CN114787185B - 一种凝血因子ⅷ中间品的冻存方法 - Google Patents

一种凝血因子ⅷ中间品的冻存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法，属于血液制品领域。所述凝血因子Ⅷ中间品取自凝血因子Ⅷ制剂制备过程中原液制备前或超滤浓缩前或超滤浓缩后的FⅧ浓缩液或FⅧ层析洗脱液以及它们的组合或变形。本发明还公开了上述冻存方法在制备凝血因子Ⅷ制剂、减少凝血因子Ⅷ制品杂质析出、提高凝血因子Ⅷ制品长期稳定性等方面的用途。FⅧ中间品经本发明公开的方法冻存处理，可以确保FⅧ活性维持而比活性提升，同时经后续工艺可制成符合中国药典要求的终产品。本发明公开的凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法增加了FⅧ生产工艺的灵活性，利于扩大产能、大规模生产FⅧ制剂。

Description

一种凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法
技术领域
本发明属于血液制品技术领域，具体涉及凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法，以及包含凝血因子Ⅷ中间品冻存方法的凝血因子Ⅷ制剂的制备工艺。
背景技术
凝血因子Ⅷ制剂(以下简称FⅧ制剂)是防治甲型血友病人出血的特效血液制剂。甲型血友病患者输注凝血因子Ⅷ制剂可以直接补充其血浆中的FⅧ水平，从而治疗或预防出血并改善症状。甲型血友病是一种伴性遗传疾病，人群中甲型血友病的发病率约1/5000。临床表现以关节、肌肉、内脏和深部组织自发性或轻微外伤后出血难止，常在儿童期起病，反复关节出血导致患儿逐渐出现关节活动障碍而残疾。甲型血友病患者由于凝血机制缺陷，受伤后流血不止，需要输用足量的FⅧ制剂。虽然FⅧ制剂止血效果显著，但是在体内不能持久，再次出血需要再次输注。如果采用为患者定期输注浓缩FⅧ的预防疗法，即使是重度血友病患者，也可以过上和正常人几乎一样的生活。因此，甲型血友病病人的总数虽然不多，但对FⅧ制剂的需求量却很大。
凝血因子替代治疗仍然是目前血友病最有效的急性出血的止血措施，治疗原则是早期、足量、足疗程。替代治疗剂量和疗程应考虑出血部位和出血严重程度。急性出血时要按需治疗：可选基因重组FⅧ制剂或者病毒灭活的血源性FⅧ制剂，无条件者可选用冷沉淀或新鲜冰冻血浆，但有输血传播病毒感染风险，儿童血友病应尽量避免使用。
临床使用FⅧ重组产品遇到的问题是：大剂量反复使用基因重组的高纯FⅧ，抑制物即FⅧ抑制性抗体产生风险更高(SFDA.EMEA警告重组人凝血因子Ⅷ产生抗体的风险.药物警戒快讯，2006,3(3)：187)，而FⅧ抑制性抗体很难自动清除，进而造成非控制性出血、住院率提高以及关节损害等，最终导致发病率和死亡率升高。而相对基因重组的高纯FⅧ，反复使用血源性FⅧ后产生FⅧ抑制性抗体的程度要低，尤其对于儿童甲型血友病患者。因此对于需要长期输注FⅧ的甲型血友病患者来说，血源性FⅧ抑制性抗体安全性更高，同时价格更低，医药负担更轻。因此，存在进一步开发优化血浆来源的人FⅧ产品工艺路线的需求，以满足甲型血友病患者对预防/治疗用药的可及性和临床用药的选择性。
酸沉淀法结合柱层析纯化法是制备血源性FⅧ的经典方法之一，其原理是：FⅧ具有低温不溶解性，血浆中约50％的FⅧ随冷沉淀而沉淀，以血浆冷沉淀为原料溶解液经铝凝胶吸附维生素K依赖性凝血因子，使凝血链打断，以使制造过程FⅧ不被激活而失去活性，根据纤维蛋白原(Fg)蛋白分子氨基酸残基特性，在偏酸性pH条件沉淀去除Fg，同时大部分FⅧ保留在上清液中。由于受前端纯化工艺步骤处理能力的限制，FⅧ制剂大规模生产存在困难。各血液制品企业面临的现实情况是，相比于静注人免疫球蛋白、人血白蛋白等产品，血液制品企业每批次血浆投浆量对应能获得的FⅧ成品产量有限，相比分装冻干等工艺步骤的处理能力，前端纯化工艺步骤比如原液除菌过滤前的工艺步骤的处理能力小很多。因此，FⅧ制剂的生产规模一定程度上受制于原料血浆冷沉淀制备规模和原液除菌过滤前中间品的制备规模，但是血液制品企业又无法简单地通过加大投浆量来解决上述问题。原因在于，FⅧ的生产线是基于人免疫球蛋白、人血白蛋白等重要血液制品的生产线开发的，因此血液制品企业每批次投浆量对应能获得的FⅧ成品产量有限；对于血液制品企业来说，生产线建成后，每批次的投浆量也即固定，未经药品监督管理部门的批准，不能随意变更生产线。通常为了扩大产能，施以平行的方式以在相同的时间内以期获得更大产能，但是这对资金、组织和基础设施都提出了更高更大的要求。综上所述，不管血液制品企业生产规模是大是小，FⅧ制剂生产工艺前后端生产规模不匹配的矛盾总是存在。
因此，一方面为了满足甲型血友病患者对预防/治疗用药的可及性和临床用药的选择性的需求，另一方面，为了解决血液制品企业扩大FⅧ产品产能难的问题，亟需开发利于大规模生产的、可灵活应用的FⅧ产品生产工艺。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明提供了一种凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法，帮助灵活实现大规模生产FⅧ制剂。
本发明是采用如下方案实现的：
一方面，本发明公开一种凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法，所述凝血因子Ⅷ中间品任选自凝血因子Ⅷ制剂制备过程中原液制备前或超滤浓缩前或超滤浓缩后的FⅧ浓缩液或FⅧ层析洗脱液以及它们的组合或变形。
当本发明所述的“FⅧ中间品”特指FⅧ层析纯化洗脱液时。进一步地，可选FⅧ肝素亲和层析纯化洗脱液或FⅧ阴离子层析纯化洗脱液。
当本发明所述的“FⅧ中间品”特指原液制备前FⅧ浓缩液时，优选原液制备前的除菌过滤前的FⅧ浓缩液；优选原液制备前的纳米膜过滤前的FⅧ浓缩液；优选原液制备前的超滤前的FⅧ浓缩液。
在一种实施方式中，本发明所述的“FⅧ中间品”的变形，可以是FⅧ层析纯化洗脱液经过透析和/或缓冲液调节浓度后的FⅧ浓缩液。进一步地，本发明所称“FⅧ中间品”还可以上述FⅧ浓缩液经超滤得到的FⅧ超滤浓缩液。进一步地，本发明所称“FⅧ中间品”还可以是上述FⅧ超滤浓缩液经缓冲液调节浓度后原液配制前的样品溶液。
在一种实施方式中，本发明所述的“FⅧ中间品”的变形，可以是FⅧ层析纯化洗脱液经过病毒灭活后的FⅧ浓缩液。
在一种实施方式中，本发明所述的“FⅧ中间品”的变形，可以是添加了FⅧ活性保护剂的层析纯化洗脱液。
进一步的，所述凝血因子Ⅷ中间品的冷冻速率不低于1℃/min，并在-15℃～-196℃的条件下储存。
进一步的，所述冷冻速率是1℃/min～10℃/min。
更进一步的，所述冷冻速率是1℃/min～3℃/min。
更进一步的，所述冷冻速率是1.5℃/min～3℃/min。
在一种具体地实施方式中，所述冷冻速率是1.5℃/min。
进一步的，所述凝血因子Ⅷ中间品在-20℃～-80℃的条件下储存。
更进一步的，所述凝血因子Ⅷ中间品在-20℃～-55℃的条件下储存。
进一步的，凝血因子Ⅷ中间品使用液氮或干冰储存。
上述凝血因子Ⅷ制剂中间品的比活性为：≥1IU/mg或≥10IU/mg或≥50IU/mg或≥70IU/mg或≥100IU/mg或≥200IU/mg或≥1000IU/mg。
所述凝血因子Ⅷ制剂中间品的溶液的pH为6.5-7.5。
另一方面，本发明提供一种包含上述凝血因子Ⅷ制剂中间品的冻存方法的凝血因子Ⅷ制剂的制备工艺。
再一方面，本发明提供一种减少凝血因子Ⅷ制品杂质析出的方法，所述方法包括在凝血因子Ⅷ制品制备过程中，按上所述冻存方法对凝血因子Ⅷ中间品进行冻存。
再一方面，本发明提供一种提高凝血因子Ⅷ制品长期稳定性的方法，所述方法包括在凝血因子Ⅷ制品制备过程中，按上所述冻存方法对凝血因子Ⅷ中间品进行冻存。
再一方面，本发明提供根据上述方法制备得到的产品。
进一步的，所述产品是FⅧ制剂或FⅧ和vWF的复合物。
本发明取得的有益技术效果：
在本发明中，将FⅧ中间品溶液在不低于1℃/min的冻存速率冻结，并在-15℃～-196℃的条件下长期冻存。试验结果证实，FⅧ中间品经本发明公开的方法冻存处理，可以确保FⅧ活性维持不变而比活性提升。进一步地，本发明的FⅧ中间品冻存方法能一定程度上提高FⅧ中间品稳定性。
冻存后的凝血因子Ⅷ制剂中间品溶液可进一步作为FⅧ后续生产工艺原液及成品制备用原料，用于制备符合2015版《中国药典》要求的合格FⅧ成品。对FⅧ成品的稳定性考察结果证明：上述FⅧ成品在2～8℃条件下冷藏，48个月内性能稳定。
综上所述，在保证FⅧ活性回收率和比活回收率不降低的前提下，在不牺牲FⅧ制剂长期保存稳定性的前提下，本发明公开的凝血因子Ⅷ制剂中间品溶液的冻存方法增加了FⅧ生产工艺的灵活性，利于扩大产能，大规模生产FⅧ制剂。
附图说明
图1为一种FⅧ成品制备工艺流程图，阴影区域为可制得本发明所称“凝血因子Ⅷ中间品”的工艺步骤。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如本领域技术人员普遍知晓的行业公知，血源FⅧ产品当前产业化生产采用的工艺或者进一步开发优化的工艺都是连续无间断进行的。因为血清中FⅧ含量甚微(0.05-0.1mg/L)，而且体外极不稳定，FⅧ制剂或纯化中间品溶液在室温条件下活性损失非常严重，所以在工业化生产规模，FⅧ制剂的生产从原料血浆冷沉淀制备开始到病毒灭活结束，所有工序必须连续无间断进行，即便在实验室级别科学家们经常为了试验方便随时冻存各纯化阶段的蛋白质样品。而且储存不同批次的纯化中间产物并将不同批次的相当量的纯化中间产物合并进行后续FⅧ制剂生产的工艺设计是不被药品监管部门认可的，因为中间品冻存再融化会引起FⅧ活性降低(Stability of von Willebrand factor and factorVIII in canine cryoprecipitate under various conditions of storage.Stokol Tet al.Res Vet Sci.(1995))，进而直接影响成品效价和质量。导致这一不利后果的可能的原因是：蛋白质溶液在冷冻过程中会形成小的冰晶和相对大的冰-液界面表面积，这会增加蛋白质分子暴露在冰-液界面的程度，从而增加蛋白质变性失活的风险；而在解冻过程中，蛋白溶液的再结晶进一步使暴露在冰-液界面的蛋白质分子面临大的表面张力或机械剪切力，从而加剧损害(Effect of freezing and thawing rates on denaturation ofproteins in aqueous solutions，Biotechnology and Bioengineering，VOL.82，NO.6，JUNE 20，2003)。
进一步地，专利文献、其他科技文献以及本领域工具书(比如刘隽湘主编的《输血疗法与血液制剂》)中公开或记载的FⅧ产品的生产工艺中，均未见对FⅧ中间品进行冻存处理这一步骤的描述或介绍。比如国内血液制品公司泰邦在专利CN108218981A中公开了一种FⅧ的制备方法，具体方法如下：以血浆冷沉淀为原料，经溶解后经酸沉淀、DEAE SephadexA-50凝胶吸附、S/D病毒灭活、TOYOPEARL DEAE-650M凝胶柱层析、超滤、半成品及成品制备得到FⅧ成品。再比如华兰生物在专利CN107880112A中公开的FⅧ的制备方法如下：以血浆冷沉淀为原料，用氨丁三醇溶液溶解后经聚乙二醇沉淀、S/D病毒灭活、ToyopearlDEAE650M凝胶柱层析、超滤、半成品及成品制备得到FⅧ成品。武汉血液制品有限公司在专利CN107337727A中公开的FⅧ的制备方法如下：以血浆冷沉淀为原料，溶解后经PEG沉淀及病毒灭活得初提原液、阴离子交换层析得精提原液、超滤透析得纯化液、冻干、干热灭活及包装得到FⅧ成品。上述血液制品公司公开的FⅧ制剂的生产工艺均不包括对FⅧ中间品进行冻存处理的步骤。
发明人经过长期大量生产实践发现，生产规模下，通过对FⅧ中间品冻存条件的特殊控制，可以达到FⅧ活性回收率、比活回收率基本无损失的预料不到的技术效果。同时，发明人意外观察到，上述FⅧ中间品溶液经低温冻存处理后，室温存放可见异物析出程度降低，进一步检测经冻存处理的FⅧ中间品溶液在室温存放24小时后的FⅧ:C活性大小发现，FⅧ活性损失减缓，室温稳定性显著提高。
本发明公开的FⅧ中间品的冻存方法，其冻存速率不低于1℃/min，优选1℃/min～10℃/min，较优选1℃/min～3℃/min，较优选1.5℃/min～3℃/min。当FⅧ中间品完全冻结后，冻存温度至少应能保持FⅧ中间品处于完全冻结状态。本发明公开的FⅧ中间品在上述条件下冻结后在-15℃～-196℃的条件下储存，优选-20℃～-80℃，较优选-20℃～-55℃。
在一些具体的实施方式中，FⅧ中间品冻结后使用液氮或干冰储存。
在一些实施例中，FⅧ中间品的冻存时间可以是0～24个月或更长。
在一些情况下，FⅧ中间品的比活性(IU/mg)≥1IU/mg，在另一些情况下，FⅧ中间品的比活性(IU/mg)≥10IU/mg或≥50IU/mg或≥70IU/mg或≥100IU/mg或≥200IU/mg或≥1000IU/mg。
在一些实施例中，FⅧ制剂中间品的溶液的pH为6.5-7.5。在一些更具体地实施例中，FⅧ中间品的缓冲液可以是含一种或多种氨基酸的缓冲液，缓冲液任选枸橼酸钠缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液等。因为FⅧ与血管性血友病因子复合物的等电点为5.5～6.0，当pH在6.5～7.5时FⅧ与血管性血友病因子复合物带负电，适合通过阴离子层析进一步精制FⅧ；同时pH为6.5-7.5的偏中性条件有助于保护FⅧ活性。
进一步地，本发明公开的FⅧ中间品的冻存方法，其冻存效果受其他前序工艺步骤的影响较小。冻存后的FⅧ中间品融化后，再经过滤、半成品配制、除菌、分装、冻干、干热灭活等工艺步骤，可制备得到符合2015版《中国药典》规定的合格FⅧ制剂。
本发明所称的“FⅧ制剂”也可称之为“抗血友病球蛋白制剂”。
本发明所称的“FⅧ制剂的制备工艺”为FⅧ制剂的整个生产工艺。本发明实施例所要突出的FⅧ中间品的冻存方法可以是FⅧ制剂整体生产工艺中的一个环节。
现有技术中，FⅧ生产工艺从血浆冷沉淀开始，经凝胶吸附、病毒灭活以及层析等多个步骤制得FⅧ中间产品，FⅧ中间产品进一步经配制分装后进行冻干或其他病毒灭活工艺即得FⅧ制剂成品。通常包括多个具体步骤：制备血浆冷沉淀，将冷沉淀溶解，得溶解液；将溶解液通过调节pH进行酸沉淀，并滤去沉淀部分，得上清液；将上清液进行凝胶吸附；将凝胶吸附后的流穿液进行病毒灭活、层析、超滤、除菌等工艺步骤，并经分批、分装、冻干、干热病毒灭活等步骤最终制得FⅧ成品。
为实现本发明，一种基本的FⅧ制备工艺路线为：制备血浆冷沉淀；将血浆冷沉淀溶解，得溶解液；将溶解液通过调节pH进行预沉淀，并滤去沉淀部分，得上清液；将上清液通过平衡过的凝胶吸附；将凝胶吸附后得的上清液经进行病毒灭活、层析、超滤、除菌等工艺步骤，并经分批、分装、冻干，干热病毒灭活等步骤最终制得Ⅷ成品。
为实现本发明，一种可选基本的FⅧ制备工艺路线为：制备血浆冷沉淀；将血浆冷沉淀溶解，得溶解液；将溶解液通过平衡过的凝胶吸附；将凝胶吸附后得的上清液经进行病毒灭活、层析、超滤、除菌等工艺步骤，并经分批、分装、冻干，干热病毒灭活等步骤最终制得Ⅷ成品。
为实现本发明，一种可选的基本的FⅧ制备工艺路线为：制备血浆冷沉淀；Tris缓冲液溶解冷沉淀，经聚乙二醇沉淀后，0.3％磷酸三丁酯和1％Tween 80处理6h以灭活脂包膜病毒，然后经DEAE 650M层析纯化。绝大部分杂蛋白和磷酸三丁酯及Tween80随流穿液直接流穿，洗脱液即为人凝血因子Ⅷ中间品(参考文献《人凝血因子Ⅷ原液生产工艺放大可行性研究》公开)。
除非特别说明，如图1所示，本发明所称的“FⅧ中间品”是指原液制备前或超滤浓缩前或超滤浓缩后的FⅧ浓缩液，或FⅧ层析纯化洗脱液。
当本发明所称的“FⅧ中间品”特指FⅧ层析纯化洗脱液时，可选FⅧ肝素亲和层析纯化洗脱液或FⅧ阴离子层析纯化洗脱液。优选FⅧ阴离子层析纯化洗脱液。因为FⅧ与血管性血友病因子复合物的等电点为5.5～6.0，当pH在6.5～7.5时复合物带负电；同时偏中性条件有助于保护FⅧ活性，所以较优选阴离子层析纯化FⅧ。通常的可选的阴离子层析介质包括不限于：DEAE Sephadex A-50、TOYOPEARL DEAE-650M、DEAE 650、Q-sepharose-FF、DEAE-SAPHROSEFF、DEAE-FractogelTSK650M、DEAE SepharoseTSK650M、DEAESepharoseFF、CaptoDEAE、QsepharoseFF、CaptoQ及QSepharoseHP等。如果需要的话，可以使用阴离子交换层析膜替代阴离子交换色谱基质。市售的阴离子交换膜包含，但不限于，来自Sartorius的SartobindTM Q，来自Pall Technologies的MustangTM Q，来自Millipore的InterceptTMQ。
当本发明所称的“FⅧ中间品”特指原液制备前FⅧ浓缩液时，优选原液制备前的除菌过滤前的FⅧ浓缩液，优选原液制备前的纳米膜过滤前的FⅧ浓缩液。
在一种实施方式中，所述FⅧ中间品可以是通过血浆冷沉淀制备并随后用Al(OH)3凝胶吸附、离心去除不容物上清液经DEAE Sephadex A-50凝胶吸附纯化得到的FⅧ层析纯化洗脱液。
在一种实施方式中，所述FⅧ中间品可以是通过血浆冷沉淀制备并随后通过酸沉淀、DEAE Sephadex A-50凝胶吸附、离心去除不容物上清液经TOYOPEARL DEAE-650M凝胶吸附纯化得到的FⅧ层析纯化洗脱液。
在一种实施方式中，所述FⅧ中间品可以是通过血浆冷沉淀制备并随后用Al(OH)3凝胶吸附、离心去除不容物上清液经S/D病毒灭活、DEAE Sephadex A-50凝胶吸附纯化得到的FⅧ层析纯化洗脱液。
在一种实施方式中，所述FⅧ中间品可以是通过血浆冷沉淀制备并随后用中性pH缓冲液溶解后用的Al(OH)3凝胶(W/V)吸附、离心去除不容物、上清液经S/D处理、再经阴离子凝胶(Fractogel TMAE 650)吸附纯化、洗脱液在糖和氨基酸保护下63℃加热10hr再次经第二次阴离子凝胶柱层析去除稳定剂所得FⅧ层析纯化洗脱液。
在一种实施方式中，所述FⅧ中间品可以是通过血浆冷沉淀制备并随后用Al(OH)3凝胶吸附、甘氨酸沉淀、NaCl沉淀、缓冲液调节浓度后原液配制前的样品溶液。
在一种实施方式中，所述FⅧ中间品可以是通过血浆冷沉淀制备并随后用PEG分级沉淀、肝素亲和凝胶(比如Heparin6FF)吸附纯化得到的FⅧ层析纯化洗脱液。
进一步的，本发明所称“FⅧ中间品”还可以是上述FⅧ层析纯化洗脱液经过透析和/或缓冲液调节浓度后的FⅧ浓缩液。进一步地，本发明所称“FⅧ中间品”还可以上述FⅧ浓缩液经超滤得到的FⅧ超滤浓缩液。进一步地，本发明所称“FⅧ中间品”还可以是上述FⅧ超滤浓缩液经缓冲液调节浓度后原液配制前的样品溶液。
一种本发明所称的“FⅧ中间品的变形”可以是FⅧ层析纯化洗脱液经过病毒灭活后的FⅧ浓缩液。也可以是添加了FⅧ活性保护剂的层析纯化洗脱液。所述的FⅧ活性保护剂任选糖类、氨基酸类。
本实施例中所述“FⅧ中间品”还可以是其他可以实现FⅧ制剂制备的工艺路线中所得到的原液制备前或超滤浓缩前或超滤浓缩后的FⅧ浓缩液或FⅧ层析纯化洗脱液，在此不一一穷举。
以下结合具体的实施例对FⅧ中间品的冻存方法加以说明。
实施例1
发明人首先考察了FⅧ层析纯化洗脱液液氮速冻、低温(-196℃至-15℃)储存前后FⅧ:C活性回收率的变化。
FⅧ层析纯化洗脱液制备：以血浆冷沉淀为原料，溶解后经酸沉淀、DEAE SephadexA-50凝胶吸附、S/D病毒灭活、TOYOPEARL DEAE-650M凝胶柱层析制备得到FⅧ层析纯化洗脱液。检测FⅧ层析纯化洗脱液的FⅧ:C活性大小。
将制得的FⅧ层析纯化洗脱液分成多个平行样品在液氮中冻结，并分别在-196℃、-80℃、-60℃、-40℃、-20℃、-15℃储存12个月后，室温水浴融化，检测FⅧ:C活性大小，计算活性回收率。
FⅧ:C活性回收率检测结果如表1所示：FⅧ层析纯化洗脱液液氮冻结后低温(-196℃至-15℃)保存12个月，活性无损失。
表1实施例1FⅧ纯化洗脱液冻存前后FⅧ:C活性回收率
发明人将上述6个经过冻存的FⅧ纯化洗脱液样品室温水浴融化后超滤，室温放置2小时后，肉眼观察意外发现无可见异物析出(可见异物检查法参考2015版2015版《中国药典》进行)。而此前，发明人多次试验观察到，不经冻存处理的FⅧ层析纯化洗脱液样品超滤后如果在室温放置2个小时，可肉眼明显地观察到可见异物析出。
进一步地，发明人将上述样品继续在室温放置至24个小时，检测FⅧ:C活性大小，以考察FⅧ:C活性回收率的变化。
检测结果如表2显示：与未经液氮冷冻低温储存的样品相比，FⅧ纯化洗脱液经低温冻存处理后，室温存放24小活性损失显著降低，稳定性提高。
表2实施例1FⅧ纯化洗脱液低温冻存后室温放置24小时活性回收率
进一步地，发明人考察了不同冷冻条件对FⅧ纯化洗脱液/FⅧ超滤浓缩液活性回收率、室温条件下的稳定性的影响以及对最终制得的FⅧ成品质量的影响。
实施例2
FⅧ层析纯化洗脱液制备：以血浆冷沉淀为原料，溶解后经酸沉淀、DEAE SephadexA-50凝胶吸附、S/D病毒灭活、TOYOPEARL DEAE-650M凝胶柱层析制备得到FⅧ层析纯化洗脱液。检测FⅧ层析纯化洗脱液的蛋白含量及FⅧ:C活性大小，计算得到FⅧ层析纯化洗脱液的比活性为(IU/mg)＝257IU/mg。
FⅧ层析纯化洗脱液冻存：以1℃/min的速率冻结，并在-30℃～-45℃冻存12个月。
FⅧ成品制备：室温水浴融化冻存的FⅧ层析纯化洗脱液，将融化后的FⅧ层析纯化洗脱液超滤、除菌过滤。除菌过滤后按成品规格配制，并加入稳定剂100mM的甘氨酸。分装、冻干，密封出柜，冻干制品干热灭活(100℃×30min或80℃×72h)后包即得FⅧ成品。
超滤透析液为：50mmol/L氯化钠，20mmol/L枸橼酸钠，1mmol/L氯化钙，7g/L白蛋白，35g/L盐酸精氨酸；pH 7.0。
实施例3
FⅧ层析纯化洗脱液制备：以血浆冷沉淀为原料，用氨丁三醇溶液溶解后经聚乙二醇沉淀、S/D病毒灭活、ToyopearlDEAE 650M凝胶柱层析制备得到FⅧ层析纯化洗脱液。检测FⅧ层析纯化洗脱液的蛋白含量及FⅧ:C活性大小，计算得到FⅧ层析纯化洗脱液的比活性为(IU/mg)＝151IU/mg。
FⅧ层析纯化洗脱液冻存：以10℃/min的速率冻结，并在-60℃～-45℃冻存12个月。
FⅧ成品制备：室温水浴融化冻存的FⅧ层析纯化洗脱液，将融化后的FⅧ层析纯化洗脱液超滤、除菌过滤。除菌过滤后按成品规格配制，并加入稳定剂10mM的甘氨酸。分装、冻干，密封出柜，冻干制品干热灭活(100℃×30min或80℃×72h)后包即得FⅧ成品。
超滤透析液为：50mmol/L氯化钠，6mmol/L枸橼酸钠，1mmol/L氯化钙，6.7g/L白蛋白，35g/L盐酸精氨酸；pH 6.5。
实施例4
FⅧ层析纯化洗脱液制备：以血浆冷沉淀为原料，溶解后经PEG沉淀、S/D病毒灭活、ToyopearlDEAE 650M凝胶柱层析制备得到FⅧ层析纯化洗脱液。检测FⅧ层析纯化洗脱液的蛋白含量及FⅧ:C活性大小，计算得到FⅧ层析纯化洗脱液的比活性为(IU/mg)＝85IU/mg。
FⅧ层析纯化洗脱液冻存：以1.5℃/min的速率冻结，干冰冻存12个月。
FⅧ成品制备：室温水浴融化冻存的FⅧ层析纯化洗脱液，将融化后的FⅧ层析纯化洗脱液超滤、除菌过滤。除菌过滤后按成品规格配制，并加入稳定剂20mM的甘氨酸。分装、冻干，密封出柜，冻干制品干热灭活(100℃×30min或80℃×72h)后包即得FⅧ成品。
超滤透析液为：50mmol/L氯化钠，20mmol/L枸橼酸钠，1mmol/L氯化钙，7g/L白蛋白，35g/L盐酸精氨酸；pH 7.2。
实施例5
FⅧ层析纯化洗脱液制备：以血浆冷沉淀为原料溶解后，经DEAE Sephadex A-50凝胶吸附、S/D病毒灭活、TOYOPEARL DEAE-650M凝胶柱层析制备得到FⅧ层析纯化洗脱液。检测FⅧ层析纯化洗脱液的蛋白含量及FⅧ:C活性大小，计算得到FⅧ层析纯化洗脱液的比活性为(IU/mg)＝54IU/mg。
FⅧ层析纯化洗脱液冻存：以3℃/min的速率冻结，并在-20℃～-30℃冻存12个月后，室温水浴融化FⅧ层析高纯度洗脱液。
FⅧ成品制备：室温水浴融化冻存的FⅧ层析纯化洗脱液，将融化后的FⅧ层析纯化洗脱液超滤、除菌过滤。除菌过滤后按成品规格配制，并加入稳定剂200mM的甘氨酸。分装、冻干，密封出柜，冻干制品干热灭活(100℃×30min或80℃×72h)后包即得FⅧ成品。
超滤透析液为：50mmol/L氯化钠，20mmol/L枸橼酸钠，1mmol/L氯化钙，7g/L白蛋白，35g/L盐酸精氨酸；pH 7.0。
实施例6～9
实施例6～9的所采用的冻存样品分别取自实施例1～4FⅧ纯化洗脱液的超滤浓缩液。超滤浓缩液的制取方法为，将FⅧ纯化洗脱液经过截流分子量10～30KD超滤膜透析浓缩，得到FⅧ超滤浓缩液。
其冻存条件同实施例2～5，及合批后的透析浓缩、除菌、半成品配制、分装、冻干、干热灭活步骤同实施例2～5。
超滤浓缩后的FⅧ中间品FⅧ:C值如下：
实施例6冻存条件：冻存液FⅧ:C 111IU/mL。
实施例7冻存条件：冻存液FⅧ:C 98IU/mL。
实施例8冻存条件：冻存液FⅧ:C 73IU/mL。
实施例9冻存条件：冻存液FⅧ:C 52IU/mL。
对比例1
对比例1与实施例2的区别在于：TOYOPEARL DEAE-650M凝胶柱层析制备得到FⅧ层析纯化洗脱液后直接进入FⅧ成品步骤，不包括FⅧ层析纯化洗脱液冻存步骤。
其他工艺FⅧ纯化工艺和成品制备工艺参考实施例2，制备FⅧ成品。
以下为实施例2～9FⅧ中间品冻存前后及制备得到的成品的各项指标对比。
1、不同冷冻条件对FⅧ纯化洗脱液/FⅧ超滤浓缩液活性回收率的影响
检测实施例2～9FⅧ纯化洗脱液/FⅧ超滤浓缩液冻存前后蛋白浓度及FⅧ:C活性，计算活性回收率及比活回收率。检测结果见表3。
试验结果表明：
实施例2～9的凝血因子Ⅷ中间品以1℃/min及以上的速率冻结，并在-20℃～-60℃冻存12个月后，活性回收率未见降低，FⅧ:C活性得以维持。
实施例2～9的凝血因子Ⅷ中间品以1℃/min及以上的速率冻结，并在-20℃～-60℃冻存12个月后，比活回收率未见降低，FⅧ:C比活性得到提升。
以上试验结果表明：本发明的FⅧ中间品冻存方法对FⅧ:C活性回收率、比活回收率基本无影响，可以确保FⅧ活性维持而比活性提升。
表3实施例2～9FⅧ纯化洗脱液/FⅧ超滤浓缩液冻存前后活性回收率及比活回收率
2、不同冷冻条件对FⅧ纯化洗脱液/FⅧ超滤浓缩液室温条件下的稳定性影响
将实施例2～9经过冻存处理后的FⅧ纯化洗脱液/FⅧ超滤浓缩液样品室温水浴融化后超滤，室温放置24小时后检测其FⅧ:C活性。同时，将实施例2～9未经过冻存处理的FⅧ纯化洗脱液/FⅧ超滤浓缩液超滤，室温放置24小时后检测其FⅧ:C活性。对比两组试验结果，具体见表4。
试验结果表明：FⅧ纯化洗脱液/FⅧ超滤浓缩液经实施例2～9的方法冻存处理后，室温存放24小活性损失显著降低，室温存放稳定性提高。
表4实施例2～9低温冻存处理对FⅧ纯化洗脱液室温存放活性回收率影响
3、不同冷冻条件对FⅧ纯化洗脱液/FⅧ超滤浓缩液最终制得的FⅧ成品质量的影响
按2015版《中国药典》的规定，全检实施例2～9制得的FⅧ成品的各项指标，尤其关注检测可见异物。检测结果见表5。
检测结果表明：
实施例2～9制得的FⅧ成品符合2015版《中国药典》对FⅧ制剂的各项规定，尤其是可见异物检测结果符合《中国药典》规定。实施例2～9所得FⅧ成品与对比例1所得成品质量检测结果无差异。
以上检测结果进一步证明：本发明冻存方法处理的FⅧ纯化洗脱液/FⅧ超滤浓缩液可以作为FⅧ后续生产工艺原液及成品制备用原料。
表5实施例2～9制得的FⅧ成品主要质量指标检测结果
4、实施例2～9制得的FⅧ成品长期稳定性考察
将实施例2～9制得的FⅧ成品在2～8℃条件下冷藏48个月，并按2015版《中国药典》的规定，全检FⅧ成品的各项指标。检测结果见表6。
检测结果显示：用经过冻存的FⅧ纯化洗脱液/FⅧ超滤浓缩液制备得到的FⅧ成品在2～8℃条件下冷藏，48个月内性能稳定。实施例2～9所得FⅧ成品可异物合格率优于对比例1。
实施例2～9所得FⅧ成品与对比例1所得成品质量检测结果无差异。
表6实施例2～9制得的FⅧ成品长期保存稳定性
以上试验结果证明：
FⅧ中间品经本发明公开的方法冻存处理，FⅧ活性维持而比活性提升。同时本发明的FⅧ中间品冻存方法能一定程度上提高FⅧ中间品室温存放稳定性。
用本发明公开的冻存工艺冻存后的凝血因子Ⅷ制剂中间品可用于制备合格的FⅧ成品。稳定性考察数据证明用经过冻存的FⅧ中间品制备得到的FⅧ成品在2～8℃条件下冷藏，48个月内性能稳定。
以上内容仅仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依照本发明的思路，在具体实施例方式及其应用范围上均会有所改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (16)

1.一种使凝血因子Ⅷ活性维持而比活性提升的凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法，其特征在于，所述凝血因子Ⅷ中间品任选凝血因子Ⅷ制剂制备过程中原液制备前或超滤浓缩前或超滤浓缩后的FⅧ浓缩液或FⅧ层析洗脱液以及它们的组合或变形进行冻存，
所述凝血因子Ⅷ中间品的冷冻速率是1℃/min～10℃/min，并在-20℃～-80℃的条件下储存，冻存时间为0~12个月。
2.根据权利要求1所述的使凝血因子Ⅷ活性维持而比活性提升的凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法，其特征在于，所述冷冻速率是1℃/min～3℃/min。
3.根据权利要求1所述的使凝血因子Ⅷ活性维持而比活性提升的凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法，其特征在于，所述冷冻速率是1.5℃/min～3℃/min。
4.根据权利要求1所述的使凝血因子Ⅷ活性维持而比活性提升的凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法，其特征在于，所述凝血因子Ⅷ中间品在-20℃～-55℃的条件下储存。
5.根据权利要求1所述的使凝血因子Ⅷ活性维持而比活性提升的凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法，其特征在于，所述凝血因子Ⅷ中间品使用液氮或干冰储存。
6.根据权利要求1～5任一所述的使凝血因子Ⅷ活性维持而比活性提升的凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法，其特征在于，所述凝血因子Ⅷ中间品的比活性为≥1IU/mg。
7.根据权利要求1～5任一所述的使凝血因子Ⅷ活性维持而比活性提升的凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法，其特征在于，所述凝血因子Ⅷ中间品的比活性为≥10IU/mg。
8.根据权利要求1～5任一所述的使凝血因子Ⅷ活性维持而比活性提升的凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法，其特征在于，所述凝血因子Ⅷ中间品的比活性为≥50IU/mg。
9.根据权利要求1～5任一所述的使凝血因子Ⅷ活性维持而比活性提升的凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法，其特征在于，所述凝血因子Ⅷ中间品的比活性为≥70IU/mg。
10.根据权利要求1～5任一所述的使凝血因子Ⅷ活性维持而比活性提升的凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法，其特征在于，所述凝血因子Ⅷ中间品的比活性为≥100IU/mg。
11.根据权利要求1～5任一所述的使凝血因子Ⅷ活性维持而比活性提升的凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法，其特征在于，所述凝血因子Ⅷ中间品的比活性为≥200IU/mg。
12.根据权利要求1～5任一所述的使凝血因子Ⅷ活性维持而比活性提升的凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法，其特征在于，所述凝血因子Ⅷ中间品的比活性为≥1000IU/mg。
13.根据权利要求1～5任一所述的使凝血因子Ⅷ活性维持而比活性提升的凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法，其特征在于，所述凝血因子Ⅷ中间品的溶液的pH为6.5-7.5。
14.一种包含权利要求1～13任一所述的凝血因子Ⅷ中间品的冻存方法的凝血因子Ⅷ制剂的制备工艺。
15.一种减少凝血因子Ⅷ制品杂质析出的方法，其特征在于，在凝血因子Ⅷ制品制备过程中，根据权利要求1～13任一所述的冻存方法对凝血因子Ⅷ中间品进行冻存。
16.一种提高凝血因子Ⅷ制品长期稳定性的方法，其特征在于，在凝血因子Ⅷ制品制备过程中，根据权利要求1～13任一所述的冻存方法对凝血因子Ⅷ中间品进行冻存。
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