CN105315360A - 一种同时制备高纯人凝血因子viii及人纤维蛋白原的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种冷沉淀与组分I沉淀混合投料同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，步骤包括：（1）冷沉淀与组分I同时投料、溶解；（2）DEAE？Sephadex？A-50？凝胶吸附；（3）S/D病毒灭活；（4）阴离子交换柱层析；（5）层析穿透液经两步低温乙醇沉淀纯化、除菌过滤、分装、冻干及干热病毒灭活制得人纤维蛋白原；（6）层析洗脱液进一步疏水柱层析；（7）疏水柱洗脱液经超滤、纳米膜过滤、除菌过滤、分装、冻干及干热病毒灭活制得高纯人凝血因子VIII。本发明工艺将两种原料均含有的FVIII与Fg同时提取出来，大大提高了两种产品的得率，其中人凝血因子VIII可达20万IU/吨血浆，人纤维蛋白原超过2000瓶/吨血浆，均远高于传统工艺。

Description

一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法
技术领域
本发明属生物制药领域，涉及一种血液制品的制备，具体讲是涉及一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法。
背景技术
人凝血因子VIII(FVIII)是在肝脏中合成的人体凝血因子之一，有2332个氨基酸残基，由两条肽链所组成，重链分子量为90～200kDa；轻链分子量为80kDa，二条肽链间由Ca2+连接。在人体内的半衰期8~12小时，血浆中的含量仅为0.05～0.1mg/升。FVIII缺乏会导致甲型血友病发生，该病是一种遗传性疾病，患者多为男性，发病率约1/10000~1/5000，患者出血部位集中于关节、肌肉和内脏。其中，关节反复出血导致骨骼变形，肌肉萎缩；而内脏和颅内出血则会危及生命。甲型血友病因属遗传性疾病,目前尚无根治的方法，只能通过输注FⅧ制剂进行替代性治疗，只要定期输注FⅧ制剂，甲型血友病患者完全可以像正常人一样生活。
人纤维蛋白原（humanfibrinogen，简称Fg）,是一种含2964个氨基酸、具有凝血功能的蛋白质,由肝脏合成，它是人体所有凝血因子中含量最大的一种，血浆中含量2～4克/升，分子量340KD，半衰期4～6日，等电点5.10-5.50，沉降系数7.70-7.90。Fg由α、β、γ三对不同多肽链所组成，多肽链间以二硫键相连。人体凝血的最后阶段是在凝血酶作用下，Fg的α链与β链分别释放出A肽与B肽，生成纤维蛋白单体，进一步在Ca2+与活化的XIII因子作用下，单体之间以共价键相连，变成稳定的不溶性纤维蛋白凝块，从而完成凝血过程。Fg缺乏会导致各类凝血方面的疾病，常见的包括：先天性纤维蛋白原减少或缺乏症,以及因肝损伤、肝硬化、弥散性血管内凝血、外伤、产后大出血、大手术、内出血等导致的后天性纤维蛋白原缺少症。因先天因素引起的Fg减少或缺乏症,补充Fg是目前唯一可靠的治疗方法,而对于后天因素引起的Fg减少或缺乏,根据病因的不同,也需输注不同剂量的Fg。Fg除直接参与凝血过程外,还可介导血小板聚集,影响血液粘度,是心、脑血管病发病的重要危险因素，在动脉粥样硬化的形成及肿瘤血行转移等病理过程中也起重要作用。
近年来，一种具有高效止血功能的外科用血液制品——人纤维蛋白粘合剂在临床上的应用越来越广泛，也使得作为该药配伍之一的高浓度人纤维蛋白原的需求量大增.人纤维蛋白粘合剂所用的Fg与常规静脉输注的Fg很大的不同，主要体现在前者具有很高的蛋白浓度，至少是后者（一般为2.5%）的二倍或者更高。
Fg制品最大的问题在于冻干粉复溶时间长且溶解时需在30-37℃的水浴中进行，另一个问题是容易产生蛋白析出及蛋白颗粒悬浮，这给临床使用带来了不便，譬如必须提前从冰箱里取出置于水浴中，静脉输注时需配备过滤装置。低浓度人纤维蛋白原尚且如此，高浓度人纤维蛋白原的复溶就更困难了。因此用常规的人纤维蛋白原生产工艺很难制备出合格的高浓度纤维蛋白原产品。
目前，国内血制品公司供应市场的FⅧ产品数量十分有限，患者经常面临无药可用的情况，严重危害患者的健康和生命安全。国内目前血制品厂家的FVIII制备工艺得率普遍较低，一般不高于10万IU/吨血浆（FVIII含量一般为70~80万IU/吨血浆），同时产品纯度不高，比活一般不高于50IU/mg，另外产品的外观欠佳，冻干粉不成饼状，复溶后乳光较重，有的还有蛋白析出。
目前我国也仅有少数几家血制品公司具有人纤维蛋白原的生产能力，但产量均不大，有的公司生产断断续续，基本处于停顿状态，因而纤维蛋白原在临床上也处于供应不足的状态,作为人纤维蛋白粘合剂配伍的高浓度人纤维蛋白原,由于技术难度较高,国内仅个别厂家有能力生产。
传统的生产工艺，大都是用冷沉淀生产人凝血因子VIII,用组分I生产人纤维蛋白原，这种工艺的缺点在于，冷沉淀中含有的人纤维蛋白原（约占血浆Fg的20%）被当作生产废料扔掉了；同样地，组分I中含有的大量FVIII也未回收利用而白白损失。
鉴于此,本发明开发了一种冷沉淀与组分I沉淀混合投料，同时制备高纯FVIII与人纤维蛋白原的新工艺，降低了劳动强度，缩短了生产周期，大大提高了FVIII与Fg的得率与纯度，明显改善了人纤维蛋白原的品质，使得高浓度纤维蛋白原的外观得到明显改善，复溶时间大大缩短，可以大规模进行生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺稳定、产品质量好、得率高、生产成本低及生产效率高的同时制备人凝血因子VIII及纤维蛋白原的方法。
1.一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：生产流程包括如下步骤:
（1）冷沉淀与组分I沉淀制取
将新鲜冰冻血浆融化，保持血浆温度在1-3℃，离心得到冷沉淀，保持0-5℃，暂存；在去冷沉淀血浆中加入-20℃以下的低温95%乙醇，使血浆中乙醇含量约7-9%,调节PH值至6.80-7.00，在-1~-3℃下离心得到组分I沉淀；然后立即将冷沉淀与组分I沉淀合并在一起，切成碎块；
（2）冷沉淀与组分I沉淀共溶解并压滤
按1：10~20的重量比，将切成碎块的新鲜冷沉淀及组分I沉淀一起投入预先配制的溶解缓冲液1中，温度控制在15-30℃，搅拌2.5-5小时，使其充分溶解；然后用PALL公司生产的Supradur50P滤板串联0.45μm滤芯压滤，收集澄清滤液；过滤前用溶解缓冲液1预洗滤板及滤芯；
（3）DEAESephadexA-50凝胶吸附并过滤
在步骤（2）收集的滤液中加入预先用65℃以上的热注射用水溶胀后用25℃以下的冷注射用水冷却再用步骤（2）所述溶解缓冲液1平衡的DEAESephadexA-50凝胶,按凝胶溶胀前的重量（干重）计，凝胶的加入量为0.5-1.5克/kg溶解缓冲液1；凝胶加入到滤液后缓慢搅拌45-75分钟，后静置5-10分钟；然后过滤，收集滤液；
（4）S/D病毒灭活
在步骤（3）收集的滤液中加入Tween80至1.0%（wt%）,TNBP（磷酸三丁酯）至0.3%（wt%），搅匀后升温至24-26℃，后保温6-8小时，然后用0.45μm滤芯过滤，收集滤液；
（5）阴离子交换柱层析
步骤（4）收集的滤液上阴离子交换柱进行层析，柱子预先用平衡缓冲液1充分平衡；上柱过程中，收集穿透液，上柱结束后，用平衡缓冲液1冲洗柱子，将冲洗液并入穿透液中；后用洗涤缓冲液1洗涤柱子，再用洗脱缓冲液1洗脱柱子，收集洗脱液即为纯化的FVIII溶液,及时用0.45μm滤芯进行过滤,收集滤液；洗脱液的滤液按照以下6A-11A步骤进行，而流穿液按6B-11B步骤进行；
（6A）疏水柱层析；以上洗脱液滤液中加入氯化钠至1.8M-2.5M,然后上疏水柱,柱子预先用平衡缓冲液2充分平衡；上柱结束后用平衡缓冲液2冲洗柱子，后用洗涤缓冲液2洗涤柱子，再用洗脱缓冲液2洗脱，收集洗脱液即为高纯FVIII溶液；用0.45μm或0.22μm滤芯过滤，收集滤液；
（7A）用10K~30K的超滤膜浓缩以上滤液，然后恒体积透析4-6倍，再浓缩至凝血FVIII活力高于35IU/ml;后移出超滤膜包并后洗膜包；
（8A）调节FVIII含量至所需值（一般规格为20-30IU/ml），加入稳定剂，后调PH值至6.50-7.50；
（9A）用0.1μm滤芯串联15-20纳米滤芯进行除病毒过滤
（10A）用0.22μm滤芯对产品进行除菌过滤并分装；
（11A）冻干；
（12A）干热病毒灭活
将人凝血因子VIII冻干制剂在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活；
（6B）将流穿液温度降至-2~0℃时，缓慢加入-20℃以下的低温95%乙醇溶液至浓度为7-9%（V/V）,调解PH值至6.80-7.20，保持温度-3.0-0℃，均匀搅拌1.5-3小时后离心，得到第一次Fg沉淀，立即切碎；
（7B）按1：10-20的稀释比，将以上切碎的新鲜Fg沉淀投入预先配制的溶解缓冲液2中溶解，在20-30℃下均匀搅拌2-3小时；用30SP深层滤芯(3M公司CUNO滤芯)串联一只1.0μm的滤芯过滤悬浮液；用上述溶解缓冲液2后洗滤芯，收集滤液；
（8B）将滤液降温至-1℃左右，缓慢加入低温乙醇（不高于-20℃）至7-9%；搅拌2-3小时，低温（-2-0℃）离心，得到第二次Fg沉淀，立即切碎；
（9B）根据终产品的蛋白浓度要求（一般为2.5-6.0%），将以上切碎的新鲜沉淀投入预先配制的溶解缓冲液3中，在20-30℃下搅拌0.5-2小时，后调节蛋白浓度至所需值，调PH值至6.50-7.50，用0.45μm的滤芯过滤并用溶解缓冲液3后洗滤芯，收集滤液；
（10B）除菌过滤并分装；
（11B）冻干；
（12B）干热病毒灭活
将人纤维蛋白原冻干制剂在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。
2.根据权利要求1所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤（2）所述的溶解缓冲液1的组成为0.01M-0.02MTRIS(三羟甲基氨基甲烷)、0.03M-0.06M柠檬酸钠、0.02M-0.04M赖氨酸盐酸盐、0.1M-0.15M氯化钠，其余为水；溶解缓冲液中同时加入肝素钠，加入量为3000-12000IU/kg溶解缓冲液1；所述溶解缓冲液1的PH6.50-7.50。
3.根据权利要求1所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤（5）所述的阴离子交换柱所用填料为CaptoDEAE，Q-SepharoseFF，Q-Sepharose4FF，Q-SepharoseHP及CaptoQ中的任意一种；所述的平衡缓冲液1组成为0.01M-0.02MTRIS，0.03M-0.06M柠檬酸钠，0.02-0.04M赖氨酸盐酸盐，0.1M-0.15M氯化钠，0.005M-0.015M氯化钙，其余为水；所述平衡缓冲液1的PH6.50-7.50；所述洗涤缓冲液1的组成为0.01M-0.02MTRIS，0.2M-0.3M氯化钠，0.005M-0.015M氯化钙，其余为水；所述洗涤缓冲液1的PH6.50-7.50；所述洗脱缓冲液1的组成为0.01M-0.02MTRIS，0.5M-2.0M氯化钠，0.001M-0.005M氯化钙，其余为水；所述洗脱缓冲液1的PH6.50-7.50。
4.根据权利要求1所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤（6A）所述的疏水柱所用填料为CaptoPhenyl(LS),PhenylSepharose6FF（LS）,OctylSepharose4FF中的任意一种；所述的平衡缓冲液2组成为0.01M-0.02MTRIS,1.8M-2.5M氯化钠,0.01M-0.02M氯化钙,其余为水；所述的平衡缓冲液1的PH6.50-7.50；所述的洗涤缓冲液2的组成为0.01M-0.02MTRIS，0.6M-1.6M氯化钠，0.01-0.02M氯化钙,其余为水；所述的洗涤缓冲液2的PH6.50-7.50；所述的洗脱缓冲液2的组成为0.01M-0.02MTRIS，0.001M-0.003M氯化钙，其余为水；所述洗脱缓冲液2的PH6.50-7.50。
5.根据权利要求1所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤（7B）所述的溶解缓冲液2组成为0.01M-0.02MTRIS，0.03M-0.06M柠檬酸钠,0.5-3%甘氨酸，0.5-3%精氨酸盐酸盐，0.075M-0.15M氯化钠，其余为水；所述的溶解缓冲液2的PH6.50-7.50。
6.根据权利要求1所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤（9B）所述的溶解缓冲液3组成为0.03M-0.06M柠檬酸钠,0.01M-0.15M氯化钠，甘氨酸0.5-3%，精氨酸盐酸盐0.5-3%，其余为水；所述的溶解缓冲液3的PH6.50-7.50。
7.根据权利要求1所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤（8A）所述的FVIII的稳定剂为甘氨酸，所述的甘氨酸的浓度为0.5-3%。
8.根据权利要求1-7所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：分别从冰冻血浆中制取冷沉淀与组分I沉淀，但将冷沉淀与组分I沉淀混和投料用于FVIII与Fg的生产，且投料时冷沉淀与组分I均为新鲜组分，未经冷冻储存。
9.根据权利要求1-8所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：冷沉淀与组分I沉淀混和投料并充分溶解后用压滤而不是离心的方法获得上清液。
10.根据权利要求1-9所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：人凝血因子VIII冻干制剂经过S/D、纳米膜过滤及干热三步病毒灭活步骤，人纤维蛋白原制剂经过S/D及干热两步病毒灭活步骤。
本发明的优势：
1，本发明采用冷沉淀与组分I沉淀混和后一起投料，同时制备FVIII与Fg,明显提高了生产效率，减少了劳动强度，节省化学品与耗材，特别是冷沉淀与组分I中所含的Fg同时被提取，使得Fg的得率明显提高，可达2000瓶/吨血浆以上（0.5克/瓶）；同样地，冷沉淀与组分I中所含的FVIII一同被提取，也使FVIII的得率明显提高，可达20万IU/吨血浆以上；两种产品的得率均远高于传统工艺；
2，本发明因采用DEAESephadexA-50凝胶吸附去除悬浮液中的维生素K依赖的凝血因子(FII,FVII,FIX,FX)代替传统的氢氧化铝凝胶吸附或PEG沉淀，减少了FVIII与Fg的损失，也使FVIII与Fg的得率进一步提高；
3，本发明采用离子交换层析结合疏水层析，大幅提高了FVIII的纯度，比活250IU/mg左右，远高于传统工艺制备的产品（不大于50IU/mg）；
4，本发明因采用DEAESephadexA-50凝胶吸附去除了悬浮液中的维生素K依赖的凝血因子(FII,FVII,FIX,FX)，使得Fg在生产过程被凝血酶激活的概率明显下降，同时由于经过了柱层析精制，使得Fg的纯度明显提高(>85%),终产品的品质（如复溶时间及外观等）明显改善；
5，本发明在悬浮液预处理阶段采用压滤法取代离心法，避免了高速离心过程中强剪切力及泡沫，从而减少了蛋白变性失活的机会，FVIII及Fg产品更加稳定；
6，本发明生产工艺制备的FVIII为白色均匀海绵状，复溶时间极快，复溶液澄明，无蛋白析出，几乎无乳光；
7，本发明生产工艺制备的Fg冻干粉为白色均匀海绵状，复溶时间很快，复溶液澄明，无乳光，无蛋白析出亦无蛋白颗粒。
附图说明
图1是同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的说明，不能认为本发明的实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下所做出的若干简单的改变或替换，都应视为属于本发明权利要求书确定的专利保护范围。
实施例一
1,按工艺流程步骤1所述的方法制备冷沉淀与组分I沉淀，称取冷沉淀与组分I沉淀各0.5kg，一起投入10kg预先配制的溶解缓冲液1中，溶解缓冲液1组成为0.02MTRIS-HCL，0.06M柠檬酸钠，0.02M赖氨酸盐酸盐，0.15MNaCL，PH6.90-7.10；溶解缓冲液1中预先加入肝素钠至6000IU/kg；温度控制在25-30℃，搅拌2小时使其充分溶解；然后用颇尔公司生产的Supradur50P滤板串联0.45μm滤芯过滤，收集滤液；过滤前用溶解缓冲液1预洗滤板及滤芯；
2,以上滤液中加入预先溶胀、冷却并用上一步骤所述的溶解缓冲液1平衡的DEAESephadexA-50凝胶,凝胶按干胶计加入量为5.5g；缓慢搅拌1小时，后静置10分钟；然后用滤布过滤，收集滤液；
3,以上滤液中加入Tween80至1.0%（wt%）,TNBP（磷酸三丁酯）至0.3%（wt%），搅匀后升温至24-26℃，后保温6小时，然后用0.45μm滤芯过滤，收集滤液；
4,以上滤液上CaptoQ柱，柱子预先用平衡缓冲液1充分平衡，平衡缓冲液1组成为0.02MTRIS-HCL，0.03M柠檬酸钠，0.02M赖氨酸盐酸盐，0.15MNaCL，0.015MCaCL2，PH6.80-7.00）；用带冷媒夹套的不锈钢罐收集流穿液；上柱结束后，用平衡缓冲液1冲洗柱子，冲洗液并入流穿液；用洗涤缓冲液1（0.02MTRIS-HCL，0.2MNaCL，0.015MCaCL2，PH6.80-7.00）洗涤柱子，再用洗脱缓冲液1（0.02MTRIS-HCL，2.5MNaCL，0.002MCaCL2，PH6.80-7.00）洗脱，及时用0.45μm滤芯进行过滤,收集滤液；滤液直接上CaptoPhenyl(LS),柱子预先用平衡缓冲液2充分平衡，平衡缓冲液2组成为0.02MTRIS-HCL,2.5MNaCL,0.01MCaCL2,PH6.80-7.00；上柱结束后，用平衡缓冲液2冲洗柱子，后用洗涤缓冲液2（0.02MTRIS-HCL，0.8MNaCL，0.01MCaCL2,PH6.80-7.00）洗涤柱子，再用洗脱缓冲液2（0.02MTRIS-HCL，0.002MCaCL2,PH6.80-7.00）洗脱，收集洗脱液；用0.45μm滤芯过滤以上洗脱液，收集滤液；用10K的超滤膜浓缩以上滤液，然后恒体积透析5倍，再浓缩至凝血FVIII活力高于35IU/ml;后移出超滤膜包并后洗膜包；调节FVIII含量至所30IU/ml，加入甘氨酸至3%，后调PH值至6.50-7.50；用0.1μm滤芯串联20纳米滤芯进行除病毒过滤；用0.22μm滤芯对产品进行除菌过滤并分装；然后进冻干机进行冻干，获得FVIII冻干制剂；将FVIII冻干制剂在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活；
5,将步骤4收集的流穿液温度降至-3~0℃时，缓慢加入低温95%乙醇溶液（温度不高于-20℃）至浓度为7-9%（V/V）,调解PH值至6.80-7.00，保持温度-3~-1℃，均匀搅拌3小时后离心，得到一次Fg沉淀；将此Fg沉淀立即摊薄切碎成小块,按1：20的稀释比,将切碎后的沉淀投入预先配制的溶解缓冲液中(0.02MTRIS，0.06M柠檬酸钠,1%甘氨酸，1%精氨酸盐酸盐，0.15M氯化钠，PH6.80-7.00)溶解，25-30℃下均匀搅拌2小时；用30SP深层滤芯(3M公司CUNO滤芯)串联一只1.0μm的滤芯过滤悬浮液；用上述溶解缓冲液后洗滤芯，收集滤液；将滤液降温至-1℃左右，缓慢加入低温乙醇（不高于-20℃）至7-9%；搅拌2小时，低温（-3~-1℃）离心，收集沉淀，弃上清液；按1：6的稀释比，用溶解缓冲液（0.06M柠檬酸钠,精氨酸盐酸盐1.5%，甘氨酸1.5%，0.15MNaCL，PH6.90-7.10）溶解收集的沉淀，在25-30℃下搅拌1小时，用一只0.45μm的滤芯过滤悬浮液并用溶解缓冲液后洗滤芯，收集滤液；将蛋白浓度至2.50-3.0%；除菌分装；送进冻干机进行冻干，获得Fg冻干制剂；将Fg冻干制剂在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。
实施例二
1,同实施例一；
2,以上滤液中加入预先溶胀、冷却并用上步所述的溶解缓冲液1平衡的DEAESephadexA-50凝胶,凝胶按干胶计加入量为11g，PH6.90-7.10；缓慢搅拌至少45分钟，后静置30分钟；然后用滤布过滤，收集滤液；
3,同实施例一；
4,以上病毒灭活后的滤液上CaptoDEAE柱，柱子预先用平衡缓冲液1充分平衡，平衡缓冲液1组成为0.02MTRIS-HCL，0.06M柠檬酸钠，0.02M赖氨酸盐酸盐，0.1MNaCL，0.01MCaCL2PH7.40-7.50）；用带冷媒夹套的不锈钢罐收集流穿液，上柱结束后，用平衡缓冲液1冲洗柱子，冲洗液并入流穿液；后用洗涤缓冲液1（0.02MTRIS-HCL，0.3MNaCL，0.01MCaCL2，PH7.40-7.50）洗涤柱子，再用洗脱缓冲液1（0.02MTRIS-HCL，0.6MNaCL，0.001MCaCL2，PH7.40-7.50）洗脱，及时用0.45μm滤芯进行过滤,收集滤液；加入NaCL至2.2M,上PhenylSepharose6FF(LS),柱子预先用平衡缓冲液2充分平衡，平衡缓冲液2组成为0.02MTRIS-HCL,2.2MNaCL,0.01MCaCL2,PH7.40-7.50；上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，后用洗涤缓冲液2（0.02MTRIS-HCL，1.0MNaCL，0.01MCaCL2,PH7.40-7.50）洗涤柱子，再用洗脱缓冲液2（0.02MTRIS-HCL，0.002MCaCL2,PH7.40-7.50）洗脱，收集洗脱液；用0.45μm滤芯过滤以上洗脱液；用30K的超滤膜浓缩以上滤液，然后恒体积透析4倍，再浓缩至凝血FVIII活力高于35IU/ml;后移出超滤膜包并后洗膜包；调节FVIII含量至所30IU/ml，加入甘氨酸至1.5%，后调PH值至6.90-7.10；用0.1μm滤芯串联20纳米滤芯进行除病毒过滤；用0.22μm滤芯对产品进行除菌过滤并分装；然后进冻干机进行冻干，获得FVIII冻干制剂；将FVIII冻干制剂在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活；
5,将步骤4收集的流穿液温度降至-3~0℃，缓慢加入低温95%乙醇溶液（温度不高于-20℃）至浓度为7-9%（V/V）,调解PH值至7.40-7.50，保持温度-3~-1℃，均匀搅拌2小时后离心，得到第一次Fg沉淀；将此Fg沉淀立即摊薄切碎成小块,按1：15的稀释比,将切碎后的沉淀投入预先配制的溶解缓冲液中(0.02MTRIS，0.04M柠檬酸钠,甘氨酸0.5%，精氨酸盐酸盐3%，0.15M氯化钠，PH7.40-7.50)溶解，20-25℃下均匀搅拌3小时；用30SP深层滤芯(3M公司CUNO滤芯)串联一只1.0μm的滤芯过滤悬浮液；用上述溶解缓冲液后洗滤芯，收集滤液；将滤液降温至-1℃左右，缓慢加入低温乙醇（不高于-20℃）至7-9%；搅拌3小时，低温（-3~-1℃）离心得到第二次Fg沉淀；按1：2.5的稀释比，用溶解缓冲液（0.04MNa-Citrate,0.05MNaCL，精氨酸盐酸盐2%，甘氨酸1%，PH6.90-7.10）溶解收集的沉淀，在25-30℃下搅拌2小时，用一只0.45μm的滤芯过滤悬浮液并用溶解缓冲液后洗滤芯，收集滤液；将蛋白浓度至5.0-5.5%；除菌分装；送进冻干机进行冻干，获得Fg冻干制剂；将Fg冻干制剂在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。
实施例三
1~3同实施例一；
4,以上病毒灭活后的滤液上QSepharose4FF柱，柱子预先用平衡缓冲液1充分平衡，平衡缓冲液1组成为0.02MTRIS-HCL，0.05M柠檬酸钠，0.04M赖氨酸盐酸盐，0.15MNaCL，0.015MCaCL2PH6.60-6.80）；用带冷媒夹套的不锈钢罐收集流穿液；上柱结束后，用平衡缓冲液1冲洗柱子，冲洗液并入流穿液；后用洗涤缓冲液1（0.02MTRIS-HCL，0.2MNaCL，0.01MCaCL2，PH6.60-6.80）洗涤柱子，再用洗脱缓冲液1（0.02MTRIS-HCL，1.0MNaCL，0.003MCaCL2，PH6.60-6.80）洗脱，及时用0.45μm滤芯进行过滤,收集滤液；加入NaCL至1.8M,上PhenylSepharose6FF(LS),柱子预先用平衡缓冲液2充分平衡，平衡缓冲液2组成为0.02MTRIS-HCL,1.8MNaCL,0.015MCaCL2,PH6.60-6.80；上柱结束后，用平衡缓冲液2冲洗柱子，后用洗涤缓冲液2（0.02MTRIS-HCL，1.2MNaCL，0.015MCaCL2,PH6.60-6.80）洗涤柱子，再用洗脱缓冲液2（0.02MTRIS-HCL，0.001MCaCL2,PH6.90-7.10）洗脱，收集洗脱液；用0.45μm滤芯过滤以上洗脱液；用10K的超滤膜浓缩以上滤液，然后恒体积透析5倍，再浓缩至凝血FVIII活力高于35IU/ml;后移出超滤膜包并后洗膜包；调节FVIII含量至所30IU/ml，加入甘氨酸至1%，后调PH值至6.90-7.10；用0.1μm滤芯串联20纳米滤芯进行除病毒过滤；用0.22μm滤芯对产品进行除菌过滤并分装；然后进冻干机进行冻干，获得FVIII冻干制剂；将FVIII冻干制剂在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活；
5,将步骤4收集的流穿液温度降至-3~0℃时，缓慢加入低温95%乙醇溶液（温度不高于-20℃）至浓度为7-9%（V/V）,调解PH值至6.60-6.80，保持温度-3~-1℃，均匀搅拌2.5小时后离心，得到一次Fg沉淀；将此Fg沉淀立即摊薄切碎成小块,按1：18的稀释比,将切碎后的沉淀投入预先配制的溶解缓冲液中(0.02MTRIS，0.03M柠檬酸钠,甘氨酸2.5%，精氨酸盐酸盐0.5%，0.15M氯化钠，PH7.40-7.50)溶解，20-25℃下均匀搅拌3小时；用30SP深层滤芯(3M公司CUNO滤芯)串联一只1.0μm的滤芯过滤悬浮液；用上述溶解缓冲液后洗滤芯，收集滤液；将滤液降温至-1℃左右，缓慢加入低温乙醇（不高于-20℃）至7-9%；搅拌3小时，低温（-3~-1℃）离心，收集沉淀，弃上清液；按1：5的稀释比，用溶解缓冲液（0.03M柠檬酸钠,0.075M氯化钠，精氨酸盐酸盐2.5%,甘氨酸0.5%，PH6.90-7.10）溶解收集的沉淀，在25-30℃下搅拌1.5小时，用一只0.45μm的滤芯过滤悬浮液并用溶解缓冲液后洗滤芯，收集滤液；将蛋白浓度至2.5-3.0%；除菌分装；送进冻干机进行冻干，获得Fg冻干制剂；
6,将Fg冻干制剂在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。
表试制品FVIII及Fg收率及关键技术指标一览表

Claims (10)

1.一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：生产流程包括如下步骤:
（1）冷沉淀与组分I沉淀制取
将新鲜冰冻血浆融化，保持血浆温度在1-3℃，离心得到冷沉淀，保持0-5℃，暂存；在去冷沉淀血浆中加入-20℃以下的低温95%乙醇，使血浆中乙醇含量约7-9%,调节PH值至6.80-7.00，在-1~-3℃下离心得到组分I沉淀；然后立即将冷沉淀与组分I沉淀合并在一起，切成碎块；
（2）冷沉淀与组分I沉淀共溶解并压滤
按1：10~20的重量比，将切成碎块的新鲜冷沉淀及组分I沉淀一起投入预先配制的溶解缓冲液1中，温度控制在15-30℃，搅拌2.5-5小时，使其充分溶解；然后用PALL公司生产的Supradur50P滤板串联0.45μm滤芯压滤，收集澄清滤液；过滤前用溶解缓冲液1预洗滤板及滤芯；
（3）DEAESephadexA-50凝胶吸附并过滤
在步骤（2）收集的滤液中加入预先用65℃以上的热注射用水溶胀后用25℃以下的冷注射用水冷却再用步骤（2）所述溶解缓冲液1平衡的DEAESephadexA-50凝胶,按凝胶溶胀前的重量（干重）计，凝胶的加入量为0.5-1.5克/kg溶解缓冲液1；凝胶加入到滤液后缓慢搅拌45-75分钟，后静置5-10分钟；然后过滤，收集滤液；
（4）S/D病毒灭活
在步骤（3）收集的滤液中加入Tween80至1.0%（wt%）,TNBP（磷酸三丁酯）至0.3%（wt%），搅匀后升温至24-26℃，后保温6-8小时，然后用0.45μm滤芯过滤，收集滤液；
（5）阴离子交换柱层析
步骤（4）收集的滤液上阴离子交换柱进行层析，柱子预先用平衡缓冲液1充分平衡；上柱过程中，收集穿透液，上柱结束后，用平衡缓冲液1冲洗柱子，将冲洗液并入穿透液中；后用洗涤缓冲液1洗涤柱子，再用洗脱缓冲液1洗脱柱子，收集洗脱液即为纯化的FVIII溶液,及时用0.45μm滤芯进行过滤,收集滤液；洗脱液的滤液按照以下6A-11A步骤进行，而流穿液按6B-11B步骤进行；
（6A）疏水柱层析；以上洗脱液滤液中加入氯化钠至1.8M-2.5M,然后上疏水柱,柱子预先用平衡缓冲液2充分平衡；上柱结束后用平衡缓冲液2冲洗柱子，后用洗涤缓冲液2洗涤柱子，再用洗脱缓冲液2洗脱，收集洗脱液即为高纯FVIII溶液；用0.45μm或0.22μm滤芯过滤，收集滤液；
（7A）用10K~30K的超滤膜浓缩以上滤液，然后恒体积透析4-6倍，再浓缩至凝血FVIII活力高于35IU/ml;后移出超滤膜包并后洗膜包；
（8A）调节FVIII含量至所需值（一般规格为20-30IU/ml），加入稳定剂，后调PH值至6.50-7.50；
（9A）用0.1μm滤芯串联15-20纳米滤芯进行除病毒过滤
（10A）用0.22μm滤芯对产品进行除菌过滤并分装；
（11A）冻干；
（12A）干热病毒灭活
将人凝血因子VIII冻干制剂在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活；
（6B）将流穿液温度降至-2~0℃时，缓慢加入-20℃以下的低温95%乙醇溶液至浓度为7-9%（V/V）,调解PH值至6.80-7.20，保持温度-3.0-0℃，均匀搅拌1.5-3小时后离心，得到第一次Fg沉淀，立即切碎；
（7B）按1：10-20的稀释比，将以上切碎的新鲜Fg沉淀投入预先配制的溶解缓冲液2中溶解，在20-30℃下均匀搅拌2-3小时；用30SP深层滤芯(3M公司CUNO滤芯)串联一只1.0μm的滤芯过滤悬浮液；用上述溶解缓冲液2后洗滤芯，收集滤液；
（8B）将滤液降温至-1℃左右，缓慢加入低温乙醇（不高于-20℃）至7-9%；搅拌2-3小时，低温（-2-0℃）离心，得到第二次Fg沉淀，立即切碎；
（9B）根据终产品的蛋白浓度要求（一般为2.5-6.0%），将以上切碎的新鲜沉淀投入预先配制的溶解缓冲液3中，在20-30℃下搅拌0.5-2小时，后调节蛋白浓度至所需值，调PH值至6.50-7.50，用0.45μm的滤芯过滤并用溶解缓冲液3后洗滤芯，收集滤液；
（10B）除菌过滤并分装；
（11B）冻干；
（12B）干热病毒灭活
将人纤维蛋白原冻干制剂在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。
2.根据权利要求1所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤（2）所述的溶解缓冲液1的组成为0.01M-0.02MTRIS(三羟甲基氨基甲烷)、0.03M-0.06M柠檬酸钠、0.02M-0.04M赖氨酸盐酸盐、0.1M-0.15M氯化钠，其余为水；溶解缓冲液中同时加入肝素钠，加入量为3000-12000IU/kg溶解缓冲液1；所述溶解缓冲液1的PH6.50-7.50。
3.根据权利要求1所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤（5）所述的阴离子交换柱所用填料为CaptoDEAE，Q-SepharoseFF，Q-Sepharose4FF，Q-SepharoseHP及CaptoQ中的任意一种；所述的平衡缓冲液1组成为0.01M-0.02MTRIS，0.03M-0.06M柠檬酸钠，0.02-0.04M赖氨酸盐酸盐，0.1M-0.15M氯化钠，0.005M-0.015M氯化钙，其余为水；所述平衡缓冲液1的PH6.50-7.50；所述洗涤缓冲液1的组成为0.01M-0.02MTRIS，0.2M-0.3M氯化钠，0.005M-0.015M氯化钙，其余为水；所述洗涤缓冲液1的PH6.50-7.50；所述洗脱缓冲液1的组成为0.01M-0.02MTRIS，0.5M-2.0M氯化钠，0.001M-0.005M氯化钙，其余为水；所述洗脱缓冲液1的PH6.50-7.50。
4.根据权利要求1所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤（6A）所述的疏水柱所用填料为CaptoPhenyl(LS),PhenylSepharose6FF（LS）,OctylSepharose4FF中的任意一种；所述的平衡缓冲液2组成为0.01M-0.02MTRIS,1.8M-2.5M氯化钠,0.01M-0.02M氯化钙,其余为水；所述的平衡缓冲液2的PH6.50-7.50；所述的洗涤缓冲液2的组成为0.01M-0.02MTRIS，0.6M-1.6M氯化钠，0.01-0.02M氯化钙,其余为水；所述的洗涤缓冲液2的PH6.50-7.50；所述的洗脱缓冲液2的组成为0.01M-0.02MTRIS，0.001M-0.003M氯化钙，其余为水；所述洗脱缓冲液2的PH6.50-7.50。
5.根据权利要求1所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤（7B）所述的溶解缓冲液2组成为0.01M-0.02MTRIS，0.03M-0.06M柠檬酸钠,0.5-3%甘氨酸，0.5-3%精氨酸盐酸盐，0.075M-0.15M氯化钠，其余为水；所述的溶解缓冲液2的PH6.50-7.50。
6.根据权利要求1所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤（8A）所述的FVIII的稳定剂为甘氨酸，所述的甘氨酸的浓度为0.5-3%。
7.根据权利要求1所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：步骤（9B）所述的溶解缓冲液3组成为0.03M-0.06M柠檬酸钠,0.01M-0.15M氯化钠，甘氨酸0.5-3%，精氨酸盐酸盐0.5-3%，其余为水；所述的溶解缓冲液3的PH6.50-7.50。
8.根据权利要求1-7所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：冷沉淀与组分I沉淀分别从冰冻血浆中制取，投料时将冷沉淀与组分I沉淀混和。
9.根据权利要求1-8所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：冷沉淀与组分I沉淀混和投料并充分溶解后用压滤而不是离心的方法获得上清液。
10.根据权利要求1-9所述的一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：人凝血因子VIII冻干制剂经过S/D、纳米膜过滤及干热三步病毒灭活步骤，人纤维蛋白原冻干制剂经过S/D及干热两步病毒灭活步骤。
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