CN102228683A - 冻干人凝血因子ⅷ的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法，包括如下工艺：以含肝素3-10IU/ml的注射用水作为肝素钠溶液溶解冷沉淀，经PEG沉淀后取上清液，离心过滤，24-26℃S/D灭活，DEAESepharoseFastFlow层析柱平衡、吸附、洗涤、洗脱，分子膜超滤，配制、除菌分装，冻干、轧盖，99.5-100.5℃干热灭活。本发明采用PEG沉淀和离子交换层析技术相结合的工艺方法，操作简便，既提高FⅧ活性回收率，又可大量去除杂蛋白，产品收率达到60%以上，产品比活达到5IU/mg，明显高于药典不少于1IU/mg的规定。同时，PEG残留为0.08g/L，明显低于药典≤0.5g/L规定，避免了Al（OH）3凝胶法最终制剂中Al3+残留，产品纯度高、安全性好，最终制品质量得到明显改善。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法。
背景技术
凝血因子Ⅷ（简称FⅧ）制剂与白蛋白制剂、免疫球蛋白制剂在国外同为血浆蛋白制剂的三大支柱产品，FⅧ制剂是临床用于甲型血友病患者出血症替补治疗的特效制剂，由于该病至今无根治之术，病人一生都需要输注FⅧ制剂，因此国内外市场需求量较大，为了避免潜在的血液来源的病毒传染，出于安全考虑，目前我国禁止进口凝血因子类血液制品。目前国内具备人凝血因子Ⅷ的生产厂家只有上海莱仕、华兰生物等少数几家具有人凝血因子Ⅷ的生产批文。现有生产工艺生产人凝血因子Ⅷ比活、产品得率及成功率较低，面对国内人凝血因子Ⅷ的短缺，现阶段研发生产安全性高、产品纯度高、产品比活性好的人凝血因子Ⅷ具有积极意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的上述不足，而提供一种安全性高、产品纯度高、工艺简单、产品比活性好的冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法。
本发明的技术方案是：一种冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法，包括如下工艺：以含肝素3-10IU/ml的注射用水作为肝素钠溶液溶解冷沉淀，经PEG沉淀后取上清液，离心过滤，24-26℃S/D灭活，DEAE Sepharose Fast Flow层析柱平衡、吸附、洗涤、洗脱，分子膜超滤，配制、除菌分装，冻干、轧盖，99.5-100.5℃干热灭活；PEG沉淀时，在冷沉淀溶解后的上清液中加入PEG至溶液中PEG终浓度为2.5-4.5%。
DEAE Sepharose Fast Flow层析柱平衡时，用平衡液平衡层析柱至流出液pH值为6.5-7.5，平衡液中含80-115mmol/LNaCl、15-25mmol/L柠檬酸钠、1.0-4.0%甘氨酸和/或盐酸精氨酸、1.5-2.5mmol/L CaCl2，pH值6.5-7.5，其余为注射用水。
洗涤时，用1-2倍柱体积洗涤液洗涤层析柱8次以上，洗涤液中含115-135mmol/LNaCl、15-25mmol/L柠檬酸钠、1.0-3.0%甘氨酸和/或盐酸精氨酸、1.5-2.5mmol/L CaCl2，pH值6.5-7.5，其余为注射用水。
洗脱时，用1-2倍柱体积洗脱液洗脱2次，洗脱液中含800-1000mmol/LNaCl、20-40mmol/L柠檬酸钠、1.0-3.0%甘氨酸和/或盐酸精氨酸、2-4mmol/L CaCl2，pH值6.5-7.5，其余为注射用水。
超滤时，用十万分子量膜的超滤器超滤预浓缩至洗脱液一半，然后用透析液对半超滤至浓缩液电导率u≦15ms/cm，透析液中含10-15mmol/L柠檬酸钠、1.0-3.0%甘氨酸和/或盐酸精氨酸、1-1.5mmol/L CaCl2，pH值6.5-7.5，其余为注射用水。
洗脱后的DEAE Sepharose Fast Flow层析柱可再生后使用，其方法是：先用1-2倍柱体积1.0-1.5mol/LNaCl再生液洗涤DEAE Sepharose Fast Flow层析柱2-4次，其次用1-2倍柱体积注射用水洗涤2-4次，再用3-4个柱体积0.5mol/LNaOH洗涤层析柱，然后用2-3个柱体积0.2mol/LNaOH洗涤层析柱，最后用0.2mol/LNaOH保存。
本发明所提出的上述用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱对FⅧ吸附分离方法，可以适用于任何一种常规方法，包括普通柱层析方法和搅拌柱层析方法。
本发明所用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱还可以是DEAE 650M凝胶层析柱或DEAE SepharoseTSK650M凝胶层析柱。
本发明采用PEG沉淀和离子交换层析技术相结合，在第一步FⅧ粗提过程中，本发明选用肝素溶液作为溶解液，取代常用的Tris-HCl溶液，在制备过程中有效的减少了FⅧ：C活性的损失，使FⅧ：C活性提高30%以上，比活提高3倍，并且澄明度也好。试验结果见表一。
表1 肝素钠溶解液与Tirs-HCl溶解液抽提后PEG上清FⅧ活性、比活的比较（Xn=8）
| 溶解液 | 肝素钠溶解液抽提后PEG上清 | Tirs-HCl溶解液抽提后PEG上清 |
| 蛋白含量（%） | 0.60 | 1.48 |
| 活性（IU/ml） | 4.68 | 3.48 |
| 比活（IU/ml蛋白质） | 0.90 | 0.30 |
| 澄明度 | 澄清 | 浑浊 |
本发明选用2.5-4.5%PEG沉淀法取代常用的Al（OH）3凝胶法，不仅有去除维生素K依赖因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的作用，而且对其他杂蛋白的清除效果也很明显。本发明操作简便，既提高FⅧ活性回收率，又可大量去除杂蛋白，保证FⅧ制剂的稳定性，同时又避免了最终制剂中残留Al3+。试验表明，选用浓度为2.5-4.5%PEG时，既保证最终制品的澄明度，又能得到较高的活性回收率，试验结果见表二。
表2 不同浓度PEG上清FⅧ活性和蛋白浓度的比较（Xn=8）
| PEG浓度（%） | 活性（IU/ml） | 蛋白含量（%） | 最终制品澄明度 |
| 6.0-8.0 | 2.80 | 0.38 | 澄清 |
| 2.5-4.5 | 3.62 | 0.53 | 澄清 |
| 1.0-2.0 | 4.44 | 0.55 | 有颗粒析出 |
本发明在S/D后，采用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱吸附，由于PEG不带电荷，不被离子交换剂吸附，而所要目标蛋白FⅧ吸附在DEAE Sepharose Fast Flow层析柱上，通过用洗涤液分次洗涤层析柱，即可轻易去除S/D溶液和PEG，很好的解决了PEG残留问题。同时，利用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱选择性吸附，将第一步PEG沉淀粗提后的FⅧ尽最大可能的纯化，试验结果表明，本发明此步操作，制品的回收率可以达到80%，活性由处理前2.42IU/ml提高到处理后5.03IU/ml，试验结果见表三。
表3 DEAE Sepharose Fast Flow层析柱处理前后质量分析（Xn=8）
| DEAE Sepharose Fast Flow层析柱处理前后比较 | DEAE Sepharose Fast Flow层析柱处理前 | DEAE Sepharose Fast Flow层析柱处理后 |
| 人凝血因子Ⅷ总效价（IU） | 118.6万 | 95.3万 |
| 活性（IU/ml） | 2.42 | 5.03 |
| PEG残留（g/L） | 25-45 | 0.08 |
| 澄明度 | 澄清 | 澄清 |
本发明所提出的上述用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱对FⅧ吸附分离方法，可以适用于在普通柱层析方法、搅拌柱层析方法等任何一种常规方法中使用。
本发明所用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱还可以是DEAE 650M凝胶层析柱或DEAE SepharoseTSK650M凝胶层析柱。
本发明采用S/D法去除脂包膜病毒以及99.5-100.5℃水浴干热灭活去除非脂包膜病毒，显著提高了临床用药的安全性。
本发明提出的工艺方法，操作简便，既提高FⅧ活性回收率，产品收率达到60%以上，又能得到较高的活性回收率，产品比活达到5IU/mg，明显高于药典不少于1IU/mg的规定。同时，PEG残留为0.08g/L，明显低于药典≤0.5g/L规定，避免了Al（OH）3凝胶法最终制剂中Al3+残留。最终制品质量得到明显改善，最终制品质量分析结果见表四。
表4 连续3批冻干人凝血因子Ⅷ的质量分析
本发明采用低离子浓度的透析液进行超滤，能够有效控制和降低本发明产品中氯离子和钠离子浓度，使其在100mmol/L以下，从而提高本发明产品的质量（氯离子和钠离子浓度会破坏人体中的钠离子平衡）。
以下结合具体实施方式对本发明的详细内容作进一步描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于下述实例，凡基于本发明上述内容所实现的内容均属于本发明的内容。
具体实施方式
基本要求：
1、原料血浆的采集和质量应符合《中国药典》血液制品生产用人血浆的要求；
2、生产设备管线器具应清洁消毒；
3、生产过程应符合血液制品生产规范要求。
S/D溶液：按110gTween80和33gTNBP加注射用水至1kg，搅拌至清亮。
实施例一：
一种冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法，包括如下工艺：以含肝素3-10IU/ml的注射用水作为肝素钠溶液溶解冷沉淀，经PEG沉淀后取上清液，离心过滤，24-26℃S/D灭活，DEAE Sepharose Fast Flow层析柱平衡、吸附、洗涤、洗脱，分子膜超滤，配制、除菌分装，冻干、轧盖，99.5-100.5℃干热灭活；具体工艺如下：
一、取符合药典要求的血浆冷沉淀：室温融解1-2小时，处理成1.5-2.5cm的小块，湿法粉碎；
二、冷沉淀溶解：将冷沉淀置于5-6倍体积的肝素钠溶解液中，搅拌1小时，然后用1mol/LHCl调pH至6.5-7.5，继续搅拌20分钟，静置1小时；
三、PEG沉淀：取上清液，加入PEG至溶液中PEG终浓度为2.5%，搅拌30分钟，使充分反应；
四、离心过滤：离心温度控制在20℃以下，离心速度14000rmp/min，上清液澄清过滤；
五、S/D灭活：取超滤液，加入S/D溶液，使TNBP和Tween80终浓度分别为0.3%和1%，24-26℃保温6小时；
六、DEAE Sepharose Fast Flow层析柱平衡：用平衡液平衡DEAE Sepharose Fast Flow凝胶至流出液pH值为6.5-7.5；
七、吸附：将S/D后溶液上柱，吸附45-60分钟，使人凝血因子Ⅷ充分吸附在DEAE Sepharose Fast Flow凝胶上；
八、洗涤：用1-2倍柱体积洗涤液洗涤层析柱8次以上；
九、洗脱：用1-2倍柱体积洗脱液洗脱2次，收集洗脱液；
十、DEAE Sepharose Fast Flow层析柱再生：先用1-2倍柱体积1.0-1.5mol/LNaCl再生液洗涤DEAE Sepharose Fast Flow层析柱2-4次，其次用1-2倍柱体积注射用水洗涤2-4次，再用3-4个柱体积0.5mol/LNaOH洗涤层析柱，然后用2-3个柱体积0.2mol/LNaOH洗涤层析柱，最后用0.2mol/LNaOH保存；
十一、超滤：用十万分子量膜的超滤器超滤预浓缩至洗脱液一半，然后用透析液对半超滤至浓缩液电导率u≦15ms/cm；
十二、配液、除菌分装：检测浓缩液效价，依据检测结果进行配制、除菌分装；
十三、冻干：
①制品常温进柜；
②隔板10分钟从常温降至0℃，保持30分钟；
③隔板30分钟从0℃降到-40℃，在-40℃保持1-2小时；
④开真空泵到真空达到0.3mbar稳定；
⑤1小时隔板升温到-33℃，保持1小时；
⑥5小时隔板升温到0℃，保持30小时；
⑦2小时隔板升温到10℃，保持6小时；
⑧2小时隔板升温到35℃，保持6小时；
⑨1小时使真空到0.05mbar，保持1小时，真空压塞；
十四、出柜、轧盖；
十五、干热病毒灭活：99.5-100.5℃水浴干热灭活30分钟。
主要试剂配制：
1molHCl：90ml浓盐酸用水稀释到1000ml。
肝素钠溶解液：含肝素6IU/ml的注射用水。
平衡液：含80mmol/LNaCl、15mmol/L柠檬酸钠、1.0%盐酸精氨酸和/或甘氨酸、1.5mmol/L CaCl2，pH值6.6，其余为注射用水。
洗涤液：含115mmol/LNaCl、15mmol/L柠檬酸钠、1.0%盐酸精氨酸和/或甘氨酸、1.5mmol/L CaCl2，pH值6.6，其余为注射用水。
洗脱液：含800mmol/LNaCl、20mmol/L柠檬酸钠、1.0%盐酸精氨酸和/或甘氨酸、2mmol/L CaCl2，pH值6.6，其余为注射用水。
透析液：含10mmol/L柠檬酸钠、1.0%盐酸精氨酸和/或甘氨酸、1mmol/L CaCl2，pH值6.6，其余为注射用水。
实施例二：
基本要求与实施例一相同。
一种冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法，包括如下工艺：以含肝素3-10IU/ml的注射用水作为肝素钠溶液溶解冷沉淀，经PEG沉淀后取上清液，离心过滤，24-26℃S/D灭活，DEAE Sepharose Fast Flow层析柱平衡、吸附、洗涤、洗脱，分子膜超滤，配制、除菌分装，冻干、轧盖，99.5-100.5℃干热灭活；具体工艺如下：
一、取符合药典要求的血浆冷沉淀：室温融解1-2小时，处理成1.5-2.5cm的小块，湿法粉碎；
二、冷沉淀溶解：将冷沉淀置于5-6倍体积的肝素钠溶解液中，搅拌1小时，然后用1mol/LHCl调pH至6.5-7.5，继续搅拌20分钟，静置1小时；
三、PEG沉淀：取上清液，加入PEG至溶液中PEG终浓度为4.5%，搅拌30分钟，使充分反应；
四、离心过滤：离心温度控制在20℃以下，离心速度14000rmp/min，上清液澄清过滤；
五、S/D灭活：取超滤液，加入S/D溶液，使TNBP和Tween80终浓度分别为0.3%和1%，24-26℃保温6小时；
六、DEAE Sepharose Fast Flow层析柱平衡：用平衡液平衡DEAE Sepharose Fast Flow凝胶至流出液pH值为6.5-7.5；
七、吸附：将S/D后溶液上柱，吸附45-60分钟，使人凝血因子Ⅷ充分吸附在DEAE Sepharose Fast Flow凝胶上；
八、洗涤：用1-2倍柱体积洗涤液洗涤层析柱8次以上；
九、洗脱：用1-2倍柱体积洗脱液洗脱2次，收集洗脱液；
十、DEAE Sepharose Fast Flow层析柱再生：先用1-2倍柱体积1.0-1.5mol/LNaCl再生液洗涤DEAE Sepharose Fast Flow层析柱2-4次，其次用1-2倍柱体积注射用水洗涤2-4次，再用3-4个柱体积0.5mol/LNaOH洗涤层析柱，然后用2-3个柱体积0.2mol/LNaOH洗涤层析柱，最后用0.2mol/LNaOH保存；
十一、超滤：用十万分子量膜的超滤器超滤预浓缩至洗脱液一半，然后用透析液对半超滤至浓缩液电导率u≦15ms/cm；
十二、配液、除菌分装：检测浓缩液效价，依据检测结果进行配制、除菌分装；
十三、冻干：
①制品常温进柜；
②隔板10分钟从常温降至0℃，保持30分钟；
③隔板30分钟从0℃降到-40℃，在-40℃保持1-2小时；
④开真空泵到真空达到0.3mbar稳定；
⑤1小时隔板升温到-33℃，保持1小时；
⑥5小时隔板升温到0℃，保持30小时；
⑦2小时隔板升温到10℃，保持6小时；
⑧2小时隔板升温到35℃，保持6小时；
⑨1小时使真空到0.05mbar，保持1小时，真空压塞；
十四、出柜、轧盖；
十五、干热病毒灭活：99.5-100.5℃水浴干热灭活30分钟。
主要试剂配制中，
平衡液：含115mmol/LNaCl、25mmol/L柠檬酸钠、4.0%盐酸精氨酸和/或甘氨酸、2.5mmol/L CaCl2，pH值7.4，其余为注射用水。
洗涤液：含135mmol/LNaCl、25mmol/L柠檬酸钠、3.0%盐酸精氨酸和/或甘氨酸、2.5mmol/L CaCl2，pH值7.4，其余为注射用水。
洗脱液：含1000mmol/LNaCl、40mmol/L柠檬酸钠、3.0%盐酸精氨酸和/或甘氨酸、4mmol/L CaCl2，pH值7.4，其余为注射用水。
透析液：含15mmol/L柠檬酸钠、3.0%盐酸精氨酸和/或甘氨酸、1.5mmol/L CaCl2，pH值7.4，其余为注射用水。
其余试剂的配制与与实施例一相同。
Claims (8)
1.一种冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法，包括如下工艺：以含肝素3-10IU/ml的注射用水作为肝素钠溶液溶解冷沉淀，经PEG沉淀后取上清液，离心过滤，24-26℃S/D灭活，DEAE Sepharose Fast Flow层析柱平衡、吸附、洗涤、洗脱，分子膜超滤，配制、除菌分装，冻干、轧盖，99.5-100.5℃干热灭活；其特征是PEG沉淀时，在冷沉淀溶解后的上清液中加入PEG至溶液中PEG终浓度为2.5-4.5%。
2.根据权利要求1所述的冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征是DEAE Sepharose Fast Flow层析柱平衡时，用平衡液平衡层析柱至流出液pH值为6.5-7.5，平衡液中含80-115mmol/LNaCl、15-25mmol/L柠檬酸钠、1.0-4.0%甘氨酸和/或盐酸精氨酸、1.5-2.5mmol/L CaCl2，pH值6.5-7.5，其余为注射用水。
3.根据权利要求1所述的冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征是洗涤时，用1-2倍柱体积洗涤液洗涤层析柱8次以上，洗涤液中含115-135mmol/LNaCl、15-25mmol/L柠檬酸钠、1.0-3.0%甘氨酸和/或盐酸精氨酸、1.5-2.5mmol/L CaCl2，pH值6.5-7.5，其余为注射用水。
4.根据权利要求1所述的冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征是洗脱时，用1-2倍柱体积洗脱液洗脱2次，洗脱液中含800-1000mmol/LNaCl、20-40mmol/L柠檬酸钠、1.0-3.0%甘氨酸和/或盐酸精氨酸、2-4mmol/L CaCl2，pH值6.5-7.5，其余为注射用水。
5.根据权利要求1所述的冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征是超滤时，用十万分子量膜的超滤器超滤预浓缩至洗脱液一半，然后用透析液对半超滤至浓缩液电导率u≦15ms/cm，透析液中含10-15mmol/L柠檬酸钠、1.0-3.0%甘氨酸和/或盐酸精氨酸、1-1.5mmol/L CaCl2，pH值6.5-7.5，其余为注射用水。
6.根据权利要求1所述的冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征是洗脱后的DEAE Sepharose Fast Flow层析柱可再生后使用，其方法是：先用1-2倍柱体积1.0-1.5mol/LNaCl再生液洗涤DEAE Sepharose Fast Flow层析柱2-4次，其次用1-2倍柱体积注射用水洗涤2-4次，再用3-4个柱体积0.5mol/LNaOH洗涤层析柱，然后用2-3个柱体积0.2mol/LNaOH洗涤层析柱，最后用0.2mol/LNaOH保存。
7.根据权利要求1-6所述的冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征是用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱对FⅧ吸附分离方法，可以适用于任何一种常规方法，包括普通柱层析方法和搅拌柱层析方法。
8.根据权利要求1-6所述的冻干人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征是DEAE Sepharose Fast Flow层析柱还可以是DEAE 650M凝胶层析柱或DEAE SepharoseTSK650M凝胶层析柱。
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| 何广发: "《冻干人凝血因子Ⅷ制剂的S/D处理及其理化分析", 《中国生物制品学杂志》, vol. 14, no. 1, 31 January 2001 (2001-01-31), pages 44 - 47 * |
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