CN103613658A - 一种人第viii凝血因子的制备方法 - Google Patents

一种人第viii凝血因子的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人第VIII凝血因子的制备方法，包括如下步骤：（1）从人血浆中分离冷沉淀，加入Tris-HCl溶解液溶解；（2）一次PEG沉淀：向溶解液中加入PEG1溶液，搅拌静置后离心；（3）收集离心后的上清液，加入S/D溶液灭活；（4）二次PEG沉淀：将灭活后的所述上清液澄清过滤，滤液转至低温反应罐，在搅拌条件下加入PEG2溶液，搅拌静置后离心；（5）沉淀洗涤、采用溶解液溶解，溶解完全后离心，收集上清，过滤，配制、除菌分装，冻干、轧盖，干热灭活得到产品。本发明所述方法采用二次PEG沉淀法简化了生产工艺，降低了对大型设备的要求，占地面积小，操作简单，成本低廉，提高了劳动效率，提高了经济效益。

Description

一种人第VIII凝血因子的制备方法
技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别是涉及一种人第VIII凝血因子的制备方法。
背景技术
凝血因子VIII制剂与白蛋白制剂、免疫球蛋白制剂在国外同为血浆蛋白制剂的三大支柱产品，在血友病中，80%的病人属于甲型血友病，该类病人主要缺少正常人所拥有的人凝血因子VIII，因此，人凝血因子VIII是治疗血友病的救命药。目前国内仅有少数几家具有人凝血因子VIII的生产批文，主要是工艺操作繁琐，质量不易控制。现有生产工艺生产人凝血因子VIII产品得率低，面对国内人凝血因子VIII的短缺，现阶段研发生产安全性高、比活性高的人凝血因子VIII具有积极意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单，产品质量可控的制备人凝血因子VIII的方法。
一种人第VIII凝血因子的制备方法，包括如下步骤：
（1）从人血浆中分离出的冷沉淀为起始原料，用3倍的0.01-0.05mol/L的Tris-HCl溶解液溶解；反应液温度控制在24～26℃，加入肝素钠作为保护剂，终浓度为0.005-0.065%；
（2）一次PEG沉淀：向溶解液中加入30%浓PEG1溶液，溶液中最终PEG浓度为2%-6%，调节溶液pH值至6.5～7.5，搅拌静置后离心；
（3）收集离心后的上清液，经澄清过滤后，根据过滤后的体积加入S/D病毒灭活液，使溶液中Tween-80含量为11.0％、TNBP含量为3.3％，反应液温度控制在24-26℃，保温6小时；
（4）二次PEG沉淀：将灭活后的所述反应液澄清过滤，滤液转至低温反应罐，准确计量过滤液体积，在搅拌条件下加入40%PEG2溶液，溶液中PEG浓度为10%-16%，调节溶液pH值至5.4～6.0，搅拌静置后离心；
（5）沉淀洗涤：收集沉淀，用10%的甘氨酸溶液洗涤3次，洗涤完全后离心，收集沉淀；
（6）用1%的甘氨酸溶液溶解，溶解液调pH至7.1～7.3，过滤，配制、除菌分装，冻干、轧盖，干热灭活得到人凝血因子VIII成品。
本发明所述的人第VIII凝血因子的制备方法，其中步骤（1）冷沉淀的制备方法为：
生产用血浆符合《中华人民共和国药典》2010版三部“血液制品生产用原料血浆”规定，血浆应无凝块，无纤维蛋白析出，非脂血，无溶血。采集后应在4小时以内冻结，-30℃保存不超过1年；
冰冻血浆在0-4℃融化，经低温高速离心，离心过程中血浆温度控制2-8℃，收集沉淀；即为冷沉淀。
本发明所述的人第VIII凝血因子的制备方法，其中步骤（2）PEG1溶液的配方为：PEG为30%、Na3Cit·2H2O为1%，用1.0mol/LHCl溶液调PH为6.2～6.4。
本发明所述的人第VIII凝血因子的制备方法，其中步骤（4）PEG2溶液的配方为：PEG为40%、Na3Cit·2H2O为1%，用1.0mol/LHCl溶液调PH为6.2～6.4。。
本发明所述的人第VIII凝血因子的制备方法，其中步骤（5）具体包括如下步骤：
配制甘氨酸洗涤液：取甘氨酸0.232kg、柠檬酸三钠0.133kg、肝素钠0.142kg、加注射用水1.4kg，用1.0mol/L HCl溶液调pH为6.65～6.75，配制好后降温至-1.0～1.0℃备用；
沉淀洗涤：收集沉淀，第一次加9-12倍沉淀量的甘氨酸洗涤液，充分粉碎洗涤沉淀，离心收集沉淀；第二次加13-15倍沉淀量的洗涤液，充分粉碎洗涤沉淀，离心收集沉淀；第三次加18-20倍沉淀量的洗涤液，充分粉碎洗涤沉淀，离心收集沉淀。
本发明所述的人第VIII凝血因子的制备方法，其中步骤（6）具体包括如下步骤：
配制溶解液，取甘氨酸90g，含2个结晶水放入柠檬酸三钠23.5g，加25～35℃注射用水溶解成10L，用1.0mol/L HCL溶液调pH至7.1～7.3；温度控制在25～35℃之间；
用13～15倍溶解液溶解沉淀，缓缓搅拌至完全溶解；溶解后澄清过滤，收集上清，除菌分装，冻干、轧盖，干热灭活得到人凝血因子VIII成品。
本发明所述方法制备得到的产品，制备得到的所述人凝血因子VIII效价为不低于35IU/ml，比活不低于10IU/g蛋白质。
本发明人第VIII凝血因子的制备方法优点在于：
（1）本发明所述方法采用从人血浆中分离的冷沉淀为原料，替代从组分Ⅲ沉淀中提取人第VIII凝血因子，冷沉淀较组分Ⅲ沉淀易制备，且质量可控。
（2）本发明采用了浓度为10%的甘氨酸溶液洗涤，提高产品的比活性。
（3）本发明采用二次PEG沉淀法替代乙醇纯化和柱层析工艺，降低了对大型设备的要求，占地面积小，操作简单，成本低廉，提高了经济效益。
具体实施方式
实施例1
一种人第VIII凝血因子的制备方法，包括如下步骤：
1、血浆要求：
A、所用血浆原料应符合“血液制品生产用人血浆”规定；
B、血浆采集后应在4小时以内冻结；
C、冰冻血浆运输过程中不低于-20℃，冷冻保存温度不得超过-30℃，有效期不超过12个月。
D、血浆应无凝块，无纤维蛋白析出，非脂血，无溶血。
2、冷沉淀制备：
称取1000kg冰冻血浆（计1667人份血浆），采用水浴法融化混合血浆，融化的血浆温度控制在0-4℃，采用低温高速离心机分离冷不容物，离心过程血浆流出液温度控制在2-8℃，流速控制在3±1L/台/分，离心结束后收集8Kg冷沉淀。
附冷沉淀原料质量标准
a、冷沉淀原料为采用低温离心分离法的血浆组分。所用血浆原料应符合“血液制品生产用人血浆”规定；
b、冷沉淀应尽能保持无菌和低温冰冻保存，保存温度不得超过-30℃，保存期应不超过1年。
c、冷沉淀的检定：
准确称取冷沉淀10g，用生理氯化钠溶液稀释至100ml，在1～3℃搅拌充分溶解后离心或过滤，取上清液进行以下项目检测。
人凝血因子VIII效价：每毫升不低于10IU；
细菌内毒素：用经批准的试剂盒检测，应为阴性。
HBsAg：用经批准的试剂盒检测，应为阴性。
HIV抗体：用经批准的试剂盒检测，应为阴性。
HCV抗体：用经批准的试剂盒检测，应为阴性。
3、冷沉淀的溶解
将化冻后的冷沉淀切碎倒入3倍冷沉淀量0.02mol/L-HCL溶解液中（24L），水浴升温至24～26℃，搅拌溶解至少3小时后，以200ml/min加入3.3％肝素钠溶液至肝素钠终浓度为0.046％后，继续搅拌0.5小时，溶解液体积为32L.。
4、一次PEG沉淀：沉淀溶解结束后，加入配制好的30%PEG1溶液3.1Kg，速度不超过500g/min，使最终PEG浓度为3.5％；加入PEG后用0.5mol/L醋酸溶液调PH值至6.50－6.60,温度：10～12℃搅拌30分钟后，静置1.0小时后离心。
5、S/D灭活：收集上清准确计量过滤后的蛋白液体积34Kg，按1:10比例在搅拌下缓慢加入配制好的S/D溶液（Tween-80含量为11.0％、TNBP含量为3.3％），使蛋白液中聚山梨酯80最终浓度为1%、磷酸三丁脂最终浓度为0.3%，升温至24～26℃，保温6小时；
6、二次PEG沉淀：灭活孵育结束后经澄清过滤，滤液转至低温反应罐，准确计量过滤液体积37.3Kg，在搅拌过程中加入配置好的40%PEG2溶液18Kg，添加速度应不大于500ml/分，使最终制品中PEG浓度为13%；加入PEG后用0.5mol/L醋酸溶液调PH至5.70～5.80；冷却至10～12℃后搅拌0.5小时，静置1小时后分离。
7、沉淀洗涤：收集沉淀125g，第一次加10倍沉淀量的洗涤液（配方：甘氨酸0.232kg、柠檬酸三钠0.133kg、肝素钠0.142kg、加注射用水1.4kg，用1.0mol/L HCl溶液调pH为6.65～6.75，配制好后降温至-1.0～1.0℃备用），充分粉碎洗涤沉淀，离心收集沉淀；第二次加15倍沉淀量的洗涤液，充分粉碎洗涤沉淀，离心收集沉淀；第三次加20倍沉淀量的洗涤液，充分粉碎洗涤沉淀，离心收集沉淀。
8、溶解用13倍溶解液（配制溶解液配方：取甘氨酸90g，含2个结晶水的柠檬酸三钠23.5g，加25～35℃注射用水溶解成10L，用1.0mol/L HCL溶液调pH至7.1～7.3；温度控制在25～35℃之间。）溶解沉淀，溶解完全后离心，收集上清1.25Kg，过滤；
9、配制：取溶解后制品测效价，按分装规格加溶解液稀释，最终控制在总体积为沉淀重15倍量。人凝血因子VIII效价最终为35IU/ml，用1.0mol/L HCl或1.0mol/L NaOH溶液调PH至7.0。）、除菌分装，按10ml/瓶进行分装；共分装252瓶。
10、冻干：在严格无菌操作规程，严格控制冻干期间升温速度和真空度，保证制品有良好的外观、合格的真空度，残余水分不高于3.0%。、轧盖；
11、干热灭活：将冻干制品移入干热灭活柜，温度控制在：98-100℃，时间为：保温30分钟，干热结束后，转入待检品库，取样送检，得到人凝血因子VIII成品。
本发明所述方法中的数值不限于实施例1中应用的具体数值，在生产中，在较小范围内的数值变化不影响试验结果，本发明中的百分数除具体说明的以外，均为质量百分数。
成品检测按照《中华人民共和国药典》2010版三部“人凝血因子VIII”（P236-237页）进行检测，检测结果如表1所示：制备得到的所述人凝血因子VIII效价为不低于35IU/ml，比活不低于10IU/g蛋白质。
表1.成品检测报告
Figure BDA0000414876660000051
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种人第VIII凝血因子的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）从人血浆中分离出的冷沉淀为起始原料，用3倍的0.01-0.05mol/L的Tris-HCl溶解液溶解，溶解液温度控制在24～26℃，加入肝素钠作为保护剂，终浓度为0.005-0.065%；
（2）一次PEG沉淀：向所述溶解液中加入30%浓PEG1溶液，溶液中最终PEG浓度为2%-6%，调节溶液pH值至6.5～7.5，搅拌静置后离心；
（3）收集离心后的上清液，经澄清过滤后，根据过滤后的体积加入S/D病毒灭活液，使溶液中Tween-80含量为11.0％、TNBP含量为3.3％，反应液温度控制在24-26℃，保温6小时；
（4）二次PEG沉淀：将灭活后的所述反应液澄清过滤，滤液转至低温反应罐，准确计量过滤液体积，在搅拌条件下加入40%PEG2溶液，溶液中PEG浓度为10%-16%，调节溶液pH值至5.4～6.0，搅拌静置后离心；
（5）沉淀洗涤：收集沉淀，用10%的甘氨酸溶液洗涤3次，洗涤完全后离心，收集沉淀；
（6）用1%的甘氨酸溶液溶解，溶解液调pH至7.1～7.3，过滤，配制、除菌分装，冻干、轧盖，干热灭活得到人凝血因子VIII成品。
2.根据权利要求1所述的人第VIII凝血因子的制备方法，其特征在于：步骤（1）冷沉淀的制备方法为：
采集的血浆应无凝块，无纤维蛋白析出，非脂血，无溶血，采集后应在4小时以内冻结，-30℃保存不超过1年；将所述冰冻血浆在0-4℃融化，经低温高速离心，离心过程中血浆温度控制2-8℃，收集沉淀，即为冷沉淀。
3.根据权利要求2所述的人第VIII凝血因子的制备方法，其特征在于：步骤（2）PEG1溶液的配方为：PEG为30%、Na3Cit·2H2O为1%，用1.0mol/LHCl溶液调PH为6.2～6.4。
4.根据权利要求2所述的人第VIII凝血因子的制备方法，其特征在于：步骤（4）PEG2溶液的配方为：PEG为40%、Na3Cit·2H2O为1%，用1.0mol/LHCl溶液调PH为6.2～6.4。
5.根据权利要求3或4所述的人第VIII凝血因子的制备方法，其特征在于：步骤（5）具体包括如下步骤：
配制甘氨酸洗涤液：取甘氨酸0.232kg、柠檬酸三钠0.133kg、肝素钠0.142kg、加注射用水1.4kg，用1.0mol/L HCl溶液调pH为6.65～6.75，配制好后降温至-1.0～1.0℃备用；
沉淀洗涤：收集沉淀，第一次加9-12倍沉淀量的甘氨酸洗涤液，充分粉碎洗涤沉淀，离心收集沉淀；第二次加13-15倍沉淀量的洗涤液，充分粉碎洗涤沉淀，离心收集沉淀；第三次加18-20倍沉淀量的洗涤液，充分粉碎洗涤沉淀，离心收集沉淀。
6.根据权利要求1所述的人第VIII凝血因子的制备方法，其特征在于：步骤（6）具体包括如下步骤：
配制溶解液：取甘氨酸90g，放入含2个结晶水的柠檬酸三钠23.5g，加25～35℃注射用水溶解成10L，用1.0mol/L HCL溶液调pH至7.1～7.3；温度控制在25～35℃之间；
用13～15倍溶解液溶解沉淀，缓缓搅拌至完全溶解；溶解后澄清过滤，收集上清，除菌分装，冻干、轧盖，干热灭活得到人凝血因子VIII成品。
7.根据权利要求1-6所述方法制备得到的产品，其特征在于：制备得到的所述人凝血因子VIII效价为不低于35IU/ml，比活不低于10IU/g蛋白质。
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