WO2015143696A1 - 一种冷沉淀的制备方法以及用其制备凝血因子ⅷ制剂的方法 - Google Patents

一种冷沉淀的制备方法以及用其制备凝血因子ⅷ制剂的方法 Download PDF

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WO2015143696A1
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plasma
temperature
coagulation factor
preparing
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牟蕾
鲁涛
初毅波
苗松
邓红
王黔川
李伟
余伟
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成都蓉生药业有限责任公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a blood product, and more particularly to a method for preparing a cryoprecipitate and a method for preparing a blood coagulation factor ring therewith.
  • Cryoprecipation is a white precipitate in which fresh frozen plasma does not dissolve under low temperature conditions. It mainly contains components such as a loop factor, fibrinogen, von Willebrand factor (VWF), factor XIII, and fibronectin.
  • VWF von Willebrand factor
  • XIII factor XIII
  • fibronectin The raw material of the coagulation factor ring preparation.
  • the specific steps of the rapid melting centrifugation method are: taking out the fresh frozen plasma to be prepared into a cold precipitate,
  • cryoprecipitate produced by this method is small, and generally only 8.9 kg of cryoprecipitate per ton of plasma is obtained, and the content of human coagulation factor ring in the cryoprecipitate is 39.951 IU/g (see battalion Chang et al., "Human coagulation factor VIII separation and purification process research, Shandong University Master's thesis, the amount of human coagulation factor ring preparation obtained by separation and purification of cryoprecipitate is relatively small, resulting in waste of plasma resources.
  • the present invention provides a novel cryoprecipitation preparation method.
  • the method for preparing a cryoprecipitate according to the present invention comprises the following steps:
  • Filtration is carried out under conditions of a melting plasma temperature of 0 to 5 ° C to obtain a filtrate and a filter residue;
  • Step (1) The melting includes the following two steps:
  • the fresh frozen plasma is placed in the environment of 0 ⁇ 2 °C, and the plasma is heated to -10 °C ⁇ 0 °C;
  • step a the ambient temperature is 0 °C.
  • step b the method of raising the temperature is a 25 ⁇ 37 ° C water bath.
  • the filtration is filtered using a helium filter.
  • the centrifugal force of the centrifugation is 14,000 to 15900 g.
  • the centrifugation Centrifugation was performed using a high speed tube centrifuge model GQ142.
  • the method for preparing a blood coagulation factor loop of the present invention comprises the following steps:
  • step b the buffer used to dissolve the cryoprecipitate is 0.02 M Tris buffer.
  • step c the polyethylene glycol precipitation method is precipitated using 30% polyethylene glycol.
  • the gel used in the ion exchange chromatography is Toyopearl DEAE 650M, and the buffer is 0.001 M-0.05 M sodium citrate buffer.
  • the salting out method is precipitated with sodium chloride/glycine.
  • the cryoprecipitate can be prepared by the method of the invention, and 11.14 kg of cryoprecipitate can be prepared per ton of plasma, and the content of the human coagulation factor ring is 39.43 IU/g, which effectively increases the amount of cryoprecipitate obtained per unit of plasma, and also increases the unit plasma.
  • the amount of human coagulation factor ring preparation prepared has good economic benefit, makes full use of plasma resources, and has good market application prospects.
  • Model is FL-2023 ⁇ type tank filter
  • Pre-melting 2500L of fresh frozen plasma (ie 2575Kg, human coagulation factor ring is 2500, 000 IU), placed at an ambient temperature of 0 ° C, and heated to -10 ° C ⁇ 0 ° C;
  • the precipitate obtained by combining the steps (4) and the precipitate obtained in the step (5) are cold precipitates.
  • the weight of the cryoprecipitate was weighed and the amount of human coagulation factor loop in the cryoprecipitate was measured.
  • the weight of the filter residue in the step (4) is 6.18 kg
  • the content of the human coagulation factor ring is 41 IU/g
  • the weight of the filter residue in the precipitation of the step (5) is 22.5 kg
  • the content of the human coagulation factor ring is 39 IU/g
  • the cold precipitate of the present invention obtained by combining the two, the total weight was 28.68 Kg, and the content of the human coagulation factor ring in the cold precipitate was 39.43 IU/g.
  • the cold precipitate is prepared by the method of the present invention, and 11.14 kg of cold precipitate can be prepared per ton of plasma, and the content of the human coagulation factor ring is 39.43 IU/g, wherein the cold precipitate obtained by filtration is 2.4 Kg, accounting for 21.55%.
  • the content of human coagulation factor ring was 41 IU/g, and the cryoprecipitate was 8.74 Kg, accounting for 78.45%, and the content of human coagulation factor ring was 39 IU/g.
  • Example 2 Preparation of cryoprecipitate by the method of the present invention
  • Model is FL-2023 ⁇ type tank filter
  • Pre-melting 2500L of fresh frozen plasma (ie 2575Kg, the content of human coagulation factor ring is 2500, 000 IU), placed at an ambient temperature of 2 ° C, and heated to -10 ° C ⁇ 0 ° C;
  • the precipitate obtained by combining the steps (4) and the precipitate obtained in the step (5) are cold precipitates.
  • Example 1 (4) The obtained cold precipitate (filter residue) 300 g (repeated three times) and the cold precipitate (precipitate) obtained by centrifugation in Example 1 (5) (weights were 3.8 kg, 3.525 kg, respectively). 2kg)
  • the human coagulation factor loop was purified by the following methods:
  • cryoprecipitate was dissolved in 0.02 M tromethamine (Tris) buffer, precipitated with 30% polyethylene glycol, and centrifuged to obtain a supernatant;
  • Example 1 Step (4) The detection results of the cryoprecipitate obtained by filtration are as follows:
  • Example 1 Step (5) The test results of the cryoprecipitate obtained by centrifugation are shown in Table 2 below: Table 2 Recovery of human coagulation factor vm
  • Example 1 the cold precipitate obtained by the filtration of Example 1 (4) was used as a raw material to prepare a human factor VIII ultrafiltrate, and the yield was on average 39%.
  • the cryoprecipitate obtained by filtration in Example 1 (4) was used as a raw material, and 15.21 IU (39 IU/g Xlg X39%) of human coagulation factor loop ultrafiltrate was prepared per lg of cold precipitate.
  • the cryoprecipitate prepared in Example 1 of the present invention can prepare 14.46 IU (11.75 IUX 21.55% + 15.21 X 78.45%) of human coagulation factor ring preparation per lg, and the recovery rate is 36.68%.
  • Example 4 Preparation of human coagulation factor loop preparation by cold precipitation of the present invention
  • Example 1 The cold precipitate of the present invention prepared in Example 1 was 300 g, 0.02 M Tris buffer was dissolved in a cold precipitate, precipitated with 30% polyethylene glycol, and centrifuged to obtain a supernatant;
  • the cryoprecipitate was prepared by the existing method, and only 8.9 kg of cryoprecipitate was obtained per ton of plasma, and the content of the human coagulation factor loop in the cryoprecipitate was 39.951 IU/g.
  • the activity recovery rate of the obtained human factor VIII preparation was 32.02% (for details, see Ying Changyong, "Study on Separation and Purification Process of Human Coagulation Factor VIII", Master's thesis of Shandong University, 1-3 lines on page 23 and Figure 10 on page 42). Therefore, the existing method is adopted.
  • a human factor VIII preparation was prepared, and 112366 IU of human factor VIII preparation was prepared per ton of plasma.
  • the cold precipitation is prepared by the method of the present invention, and the amount of cold precipitate obtained is 2.24 kg/ton of plasma higher than the prior method, and the increase ratio is 25.17%; using the cold precipitation of the present invention as a raw material to prepare human coagulation
  • the activity recovery rate is comparable to the prior art method.
  • 47268 IU of human factor VIII preparation can be prepared per ton of plasma, and the ratio is increased by 41.51%.
  • the isolation and purification of human factor VIII is complicated, so the human factor VIII preparation is expensive.
  • domestic human factor VIII preparations The price of 200 IU / bottle is at least 200 yuan.
  • 47268 IU of human coagulation factor VIII preparation can be obtained per ton of plasma, that is, 47268 yuan can be obtained per ton of plasma, and the economic benefit can be increased.
  • the active ingredients are very sensitive, and the activity is easily lost. Therefore, the increase in yield through technical improvement means that the technicians have made great efforts.
  • the amount of cryoprecipitate prepared by the method of the invention is large, and each ton of cold precipitate can be prepared.
  • cryoprecipitate 11.14kg cryoprecipitate, the content of human coagulation factor ring in cryoprecipitate is high, 39.43IU/g, and the amount of human coagulation factor ring products is further purified and purified, and the plasma is fully utilized, which has a good market. Application prospects, suitable for industrial production.

Abstract

一种制备冷沉淀的方法，包括如下步骤：（1）融化：取新鲜冰冻血浆，升温，得温度为0〜5°C融化血浆；（2）过滤：在融化血浆温度为0〜5°C的条件下，过滤，得滤液和滤渣；（3）离心：在滤液温度为0〜5°C的条件下，离心，得沉淀；（4）合并步骤（2）得到的滤渣和步骤（3）得到的沉淀，即为冷沉淀。

Description

一种冷沉淀的制备方法以及用其制备凝血因子環制剂的方法
技术领域
本发明涉及血液制品的制备方法， 特别涉及一种冷沉淀的制备方法以及 用其制备凝血因子環的方法。
背景技术
冷沉淀是新鲜冰冻血浆在低温条件下不溶解的白色沉淀物， 主要含有第 環因子、 纤维蛋白原、 血管性血友病因子 (VWF)、 第 XIII因子以及纤连蛋白 等成分， 是制备人凝血因子環制剂的原料。
目前， 血浆的冷沉淀制备方法有两种： 快速融化离心法和虹吸法。 虹吸 法制得的冷沉淀中，人凝血因子 vm含量低， 目前通常采用快速融化离心法。
快速融化离心法的具体歩骤为： 取出待制备冷沉淀的新鲜冰冻血浆， 置
4±2°C冰箱中过夜融化或在 4±2°C水浴装置中融化； 当血浆基本融化时， 取 出血浆， 在 4±2°C的环境下离心， 离心的沉淀即为冷沉淀。 但是， 该方法制 得的冷沉淀的量较少， 通常每吨血浆仅得到 8.9kg冷沉淀， 冷沉淀中人凝血 因子環的含量为 39.951IU/g (见营长永等， "人凝血因子 VIII分离纯化工艺 研究"， 山东大学硕士学位论文）， 对冷沉淀进一歩分离纯化制得的人凝血因 子環制剂的量也比较少， 造成血浆资源的浪费。
发明内容
为了解决上述问题， 本发明提供了一种新的冷沉淀制备方法。
本发明制备冷沉淀的方法， 它包括如下歩骤：
( 1 ) 融化： 取新鲜冰冻血浆， 升温， 得温度为 0~5°C融化血浆；
(2) 过滤： 在融化血浆温度为 0~5°C的条件下， 过滤， 得滤液和滤渣；
(3 ) 离心： 在滤液温度为 0~5°C的条件下， 离心， 得沉淀；
(4) 合并歩骤 （2) 得到的滤渣和歩骤 （3 ) 得到的沉淀， 即为冷沉淀。 歩骤 （1 ) 所述融化包括如下两个歩骤：
a、 预融化： 将新鲜冰冻血浆静置于 0~2°C环境中， 使血浆升温至 -10°C~0°C ;
b、 融化： 再升温， 得 0~5°C融化血浆。
歩骤 a中， 所述环境温度为 0°C。
歩骤 b中， 所述升温的方法是 25~37°C水浴。
歩骤 （2) 中， 所述过滤采用堰式滤器过滤。
歩骤 （3 ) 中， 所述离心的离心力为 14000~15900g。 优选地， 所述离心 采用型号为 GQ142的高速管式离心机离心。
本发明制备凝血因子環的方法， 它包括如下歩骤：
a、 按照前述方法制备冷沉淀；
b、 溶解冷沉淀；
c、 用聚乙二醇沉淀法沉淀， 离心， 得上清；
d、 SD法病毒灭活；
e、 采用离子交换层析法或者用氯化钠 /甘氨酸盐析法纯化；
f、 除菌、 分装、 冻干、 干热灭活， 即可。
歩骤 b中， 溶解冷沉淀采用的缓冲液为 0.02MTris缓冲液。
歩骤 c中， 所述聚乙二醇沉淀法采用 30%聚乙二醇沉淀。
歩骤 e中， 所述离子交换层析采用的凝胶为 Toyopearl DEAE 650M， 缓 冲液为 0.001 M-0.05M的枸橼酸钠缓冲液。
歩骤 e中， 所述盐析法采用氯化钠 /甘氨酸沉淀。
采用本发明方法制备冷沉淀， 每吨血浆可以制备得到 11.14kg冷沉淀， 其人凝血因子環的含量为 39.43IU/g， 有效提高了单位血浆制得的冷沉淀的 量， 也提高了单位血浆制得的人凝血因子環制剂的量， 经济效益好， 充分利 用了血浆资源， 具有良好的市场应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段， 在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式， 对本发明的上述内容再作进一歩 的详细说明。 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。 凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例 1 用本发明方法制备冷沉淀
1、 实验仪器
堰式滤器： 型号是 FL-2023堰式罐形过滤器；
连续离心机： GQ142的高速管式离心机离心。
2、 实验方法
( 1 ) 新鲜健康人血浆采集后， -20°C保存， 不超过 3年；
(2) 预融化： 将新鲜冰冻血浆 2500L (即 2575Kg， 人凝血因子環的含 量为 2500， 000IU), 放置在环境温度为 0°C的条件下， 升温至 -10°C~0°C ;
(3 ) 融化： 在 25°C水浴中融化， 将血浆升温至 0~5°C， 得融化血浆；
(4)过滤： 在维持融化血浆温度为 0~5°C条件下， 采用堰式滤器过滤过 滤， 得滤液和滤渣； (5 )离心： 在维持滤液温度为 0~5°C条件下， 采用连续离心机对滤液进 行离心， 离心力为 15900 g， 得沉淀；
(6) 合并歩骤 （4) 得到的滤渣和歩骤 （5 ) 得到的沉淀， 即为冷沉淀。 称量冷沉淀的重量， 检测冷沉淀中人凝血因子環的含量。
2、 检测结果
经过检测， 歩骤 （4) 的滤渣重量为 6.18kg， 其人凝血因子環的含量为 41IU/g， 歩骤（5 ) 的沉淀中， 滤渣重量为 22.5kg， 其人凝血因子環的含量为 39IU/g， 将二者合并后得到的本发明冷沉淀， 总重量为 28.68Kg， 冷沉淀中 人凝血因子環的含量为 39.43IU/g。 因此， 采用本发明方法制备冷沉淀， 每吨血浆可以制备得到 11.14kg冷 沉淀， 其人凝血因子環的含量为 39.43IU/g， 其中， 过滤获得冷沉淀为 2.4Kg， 占比 21.55%， 其人凝血因子環的含量为 41IU/g， 离心获得冷沉淀为 8.74Kg， 占比 78.45%， 其人凝血因子環的含量为 39IU/g。 实施例 2 用本发明方法制备冷沉淀
1、 实验仪器
堰式滤器： 型号是 FL-2023堰式罐形过滤器；
连续离心机： GQ142的高速管式离心机离心。
2、 实验方法
( 1 ) 新鲜健康人血浆采集后， -20°C保存， 不超过 3年；
(2) 预融化： 将新鲜冰冻血浆 2500L (即 2575Kg， 人凝血因子環的含 量为 2500， 000IU), 放置在环境温度为 2°C的条件下， 升温至 -10°C~0°C；
(3 ) 融化： 在 37°C水浴中融化， 将血浆升温至 0~5°C， 得融化血浆；
(4)过滤： 在维持融化血浆温度为 0~5°C条件下， 采用堰式滤器过滤过 滤， 得滤液和滤渣；
(5 )离心： 在维持滤液温度为 0~5°C条件下， 采用连续离心机对滤液进 行离心， 离心力为 14000 g， 得沉淀;
(6) 合并歩骤 （4) 得到的滤渣和歩骤 （5 ) 得到的沉淀， 即为冷沉淀。
实施例 3 采用本发明冷沉淀制备人凝血因子環制剂
1、 实验方法
实施例 1歩骤（4)过滤获得的冷沉淀 (滤渣) 300g (重复三次） 以及实 施例 1歩骤 （5 ) 离心获得的冷沉淀 （沉淀） （重量分别为 3.8kg、 3.525kg, 2kg) 分别按照如下方法纯化制备人凝血因子環：
(1) 将冷沉淀用 0.02M氨丁三醇 （Tris) 缓冲液溶解， 30%聚乙二醇沉 淀， 离心， 得上清；
(2) 上清合并澄清后， 加入 Tween-80和磷酸三丁酯使其最终浓度分别 为 1%和 0.3%， 25°C±1°C处理 6小时， 完成第一次病毒灭活（即 SD病毒灭 活）；
(3)氯化钠 /氨基酸盐析： SD病毒灭活结束后，加入液体体积 15%(w/v) 的氯化钠和 7.5% (w/v) 的甘氨酸进行沉淀， 4000rpm离心， 收集沉淀；
(4) 超滤配制： 用含 0.01M枸橼酸钠、 0.001M氯化钙、 0.19M盐酸精 氨酸的缓冲液对歩骤 I获得的洗脱液进行超滤透析， 制得的溶液成分为人凝 血因子環、 枸橼酸钠、 氯化钙和盐酸精氨酸， 超滤完成后， 加入 20%人血白 蛋白， 使得人血白蛋白的浓度为 8g/L的比例， 得超滤液；
(5) 再进行除菌、 分装、 冻干， 冻干结束后， 作 80°C72小时的干热处 理， 即得终产品： 人凝血因子 VIII制剂。
检测各歩骤产物以及终产品的效价， 计算效价回收率。
2、 实验结果
实施例 1歩骤 （4) 过滤获得的冷沉淀的检测结果如下表 1:
表 1 人凝血因子 VIII的效价回收
Figure imgf000005_0001
由上表可以看出， 采用实施例 1歩骤（4)过滤获得的冷沉淀为原料， 制 备的人凝血因子 VIII制剂， 平均收率为 28.67%。 换句话说， 以实施例 1歩 骤（4)过滤获得的冷沉淀为原料，每 lg冷沉淀可以制备得到 11.75IU(41IU/g XlgX 28.67%) 人凝血因子環超滤液。 实施例 1歩骤 （5) 离心获得的冷沉淀的检测结果如下表 2: 表 2 人凝血因子 vm的效价回收
Figure imgf000006_0001
由上表可以看出， 采用实施例 1歩骤（4)过滤获得的冷沉淀为原料， 制 备人凝血因子 VIII超滤液，收率平均为 39%。换句话说，以实施例 1歩骤（4) 过滤获得的冷沉淀为原料， 每 lg冷沉淀可以制备得到 15.21IU (39IU/gXlg X39%) 人凝血因子環超滤液。 综上， 本发明实施例 1制备得到的冷沉淀， 每 lg可以制备得到 14.46IU (11.75IUX21.55%+15.21X78.45%) 人凝血因子環制剂， 回收率为 36.68%。 实施例 4 采用本发明冷沉淀制备人凝血因子環制剂
1、 实验方法
( 1 ) 实施例 1制备得到的本发明冷沉淀 300g， 0.02MTris缓冲液溶解 冷沉淀， 30%聚乙二醇沉淀， 离心， 得上清；
(2) 上清合并澄清后， 加入 Tween-80和磷酸三丁酯使其最终浓度分别 为 1%和 0.3%， 25°C±1°C处理 6小时， 完成第一次病毒灭活（即 SD病毒灭 活）；
(3) 采用以 Toyopearl DEAE 650M为凝胶为填料的离子交换层析作进 一歩纯化， 缓冲液为 0.001M的枸橼酸钠缓冲液， 通过改变层析缓冲液的氯 化钠离子强度， 采用 0.11M氯化钠流穿， 0.15M氯化钠洗涤， 收集 0.3M氯 化钠洗脱峰， 收集得到含人凝血因子環的洗脱液； (4) 用含 0.01M枸橼酸钠、 0.001M氯化钙、 0.19M盐酸精氨酸的缓冲 液对歩骤 I获得的洗脱液进行超滤透析， 制得的溶液成分为人凝血因子環、 枸橼酸钠、 氯化钙和盐酸精氨酸， 超滤完成后， 加入 20%人血白蛋白， 使得 人血白蛋白的浓度为 8g/L的比例；
(5 ) 再进行除菌、 分装、 冻干， 冻干结束后， 作 80°C72小时的干热处 理， 即得人凝血因子 VIII制剂。
采用现有方法制备冷沉淀， 每吨血浆仅得到 8.9kg冷沉淀， 冷沉淀中人 凝血因子環的含量为 39.951IU/g， 后续分离纯化后， 得到的人凝血因子 VIII 制剂的活性回收率为 32.02% (详见营长永等， "人凝血因子 VIII分离纯化工 艺研究"， 山东大学硕士学位论文， 第 23页倒数 1-3行以及第 42页图 10)， 因此， 采用现有的方法制备人凝血因子 VIII制剂， 每 1吨血浆能制备得到 112366IU人凝血因子 VIII制剂。
将现有方法与本发明对比如下表:
Figure imgf000007_0001
由上表可以看出， 采用本发明方法制备冷沉淀， 得到的冷沉淀的量比现 有方法高了 2.24kg/吨血浆， 提高比例为 25.17%; 以本发明冷沉淀为原料， 制备人凝血因子 VIII制剂时，活性回收率与现有方法相当，采用本发明方法， 每 1吨血浆可以多制备得到 47268IU人凝血因子 VIII制剂， 提高比例为 41.51%。 在血液制品领域， 由于血浆资源非常有限， 具有稀缺和不可替代性， 人 凝血因子 VIII的分离纯化又较为复杂，因而人凝血因子 VIII制剂的价格昂贵， 目前， 国内的人凝血因子 VIII制剂， 每 200IU/瓶的价格最低为 200元。
采用本发明方法，每 1吨血浆可以多获得 47268IU人凝血因子 VIII制剂， 也就是说， 每 1吨血浆的可以多获得 47268元， 经济效益的提高幅度可想而 知。 换句话说， 因为血液制品的特殊性， 有效成分非常敏感， 活性容易丧失， 因此，通过技术改进得到的收率提高，都意味着技术人员付出了极大的努力， 采用本发明方法制备得到的冷沉淀的量大， 每一吨冷沉淀可制备得到
11.14kg冷沉淀， 冷沉淀中人凝血因子環的含量高， 为 39.43IU/g， 用其进一 步分离纯化制备得到人凝血因子環制品的量也较大， 充分地利用了血浆， 具 有良好的市场应用前景， 适合产业化生产。

Claims

权 利 要 求 书
1、 一种制备冷沉淀的方法， 其特征在于： 它包括如下歩骤：
( 1 ) 融化： 取新鲜冰冻血浆， 升温， 得温度为 0~5°C融化血浆；
(2) 过滤： 在融化血浆温度为 0~5°C的条件下， 过滤， 得滤液和滤渣；
(3 ) 离心： 在滤液温度为 0~5°C的条件下， 离心， 得沉淀；
(4) 合并歩骤 （2) 得到的滤渣和歩骤 （3 ) 得到的沉淀， 即为冷沉淀。
2、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于： 歩骤 （1 ) 所述融化包括 如下两个歩骤：
a、 预融化： 将新鲜冰冻血浆静置于 0~2°C环境中， 使血浆升温至 -10°C~0°C ;
b、 融化： 再升温， 得 0~5°C融化血浆。
3、 根据权利要求 2所述的方法 ， 其特征在于： 歩骤 a中， 所述环境温度 为 o。c。
4、 根据权利要求 2所述的方法， 其特征在于： 歩骤 b中， 所述升温的方 法是 25~37°C水浴。
5、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于： 歩骤 （2) 中， 所述过滤 采用堰式滤器过滤。
6、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于： 歩骤 （3 ) 中， 所述离心 的离心力为 14000~15900g。
7、根据权利要求 6所述的方法，其特征在于:所述离心采用型号为 GQ142 的高速管式离心机离心。
8、 一种制备凝血因子環制剂的方法， 其特征在于： 它包括如下歩骤： a、 按照权利要求 1~7任意一项所述方法制备冷沉淀；
b、 溶解冷沉淀；
c、 用聚乙二醇沉淀法沉淀， 离心， 得上清；
d、 SD法病毒灭活；
e、 采用离子交换层析法或者用氯化钠 /甘氨酸盐析法纯化；
f、 除菌、 分装、 冻干、 干热灭活， 即可。
9、 根据权利要求 8所述的方法， 其特征在于： 歩骤 b中， 溶解冷沉淀采 用的缓冲液为 0.02MTris缓冲液。
10、 根据权利要求 8所述的方法， 其特征在于： 歩骤 c中， 所述聚乙二 醇沉淀法采用 30%聚乙二醇进行沉淀。
11、 根据权利要求 8所述的方法， 其特征在于： 歩骤 e中， 所述离子交 换层析采用的凝胶为 Toyopearl DEAE 650M， 缓冲液为 0.001 M~0.05M的 枸橼酸钠缓冲液。
12、 根据权利要求 8所述的方法， 其特征在于： 歩骤 e中， 所述氯化钠 / 甘氨酸盐析法中， 溶液中氯化钠的终浓度为 15% (w/v) , 甘氨酸的终浓度为 7.5% (w/v
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