CN116715751A - 一种人血管性血友病因子/人凝血因子ⅷ复合物干热处理稳定剂及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的干热处理稳定剂，它是由如下原料组成：枸橼酸钠0.03‑0.05摩尔份、氯化钠0.12‑0.15摩尔份、盐酸精氨酸20‑40重量份。本发明稳定剂在80℃，72小时的干热灭活时，保持对病毒的灭活作用同时有效维持人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的活性。含有本发明干热处理稳定剂的人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物制剂质量符合规定，稳定性好，可常温保存和运输，是一种新的、安全有效、成本低廉的人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物制剂。
Description
技术领域
本发明属于血液制品加工领域，具体涉及一种人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物干热处理稳定剂及其用途。
背景技术
人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物属于血液制品，是由健康人血浆分离的冷沉淀为原料，经纯化和病毒灭活而成，是用于血友病A和血管性血友病的预防和治疗的一种复合因子，其中小分子量(约260KD)部分即人凝血因子Ⅷ可纠正血友病A的凝血异常，用于血友病A患者出血的预防和治疗；大分子量部分为血管性血友病因子，主要功能有：1)与血小板膜糖蛋白(GP)IbⅨ-V复合物及内皮下胶原结合，介导血小板黏附至血管损伤部位；2)作为人凝血因子Ⅷ的载体，具有稳定人凝血因子Ⅷ的作用，主要用于各型血管性血友病患者出血的预防和治疗。
由于人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物不稳定，分离纯化时需要加入稳定剂，使产品既能耐受冻干及干热处理，又不影响干热处理的病毒灭活效果。但目前还没有针对人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的稳定剂的研究。CN201610077438.9仅公开了一种血管性血友病因子的保护液，由于其未进行病毒灭活的耐受研究，导致无法实际应用于需在冻干后进行干热病毒灭活处理以除去可能残留的血浆传播病毒的血液制品中。CN 201210468069.8仅公开了对人凝血因子Ⅷ的稳定剂配方，未论证该配方对血管性血友病因子的保护效果，且该稳定剂配方含人血白蛋白，产品成本高。CN201210060299.0公开的人凝血因子Ⅷ与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂，在80℃干热处理过程中对人凝血因子Ⅷ的保护效果欠佳，人凝血因子Ⅷ的活性回收率不到35％，不适用于该产品实际生产。CN202111231245.1公开的血源人凝血因子Ⅷ/血管性血友病因子复合物的稳定剂配方，仅被验证了100℃干热处理30分钟的灭活方式下对人凝血因子Ⅷ/血管性血友病因子复合物保护效果，而对于实际生产中对病毒灭活效果更好的80℃处理72小时的保护效果未被验证，也无法应用于血液制品的生产。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的干热处理稳定剂，它是由如下配比的成分组成：枸橼酸钠0.005-0.015摩尔份、氯化钙0.0005-0.0015摩尔份，盐酸精氨酸30-50重量份。
进一步地，它由如下配比的成分组成：枸橼酸钠0.01摩尔份、氯化钙0.001摩尔份、盐酸精氨酸40重量份。
本发明还提供了一种前述的干热处理稳定剂在制备人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物制剂中的用途。
本发明还提供了一种人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物制剂，它包括前述的干热处理稳定剂和人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物；所述人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物与干热处理稳定剂中枸橼酸钠、氯化钙和盐酸精氨酸的质量摩尔比为1mg：0.005～0.02mol：0.0005～0.003mol：21～63mg。
进一步地，所述人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物与干热处理稳定剂中枸橼酸钠、氯化钙和盐酸精氨酸的质量摩尔比为1mg：0.01mol：0.001mol：40mg。
进一步地，所述人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物是通过如下方法制得：
取新鲜冰冻血浆制备的冷沉淀的溶液吸附剂除杂后进行病毒灭活，采用离子交换层析纯化即得。
本发明最后提供了一种前述的人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)取新鲜冰冻血浆，融化，离心，得冷沉淀，加缓冲液溶解，溶解液加吸附剂吸附除杂，过滤，得澄清液；
(2)取步骤1)澄清液，采用S/D法灭活，再采用柱层析纯化；
(3)取步骤2)所得纯化后的溶液，用含有前述干热处理稳定剂的缓冲液超滤透析，除菌、冻干，干热处理，即得。
进一步地，步骤(1)所述的缓冲液为氨丁三醇水溶液；所述的吸附剂为氢氧化铝和聚乙二醇；
步骤(2)所述S/D法灭活是用有机溶剂/去污剂混合物灭活病毒，所述有机溶剂为磷酸三丁酯，所述去污剂为聚山梨酯80；所述的柱层析是离子交换层析；
步骤(3)所述除菌是以膜过滤法除菌；所述干热处理的温度为80～87℃，时间72小时以上。
进一步地，步骤(1)所述缓冲液为0.02M氨丁三醇水溶液；所述氢氧化铝的添加量为每kg冷沉淀添加10g，所述聚乙二醇的添加量为终浓度3.5％；
步骤(2)所述S/D法灭活是添加聚山梨酯80至浓度1％，磷酸三丁酯至浓度0.3％，在温度25℃±1℃灭活6小时；所述离子交换层析的条件为以层析缓冲液调整不同盐浓度获得层析洗脱液；所述层析缓冲液为枸橼酸缓冲液。
步骤(3)所述除菌是用0.2um膜过滤除菌；所述干热处理是80℃下处理72小时。
进一步地，步骤(3)所述透析使用的缓冲液为枸橼酸缓冲液。
本发明以特定成分及用量组成的干热处理稳定剂保护人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物，使之在用于80℃，72小时干热处理时，既可以有效维持人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的活性，又不影响干热处理的病毒灭活效果。本发明人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物制剂制备方法简便，稳定性好，纯度高，安全有效，成本低，能进行规模化制备，可常温保存和运输，具有良好的临床应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料与设备均为已知产品，可通过市售购买获得。
实施例1、本发明人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的制备
1.初步纯化
I.取新鲜冰冻血浆，融化，离心，得冷沉淀，加缓冲液0.02M氨丁三醇注射用水溶液溶解，得到含人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的溶解液；
II.取溶解液，加冷沉淀重量1/100的氢氧化铝，再加聚乙二醇至浓度3.5％进行吸附处理；
III.吸附后溶液离心，取上清过滤，得澄清液；
2.病毒灭活
取澄清液，采用S/D法对病毒灭活，具体为澄清液添加聚山梨酯80至浓度1％，磷酸三丁酯至浓度0.3％，在温度25℃±1℃灭活6小时；
3.层析纯化
灭活后澄清液采用离子交换层析纯化，具体为澄清液上样于以DEAE 650M为填料的层析柱，以枸橼酸缓冲液洗脱，通过改变缓冲液的氯化钠盐浓度调整离子强度(即分别用含0.1mol/L、0.125mol/L、0.3mol/L氯化钠盐的枸橼酸缓冲液洗脱，收集含0.3mol/L氯化钠盐的枸橼酸缓冲液)，收集得到含人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的洗脱液；
4.配方
取含人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的洗脱液，检测蛋白浓度，其中人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物浓度为1mg/mL，再用含0.01M枸橼酸钠、0.001M氯化钙、40mg/mL盐酸精氨酸的枸橼酸缓冲液进行超滤透析，超滤完成后，用0.2um膜过滤除菌、冻干。
5.病毒灭活
冻干后制剂采用80℃处理72小时的方式对病毒灭活。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、本发明的配方筛选试验
1.以5-20mmol/L枸橼酸钠、0.5-3mmol/L氯化钙为基础，21-63mg/ml盐酸精氨酸，按照实施例1制备方法开展配方组合实验；
1.1配方优劣的判断指标1为本复合物冻干及干热后外观有无塌陷或萎缩，《中国药典》规定：应为乳白色疏松体，复溶后应为澄明溶液，可带轻微乳光。
配方优劣的判断指标2为本复合物复溶时间，《中国药典》规定：应于30分钟内完全溶解。
配方优劣的判断指标3为本复合物的人凝血因子Ⅷ活性，《中国药典》规定：应为标识量的80-140％，应用于本复合物为16-28IU/ml。
配方优劣的判断指标4为本复合物的人血管性血友病因子活性，《中国药典》现没有该项规定，参照《欧洲药典》标准，应为标识量60-140％，应用于本复合物为24-56IU/ml。
1.2配方组合试验结果见表1。
表1.配方组合试验结果
从上述表1可以看出，以本发明配方4作为人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物稳定剂，再进行80℃，72小时干热处理，得到的人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物制剂(实施例1)外观、复溶时间和人凝血因子Ⅷ活性均符合《中国药典》要求，人血管性血友病因子活性符合《欧洲药典》要求，其中复溶时间远超过《中国药典》规定。
2.与申请号201610077438.9中的稳定剂体系对比：
参照实施例1的制剂制备方法，仅将稳定剂替换为如下体系：
1)配方A(申请号201610077438.9配方)：每L缓冲液体系含2.94g(10mmol/L)枸橼酸钠，25g氯化钠，0.111g(1mmol/L)氯化钙，30g甘氨酸，2g盐酸赖氨酸，人血白蛋白8g；
2)配方B(本发明配方)：10mmol/L枸橼酸钠、1mmol/L氯化钙，40mg/ml盐酸精氨酸；
分装冻干后采用80℃和100℃两种方法分别进行干热，得到的结果如表2：
表2本发明配方在不同干热处理条件下对产品质量的影响比较
从表2可见，专利CN201610077438.9中的稳定剂体系由于含有甘氨酸和较高的氯化钠，其冻干后外观虽然合格，但是经过80℃，72小时干热处理后，产品外观萎缩，且产品复溶时间较长。
实验例2、本发明的病毒灭活效果
取实施例1的人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物，进行80℃，72小时干热病毒灭活效果检测，结果见表3。
表3.病毒灭活验证结果(n＝3)
| 指示病毒 | HIV | PRV | Sindbis | EMCV |
| 灭活效果 | ＞4.0log | ＞4.0log | ＞4.0log | ＞4.0log |
从表3可以看出，本发明人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物制剂的病毒灭活效果＞4.0log，完全达到国家规定标准。
实验说明本发明干热处理稳定剂在保护制品质量的同时，不会影响干热处理对病毒的灭活作用，本发明的灭活滴度＞4.0log。
实验例3、本发明制剂的稳定性
取实施例1的人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物制剂，分别考察在2-8℃(常规保存条件)、25℃(常温保存条件)和40℃(加速稳定性)保存条件下的稳定性。
综合《中国药典》和《欧洲药典》规定，人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的复溶时间应不超过30分钟，水分含量不超过3％，人凝血因子Ⅷ活性应为16-28IU/ml，人血管性血友病因子活性应为24-56IU/ml。
结果见表4，表5、表6。
表4.2-8℃稳定性试验结果(n＝3)
由表5可知，2-8℃条件下，人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物保存12个月，其复溶时间、水分、人血管性血友病因子活性和人凝血因子Ⅷ活性均保持在较好水平，各项指标无明显衰减。
表5.25℃常温保存稳定性试验结果(n＝3)
由表5可知，25℃条件下，本发明人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物保存12个月，其复溶时间、水分、人凝血因子Ⅷ和血管性血友病因子活性均保持在较好水平，各项指标无明显衰减，符合本产品质量要求。
表6.40℃加速稳定性试验结果(n＝3)
由表4可知，40℃条件下，本发明人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物保存6个月，其复溶时间、水分、人凝血因子Ⅷ和血管性血友病因子活性均保持在较好水平，各项指标无明显衰减，符合本产品质量要求。
上述结果充分说明本发明的稳定剂配方能保证人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ制剂稳定性优异。
综上，本发明人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物干热处理稳定剂适于80℃，72小时的干热灭活方式，既能有效维持人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的活性指标，又不会影响干热病毒处理对病毒的灭活作用，使用氨基酸种类少，用量少，成本低廉，显著优于现有的人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物制剂的干热处理稳定剂。本发明人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物制剂外观符合规定，在常温保存条件和高温条件下的稳定性好，是一种新的、安全有效、成本低廉的人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物制剂，具有良好的工业应用前景。
Claims (10)
1.一种人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的干热处理稳定剂，其特征在于，它是由如下配比的成分组成：枸橼酸钠0.005-0.015摩尔份、氯化钙0.0005-0.0015摩尔份，盐酸精氨酸30-50重量份。
2.如权利要求1所述的干热处理稳定剂，其特征在于，它由如下配比的成分组成：枸橼酸钠0.01摩尔份、氯化钙0.001摩尔份、盐酸精氨酸40重量份。
3.权利要求1或2所述的干热处理稳定剂在制备人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物制剂中的用途。
4.一种人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物制剂，其特征在于，它包括权利要求1或2所述的干热处理稳定剂和人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物；所述人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物与干热处理稳定剂中枸橼酸钠、氯化钙和盐酸精氨酸的质量摩尔比为1mg：0.005～0.02mol：0.0005～0.003mol：21～63mg。
5.如权利要求4所述的人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物制剂，其特征在于，所述人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物与干热处理稳定剂中枸橼酸钠、氯化钙和盐酸精氨酸的质量摩尔比为1mg：0.01mol：0.001mol：40mg。
6.如权利要求4或5所述的人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物制剂，其特征在于，所述人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物是通过如下方法制得：
取新鲜冰冻血浆制备的冷沉淀的溶液吸附剂除杂后进行病毒灭活，采用离子交换层析纯化即得。
7.权利要求4-6任一项所述的人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取新鲜冰冻血浆，融化，离心，得冷沉淀，加缓冲液溶解，溶解液加吸附剂吸附除杂，过滤，得澄清液；
(2)取步骤1)澄清液，采用S/D法灭活，再采用柱层析纯化，得人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物溶液；
(3)取步骤2)所得人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物溶液，用含有权利要求1～3任一项所述干热处理稳定剂的缓冲液超滤透析，除菌、冻干，干热处理，即得。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的缓冲液为氨丁三醇水溶液；所述的吸附剂为氢氧化铝和聚乙二醇；
步骤(2)所述S/D法灭活是用有机溶剂/去污剂混合物灭活病毒，所述有机溶剂为磷酸三丁酯，所述去污剂为聚山梨酯80；所述的柱层析是离子交换层析；
步骤(3)所述除菌是以膜过滤法除菌；所述干热处理的温度为80～87℃，时间72小时以上。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述缓冲液为0.02M氨丁三醇水溶液；所述氢氧化铝的添加量为每kg冷沉淀添加10g，所述聚乙二醇的添加量为终浓度3.5％；
步骤(2)所述S/D法灭活是添加聚山梨酯80至浓度1％，磷酸三丁酯至浓度0.3％，在温度25℃±1℃灭活6小时；所述离子交换层析的条件为以层析缓冲液调整不同盐浓度获得层析洗脱液；所述层析缓冲液为枸橼酸缓冲液。
步骤(3)所述除菌是用0.2um膜过滤除菌；所述干热处理是80℃下处理72小时。
10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述透析使用的缓冲液为枸橼酸缓冲液。
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