通过遮光测量，例如通过配备HiacModel HRLD-400型传感器、尺寸范围为2至400μm的HiacModel 9703+粒子计数器(贝克曼，克雷菲尔德，德国)。每次测量通过毛细管吸入5mL蛋白质溶液并通过传感器。第一次测量用于冲洗系统，结果被丢弃。随后的四次测量的平均值用于确定溶液中SVP的数量。重要的是注意在测量之前蛋白质溶液没有被过滤。
对于最终的纤维蛋白原药物产品(DP)，优选确定≥10μm和≥25μm的SVP的数量。为此，冻干的DP优选用50mL注射用水(WFI)重构。将重构的溶液转移到颗粒计数器中而不进行任何进一步的过滤。每个样品优选测量三次。报告每个容器的总颗粒量的平均值。由于≥25μm的SVP也包括在≥10μm的SVP的组中，因此≥10μm的SVP数量始终高于≥25μm的SVP数量。
由于包括在本发明的药物产品中的SVP的数量少，因此可以安全地施用所述药物产品而无需预先过滤。当时间紧迫时，这尤其有利。然而，仍然可以进行过滤，例如，为了以避免泡沫形成的方式溶解干燥产物。
本发明首次提供了生产此类纤维蛋白原药物产品和包括它们的容器的可重复的方法。因此，本发明还提供了包括干燥形式的纤维蛋白原药物产品的容器的分批，其中，对于来自所述分批的至少10个容器，所述纤维蛋白原药物产品适于在水溶液、优选注射用水中重构，并且其中由所述药物产品的1g纤维蛋白原的所述重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过6000个具有10-100μm尺寸的SVP和不超过600个具有25-100μm尺寸的SVP。优选地，这些条件适用于来自本发明的分批的至少100个容器，任选地，适用于至少200个容器。这些限制也可由来自本发明分批的至少500个容器，任选地，所述分批的几乎所有容器满足。容器可以从分批中随机选择，优选地，从首先灌装到容器中的分批的一半和随后灌装到容器中的分批的一半相等地或近乎相等地选择。
本发明还提供了包括干燥形式的纤维蛋白原药物产品的容器的分批，其中对于来自所述分批的至少最后10％的容器，优选地，来自所述分批的至少最后20％的容器，任选地，所述分批的基本上所有容器，所述纤维蛋白原药物产品适于在水溶液、优选注射用水中重构，并且其中由所述药物产品的1g纤维蛋白原的所述重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过6000个具有10-100μm尺寸的SVP和不超过600个具有25-100μm尺寸的SVP。在本文中，“最后”是指最末灌装。
优选地，用于本发明的纤维蛋白原药物产品含有甚至更少的SVP。例如，其可适于在水溶液、优选注射用水中重构，并且其中由所述药物产品的1g纤维蛋白原的所述重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过3500个具有10-100μm尺寸的SVP和不超过60个具有25-100μm尺寸的SVP。任选地，用于本发明的纤维蛋白原药物产品适于在水溶液，优选注射用水中重构，并且其中由所述药物产品的1g纤维蛋白原的所述重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过3500个具有10-100μm尺寸的SVP和不超过35个具有25-100μm尺寸的SVP。发明人可以示出，本发明还提供了本发明的纤维蛋白原药物产品，其适于在水溶液，优选注射用水中重构，并且其中由所述药物产品的1g纤维蛋白原的所述重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过2500个具有10-100μm尺寸的SVP和不超过30个具有25-100μm尺寸的SVP。
就本发明涉及包括本发明的纤维蛋白原药物产品的容器的分批而言，所述纤维蛋白原药物产品具有2-5％(w/w)，优选2.5-3.5％(w/w)的残留水分含量。这意味着所述分批中的药物产品都具有所述残留水分。
本发明的纤维蛋白原药物产品被包装在容器中，例如小瓶，例如玻璃小瓶或塑料(例如聚乙烯)小瓶。优选地，容器是玻璃容器。容器可以例如具有允许添加至少50mL溶液的体积。优选地，容器具有100mL的标称灌装体积。容器也可以是注射器，例如单室注射器。它也可以是在其中一个室中包括纤维蛋白原药物产品的双室注射器。
本发明提供了一种试剂盒，其在合适的容器例如小瓶和/或合适的转移装置中包括本发明的药物产品。更优选地，所述转移装置是便于将合适的溶剂(例如注射用水)从包括所述溶剂的容器清洁或无菌转移到包括药物产品的容器中的装置。甚至更优选地，所述转移装置还便于将溶解的产品转移到用于施用的装置，例如注射器。此类转移装置是可商购的(例如(West)、/>(SFM))和本领域技术人员已知的。所述转移装置任选地包括一个或多个过滤器，例如能够除去细菌和/或耗尽溶剂和/或产品中的任何颗粒的过滤器。这样的过滤器可以例如用于确保去除由于穿透容器的封闭物而进入药物产品或溶剂的任何颗粒(例如，用针穿透产生的来自橡胶塞的材料)。
如果认为合适的话，可使用筛网过滤器或膜过滤器。这种过滤器的孔径可以在3μm至25μm的范围内，优选在4至10μm的范围内。术语“孔径”涉及标称孔径。
对于溶解的药物产品所通过的过滤器，优选使用膜过滤器。优选地，所述过滤器具有3至10μm，更优选4至9μm，例如5或8μm的孔径。发明人已经发现，使用由丙烯酸共聚物制成的膜过滤器可以获得特别好的结果。
因此，本发明还涉及试剂盒，其包括在合适的容器(例如小瓶)中的本发明的药物产品和如上所述的合适的转移装置。优选地，所述试剂盒还包括合适的容器，其包括用于溶解药物产品的水性溶剂(例如注射用水)。例如，本发明还涉及试剂盒，其包括(i)在合适的容器(例如小瓶)中的本发明的药物产品，(ii)合适的转移装置，其包括用于过滤药物产品的具有3至10μm的孔径的过滤器，优选地其中所述膜为丙烯酸共聚物膜，和(iii)包括水性溶剂(例如注射用水)的合适的容器。
本发明的容器通常包含含有1g纤维蛋白原的纤维蛋白原药物产品，但它也可以包括其它量，例如0.5-10g或1-5g，如2g或5g纤维蛋白原。
优选地，容器例如小瓶适于以20g纤维蛋白原/L的浓度在50mL注射用水中重构。用以测量本文定义的SVP数目的重构通常也在所述浓度下进行。
本发明的纤维蛋白原药物产品是干燥的，优选是冻干的。它也可以是喷雾干燥的或喷雾冷冻干燥的。
除了纤维蛋白原和指定的残留水分之外，本发明中使用的纤维蛋白原药物产品还可以包括：
a)聚山梨醇酯，
b)任选地，填充剂，
c)任选地，氨基酸和/或
d)任选地，盐。
例如，本发明中使用的纤维蛋白原药物产品优选包括聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯80，因为本发明人可以示出聚山梨醇酯在优选的残留水分含量下有助于减少干热处理时的病毒载量，并且可以进一步帮助减少SVP。聚山梨醇酯20是替代品。
本发明的纤维蛋白原药物产品或纤维蛋白原药物产品的分批还可以包括填充剂，任选地，海藻糖。优选地，填充剂还充当冻干保护剂。可以替代性地使用甘露糖，但发明人已发现海藻糖造就更好的饼和更好的溶解特性。
本发明的纤维蛋白原药物产品或纤维蛋白原药物产品的分批还可以包括氨基酸，任选地，精氨酸。氨基酸优选地具有稳定作用。赖氨酸可被替代性地使用，但发明人已发现精氨酸造就更好的饼和更好的溶解特性。
此外，本发明的纤维蛋白原药物产品或纤维蛋白原药物产品的分批可以包括盐，优选地，氯化钠、柠檬酸钠或其组合，任选地，氯化钠和柠檬酸钠。盐可以例如用作缓冲剂和/或提供等渗溶液。优选地，由于钾的毒性，组合物不包括显著量的钾。
因此，用于本发明的纤维蛋白原药物产品可以例如包括：
a)聚山梨酸酯80，
b)海藻糖，
c)精氨酸，和
d)盐，优选地，氯化钠、柠檬酸钠及其组合。
优选地，用于本发明的纤维蛋白原药物产品包括聚山梨醇酯80、海藻糖、精氨酸、钠、氯化物、柠檬酸盐和残留水分。它还可以包括钙，优选地，以小于1mM的浓度。更高浓度的钙可能导致不希望的络合物形成。本发明的纤维蛋白原药物产品或纤维蛋白原药物产品的分批还可以包括额外的血浆蛋白，其选自包含以下的组：白蛋白、纤连蛋白、a2-巨球蛋白、免疫球蛋白(如IgG、IgA或IgM)、血管性血友病因子(Von Willebrand factor,vWF)、纤维蛋白肽A和D-二聚体，例如，其痕量，优选地，以如下实施例中提供的大致浓度。
用于本发明的优选纤维蛋白原药物产品基本上由所述组分组成，即纤维蛋白原、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯80、填充剂如海藻糖、氨基酸如精氨酸、盐如氯化钠和/或柠檬酸钠，或选自包含白蛋白、纤连蛋白、a2-巨球蛋白、免疫球蛋白(如IgG、IgA或IgM)、血管性血友病因子、纤维蛋白肽A和D-二聚体的组的血浆蛋白，以及残留水分。
例如，在优选的实施方案中，如本文所述，在将所述药物产品的1g纤维蛋白原以20g/L在注射用水中重构时，本发明中使用的纤维蛋白原药物产品可包括95-135mmol/LNa、小于1mmol/L Ca、100-160mmol Cl、3-7mmol/L柠檬酸盐、25-55mmol/L精氨酸、22-38mmol/L海藻糖和0.03-0.07％聚山梨醇酯80。
特别地，优选地，本发明的药物产品不包括比所述的显著更多的白蛋白，例如，在以20g/L纤维蛋白原重构时，其优选包括小于0.5g/L白蛋白，优选小于0.15g/L白蛋白。因此，有可能分别向患者提供合适剂量的纤维蛋白原和白蛋白，并且进一步不需要对纤维蛋白原和白蛋白二者进行质量控制过程。优选地，在以20g/L纤维蛋白原重构时，上述非纤维蛋白原血浆蛋白都不以高于0.5g/L的浓度被包含，以允许单独给药。
另外优选地，本发明的纤维蛋白原药物产品或纤维蛋白原药物产品的分批不包括蔗糖和/或谷氨酸盐，优选地，既不包括蔗糖也不包括谷氨酸盐。蔗糖会引发问题，特别是在糖尿病的情况下。关于谷氨酸的担忧在“中国餐馆综合征(Chinese restaurantsyndrome)”的上下文中讨论。
发明人已发现本发明中使用的纤维蛋白原药物产品是非常稳定的。发明人已发现有利的是，当以干燥形式储存时，本发明的药物产品在2-25℃稳定至少6个月，优选地，至少1年，任选地，至少5年。此外，如以下实施例中所示，在重构后，其可在2-8℃储存至少8周而无显著降解。优选地，稳定指药物产品保持至少80％、任选至少90％的最初含有的纤维蛋白原比活性。
本发明的纤维蛋白原药物产品或纤维蛋白原药物产品的分批优选包括少于20％的聚集体，优选少于10％的聚集体。聚集体通常是纤维蛋白原的多聚体，例如二聚体、三聚体等。聚集体的比例可以通过HP-SEC分析来确定。该比例被指定为与纤维蛋白原总量相比以聚集体形式存在的纤维蛋白原的检测量。
在一个实施方案中，本发明还提供了本发明的纤维蛋白原溶液，其可通过在水性溶剂中特别是在注射用水中重构本发明的干燥药物产品而获得，其中所述溶液包括如本文所定义的少量SVP。还提供了重构所述纤维蛋白原溶液的方法，其包括向本发明的干燥药物产品中加入注射用水或另一种水性溶剂。
制备包括本发明的纤维蛋白原药物产品的容器的方法
在另一个实施方案中，本发明提供了用于生产包括本发明的纤维蛋白原药物产品的容器的方法，其包括以下步骤：
a)无菌过滤纤维蛋白原药物物质的本体溶液，
b)在接收罐中接收无菌过滤的本体溶液，所述接收罐任选地包括具有搅拌装置的搅拌器，
c)任选地，当搅拌装置浸没在所述本体溶液中时，搅拌所述接收罐中的所述本体溶液，
d)以预定量的所述溶液灌装容器，例如使用泵，
e)将所述容器中的所述溶液冻干以获得冻干的药物产品，和
f)以干热处理所述冻干的药物产品，以及
g)任选地，包装包括所述药物产品的所述容器。
在一个实施方案中，所述方法包括
a)无菌过滤纤维蛋白原药物物质的本体溶液，
b)在接收罐中接收无菌过滤的本体溶液，
c)不搅拌所述接收罐中的所述本体溶液，
d)以预定量的所述溶液灌装容器，例如使用泵，
e)将所述容器中的所述溶液冻干以获得冻干的药物产品，和
f)以干热处理所述冻干的药物产品，以及
g)任选地，包装包括所述药物产品的所述容器。
发明人惊奇地发现，在灌装步骤之前和/或期间搅拌本体溶液不是必然需要的。溶液在整个灌装过程中保持均匀，例如在2-3小时内不搅拌。即使在没有搅拌的情况下，在灌装过程中取出的样品在整个灌装过程中显示出恒定浓度的纤维蛋白原和其它成分。发明人还发现减少或避免搅拌过程减少了SVP的量。
仍然为了避免产品不均匀的任何风险，本发明的方法还可以包括短时间和/或在温和条件下搅拌。因此，通常所述方法包括以下步骤：
a)无菌过滤纤维蛋白原药物物质的本体溶液，
b)在接收罐中接收无菌过滤的本体溶液，所述接收罐包括具有搅拌装置的搅拌器，
c)当搅拌装置浸没在所述本体溶液中时，搅拌所述接收罐中的所述本体溶液，
d)以预定量的所述溶液灌装容器，例如使用泵，
e)将所述容器中的所述溶液冻干以获得冻干的药物产品，和
f)以干热处理所述冻干的药物产品，以及
g)任选地，包装包括所述药物产品的所述容器。
搅拌具有非常可靠地避免溶液不均匀性并因此避免不均匀的包装的优点。然而，发明人发现即使不搅拌溶液也是足够均匀的。
在图1中示出了可用于本发明的方法的示例性灌装线。
步骤a)中的无菌过滤优选用具有0.2μm的筛目尺寸过滤器进行，从而将溶液无菌过滤。纤维蛋白原药物物质的溶液通常从进料罐穿过所述过滤器，所述进料罐可以是例如能够容纳80L的不锈钢罐或塑料容器(例如袋)。通过压力管线将溶液挤压通过过滤器。传输压力为至多600mbar(600hPa)。任选地，在无菌过滤后，将溶液直接通入接收罐中(步骤b)。
在步骤b)中，将无菌过滤的本体溶液接收在接收罐中，例如不锈钢罐。体积可以是例如50L。接收罐任选地包括具有搅拌装置的搅拌器，优选搅拌块或棒。在本发明的上下文中，术语“一”应理解为是指“至少一个”。因此，搅拌罐也可以包括两个或更多个搅拌器。搅拌器还可以具有至少一个搅拌装置，例如一个搅拌叶片。优选地，它具有两个或更多个搅拌装置，例如，搅拌叶片。在双叶片搅拌器中，叶片通常彼此相对。搅拌装置例如搅拌叶片优选通过以水平方式旋转来混合溶液。搅拌叶片可以固定到通常旋转的中心驱动轴，从而移动搅拌叶片。搅拌装置也可以是搅拌块，例如磁力搅拌块。搅拌装置也可以是摆动板或多个摆动板。
在任选的步骤c)中，当搅拌装置浸没在所述本体溶液中时，搅拌接收罐中的本体溶液。因此，在搅拌叶片或其它搅拌装置(所有的搅拌装置或叶片，如果有多个)被浸没之前不搅拌溶液。故而，与现有技术方法相反，在足够的溶液被接收在接收罐使搅拌装置被浸没之前，不搅拌溶液。这具有在搅拌时所述本体溶液的表面不被搅拌装置破坏的效果。因此，防止了泡沫形成，并且使溶液经受的剪切力最小化。如果在灌装过程中搅拌溶液，则当来自接收罐的溶液被灌装到容器中并且接收罐中的溶液的液面再次下降时，在溶液的液面下降到搅拌装置之下之前也停止搅拌，使得所述本体溶液的表面在搅拌时不被搅拌装置破坏。
对于50L接收罐，搅拌时间优选限制为至多1小时，更优选至多10min，最优选至多5min，以进一步最小化经受的剪切应力。时间可以适应于溶液和罐的体积，例如，对于更大的罐和/或更大量的溶液，搅拌时间可以更长。
小规模实验已表明搅拌的速率或速度、搅拌的时间和搅拌器的几何特征可以影响形成的SVP的数量。
优选地，搅拌器，例如，如上所述，具有固定到旋转垂直驱动轴的两个水平搅拌叶片的搅拌器，以至多150rpm，例如30-100rpm或50-80rpm的速度转动。优选地，溶液所经受的剪切力不高于50L的圆柱形不锈钢接收罐中的溶液以优选的具有如上定义的两个搅拌叶片的搅拌器以至多150rpm(例如80rpm)的速率转动所经受的剪切力。
在特别优选的实施方案中，在50L的圆柱形不锈钢接收罐中，例如，具有灌装线KS1025，例如来自德国伊尔斯霍芬Bausch&的AS18.3型，搅拌速率≤150rpm，例如80rpm，持续0-5min，显示最小化SVP的形成。
进一步表明，在灌装期间不需要搅拌。如果将额外的原料药溶液添加到接收罐中，则可以在有限的时间内重新开始搅拌，如上所述。在这种情况下，最大搅拌时间适用于总搅拌，以确保没有药物溶液被搅拌过长。如果必须添加额外的溶液，则在接收罐中仍有很多溶液时这样做是有利的，使得(如果存在)搅拌叶片如果被转动不会破坏溶液的表面。
发明人已惊奇地发现，这种平稳或温和的搅拌，以及因此纤维蛋白原溶液所经受的剪切力的最小化，导致有利地包括在本发明所使用的药物产品中的低数量的SVP。发明人进行的试验已表明，在无菌过滤后纤维蛋白原溶液所经受的剪切力可导致重构产品中SVP数量的显著增加。特别地，在接收罐中的搅拌是关键步骤。虽然搅拌对于获得均匀的产品可能是重要的，但是太多的搅拌或在错误条件下的搅拌，例如当溶液表面被破坏或泡沫产生时，显示导致较高数量的SVP。
在步骤d)中，使用泵或通过其它方式用预定量的溶液灌装容器。泵可以是以高达300rpm，例如200-290rpm，例如至多270rpm的速率使用的蠕动泵。容器中纤维蛋白原的预定量优选为1-5g，任选地，1g、2g或3g，例如1g。
在步骤e)中，将灌装的容器例如小瓶中的药物物质冻干。优选地，将容器装入预冷的冷冻干燥器中。这允许蛋白质溶液的快速冷冻并产生有利的多孔饼结构，其改善水升华。在本发明的方法中，优选选择冻干条件以获得2-5％(w/w)，任选2.5-4％或2.5-3.5％(w/w)，例如约3％(w/w)的冻干后残留水分含量。
本发明中使用的冻干药物产品的残留水分含量主要取决于冻干条件。制剂的成分，例如聚山梨醇酯80，对残留水分含量的影响仅到可能需要调整冻干条件以获得所需的残留水分含量的程度。
本发明优选的药物产品的相对高的残留水分含量的特别优点在于，发明人发现，由于高的残留水分含量，病毒灭活在冻干后进行的干热处理过程中特别有效。通常，高的残留水分含量对产品的完整性是有害的，然而，发明人惊奇地发现，具有限定的残留水分含量的本发明的产品是高度稳定的。具有2.5-3.5％的残留水分含量的产品已被证明在两个参数方面都是最佳的。
针对无包膜病毒，以猪细小病毒(PPV)为例，可显示通过干热处理的改善的病毒灭活。对HIV(人免疫缺陷病毒)或BVDV(牛病毒性腹泻病毒)等包膜病毒的研究没有如此清楚地显示出这种效果。这可能是由于对于所有分析的残留水分含量(即，即使残留水分含量较低)，其它病毒灭活作用(例如优选包含在本发明产品中的聚山梨醇酯)在冻干时(即在干热处理之前)已经导致包膜病毒的非常好的病毒灭活。因此，在纤维蛋白原药物产品的制备中，非包膜病毒优选地通过对冻干至含有2-5％残留水分含量的纤维蛋白原溶液进行干热处理而灭活(任选地，在聚山梨醇酯例如聚山梨醇酯80存在下)。如本文所述，包膜病毒优选通过在聚山梨醇酯例如聚山梨醇酯80存在下冻干纤维蛋白原溶液和/或通过UV-C处理进行灭活。优选地，执行所有这些措施并有助于提供病毒安全产品。
在一个优选的实施方案中，本发明的冻干方法包括以下步骤：
a)在-29℃或更低冷冻(优选地，快速冷冻)至少4小时，优选地，在-50℃或更低冷冻约8小时，
b)在-10℃或更低和至少40μbar(4Pa)的初级分步(stepwise)干燥，其中优选地，温度在每步中升高，起始于小于-25℃和至少200μbar(20Pa)，优选280μbar(29Pa)，
c)在17至23℃二次干燥至少2小时。
如上所述，优选地，在所述冻干后的残留水分含量为2-5％(w/w)。
冻干方法可以更具体地包括以下步骤：
a)在-52℃或更低冷冻8h或更久，
b)初级分步干燥，第一步在约-36℃、在约280μbar(28Pa)进行约5-48h，第二步在约-23℃、在约70μbar进行约25-45h，和第三步在约-10℃、在约40μbar(4Pa)进行约45-84h，例如，第一步在约-36℃、在约280μbar(28Pa)进行约45h，第二步在约-23℃、在约70μbar进行约45h，第三步在约-10℃、在约40μbar(4Pa)进行约45h，
c)在约20℃、在约10μbar(1Pa)二次干燥约3-4h。
可替代地，步骤b)中的初级分步干燥可以如下进行，例如，第一步在约-36℃进行约5h并且约280μbar，第二步在约-23℃、在约70μbar进行约25h，第三步在-10℃、在约40μbar下进行约78h。
在本发明的方法中，在步骤f)中，进行干热处理。使用干热的处理可以，例如，包括将药物产品加热至100℃+/-1.5℃，例如99-100℃。使用干热的处理可进行20-60min，优选20-40min。30+/-3min获得了良好的结果。当然，在封闭容器之后(例如，用橡胶塞，其可以是可刺穿)，使用干热的处理优选在蒸汽高压釜中进行。
在步骤g)中所述药物产品任选地被包装。可以添加包装插页，例如，指定将药物产品以20g纤维蛋白原/L溶解于注射用水中，和/或其用于静脉内施用。过滤器可以与药物产品的容器包装在一起。
用于制备包括本发明的药物产品的容器的优选方法可以包括以下步骤：
在药物物质(即配制的产品)进行无菌过滤(0.2μm)后，将其灌装到容器中，例如小瓶中。对于灌装，优选地，将药物物质接收在接收罐中，任选地，在避免泡沫形成、在搅拌器的搅拌叶片或其它搅拌装置被药物物质溶液覆盖时，小心搅拌例如至多5min，或根本不搅拌。搅拌器以≤150rpm，优选≤80rpm运行。然后优选用蠕动泵以≤290rpm，例如≤270rpm将药物物质灌装到容器中。通常，将32mL灌装到容器中，例如相当于约1g纤维蛋白原。随后冻干至2-5％的残留水分含量，然后进行约30min 99-100℃的干热处理以进一步灭活病毒。然后可以包装包括药物产品的容器。
任选地，本发明的方法还包括在步骤a)之前制备纤维蛋白原药物物质的步骤。例如，纤维蛋白原可以根据以下或实施例中描述的方法制备。其也可根据其它方法制备，例如本领域已知的方法。
生产纤维蛋白原的起始材料通常是人血浆。人血浆的冷沉淀物可以通过在0-4℃解冻冷冻血浆并通过离心或其它分离器分离沉淀物来获得。
每kg冷沉淀物可制备2.91kg水(WFI)、114g乙醇25％(v/v)和9,000IU肝素的混合物。冷沉淀物可以在搅拌下加入到WFI/乙醇/肝素溶液中。pH值可调节至7.0。
每kg所用冷沉淀物可添加108g的2％氢氧化铝悬浮液，并将混合物在22.5℃搅拌。可将pH值调节至6.55，随后通过连续运行的离心机进行离心。
可以在搅拌的同时添加1％聚山梨醇酯80和0.3％磷酸三正丁酯。蛋白质溶液可在25.0℃搅拌至少8小时的时间。
阴离子交换凝胶Toyopearl TSK DEAE-650(羟基化甲基丙烯酸聚合物珠作为具有二乙氨基乙基的基质材料)可用于通过柱色谱法进一步纯化。蛋白质负载量可以是约50±10mg蛋白质/mL阴离子交换凝胶。
可以通过加入NaCl溶液将蛋白质溶液的氯化物含量调节至120mmol/L。可以将蛋白质溶液施加到柱上。流过级分含有纤维蛋白原，其可被收集用于进一步加工。
所得纤维蛋白原溶液(流过)可进行甘氨酸沉淀。为了沉淀纤维蛋白原，可加入甘氨酸至1.2M的终浓度。可加入NaCl至2M的终浓度。然后可以通过离心来分离含有纤维蛋白原的沉淀物。纤维蛋白原糊剂可被储存在≤-70℃的温度。
可将沉淀物重悬于缓冲液(15mM二水合柠檬酸三钠，pH值：6.9+/-0.1，电导率：3.3+/-0.5mS/cm)中。除了其它蛋白质(例如0.7-0.9U/mg vWF)之外，组合物还包括TnBP、聚山梨醇酯80、甘氨酸和NaCl。组合物可被过滤并可进行使用诸如UVivatec装置(SartoriusStedim Biotech)的装置的用于病毒灭活的UV-C处理。照射优选在254nm±1nm使用125-200J/m2进行。
对于下面的阳离子交换层析步骤，可以用平衡缓冲液(15mM二水合柠檬酸三钠，65mM氯化钠，pH值：6.5+/-0.1，电导率：9.0+/-1.5mS/cm，2-5柱体积)平衡柱(POROSTM50HS)。
可以通过将组合物调节至15mM柠檬酸三钠、pH值：6.5+/-0.1和电导率：9.0+/-1.5mS/cm来制备由UV照射步骤产生的含有纤维蛋白原的液相。柱可以装载10-20g/l蛋白质/升凝胶体积。
可以用洗涤缓冲液(15mM脱水柠檬酸三钠，65mM氯化钠，pH值：6.5+/-0.1，电导率：9.0+/-1.0mS/cm，2-5柱体积)冲洗柱。
然后可以使用洗脱缓冲液(7.5mM二水合柠檬酸三钠，150mM氯化钠，75mM L-精氨酸单盐酸盐，pH值：7.0+/-0.1，电导率：19.5+/-1.5mS/cm)洗脱纤维蛋白原。在该步骤中，从柱中洗脱纤维蛋白原。大部分vWF仍结合于柱。
然后可以用具有较高盐浓度的缓冲液(15mM脱水柠檬酸三钠；1.5M氯化钠，pH值：6.5+/-0.1，电导率：113.5+/-5.0mS/cm)冲洗柱，从柱中洗脱vWF。然后可以使用1M氢氧化钠清洗柱。
在该方法中，尽管大部分白蛋白和IgG已通过沉淀步骤与纤维蛋白原分离，但它们也不与CEX材料结合。通过使用该方法，可以除去超过50％的存在于含有纤维蛋白原的液相中的vWF。
为生产药物物质，可以使用超滤浓缩洗脱的级分，并通过使用柠檬酸盐缓冲液将蛋白质浓度调节至33g纤维蛋白原/升。可以加入进一步成分以形成最终的药物物质，例如，如本文所述。
如步骤a)和以下步骤中所述，然后在上述条件下将药物物质优选地过滤(0.2μm)到不同的容器例如小瓶中，并且干燥(优选冻干)至2-5％(w/w)的残留水分含量。然后，优选地，在蒸汽高压釜中进行最终热处理(例如，约100℃，30min)作为进一步的病毒灭活步骤。所得产品令人惊奇地稳定。
本发明的方法可有利地用于减少SVP的数量，特别是，减少到本文所述的限度。为此，温和的灌装条件是特别相关的。本发明的方法还可以有利地用于减少病毒(例如无包膜病毒)的数量。为此，在2-5％的残留水分含量下(优选在聚山梨醇酯例如聚山梨醇酯80存在下)的干热处理是特别相关的。组合起来，本发明的方法造就对患者特别安全的产品。
如本文所述，本发明还提供了可从本发明的方法获得的包括纤维蛋白原药物产品的容器或包括本发明的纤维蛋白原药物产品的容器的分批。
用途，特别是医药用途
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗纤维蛋白原缺乏症的包括纤维蛋白原药物产品的容器。例如，纤维蛋白原药物产品可用于治疗遗传性纤维蛋白原相关病症。优选地，所述药物产品用于治疗先天性纤维蛋白原缺乏症。纤维蛋白原缺乏症可以是例如先天性无纤维蛋白原血症、先天性低纤维蛋白原血症、纤维蛋白原贮积病、先天性异常纤维蛋白原血症、遗传性纤维蛋白原Aα链淀粉样变性、先天性低纤维蛋白原血症或冷冻纤维蛋白原血症。
本发明的纤维蛋白原药物产品还可以用于治疗获得性纤维蛋白原相关病症，例如获得性异常纤维蛋白原血症或获得性低纤维蛋白原血症。
如果纤维蛋白原缺乏症是获得性的，药物产品优选用于治疗失血或出血，任选地，在(严重)外科手术过程中。失血或出血也可能是由外伤造成的。
本发明的药物产品可以代替血浆制剂如新鲜冷冻血浆而施用。有利的是施用本发明的纤维蛋白原药物产品代替这样的血浆产品，或代替进一步包括大量其它血浆蛋白如白蛋白的纤维蛋白原产品，因为对于本产品，血浆蛋白可根据患者的需要单独给药。特别是，在出血的情况下需要施用纤维蛋白原，即用于治疗出血，或在存在纤维蛋白原缺乏症的情况下预防出血。本发明的药物产品还尤其是病毒安全的。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗纤维蛋白原缺乏症的方法，其包括将本发明的纤维蛋白原药物产品施用于有需要的患者，例如患有任何上述病症的患者。被施用药物产品的患者优选为人类患者。
典型地，本发明的纤维蛋白原药物产品或纤维蛋白原药物产品的分批被配制用于在重悬后静脉施用于患者。由于如本文所定义的低数量的SVP，本发明的纤维蛋白原药物产品或纤维蛋白原药物产品的分批有利地适合在重悬后且无需预先过滤的情况下施用于患者。这节省了时间，特别是在紧急情况下。然而，纤维蛋白原药物产品也可以在重悬和过滤后使用。过滤器可以是本发明试剂盒的一部分，所述试剂盒包括容器(其含有本发明的纤维蛋白原药物产品)和过滤器(优选转移装置或注射器顶部过滤器)。过滤可有助于本发明的产品的重悬，特别是避免或减少泡沫形成。替代性地，为避免泡沫形成，可通过温和摇动进行重悬。
本发明的纤维蛋白原药物产品或纤维蛋白原药物产品的分批也可用作纤维蛋白胶，例如，在绷带中。替代性的用途是作为细胞培养基的一部分或用于器官打印例如三维器官打印中。
本发明的实施方案
本发明提供例如以下实施方案：
实施方案1是包括具有2-5％(w/w)的残留水分含量的干燥形式的纤维蛋白原药物产品的容器。在实施方案2中，实施方案1的包括药物产品的容器具有2.5-3.5％(w/w)，例如约3％(w/w)的残留水分含量。
在实施方案3中，实施方案1或2中任一项的容器中的药物产品适于在水溶液、优选注射用水中重构，并且其中由所述药物产品的1g纤维蛋白原的所述重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过6000个具有10-100μm尺寸的SVP和不超过600个具有25-100μm尺寸的SVP。在实施方案4中，对于实施方案1-3中任一项的容器中的药物产品，当在溶剂中、尤其是在注射用水中重构一个容器时，获得包括6000个或更少的具有10-100μm尺寸的SVP和600个或更少的具有25-100μm尺寸的SVP的纤维蛋白原溶液。
在实施方案5中，本发明提供了包括干燥形式的纤维蛋白原药物产品的容器，其中所述纤维蛋白原药物产品适于在水溶液、优选注射用水中重构，并且其中由所述药物产品的1g纤维蛋白原的所述重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过6000个具有10-100μm尺寸的SVP和不超过600个具有25-100μm尺寸的SVP。在实施方案6中，对于实施方案5的容器中的药物产品，当在溶剂中、尤其是在注射用水中重构一个容器时，获得包括6000个或更少的具有10-100μm尺寸的SVP和具有25-100μm尺寸的600个或SVP颗粒的纤维蛋白原溶液。
在实施方案7中，本发明提供了包括干燥形式的纤维蛋白原药物产品的容器的分批，其中，对于来自所述分批的至少10个容器，所述纤维蛋白原药物产品适于在水溶液、优选注射用水中重构，并且其中由所述药物产品的1g纤维蛋白原的所述重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过6000个具有10-100μm尺寸的SVP和不超过600个具有25-100μm尺寸的SVP。在实施方案8中，这些条件适用于来自实施方案7的分批的至少100个容器，任选地至少200个容器。在实施方案9中，这些条件适用于来自实施方案7的分批的至少500个容器，任选地适用于所述分批的基本上所有容器。在实施方案10中，这些条件适用于来自实施方案7-9中任一项的分批的至少最后10％的容器，优选适用于来自所述分批的至少最后20％的容器，任选适用于所述分批的基本上所有容器。
在实施方案11中，实施方案5-10中任一项的包括纤维蛋白原药物产品的容器或包括纤维蛋白原药物产品的容器的分批具有2-5％(w/w)的残留水分含量。在实施方案12中，实施方案5-11中任一项的包括纤维蛋白原药物产品的容器或包括纤维蛋白原药物产品的容器的分批具有2.5-3.5％(w/w)，例如约3％(w/w)的残留水分含量。
在实施方案13中，实施方案1-12中任一项的纤维蛋白原药物产品被包装在小瓶中，即，容器是小瓶。在实施方案14中，实施方案1-13中任一项的容器中的纤维蛋白原药物产品是冻干的。在实施方案15中，实施方案1-14中任一项的容器含有1-3g纤维蛋白原，任选地，1g。在实施方案16中，实施方案1-11任一项中的重构是以20g纤维蛋白原/L的浓度。
在实施方案16中，在实施方案1-15的包括纤维蛋白原药物产品的容器或包括纤维蛋白原药物产品的容器的分批中，所述纤维蛋白原药物产品适于在水溶液、优选注射用水中重构，并且其中由所述药物产品的1g纤维蛋白原的所述重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过3500个具有10-100μm尺寸的SVP和不超过60个具有25-100μm尺寸的SVP。因此，在实施方案17中，对于包括实施方案1-16中任一项的药物产品的容器，当在溶剂中、特别是在注射用水中重构一个容器时，获得包括3500个或更少的具有10-100μm尺寸的SVP和60个或更少的具有25-100μm尺寸的SVP的纤维蛋白原溶液。
在实施方案18中，实施方案1-17中任一项的容器中的纤维蛋白原药物产品或纤维蛋白原药物产品的分批适于在水溶液、优选注射用水中重构，并且其中由所述药物产品的1g纤维蛋白原的所述重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过3500个具有10-100μm尺寸的SVP和不超过35个具有25-100μm尺寸的SVP。因此，在实施方案19中，对于实施方案1-18中任一项的容器中的药物产品，当在注射用水中重构一个容器时，获得包括3500个或更少的具有10-100μm尺寸的SVP和35个或更少的具有25-100μm尺寸的SVP的纤维蛋白原溶液。
在实施方案20中，实施方案1-19的容器中的纤维蛋白原药物产品或纤维蛋白原药物产品的分批适于在水溶液、优选注射用水中重构，并且其中由药物产品的1g纤维蛋白原的重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过2500个具有10-100μm尺寸的SVP和不超过30个具有25-100μm尺寸的SVP。因此，在实施方案21中，对于实施方案1-20中任一项的容器中的药物产品，当在溶剂中、特别是在注射用水中重构一个容器时，获得包括2500个或更少的具有10-100μm尺寸的SVP和30个或更少的具有25-100μm尺寸的SVP的纤维蛋白原溶液。
在实施方案22中，在实施方案1-21的包括纤维蛋白原药物产品的容器或容器的分批中的纤维蛋白原药物产品包括
a)聚山梨醇酯，
b)任选地，填充剂，
c)任选地，氨基酸和/或
d)任选地，盐，其选自包括氯化钠、柠檬酸钠及其组合的组。
在实施方案23中，实施方案1-22的包括在容器中的纤维蛋白原药物产品包括聚山梨醇酯，任选地，聚山梨醇酯80。在实施方案24中，实施方案1-23的包括在容器中的纤维蛋白原药物产品或纤维蛋白原药物产品的分批包括填充剂，任选地，海藻糖。在实施方案25中，实施方案1-24的包括在容器中的纤维蛋白原药物产品包括氨基酸，任选地，精氨酸。在实施方案26中，实施方案1-25的包括在容器中的纤维蛋白原药物产品包括选自包括氯化钠、柠檬酸钠及其组合的组的盐，任选地，氯化钠和柠檬酸钠。
在实施方案27中，在实施方案1-26的包括在容器中的纤维蛋白原药物产品包括
a)聚山梨醇酯，优选聚山梨醇酯80，
b)填充剂，优选海藻糖，
c)氨基酸，优选精氨酸和/或
d)盐，其选自包括氯化钠、柠檬酸钠及其组合的组。
在实施方案28中，实施方案1-27的包括在容器中的纤维蛋白原药物产品包括聚山梨酸酯80、海藻糖、精氨酸、钠、氯化物、柠檬酸盐和残留水分。在实施方案29中，实施方案1-28的包括在容器中的纤维蛋白原药物产品还包括少于1mM钙。在实施方案30中，实施方案1-29的包括在容器中的纤维蛋白原药物产品还包括选自包括白蛋白、纤连蛋白、a2-巨球蛋白、免疫球蛋白(如IgG、IgA或IgM)、血管性血友病因子、纤维蛋白肽A和D-二聚体的血浆蛋白的组的额外的血浆蛋白。在实施方案31中，实施方案1-30的包括在容器中的纤维蛋白原药物产品由所述组分组成，即纤维蛋白原、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯80、填充剂如海藻糖、氨基酸如精氨酸、盐如氯化钠和/或柠檬酸钠，或选自包括白蛋白、纤连蛋白、a2-巨球蛋白、免疫球蛋白(如IgG、IgA或IgM)、血管性血友病因子、纤维蛋白肽A和D-二聚体的血浆蛋白的组的血浆蛋白，或由所述组组成。
在实施方案32中，实施方案1-31的包括在容器中的纤维蛋白原药物产品包括，当以20g/L纤维蛋白原重构时，小于0.5g/L白蛋白，优选小于0.15g/L白蛋白。在实施方案33中，实施方案1-32的包括在容器中的纤维蛋白原药物产品不包括蔗糖和/或谷氨酸盐，优选地既不包括蔗糖也不包括谷氨酸盐。优选地，上述非纤维蛋白原血浆蛋白均不以高于0.5g/L的浓度被包括。
在实施方案34中，实施方案1-33的包括在容器中的纤维蛋白原药物产品在2-25℃稳定至少6个月，优选至少1年，任选至少5年。
在实施方案35中，实施方案1-34的包括在容器中的纤维蛋白原药物产品包括少于20％的聚集体，优选少于10％的聚集体。
在实施方案36中，本发明提供了用于生产实施方案1-35中任一项的包括纤维蛋白原药物产品的容器的方法，其包括以下步骤：
a)无菌过滤纤维蛋白原药物物质的本体溶液，
b)在接收罐中接收无菌过滤的本体溶液，所述接收罐任选地包括具有搅拌装置的搅拌器，
c)任选地，当搅拌装置浸没在所述本体溶液中时，搅拌所述接收罐中的所述本体溶液，
d)以预定量的所述溶液灌装容器，例如使用泵，
e)将所述容器中的所述溶液冻干以获得冻干的药物产品，
f)以干热处理所述冻干的药物产品。如果溶液在步骤c)中被搅拌，则接收罐包括具有搅拌装置的搅拌器。
在实施方案37中，实施方案36的方法进一步包括
g)包装包括所述药物产品的所述容器。
在实施方案38中，在实施方案36或37中任一项的方法中，冻干后的残留水分含量为2-5％(w/w)，任选地2.5-3.5％(w/w)，例如约3％(w/w)。
在实施方案39中，实施方案36-38中任一项的冻干方法包括以下步骤：
a)在-29℃或更低冷冻至少4h，优选-50℃或更低，
b)在-10℃或更低和至少40μbar(4Pa)初次分步干燥，其中优选地，温度在每步中增加，始于低于-25℃和至少200μbar(20Pa)，
c)在17至23℃二次干燥至少2小时，
其中冻干后的所述残留水分含量为2-5％(w/w)。
在实施方案40中，实施方案39的冻干方法包括以下步骤：
a)在-52℃或更低冷冻8h或更久，
b)初次分步干燥，第一步在约-36℃、在约280μbar(28Pa)进行约48h，第二步在约-23℃、在约70μbar(7Pa)进行约40h，并且第三步在约-10℃、在约40μbar(4Pa)进行约78h，
c)在约20℃、在约10μbar(1Pa)二次干燥约3-4h。
在实施方案41中，在实施方案36-40中任一项的方法中，使用干热的处理(步骤f)包括将药物产品加热至100℃+/-1.5℃。在实施方案42中，在实施方案36-41中任一项的方法中，使用干热的处理进行30+/-3min。在实施方案43中，在实施方案36-42中任一项的方法中，在蒸汽高压釜中进行使用干热的处理。
在实施方案44中，在实施方案36-43中任一项的方法中，在步骤d)中不搅拌溶液，但在步骤c)中搅拌例如至多1小时，优选地，至多1小时。在实施方案45中，在实施方案36-44中任一项的方法中，步骤c)中的搅拌持续至多10min，例如至多5min。在实施方案46中，在实施方案36-45中任一项的方法中，搅拌为至多150rpm，其中，优选地，接收罐具有50-150L的体积和圆柱形形式，并且搅拌装置是固定到以至多150rpm(例如至多80rpm)旋转的中心驱动轴的搅拌叶片(例如，以叶片或棒的形式)。在实施方案47中，在实施方案36-46中任一项的方法中，当搅拌棒会破坏溶液的表面时和/或当泡沫会形成时，不搅拌溶液。
在实施方案48中，在实施方案36-43中任一项的方法中，在步骤c)或d)中不搅拌溶液。
在实施方案49中，本发明提供可从权利要求36-48中任一项的方法获得的实施方案1-35中任一项的包括纤维蛋白原药物产品的容器或包括纤维蛋白原药物产品的容器的分批。
在实施方案50中，本发明提供用于纤维蛋白原缺乏症的治疗的实施方案1-35或49中任一项的包括纤维蛋白原药物产品的容器或包括纤维蛋白原药物产品的容器的分批。在实施方案51中，实施方案49的容器中的纤维蛋白原药物产品用于治疗遗传性纤维蛋白原相关病症。在实施方案52中，实施方案49-50中任一项的容器中的纤维蛋白原药物产品用于治疗先天性纤维蛋白原缺乏症。在实施方案53中，实施方案49的容器中的纤维蛋白原药物产品用于治疗获得性纤维蛋白原相关病症。在实施方案54中，实施方案50或53中任一项的容器中的纤维蛋白原药物产品用于治疗失血/出血，任选地，在(严重)外科手术过程中。在实施方案55中，实施方案50或53中任一项的容器中的纤维蛋白原药物产品用于治疗由外伤引起的失血/出血。
在实施方案56中，实施方案50-55中任一项的容器中的纤维蛋白原药物产品用于在重构后静脉内施用于患者。在实施方案57中，实施方案50-56中任一项的容器中的纤维蛋白原药物产品用于在重构后且无预先过滤的情况下施用于患者。
在实施方案58中，实施方案36-48中任一项的方法用于减少药物产品中SVP的数量，特别是减少至本文所述的限度。在实施方案59中，实施方案36-48中任一项的方法用于减少药物产品中病毒(例如无包膜病毒)的数量。在实施方案60中，实施方案36-48中任一项的方法用于减少药物产品中SVP的数量，特别是减少至本文所述的限度，并且用于减少药物产品中病毒(例如无包膜病毒)的数量。
以下实施例和附图进一步说明、但不限制本发明。所有引用的文献在此全部并入本文。
附图详述
图1：在本发明的方法中使用的优选灌装设备的示意图。(1)：空气流；(2)：压力管线；(3)：进料罐，例如80L；4：末级过滤器；5：产品流；6：接收罐，例如50L；7：搅拌器，优选以至多150rpm；8：搅拌叶片；9：蠕动泵，例如290rpm或更低；10：容器，例如小瓶；11：冷冻干燥器。
图2：残留水分对病毒灭活动力学有显著影响(I)。在存在和不存在聚山梨醇酯80(PS 80)(不含聚山梨醇酯的样品-H3，重构产品中含有0.05％聚山梨醇酯的样品-H5)的情况下，将掺入有PPV的纤维蛋白原样品冻干至残余水分含量<1％(w/w)，并部分地调节至如实施例4中所述的其他限定的残余水分含量。对所有样品在99℃进行0min、30min、45min或60min的干热(DH)处理。
图3：残留水分对病毒灭活动力学有显著影响(II)。在存在和不存在聚山梨醇酯80(PS 80)(不含聚山梨醇酯的样品-H3，示于图3A中，重构产品中含有0.05％聚山梨醇酯的样品-H5，示于图3B中)的情况下，将掺入有PPV的纤维蛋白原样品冻干至残余水分含量<1％(w/w)，并部分地调节至如实施例4中所述的其他限定的残余水分含量。对所有样品在99℃进行0min、30min、45min或60min的干热(DH)处理。
图4：本发明的重构纤维蛋白原药物产品在2-8℃和23-27℃的稳定性。在2-8℃，纤维蛋白原药物产品稳定至少8周。在23-27℃，纤维蛋白原药物产品稳定至少4周(研究B)。
图5：本发明的纤维蛋白原药物产品在储存6年后的稳定性(研究C)。
图6：搅拌和不搅拌下药物物质的均匀性。短暂搅拌接收罐中的药物物质，并从溶液的表面、中部和底部取样(t＝0，左柱组)。孵育5h后(t＝5，中间柱组)，在相同位置取另外的样品。然后，再次搅拌该罐，取出更多样品(t＝5+S，右柱组)。在蛋白质浓度(A)、纤维蛋白原比活性(B)、SVP≥10μm(C)、SVP≥25μm(D)或聚集体(E)上没有显著差异，既不取决于取样的位置，也不取决于孵育或搅拌后。A和B中的虚线为规格下限，A中的不规则线为规格上限。C-E中的虚线是规格上限。
实施例
方法
蛋白质测定
通过UV吸收法(Spektralphotometer GenesysTM6、SpektralphotometerGenesysTM10)进行蛋白质测定。由于芳香族氨基酸(主要是酪氨酸和色氨酸)的存在，溶液中的蛋白质吸收波长280nm的UV光。该性质是280nm处蛋白质测定的基础。蛋白质的UV光谱测定的准确性可因测试样品的光散射而降低。为了补偿该效应，从280nm处的吸收值中减去360nm处的吸收值。
纤维蛋白原(Fib:Ag)的测量
在BN Prospec(Siemens)浊度计上的通过浊度测定法测定Fib:Ag浓度。纤维蛋白原与特异性抗体形成络合物。该络合物引起照射光的色散。分散度的增加与纤维蛋白原浓度相关。
通过可凝固蛋白(clottable protein)测定纤维蛋白原的活性
为了测定纤维蛋白原活性(＝可凝固蛋白)，将样品制剂与含有足够凝血酶的合适缓冲溶液混合并在37℃孵育。通过UV光谱测定法在280/360nm处测定上清液中的残留蛋白质，随后从总蛋白质含量(参见上文)中减去该结果以计算可凝固蛋白。
纤维蛋白原比活性的测定
纤维蛋白原的比活性由与总蛋白相关的可凝固蛋白活性确定，通过UV吸收(280nm)测量。
PPV掺入
在22±4℃，测试材料掺入有病毒原液，并将34ml的等份灌装入容器，例如小瓶中。从原液和病毒掺入的测试材料中取出样品并滴定。所有小瓶均进行冷冻干燥。冷冻干燥后，通过NIR(近红外光谱)测定每个容器中的残留水分。为了病毒滴定，将冻干物悬浮于50mLWFI(注射用水)中。
病毒接种物的制备
从病毒感染的细胞中制备PPV的病毒原液。对于病毒验证研究的病毒原液的释放，通过至少三次独立滴定验证滴度，每次滴定使用3倍稀释度序列，每个稀释度8个重复。
病毒滴定
使用基于病毒特异性细胞的感染性测定(病毒滴定)对样品定量分析其病毒含量。重悬样品后(如果适用)，立即在易感细胞系上稀释和滴定样品。在给定的孵育时间后，评估病毒诱导的细胞病理效应。
病毒滴度的计算方法
病毒滴度的计算优选地根据Spearman and Kaerber(Spearman C,Kaerber G.lIn:Mayr A,Bachmann PA,Bibrack B,Wittmann G；eds.Virologische Arbeitsmethoden,Vol.I,p.37-39 Fischer Verlag Stuttgart,1974.)，或通过应用泊松分布(例如，当未检测到感染性时)。
病毒减少因子的计算
每次运行的病毒减少因子定义为病毒掺入的测试材料中的病毒载量(总病毒)与热处理后材料中的病毒载量的比率的log10。通过将病毒滴度浓度乘以体积来计算病毒载量。
根据卡尔费休(KarlFischer)法和根据NIR法(近红外光谱法)测量残留水分含量
这些测量方法如EP0844005A1中所述地进行。
聚集体含量的测量
根据欧洲药典2.2.30和USP 621，通过具有相邻UV-检测的尺寸排阻色谱法测量聚集体含量。因此，将蛋白质溶液施加到柱树脂上，其中蛋白质以尺寸依赖的方式与多孔树脂相互作用。小蛋白或蛋白片段显示出与柱树脂更强的相互作用，因此具有更长的驻留时间，而较大的蛋白或蛋白聚集物(二聚体、三聚体等)具有更短的驻留时间，因此首先被洗脱。通过柱末端的UV检测器检测蛋白质级分。
SVP的测量
根据欧洲药典2.9.19和USP 788，通过遮光测量SVP的量，例如通过配备HiacModel HRLD-400传感器、尺寸范围为2至400μm的Hiac Model 9703+粒子计数器(贝克曼，克雷菲尔德，德国)。每次测量通过毛细管吸入蛋白质溶液并通过传感器。第一次测量用于冲洗系统，结果被丢弃。随后的四次测量的平均值用于确定溶液中SVP的数量。重要的是注意在测量之前蛋白质溶液没有被过滤。
实施例1-纤维蛋白原的生产
1A)一般方法信息
以下方法是制备纤维蛋白原的优选方法，其可用于制备本发明中使用的纤维蛋白原药物产品。也可以使用其他方法，例如本领域已知的方法。
纤维蛋白原浓缩物药物物质(DS)可以例如从因子VIII生产方法的副级分(sidefraction)生产。生产方法在GMP条件下进行。该方法包括阴离子交换层析步骤，其中因子VIII与层析材料结合并被进一步处理。FVIII方法中阴离子交换层析的流出物用于纤维蛋白原的制备，被收集并用柠檬酸三钠稳定。随后，通过加入甘氨酸、NaCl和CaCl2沉淀纤维蛋白原。通过流出液离心分离沉淀物。收获的中间体“甘氨酸糊剂”可在≤-70℃储存直至进一步使用。
为生产纤维蛋白原浓缩物DS，将冷冻的中间体“甘氨酸糊剂”溶解在柠檬酸钠缓冲液(溶液F01)中并过滤。随后，进行UV-C光照射以灭活病毒。为了进一步纯化，使用POROS 50HS通过阳离子交换层析对蛋白质溶液进行层析纯化。通过超滤(UF)浓缩收集的柱洗脱级分。加入聚山梨醇酯80(PS 80)和海藻糖后，调节pH和蛋白质浓度。将最后的本体DS进一步加工成药物产品(DP)。
纤维蛋白原浓缩物DP由纤维蛋白原浓缩物DS生产。该方法在GMP条件下进行。将配制的最后本体DS装入最后容器中，其中将32.0mL蛋白质溶液装入100mL玻璃小瓶中。将塞子松散地置于小瓶上，然后将其装载在冷冻干燥器的预冷架上，并开始冷冻干燥过程。冷冻干燥后，将冻干的产品在蒸汽高压釜中在100℃(产品温度)热处理30min以灭活包膜以及尤其是无包膜病毒。
1B)纤维蛋白原浓缩物药物物质和药物产品的详细制造方法
以下列表提供了在1g灌装尺寸下的纤维蛋白原DS(药物物质)和DP(药物产品)制备的方法步骤的概述。
步骤DS 1起始材料(人血浆)
步骤DS 2血浆的汇集和解冻
步骤DS 3冷沉淀物的分离
离心
温度＝2±2℃
≤-25℃冷沉淀物的储存
步骤DS 4冷沉淀物的汇集
pH值＝7.05±0.05
温度＝22.5±2.5℃
搅拌时间≥30分钟
步骤DS 5氢氧化铝处理
在15-30min内加入2％氢氧化铝悬浮液
搅拌时间＝5分钟
温度＝22.5±2.5℃
pH值＝6.55±0.05
温度＝15.0±1.0℃
步骤DS 6聚山梨醇酯80/TnBP处理(病毒灭活)
蛋白质≤10g/l
氯化钙＝0.001M
pH值＝7.1±0.1
温度＝25.0±1.0℃
聚山梨醇酯80＝10±3g/kg
磷酸三正丁酯＝3±0.9g/kg
搅拌时间＝8-14h
步骤DS 7阴离子交换柱层析
DEAE Toyopearl
温度＝22±4℃
流通速率(Flow-through rate)＝192l/h
步骤DS 8收集流出液
步骤DS 9甘氨酸沉淀
温度＝22±4℃
0.0059kg柠檬酸三钠/kg蛋白溶液，搅拌时间≥5min
0.091kg甘氨酸/kg蛋白溶液，搅拌时间≥15min
0.117kg氯化钠/kg蛋白溶液和0.000035kg二水合氯化钙/kg蛋白溶液，搅拌时间≥5min
缓冲液A(先前阴离子交换层析的平衡和洗涤缓冲液)：10mM柠檬酸三钠、120mMNaCl、120mM甘氨酸、1mM CaCl2，pH 7.0-7.1。
将所得流出液(flow through)与甘氨酸和NaCl混合，沉淀纤维蛋白原(例如，在室温，c(甘氨酸)：1.2M，c(NaCl)：2.0M)。通过流出液离心制备甘氨酸糊剂。
将固体甘氨酸糊剂冷冻，特别是在≤-50℃(例如，-50℃至-70℃)下快速冷冻，这减少了聚集体的形成。
步骤DS 10通过UV-C-光照射的病毒灭活(病毒灭活)
温度＝18±2℃
UV-C剂量＝125-200J/m2，例如在254nm下
电导率＝9±1mS/cm
将甘氨酸糊剂重悬于柠檬酸钠缓冲液(Puffer F01)中，然后过滤。
对于照射，根据EP0840624B1使用具有圆周管的照射装置。采用125-200J/m2的在254nm处的照射是特别均匀且温和的产品处理。
步骤DS 11阳离子交换柱层析(CEX)
POROS 50 HS
蛋白质负载＝10-20g/l树脂每周期
电导率＝9±1mS/cm
温度＝22±4℃
线性流速＝200±100cm/h
CEX降低了vWF和进一步的蛋白质以及TnBP和聚山梨醇酯80的浓度。
用洗涤缓冲液F02(15mM柠檬酸盐缓冲液(柠檬酸三钠)，65mM NaCl，pH 6.5)平衡柱。加入含有纤维蛋白原的级分，且纤维蛋白原结合于柱。用含精氨酸/柠檬酸盐/NaCl的洗脱缓冲液(F03:7.5mM柠檬酸盐缓冲液(柠檬酸三钠)、150mM NaCl、75mM精氨酸，pH7.0)进行洗脱。
步骤DS 12超滤
蛋白质浓度＝55g/l±10g/l
步骤DS 13蛋白质溶液的调整、0.2μm过滤和药物物质的质量控制
二水合海藻糖＝0.0170±0.0017每kg蛋白质溶液
聚山梨醇酯80＝0.075±0.0075％
pH＝7.0±0.5
纤维蛋白原浓度＝30-36g/l
将蛋白质含量调节至33g/l，并用柠檬酸盐缓冲液调节至pH 7.0。添加0.017kg海藻糖/kg蛋白质。075％(w/v)聚山梨醇酯80(用于稳定、提高溶解度、加强无包膜病毒例如细小病毒的减少)。冻干前，将聚山梨醇酯的浓度调节至0.075％聚山梨醇酯(w/v)。重构后，这通常导致0.05％的聚山梨醇酯浓度。
→药物物质(最后本体)
步骤DP 1+2最后无菌过滤及灌装至最后容器/销售单元
0.2μm过滤
约32.0mL的灌装
步骤DP 3冷冻干燥
在≤-29℃冷冻持续≥4h
初次干燥分步≤-10℃
二次干燥20℃±3℃持续≤4h
总干燥持续约150-200h
步骤DP 4热处理(病毒灭活)
产品温度：100±1.5℃，持续30±3min
残留水分2.0-5.0％
冷却至≤80℃
步骤DP 5+6DP和包装的质量控制
在5℃±3℃储存
在EP19214919.3(申请号，尚未公开)中和在下面的本发明的关键步骤中更详细地描述了生产药物产品的优选方法。
实施例2-灌装过程
在本发明用于纤维蛋白原浓缩物药物物质(DS)最后灌装的优选方法中，使用用于灌装药物蛋白的标准化/常规灌装管线(Bausch&伊尔斯霍芬，德国，KS 1025，型号：AS 18.2)。该设置示于图1中。
a)对于灌装，最终的DS使用过滤器4(例如，过滤器类型：Sartorius 5235307H9—SS，0.2m2，醋酸纤维素(CA)膜)进行0.2μm过滤，通过压力管线2和沿着产品流5的气流1(例如，在≤600mbar(600hPa)下)中的压力叠加，从进料罐3(典型地，不锈钢罐，例如，具有80L的标称灌装体积)进入接收罐6(典型地，不锈钢罐，例如，具有50L的标称灌装体积)。当搅拌器7的搅拌块8(或搅拌棒)被纤维蛋白原溶液覆盖时，例如，在接收罐6灌装大约15L之后，搅拌器7以低速启动，特别是以≤150rpm，优选80rpm±20rpm，确保搅拌器的搅拌块8被浸没。由此，蛋白质溶液表面保持在搅拌装置8上方，防止泡沫形成。然后，例如，在将药物物质完全转移到接收罐6中之后，使用泵速≤290rpm、优选≤270rpm的蠕动泵9开始灌装。每个玻璃小瓶10(标称灌装体积：100ml，直径：5.2cm)灌装有32ml药物物质。在溶液表面到达棒/搅拌器装置8之时或之前，停止搅拌器7。
将多个小瓶10、特别是50个小瓶收集在框架、特别是金属框架中，将其无延迟地转移到预冷(≤-50℃)的冷冻干燥器11中。
如本文所述，由于温和的搅拌条件，所得的药物产品可在少量SVP形成的情况下重构。
b)替代性地，对于灌装，最终的DS使用过滤器4(例如，过滤器类型：Sartorius5235307H9—SS，0.2m2，醋酸纤维素(CA)膜)进行0.2μm过滤，通过压力管线2和沿着产品流5的气流1(例如，在≤600mbar(600hPa)下)中的压力叠加，从进料罐3(典型地，不锈钢罐，例如，具有80L的标称灌装体积)进入接收罐6(典型地，不锈钢罐，例如，具有50L的标称灌装体积)。在将药物物质完全转移到接收罐6中之后，搅拌器7以低速启动，特别是≤150rpm，优选80rpm±20rpm。溶液被搅拌5min，随后停止搅拌器。使用泵速≤290rpm、优选≤270rpm的蠕动泵9开始灌装。每个玻璃小瓶10(标称灌装体积：100ml，直径：5.2cm)灌装有32ml药物物质。
在接收罐6被排空之前将剩余的药物物质灌装到接收罐6中，使得在剩余的和添加的药物物质溶液的情况下，搅拌器7可以在被浸没时使用。将溶液搅拌5min，然后停止搅拌器并重新开始罐装过程。替代性地，如果确保搅拌装置在搅拌时总是被浸没的，可以在搅拌的同时开始填充。
将多个小瓶10、特别是50个小瓶收集在框架、特别是金属框架中，将其无延迟地转移到预冷(≤-50℃)的冷冻干燥器11中。
通过从灌装过程的不同阶段获取样品并比较所述样品，例如对于纤维蛋白原的浓度，本发明人惊奇地发现这种温和且短暂的搅拌对于均匀的产品而言是足够的。即使不搅拌，也没有发现异质性。
SVP的数量甚至可重复地低于方法a)中的数量。
c)为了比较搅拌和不搅拌下的均匀性，接收罐6中的药物被短暂地搅拌，并从溶液的表面、中部和底部取样。孵育5h后(t＝5)，在相同位置获取另外的样品。然后，再次搅拌该罐，获取更多样品(t＝5+S)。不存在显著差异，既不取决于取样的位置，也不取决于孵育或搅拌后(图6)。
实施例3-冻干
特别有利的是，将灌装的小瓶10装载入预冷的冷冻干燥器中。这允许蛋白质溶液的快速冷冻并产生有利的多孔饼结构，其改善了水升华。以导致2.5-5％(w/w)的残留水分的方式进行冻干。
在优选的方法中，在装载最后小瓶之后，开始干燥程序：第一步由在-52℃的8h冷冻步骤和随后的初次干燥组成。初次干燥细分为三个步骤：在280μbar(28Pa)和-36℃干燥5-45h(步骤1)，在70μbar(7Pa)和-23℃干燥25-45h(步骤2)以及在40μbar(4Pa)和-10℃干燥45-78h(步骤3)(优选地，步骤1持续45h、步骤2持续45h且步骤3持续45h，或步骤1持续5h、步骤2持续25h且步骤3持续78h)。该过程提高了最终产品的溶解度并降低了SVP的量。为转至二次干燥，需要通过压力上升测试(3min内0.044μbar(0.44Pa))。在10μbar(1Pa)和20℃二次干燥3h降低了残留水分的变化，并导致热处理(在100℃的30min)后更均匀的冻干物行为。此外，在20℃的二次干燥降低了最终产品中SVP的量。
使用NIR或卡尔费休法测试每分批的残留水分。可以使用针对本发明的样品校准的表格将NIR结果与卡尔费休法相关联。为了分析，从冻干物中提取水并通过以下反应进行化学定量。
如表1所示，卡尔费休法测得用本发明的方法制备的产品中的残余水分含量通常在2.5-3.5％(w/w)之间。相比于市售产品显示出显著更低的残留水分含量，低于1％(w/w)。
表1：对比样品中的残余水分
实施例4-根据残留水分含量的病毒灭活比较
通过在如上所述的药物制备过程中进行的溶剂/去污剂步骤，包膜病毒被可靠地清除。应进一步清除无包膜病毒。在以下实验中分析了最佳条件。
对于无包膜病毒的实验，首先，在存在和不存在聚山梨醇酯80(PS 80)(不含聚山梨醇酯的样品-H3，重构产品中含有0.05％聚山梨醇酯的样品-H5)的情况下，将掺入有PPV的纤维蛋白原样品冻干至残余水分含量<1％(w/w)。通过NIR(近红外光谱)测量冻干后样品的水分。
然后再次打开一些样品以将确定量的注射用水(WFI)加入小瓶中，不接触冻干物。将小瓶再次用塞子封闭并孵育直至所施加的WFI蒸发。为了在所有小瓶中获得可比较的压力，将小瓶打开并放入冷冻干燥器的室中。然后将小瓶在真空下封闭。如本文所述，在根据卡尔费休法用有机溶剂萃取之后，通过NIR或在平行对照样品中再次测量水分含量。
在99℃对所有样品进行干热(DH)处理0min、30min、45min或60min。0min表示未经干热处理的冻干样品。以对数(log10)计算病毒滴度的减少，其中，使用冻干前的材料作为减少计算的起始值。0min时没有显著的病毒减少。随着加热时间的增加(30min、45min、60min)，在4％的残留水分下观察到增加的病毒灭活(在log10约2.5-4之间，有一个热处理30min后的异常值，病毒减少因子略低于2log102)。对于所有时间点，残留水分低于1％的样品的病毒灭活在1-1.5log10的范围内。在该低水分下，没有观察到聚山梨醇酯80的作用。在较高的残留水分下，存在聚山梨醇酯80的积极作用的趋势。在所有时间点，具有约4％残留水分并包括聚山梨醇酯的样品实现最多的减少(图2)。
在另一组实验中，用另一纤维蛋白原样品重复掺入实验，其中使用如上所述在冻干后测量和调整的0-5％的其它残留水分含量。测试不含(H3)和含有聚山梨醇酯80(H5-0.05％，在重构产品中)的样品。
对于PPV所示的残留水分和病毒灭活之间的关系在不含PS 80的材料和含有PS 80的材料中都可以得到证实。
在图3A和图3B中，样品根据其残留水分分组，并且显示了在99℃干热处理(DH)不同时间的病毒减少。在具有45或60min DH的样品中，对于更潮湿的样品可显示显著更高的病毒灭活。在PS80的存在下(图3B)，或超过3.2至4.3％或优选地至少4％的残留水分似乎对于病毒灭活的显著功效是最佳的，而在没有聚山梨醇酯的情况下(图3A)，5％的残留水分是最佳的。
实施例5-药物产品的制剂
一个容器，例如本发明的纤维蛋白原药物产品的一个小瓶，当在50mL注射用水中以20g/L重构时，其适于静脉内施用，可以例如具有以下特征：
聚集体含量≤20％，例如11±1％(n＝11)(通过HP-SEC分析测定的)
表2：本发明优选的纤维蛋白原药物产品中赋形剂的概述
表3：可包括在本发明药物产品中的额外的血浆蛋白
参数 杂质来源 平均含量(3分批)
白蛋白 血浆 0.09g/l
纤连蛋白 血浆 0.27g/l
α2-巨球蛋白 血浆 0.14g/l
IgG 血浆 0.06g/l
IgA 血浆 0.15g/l
IgM 血浆 0.20g/l
血管性血友病因子 血浆 4.1U/ml
纤维蛋白肽A 血浆 9.2μg/l
D-二聚体 血浆 0.19mg/1
实施例6-SVP的测量
根据欧洲药典2.9.19和USP 788，如上所述测量SVP的量。
对于最终的纤维蛋白原浓缩物药品(纤维蛋白原药品，DP)，测定≥10μm和≥25μm的颗粒的数量。将冷冻干燥的DP用50mL注射用水(WFI)重构。不进行任何进一步的过滤，将重构的溶液转移到颗粒计数器中。每个样品测量三次。报告每个小瓶的总颗粒量的平均值。由于颗粒≥25μm也包括在颗粒≥10μm组中，因此颗粒≥10μm的数量总是高于颗粒≥25μm的数量。
通过本发明的方法生产的最后五个分批的结果显示最终产品中SVP的数量总是在规格内(表4)。因此，在施用前不需要额外的过滤。
表4：在通过实施例2a的方法产生的最后DP(五个示例性分批)的释放测量中确定的每小瓶中≥10μm和每小瓶中≥25μm的SVP的数量
出于比较目的，下表5显示了在一些竞争产品中分析的SVP计数。
表5：SVP计数(颗粒/容器)，比较产品
本发明产品中少量SVP优选是由于最终的制剂，特别是聚山梨醇酯的存在、温和的灌装方法和冷冻干燥方法，其已经精确地适应于纤维蛋白原。
实施例7-药物产品的稳定性
7.1研究A–冻干药物产品的长期稳定性
为研究纤维蛋白原药品的长期稳定性，储存四个分批的纤维蛋白原药物产品以进行稳定性测试。一个分批储存36个月，三个分批储存60个月，各在5℃(±3℃)和25℃(±2℃)。基于该数据，纤维蛋白原药物产品在5℃(±3℃)和25℃(±2℃)的有效期显示至少为60个月。
对于稳定性测试，在每种储存条件(5℃、25℃、55-65％相对湿度(RH))下的预定义时间点重构后，对分批进行活性测试，即，在重构后以及在室温(约25℃)孵育6h和24h后立即在重构的水溶液中测试纤维蛋白原活性。本研究模拟了纤维蛋白原浓缩物在临床常规中的使用。
在5℃(±3℃)储存：稳定性指示参数的所有结果分别在60个月(分批B524071、B524084和B524032)和36个月(分批B524031)后基本保持不变，即，重构的纤维蛋白原的活性、pH值、渗透压、颜色和乳光保持不变。冻干物的溶解时间在5min到30min之间变化，这是可接受的。没有检测到聚集体的增加。对于所有时间点，显示重构溶液的稳定性在室温长达24小时。柠檬酸盐、海藻糖、精氨酸等赋形剂的含量几乎没有变化。所有测试的溶液都是无菌的且不含热原。36个月和60个月后，各分批内测得的残留水分含量分别为2.1％至3.0％。该值比先前低约0.2％至0.3％。
在25℃(±2℃)储存：稳定性指示参数的所有结果分别在60个月(分批B524071、B524084和B524032)和36个月(分批B524031)后基本保持不变，即，活性、pH值、渗透压、颜色和乳光基本保持不变。溶解时间在5min到30min之间变化，结果是可接受的。
稳定性研究中测试的所有样品在所有储存条件下都是无菌且无热原的。在5℃(±3℃)和25℃(±2℃)储存60个月期间，没有铝的富集。
总之，在60个月的保质期内，在5℃和25℃的保存温度，通过比较重构后立即、6h后和24h后每个预定时间点的结果，表明纤维蛋白原活性至少在重构后的前24h内保持稳定。
7.2研究B-重构药物产品的稳定性
对于分批B524071，进行稳定性研究，其中在重构后，将药物产品在2-8℃或23-27℃储存长达8周(图4)。该分批的测定残留水分为2.4％。
在2-8℃储存长达8周，蛋白水解活性或聚集体含量没有增加，并且比活性没有显著降低。在23-27℃储存时，样品也稳定至少4周。仅在8周后，比活性缓慢降低，蛋白水解活性增加。
7.3研究C-重构药品的稳定性(储存6年)
进行第三个稳定性研究，其中在限定的时间段后，即0h、6h、24h和48h，在5℃±3℃和25℃±2℃(60％ RH±5％ RH)，在注射用水中重构后，测试六年龄纤维蛋白原药物产品(分批B524032，分别在5或25℃储存超过六年)的活性。结果示于图5。
在预定的时间点后进行取样后的微生物测试，以揭示重构期间的微生物污染。没有样品显示微生物污染。所有样品的pH值为6.9。所有样品的乳光和颜色均相同。
结论是，即使干燥药物产品储存六年(72个月)后，重构的药物产品也没有表现出纤维蛋白原活性的损失。此外，即使在5℃和25℃的48小时后，重构的药物产品仍然稳定。所有测试的参数均已显示在规格的目标范围内，重构后直接和此后的所有测试的时间点都是。仅针对参数“总蛋白”、“聚集体”和“亚可见颗粒”观察到轻微波动。这种高稳定性是令人惊讶的，在没有稳定因子(例如大量的白蛋白)的情况下更是如此，如本文所述。
实施例8-重构特征
显示相对高的残留水分对药物产品的溶解度没有显著的有害影响。与其它产品相比，本发明的产品具有相似的溶解度。
对于溶解在注射用水中的本发明的产品，重构或溶解的过程通常在3-8min内完成。来自LFB SA(Courtaboeuf Cedex，法国)的在约4-5min内溶解，其中观察到强烈的泡沫形成。/>von Octapharma(朗根费尔德，瑞士)在8min后溶解。来自CSL Behring(马尔堡，德国)的/>在约10min后溶解。溶液方法本身(将水直接加入小瓶或/>中(通过过滤器加入水并过滤溶解的产品)，用手摇动或使用摇床)似乎对结果没有显著影响，其中，通常用/>方法的泡沫形成较低。
总之，根据本发明的方法的冻干和干热处理与灌装过程和制剂相结合产生病毒安全的、有活性的和高度可溶的产品。

Claims (17)

1.一种容器(10)，其包括干燥、优选冻干形式的纤维蛋白原药物产品，其具有2-5％(w/w)的残留水分含量，任选地，具有2.5-3.5％(w/w)的残留水分含量。
2.根据权利要求1所述的容器(10)，其中所述纤维蛋白原药物产品适于在水溶液、优选注射用水中重构，并且其中由所述药物产品的1g纤维蛋白原的所述重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过6000个具有10-100μm尺寸的SVP和不超过600个具有25-100μm尺寸的SVP。
3.一种容器(10)，其包括干燥、优选冻干形式的纤维蛋白原药物产品，其中所述纤维蛋白原药物产品适于在水溶液、优选注射用水中重构，并且其中由所述药物产品的1g纤维蛋白原的所述重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过6000个具有10-100μm尺寸的SVP和不超过600个具有25-100μm尺寸的SVP。
4.一种容器(10)的分批，所述容器(10)包括干燥、优选冻干形式的纤维蛋白原药物产品，其中，对于来自所述分批的至少10个容器(10)，所述纤维蛋白原药物产品适于在水溶液、优选注射用水中重构，并且其中由所述药物产品的1g纤维蛋白原的所述重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过6000个具有10-100μm尺寸的SVP和不超过600个具有25-100μm尺寸的SVP。
5.根据权利要求3-4中任一项所述的包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)或包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)的分批，其中所述纤维蛋白原药物产品具有2-5％(w/w)、优选2.5-3.5％(w/w)的残留水分含量。
6.根据前述权利要求中任一项所述的包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)或包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)的分批，其包括
a)聚山梨醇酯，优选聚山梨醇酯80，
b)任选地，填充剂，优选海藻糖，
c)任选地，氨基酸，优选精氨酸和/或
d)任选地，盐，优选氯化钠、柠檬酸钠或其组合，
其中所述药物产品更优选地包括聚山梨醇酯80、海藻糖、精氨酸、钠、氯化物、柠檬酸盐和残留水分。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)或包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)的分批，其中所述重构是在20g/L的浓度。
8.根据权利要求2-7中任一项所述的包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)或包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)的分批，其包括，以20g/L纤维蛋白原重构时，少于0.5g/L白蛋白且无蔗糖或谷氨酸。
9.根据前述权利要求中任一项所述的包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)或包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)的分批，其中所述纤维蛋白原药物产品适于在水溶液、优选注射用水中重构，并且其中由所述药物产品的1g纤维蛋白原的所述重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过3500个具有10-100μm尺寸的SVP和不超过35个具有25-100μm尺寸的SVP，
其中，任选地，所述纤维蛋白原药物产品适于在水溶液、优选注射用水中重构，并且其中由所述药物产品的1g纤维蛋白原的所述重构产生的纤维蛋白原溶液包括不超过2500个或更少具有10-100μm尺寸的SVP和不超过30个或更少具有25-100μm尺寸的SVP。
10.根据前述权利要求中任一项所述的包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)或包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)的分批，其在2-25℃稳定至少6个月，优选至少5年。
11.根据前述权利要求中任一项所述的包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)或包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)的分批，其包括少于20％的聚集体。
12.一种用于生产根据前述权利要求中任一项所述的包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)的方法，其包括以下步骤：
a)无菌过滤纤维蛋白原药物物质的本体溶液，
b)在接收罐(6)中接收无菌过滤的本体溶液，所述接收罐(6)任选地包括具有搅拌装置(8)的搅拌器(7)，
c)任选地，当搅拌装置(8)浸没在所述本体溶液中时，搅拌所述接收罐(6)中的所述本体溶液，
d)以预定量的所述溶液灌装容器(10)，
e)将所述容器(10)中的所述溶液冻干以获得冻干的药物产品，
f)以干热处理所述冻干的药物产品，
g)任选地，包装包括所述药物产品的所述容器(10)。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述接收罐(6)具有50-150L的体积和圆柱形形式，并且所述搅拌装置(8)是固定到以至多150rpm旋转的中心驱动轴的搅拌叶片(或棒)，其中搅拌时间为至多1小时，任选地约5min，
其中，优选地，步骤c)中的搅拌为至多10min并且其中所述本体溶液在步骤d)期间不搅拌。
14.根据权利要求12或13中任一项所述的方法，其中所述冻干包括以下步骤：
a)在-29℃或更低冷冻至少4h，优选-50℃或更低，
b)在-10℃或更低和至少40μbar(4Pa)初次分步干燥，其中优选地，温度在每步中增加，始于低于-25℃和至少200μbar(20Pa)，
c)在17至23℃二次干燥至少2小时，
其中冻干后的所述残留水分含量为2-5％(w/w)，
其中所述冻干任选地包括
a)在-52℃或更低冷冻8h或更久，
b)初次分步干燥，第一步在约-36℃、在约280μbar(28Pa)进行约48h，第二步在约-23℃、在约70μbar(7Pa)进行约40h，并且第三步在约-10℃、在约40μbar(4Pa)进行约78h，
c)在约20℃、在约10μbar(1Pa)二次干燥约3-4h。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中使用干热的处理包括将所述药物产品加热至100℃+/-1.5℃持续30+/-3min，任选地在蒸汽高压釜中。
16.根据权利要求1-11中任一项所述的包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)或包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)的分批，其由根据权利要求12-14中任一项所述的方法可获得。
17.根据权利要求1-11或16中任一项所述的包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)或包括纤维蛋白原药物产品的容器(10)的分批，用于纤维蛋白原缺乏症的治疗。
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