CN103848886A - 一种冷沉淀的制备方法以及用其制备凝血因子ⅷ制剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备冷沉淀的方法，它包括如下步骤：（1）融化：取新鲜冰冻血浆，升温，得温度为0～5℃融化血浆；（2）过滤：在融化血浆温度为0～5℃的条件下，过滤，得滤液和滤渣；（3）离心：在滤液温度为0～5℃的条件下，离心，得沉淀；（4）合并步骤（2）得到的滤渣和步骤（3）得到的沉淀，即为冷沉淀。本发明制备方法简单，制备的冷沉淀收率高，人凝血因子Ⅷ含量高，工业应用前景良好。

Description

一种冷沉淀的制备方法以及用其制备凝血因子Ⅷ制剂的方法

技术领域

本发明涉及血液制品的制备方法，特别涉及一种冷沉淀的制备方法以及用其制备凝血因子Ⅷ的方法。

背景技术

冷沉淀是新鲜冰冻血浆在低温条件下不溶解的白色沉淀物，主要含有第Ⅷ因子、纤维蛋白原、血管性血友病因子(VWF)、第ⅩⅢ因子以及纤连蛋白等成分，是制备人凝血因子Ⅷ制剂的原料。

目前，血浆的冷沉淀制备方法有两种：快速融化离心法和虹吸法。虹吸法制得的冷沉淀中，人凝血因子VIII含量低，目前通常采用快速融化离心法。

快速融化离心法的具体步骤为：取出待制备冷沉淀的新鲜冰冻血浆，置4±2℃冰箱中过夜融化或在4±2℃水浴装置中融化；当血浆基本融化时，取出血浆，在4±2℃的环境下离心，离心的沉淀即为冷沉淀。但是，该方法制得的冷沉淀的量较少，通常每吨血浆仅得到8.9kg冷沉淀，冷沉淀中人凝血因子Ⅷ的含量为39.951IU/g（见营长永等，“人凝血因子VIII分离纯化工艺研究”，山东大学硕士学位论文），对冷沉淀进一步分离纯化制得的人凝血因子Ⅷ制剂的量也比较少，造成血浆资源的浪费。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的冷沉淀制备方法。

本发明制备冷沉淀的方法，它包括如下步骤：

（1）融化：取新鲜冰冻血浆，升温，得温度为0～5℃融化血浆；

（2）过滤：在融化血浆温度为0～5℃的条件下，过滤，得滤液和滤渣；

（3）离心：在滤液温度为0～5℃的条件下，离心，得沉淀；

（4）合并步骤（2）得到的滤渣和步骤（3）得到的沉淀，即为冷沉淀。

步骤（1）所述融化包括如下两个步骤：

a、预融化：将新鲜冰冻血浆静置于0～2℃环境中，使血浆升温至-10℃～0℃；

b、融化：再升温，得0～5℃融化血浆。

步骤a中，所述环境温度为0℃。

步骤b中，所述升温的方法是25～37℃水浴。

步骤（2）中，所述过滤采用堰式滤器过滤。

步骤（3）中，所述离心的离心力为14000～15900g。优选地，所述离心采用型号为GQ142的高速管式离心机离心。

本发明制备凝血因子Ⅷ的方法，它包括如下步骤：

a、按照前述方法制备冷沉淀；

b、溶解冷沉淀；

c、用聚乙二醇沉淀法沉淀，离心，得上清；

d、SD法病毒灭活；

e、采用离子交换层析法或者用氯化钠/甘氨酸盐析法纯化；

f、除菌、分装、冻干、干热灭活，即可。

步骤b中，溶解冷沉淀采用的缓冲液为0.02MTris缓冲液。

步骤c中，所述聚乙二醇沉淀法采用30%聚乙二醇沉淀。

步骤e中，所述离子交换层析采用的凝胶为Toyopearl DEAE650M，缓冲液为0.001M～0.05M的枸橼酸钠缓冲液。

步骤e中，所述盐析法采用氯化钠/甘氨酸沉淀。

采用本发明方法制备冷沉淀，每吨血浆可以制备得到11.14kg冷沉淀，其人凝血因子Ⅷ的含量为39.43IU/g，有效提高了单位血浆制得的冷沉淀的量，也提高了单位血浆制得的人凝血因子Ⅷ制剂的量，经济效益好，充分利用了血浆资源，具有良好的市场应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1 用本发明方法制备冷沉淀

1、实验仪器

堰式滤器：型号是FL-2023堰式罐形过滤器；

连续离心机：GQ142的高速管式离心机离心。

2、实验方法

（1）新鲜健康人血浆采集后，-20℃保存，不超过3年；

（2）预融化：将新鲜冰冻血浆2500L（即2575Kg，人凝血因子Ⅷ的含量为2500，000IU），放置在环境温度为0℃的条件下，升温至-10℃～0℃；

（3）融化：在25℃水浴中融化，将血浆升温至0～5℃，得融化血浆；

（4）过滤：在维持融化血浆温度为0～5℃条件下，采用堰式滤器过滤过滤，得滤液和滤渣；

（5）离心：在维持滤液温度为0～5℃条件下，采用连续离心机对滤液进行离心，离心力为15900g，得沉淀；

（6）合并步骤（4）得到的滤渣和步骤（5）得到的沉淀，即为冷沉淀。

称量冷沉淀的重量，检测冷沉淀中人凝血因子Ⅷ的含量。

2、检测结果

经过检测，步骤（4）的滤渣重量为6.18kg，其人凝血因子Ⅷ的含量为41IU/g，步骤（5）的沉淀中，滤渣重量为22.5kg，其人凝血因子Ⅷ的含量为39IU/g，将二者合并后得到的本发明冷沉淀，总重量为28.68Kg，冷沉淀中人凝血因子Ⅷ的含量为39.43IU/g。

因此，采用本发明方法制备冷沉淀，每吨血浆可以制备得到11.14kg冷沉淀，其人凝血因子Ⅷ的含量为39.43IU/g，其中，过滤获得冷沉淀为2.4Kg，占比21.55%，其人凝血因子Ⅷ的含量为41IU/g，离心获得冷沉淀为8.74Kg，占比78.45%，其人凝血因子Ⅷ的含量为39IU/g。

实施例2 用本发明方法制备冷沉淀

1、实验仪器

堰式滤器：型号是FL-2023堰式罐形过滤器；

连续离心机：GQ142的高速管式离心机离心。

2、实验方法

（1）新鲜健康人血浆采集后，-20℃保存，不超过3年；

（2）预融化：将新鲜冰冻血浆2500L（即2575Kg，人凝血因子Ⅷ的含量为2500，000IU），放置在环境温度为2℃的条件下，升温至-10℃～0℃；

（3）融化：在37℃水浴中融化，将血浆升温至0～5℃，得融化血浆；

（4）过滤：在维持融化血浆温度为0～5℃条件下，采用堰式滤器过滤过滤，得滤液和滤渣；

（5）离心：在维持滤液温度为0～5℃条件下，采用连续离心机对滤液进行离心，离心力为14000g，得沉淀；

（6）合并步骤（4）得到的滤渣和步骤（5）得到的沉淀，即为冷沉淀。

实施例3 采用本发明冷沉淀制备人凝血因子Ⅷ制剂

1、实验方法

实施例1步骤（4）过滤获得的冷沉淀（滤渣）300g（重复三次）以及实施例1步骤（5）离心获得的冷沉淀（沉淀）（重量分别为3.8kg、3.525kg、2kg）分别按照如下方法纯化制备人凝血因子Ⅷ：

（1）将冷沉淀用0.02M氨丁三醇（Tris）缓冲液溶解，30%聚乙二醇沉淀，离心，得上清；

（2）上清合并澄清后，加入Tween-80和磷酸三丁酯使其最终浓度分别为1%和0.3%，25℃±1℃处理6小时，完成第一次病毒灭活（即SD病毒灭活）；

（3）氯化钠/氨基酸盐析：SD病毒灭活结束后，加入液体体积15%（w/v）的氯化钠和7.5%（w/v）的甘氨酸进行沉淀，4000rpm离心，收集沉淀；

（4）超滤配制：用含0.01M枸橼酸钠、0.001M氯化钙、0.19M盐酸精氨酸的缓冲液对步骤Ⅰ获得的洗脱液进行超滤透析，制得的溶液成分为人凝血因子Ⅷ、枸橼酸钠、氯化钙和盐酸精氨酸，超滤完成后，加入20%人血白蛋白，使得人血白蛋白的浓度为8g/L的比例，得超滤液；

（5）再进行除菌、分装、冻干，冻干结束后，作80℃72小时的干热处理，即得终产品：人凝血因子VIII制剂。

检测各步骤产物以及终产品的效价，计算效价回收率。

2、实验结果

实施例1步骤（4）过滤获得的冷沉淀的检测结果如下表1：

表1 人凝血因子VIII的效价回收

由上表可以看出，采用实施例1步骤（4）过滤获得的冷沉淀为原料，制备的人凝血因子VIII制剂，平均收率为28.67%。换句话说，以实施例1步骤（4）过滤获得的冷沉淀为原料，每1g冷沉淀可以制备得到11.75IU（41IU/g×1g×28.67%）人凝血因子Ⅷ超滤液。

实施例1步骤（5）离心获得的冷沉淀的检测结果如下表2：

表2 人凝血因子VIII的效价回收

由上表可以看出，采用实施例1步骤（4）过滤获得的冷沉淀为原料，制备人凝血因子VIII超滤液，收率平均为39%。换句话说，以实施例1步骤（4）过滤获得的冷沉淀为原料，每1g冷沉淀可以制备得到15.21IU（39IU/g×1g×39%）人凝血因子Ⅷ超滤液。

综上，本发明实施例1制备得到的冷沉淀，每1g可以制备得到14.46IU（11.75IU×21.55%+15.21×78.45%）人凝血因子Ⅷ制剂，回收率为36.68%。

实施例4 采用本发明冷沉淀制备人凝血因子Ⅷ制剂

1、实验方法

（1）实施例1制备得到的本发明冷沉淀300g，0.02MTris缓冲液溶解冷沉淀，30%聚乙二醇沉淀，离心，得上清；

（2）上清合并澄清后，加入Tween-80和磷酸三丁酯使其最终浓度分别为1%和0.3%，25℃±1℃处理6小时，完成第一次病毒灭活（即SD病毒灭活）；

（3）采用以Toyopearl DEAE650M为凝胶为填料的离子交换层析作进一步纯化，缓冲液为0.001M的枸橼酸钠缓冲液，通过改变层析缓冲液的氯化钠离子强度，采用0.11M氯化钠流穿，0.15M氯化钠洗涤，收集0.3M氯化钠洗脱峰，收集得到含人凝血因子Ⅷ的洗脱液；

（4）用含0.01M枸橼酸钠、0.001M氯化钙、0.19M盐酸精氨酸的缓冲液对步骤Ⅰ获得的洗脱液进行超滤透析，制得的溶液成分为人凝血因子Ⅷ、枸橼酸钠、氯化钙和盐酸精氨酸，超滤完成后，加入20%人血白蛋白，使得人血白蛋白的浓度为8g/L的比例；

（5）再进行除菌、分装、冻干，冻干结束后，作80℃72小时的干热处理，即得人凝血因子VIII制剂。

采用现有方法制备冷沉淀，每吨血浆仅得到8.9kg冷沉淀，冷沉淀中人凝血因子Ⅷ的含量为39.951IU/g，后续分离纯化后，得到的人凝血因子VIII制剂的活性回收率为32.02%（详见营长永等，“人凝血因子VIII分离纯化工艺研究”，山东大学硕士学位论文，第23页倒数1-3行以及第42页图10），因此，采用现有的方法制备人凝血因子VIII制剂，每1吨血浆能制备得到112366IU人凝血因子VIII制剂。

将现有方法与本发明对比如下表：

由上表可以看出，采用本发明方法制备冷沉淀，得到的冷沉淀的量比现有方法高了2.24kg/吨血浆，提高比例为25.17%；以本发明冷沉淀为原料，制备人凝血因子VIII制剂时，活性回收率与现有方法相当，采用本发明方法，每1吨血浆可以多制备得到47268IU人凝血因子VIII制剂，提高比例为41.51%。

在血液制品领域，由于血浆资源非常有限，具有稀缺和不可替代性，人凝血因子VIII的分离纯化又较为复杂，因而人凝血因子VIII制剂的价格昂贵，目前，国内的人凝血因子VIII制剂，每200IU/瓶的价格最低为200元。

采用本发明方法，每1吨血浆可以多获得47268IU人凝血因子VIII制剂，也就是说，每1吨血浆的可以多获得47268元，经济效益的提高幅度可想而知。换句话说，因为血液制品的特殊性，有效成分非常敏感，活性容易丧失，因此，通过技术改进得到的收率提高，都意味着技术人员付出了极大的努力，同时也意味着巨大的经济利益的产生。

综上，采用本发明方法制备得到的冷沉淀的量大，每一吨冷沉淀可制备得到11.14kg冷沉淀，冷沉淀中人凝血因子Ⅷ的含量高，为39.43IU/g，用其进一步分离纯化制备得到人凝血因子Ⅷ制品的量也较大，充分地利用了血浆，具有良好的市场应用前景。

Claims (10)

1.一种制备冷沉淀的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

（1）融化：取新鲜冰冻血浆，升温，得温度为0～5℃融化血浆；

（2）过滤：在融化血浆温度为0～5℃的条件下，过滤，得滤液和滤渣；

（3）离心：在滤液温度为0～5℃的条件下，离心，得沉淀；

（4）合并步骤（2）得到的滤渣和步骤（3）得到的沉淀，即为冷沉淀。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述融化包括如下两个步骤：

a、预融化：将新鲜冰冻血浆静置于0～2℃环境中，使血浆升温至-10℃～0℃；

b、融化：再升温，得0～5℃融化血浆。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤a中，所述环境温度为0℃。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤b中，所述升温的方法是25～37℃水浴。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述过滤采用堰式滤器过滤。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述离心的离心力为14000～15900g。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述离心采用型号为GQ142的高速管式离心机离心。

8.一种制备凝血因子Ⅷ制剂的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

a、按照权利要求1～7任意一项所述方法制备冷沉淀；

b、溶解冷沉淀；

c、用聚乙二醇沉淀法沉淀，离心，得上清；

d、SD法病毒灭活；

e、采用离子交换层析法或者用氯化钠/甘氨酸盐析法纯化；

f、除菌、分装、冻干、干热灭活，即可。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤b中，溶解冷沉淀采用的缓冲液为0.02MTris缓冲液。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤c中，所述聚乙二醇沉淀法采用30%聚乙二醇进行沉淀；

步骤e中，所述离子交换层析采用的凝胶为Toyopearl DEAE650M，缓冲液为0.001M～0.05M的枸橼酸钠缓冲液；

步骤e中，所述氯化钠/甘氨酸盐析法中，溶液中氯化钠的终浓度为15%（w/v），甘氨酸的终浓度为7.5%（w/v）。