CN102580062A - 人凝血因子Ⅷ与vWF复合物或人凝血因子Ⅷ制剂的干热处理稳定剂 - Google Patents
人凝血因子Ⅷ与vWF复合物或人凝血因子Ⅷ制剂的干热处理稳定剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂。本发明稳定剂是指：组氨酸或其盐、精氨酸或其盐、赖氨酸或其盐，甘露醇、海藻糖、蔗糖，还可含有常用的甘氨酸、蔗糖、氯化钠、氯化钙、枸橼酸钠、肝素中的一种或几种。实验证明，人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII含有0.1-10％组氨酸或其盐；0.1-10％精氨酸或其盐；0.1-10％赖氨酸或其盐，0.1-10％甘氨酸，0.1-10％甘露醇，0.1-10％蔗糖和0.1-10％海藻糖的一种或几种就能在80-100℃干热环境下既能有效灭活病毒，又能有效保护人凝血因子VIII的活性，并具有合格的冻干外观及复溶外观。因此本发明可用作人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种可减少人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂在干热病毒灭活时人凝血因子VIII活性损失的稳定剂。具体而言，人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII中不添加人白蛋白，而是添加甘露醇或/和氨基酸或其盐类，在干热灭活(80℃或者100℃)病毒时能维护制剂中各类蛋白质理化性质稳定，防止蛋白变性析出；降低凝血因子活性损失，提高凝血因子VIII的回收率。
背景技术
血浆来源的人凝血因子VIII制剂(Plasma-derived Human coagulation factor VIII，pdFVIII)，是经分离纯化的含有高纯度人凝血因子VIII的血液制品。一般包含血管性血友病因子(VonWillebrand Factor，vWF)、纤维蛋白原(Fibrinogen)、纤维连接蛋白(Fibronectin)、维生素K依赖性的凝血因子II、VII、IX、X及内α抑制蛋白(inter alpha inhibitor proteins)、凝血因子V和凝血因子XIII等等。制剂中含有的人凝血因子VIII可用于甲型血友病治疗，制剂中含有的vWF因子，可用于血管性血友病的治疗。冻干保护剂不含人白蛋白成份，而是添加甘露醇或/和氨基酸或其盐类，可有效避免因人白蛋白添加所导致的潜在病毒/病原体传播的风险。
目前文献报道的无论是制备人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂，均以人血浆为原料，因此不能排除传播乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病病毒(HIV)或者其他病毒/病原体的可能性，因此制备工艺流程中必须包含病毒灭活或去除的方法。例如：血浆蛋白的热稳定专利USP4379085中提到用巴氏灭活方法处理制品；Horowitz B等[Lancet 1988 2(8604)：186-189]用磷酸三丁酯和胆酸钠进行有机溶剂和去污剂(S/D)法病毒灭活，灭活后的制品用于患者，监测1年无任何肝炎和艾滋病病毒感染案例报道。日本红十字会血浆分离中心kenji F.等[Vox sang 2006 91(2)：119-125]使用20nm纳米膜过滤方法去除人免疫球蛋白中的病毒，制剂浓度和渗透率成反比，过滤后的产品有效去除小分子非脂包膜病毒，产品无理化变化；基立福(Grifols)Santigao C等[Biologicals 2010 38(4)：486-493]使用20nm纳米膜过滤方法去除人静注免疫球蛋白中的病毒，特别是相对颗粒较小的非脂包膜病毒。
在以上各种病毒灭活/去除方法中，S/D法的反应条件比较温和，对易失活的凝血因子类制品限制少，但其作用原理只适用于脂包膜病毒的灭活，对于非脂包膜类病毒，例如：HAV、人B19没有作用。纳米膜过滤法与制品的分子、构型、理化性质密切相关，如果制品分子量较大，选用孔径较小的纳米膜则无法将病毒与制品分离，孔径较大的膜又无法实现小病毒颗粒的去除，且成本相对较高，其适用范围有一定的局限性。因此目前能够同时灭活脂包膜病毒和非脂包膜病毒的最可靠方法是加热法。湿热法，如巴氏灭活法是运用最早的病毒灭活方法，可靠性强，主用用于蛋白类制品的病毒灭活，但许多活性蛋白及酶类无法经受湿热条件下60℃10小时的严酷条件，往往需要加入大量、高浓度的稳定剂可以减少制品生物活性的损失，但灭活效果也会受到影响，同时也增加了稳定剂去除等的生产步骤，提高了生产成本，延长了生产周期。而干热法(60-100℃/10分钟-72小时，特别是80℃ 72小时或100℃ 30分钟)对脂包膜和非脂包膜病毒都有效[Vox Sang 1997 73(1)：16-23]，且干热处理往往是生产的最终步骤，其成本低，可操作性和可控制性强，因此越来越多的厂商选用干热法对制品进行病毒灭活。在干热灭活的制品中需要加入合适剂量的稳定剂用于冻干和干热灭活过程中制品活性的保护。保护剂选择一般遵循：结晶率低、最大冻结浓缩液和已干制品玻璃化温度高、吸湿性低、不含还原性基团且对人体无害，性价比高且符合相关法规要求的辅料；另外从药品的安全性和有效性考虑，干热后的制品外观、复溶时间及可见异物和活性保存率也是选择适合冻干保护剂时必须考察的关键性因素。常见的保护剂，例如：氨基酸、非还原性糖类、多元醇、表面活性剂(吐温-80)、白蛋白以及各种无机盐或有机盐，如氯化钠或枸橼酸钠等发挥保护作用。但实际使用中保护作用不够理想，实际干热处理前后的凝血因子活性回收率很难达到或超过75％，难以满足大生产的需要。至今未见有关将甘露醇或/和组氨酸、精氨酸、赖氨酸用于人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂制剂干热处理稳定剂的文献和专利报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术所存在的上述不足，提供本发明提供一种不含白蛋白的冷冻干燥人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂。
其技术方案为：
一种人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂，包括氨基酸和/或糖醇，所述的糖醇为甘露醇，所述的氨基酸为组氨酸或其盐，精氨酸或其盐，赖氨酸或其盐，糖醇含量为0.1-10％，氨基酸或其盐含量0.1-10％。
上述人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂，所述组氨酸盐为一水组氨酸盐酸盐，其含量0.1-10％。
上述人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂，所述精氨酸盐为精氨酸盐酸盐，其含量0.1-10％。
上述人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂，其特征在于，所述赖氨酸盐为赖氨酸盐酸盐，其含量0.1-10％。
本发明所述的人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂，其特征在于，还含有0.1-10％的甘氨酸。
本发明所述的人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂，其特征在于，还含有蔗糖、海藻糖、氯化钠、氯化钙、枸橼酸钠、肝素中的一种或几种。
本发明所述干热处理稳定剂在制备人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂中的应用。
本发明的有益效果：本发明的技术方案使制剂在80-100℃下干热处理过程中，凝血因子VIII活性损失少，回收率达75％以上，而且冻干外观以及复溶外观能够达到《中华人民共和国药典》(第三部2010年版)标准。在人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂中加入0.1-10％甘露醇、0.1-10％组氨酸或其盐、0.1-10％精氨酸或其盐就能在80-100℃干热下，既能达到灭活病毒效果，又能维护制剂中各类蛋白质理化性质稳定，防止蛋白变性析出；降低凝血因子活性损失，提高凝血因子VIII的回收率。
附图说明
图1是1％单因素保护剂冻干后、100℃干热和80℃干热后FVIII活性回收比较图；
图2是2％单因素保护剂冻干后、100℃干热和80℃干热后FVIII活性回收比较图；
图3是4％单因素保护剂冻干后、100℃干热和80℃干热后FVIII活性回收比较图。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明的方法作进一步详细地说明。
1.人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的制备
按照常规方法，冷沉淀用4倍体积水溶解，并加入抗凝剂肝素钠，在室温抽提30分钟后，用适量3％-6％氢氧化铝胶进行吸附，吸附后离心，上清液过层析柱用阴离子树脂DEAE 650吸附，洗涤杂蛋白后，用0.25M氯化钠洗脱，所得洗脱液进行超滤脱盐浓缩，得到人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂浓缩液半成品。
2.加入稳定剂，制备人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂冻干制剂(直至干热处理)
当组氨酸、精氨酸、赖氨酸，甘露醇、海藻糖、蔗糖、甘氨酸的浓度为1％、2％、4％时，组成的稳定剂，分别加入上述制备的人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂浓缩液半成品，除菌、分装、冻干后经80℃ 72小时或100℃ 30分钟干热病毒灭活即为成品。冻干及干热后制品外观(表1、表2、表3)
表1 1％单因素保护剂冻干后、100℃干热和80℃干热后FVIII制品外观
表2 2％单因素保护剂冻干后、100℃干热和80℃干热后FVIII制品外观
表3 4％单因素保护剂冻干后、100℃干热和80℃干热后FVIII制品外观
3.观察复溶时间和复溶样品澄明度及FVIII的活性回收率
将上述制品的制品在室温下用注射用水进行复溶，以不加制品的单因素保护剂作为阴性对照组，以仅加甘氨酸作为稳定剂的人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂也经同样的干热处理作为阳性对照，观察复溶澄明度(表4、表5、表6)，检测人凝血因子VIII冻干后、两种干热处理前后的效价，计算VIII因子的活性回收率。(表7、表8、表9、图1、图2、图3)
表4 1％单因素保护剂冻干后、100℃干热和80℃干热后FVIII制品复溶情况
表5 2％单因素保护剂冻干后、100℃干热和80℃干热后FVIII制品复溶情况
表6 4％单因素保护剂冻干后、100℃干热和80℃干热后FVIII制品复溶情况
表7 1％单因素保护剂冻干后、100℃干热和80℃干热后FVIII活性回收
表8 2％单因素保护剂冻干后、100℃干热和80℃干热后FVIII活性回收
表9 4％单因素保护剂组份冻干后、100℃干热和80℃干热后FVIII活性回收
从表1、2、3可以看出冻干后及两种干热灭活后制品外观：I组(组氨酸)、II组(精氨酸)、IV组(甘露醇)、VII组(甘氨酸)，4％III组(赖氨酸)均能合格；
从表4、5、6可以看出冻干后及两种干热灭活后制品复溶情况：100℃干热I组(组氨酸)、II组(精氨酸)、III组(赖氨酸)、IV组(甘露醇)、VII组(甘氨酸)均能合格；80℃干热I组(组氨酸)、II组(精氨酸)均能合格；
从表7、8、9可以看出，以120mM甘氨酸作为稳定剂的制品经80℃或100℃干热处理后，凝血因子VIII回收率均不超过75％，而以不同配比的氨基酸或糖醇，有部分可以在100℃干热回收率到达80％以上，各冻干制品的外观部分有明显差别，但大部分用注射用水复溶后，澄明度无影响，说明本发明稳定剂能有效保护人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂。
综上所述，组氨酸在制品冻干后、两种干热过程中，考察的外观和复溶情况均能到达要求，冻干后及干热制品FVIII效价考察中，浓度越高活性越低，但差异性不明显，整体体情况组氨酸冻干加100℃干热后活性回收率为81.89±6.99％(不同浓度均值)，因此1％、2％的组氨酸或其盐均能作为保护剂选用；精氨酸在冻干后、两种干热过程中，外观随着浓度越高，骨架支撑而萎缩，复溶情况均能达到要求，冻干后及干热制品FVIII效价考察中，差异性不明显，整体体情况精氨酸冻干加100℃干热后活性回收率为62.20±15.01％(不同浓度均值)，因此1％的精氨酸或其盐可作为保护剂选用；赖氨酸在冻干后、两种干热过程中，外观随着浓度越高，骨架支撑由萎缩逐渐变化为正常，复溶情况100℃ 30min均能达到要求，80℃72hr 1％能达到要求，冻干后及干热制品FVIII效价考察中，差异性不明显，整体体情况赖氨酸或其盐冻干加100℃干热后活性回收率为47.70±2.36％(不同浓度均值)。甘氨酸在制品冻干后、两种干热过程中外观随着浓度越高，骨架支撑由萎缩、空洞逐渐变化为正常，在两种干热过程中，外观情况无明显变化，复溶情况两种均能达到要求，冻干后及干热制品FVIII效价考察中，差异性明显，随着浓度增加，活性降低，估计和甘氨酸自身吸湿性一定关系，整体体情况甘氨酸冻干加100℃干热后活性回收率为43.62±34.85％(不同浓度均值)。甘露醇在制品冻干后、100℃干热过程中，考察的外观2％和4％能够达到要求，复溶情况均能到达要求，冻干后及干热制品FVIII效价考察中，浓度越高活性越低，有差异性，整体体情况甘露醇冻干加100℃干热后活性回收率为54.6±44.44％(不同浓度均值)，因此1％的甘露醇能作为保护剂备选；海藻糖在制品冻干后、100℃干热过程中，考察的外观和复溶情况均不能到达要求，颜色发生类似美德拉反应，干热容易产生融解状态，可能由于海藻糖自身容易吸湿，正常状态己二水水合物形式存在，结合水在冻干过程中间不易去除，海藻糖熔点从无水的203℃将至97℃，使得干热灭活后效价测定中，随着D-海藻糖浓度增加，活性保护越低的情况，因此，海藻糖不能作为干热病毒灭活的冻干保护剂备选，但是可作为其他方式的生物冻干保护剂型。蔗糖在制品冻干后、100℃干热过程中，考察的外观和复溶情况均不能到达要求，冻干后及干热制品FVIII效价考察中，整体体情况蔗糖冻干加100℃干热后活性回收率为94.64±2.76％(不同浓度均值)，因此蔗糖不能作为单因素保护剂，但是比较良好的活性保护作用，可以作为多因素保护剂进行进一步的深入研究。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂，包括氨基酸和/或糖醇，其特征在于，所述的糖醇为甘露醇，所述的氨基酸为组氨酸或其盐，精氨酸或其盐，赖氨酸或其盐，糖醇含量为0.1-10％，氨基酸或其盐含量0.1-10％。
2.根据权利要求1所述的人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂，其特征在于，所述组氨酸盐为一水组氨酸盐酸盐，其含量0.1-10％。
3.根据权利要求1所述的人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂，其特征在于，所述精氨酸盐为精氨酸盐酸盐，其含量0.1-10％。
4.根据权利要求1所述的人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂，其特征在于，所述赖氨酸盐为赖氨酸盐酸盐，其含量0.1-10％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂，其特征在于，还含有0.1-10％的甘氨酸。
6.根据权利要求1-4任一项所述的人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂，其特征在于，还含有蔗糖、海藻糖、氯化钠、氯化钙、枸橼酸钠、肝素中的一种或几种。
7.权利要求1-4任一项所述干热处理稳定剂在制备人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20170308 |