CN111518197A - 一种纤维蛋白原的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纤维蛋白原的生产方法，包括以下步骤：采集血浆和速冻血浆；融浆和去冷沉淀；制取组分I沉淀；组分I沉淀的溶解；采用S/D病毒灭活法灭活病毒；第一次乙醇沉淀、离心、溶解；第二次乙醇沉淀、离心分离沉淀；配制半成品；除菌、分装；冻干；干热病毒灭活。采用本发明所述方法具有以下优点：获得的纤维蛋白原纯度得以极大提升，可达到92％以上；凝固活力高，为18～22s；复融时间短，为5～10min；冻干后外观更加均一、稳定，收率大于2000瓶/吨血浆，收率显著提高；制品长期稳定性好，经过36个月的长期稳定性试验仍能保证很好的内在质量；双重病毒灭活使临床用药更加安全，无不良反应。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，尤其涉及一种纤维蛋白原的生产方法。
背景技术
人纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)即凝血因子I,是血浆中含量最高的凝血因子,也是凝血系统中的一“中心”蛋白质。凝血的最后阶段是凝血酶形成,使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。纤维蛋白原除直接参与凝血过程外,还可介导血小板聚集,影响血液粘度,是心、脑血管病发病的重要危险因素。在动脉粥样硬化的形成及肿瘤转移等病理过程中也起重要作用。Fg基因缺陷可导致先天性低(或无)纤维蛋白原血症,以及异常纤维蛋白原血症。
纤维蛋白原主要是作为凝血因子I而直接参与凝血过程。在凝血共同途径中,凝血酶先裂解纤维蛋白原两条Aα链氨基端Arg16-Gly17释放出一对纤维蛋白肽A,形成纤维蛋白单体I；在裂解纤维蛋白原两条Bβ链氨基端Arg14-Gly15释放出一对纤维蛋白肽B,形成纤维蛋白单体Ⅱ,暴露纤维蛋白单体的聚合部位,通过非共价结合,形成了不稳定的可溶性纤维蛋白单体。在活化的凝血因子及Ca2+的作用下,纤维蛋白单体互相交联,生成稳定的可溶性纤维蛋白,并将血液的有形成分包绕其中,形成牢固的血栓。Fg除参与凝血外,还具有其他多种功能,如与血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa结合而介导血小板聚集反应,参与动脉粥样硬化及肿瘤转移等；纤维蛋白原水平还影响血液粘度,尤其近年来人们发现血浆纤维蛋白原水平升高是心脑血管、血栓性疾病的重要危险因素。血浆纤维蛋白原也是急性时相蛋白,在很多应激状况下,如感染、严重外伤等也可短时间内升高。临床上Fg主要用于治疗先天性、获得性纤维蛋白原减少或缺乏症，及严重肝脏损伤、肝硬化、弥散性血管内凝血、产后大出血和因大手术、外伤或内出血等引起的凝血障碍。另外，Fg还是一种止血用的军事战略储备药品，每年必须有一定的储备量。
Fg的纯度是影响其内在质量的重要指标，纯度低会影响产品的凝固活力，其凝固活力会明显降低，同时复溶时间也会受到影响，有报道表明Fg的纯度低于80％，其复溶时间会超过20分钟，同时会容易产生蛋白析出及蛋白颗粒悬浮，这给临床使用带来了不便。同时纯度过低会影响Fg的稳定性，给其保存带来问题。
目前我国有11家血液制品单位具备Fg的生产能力，大多数血液制品企业采用低温乙醇的方法从组分I中提取Fg，缺点是制品的纯度较低，一般不超过80％，同时外观较差，复溶性差(20-30分钟)、收率偏低(800-1000瓶/吨血浆)。也有用冷沉淀为原料从中提取Fg，但冷沉淀中Fg含量较低，同时会造成最终成品中含有人凝血因子VIII杂质，继而造成Fg被激活使其变性，人凝血因子VIII的产量也会因此受到影响。还有采用冷沉淀与组分I共沉淀，即在融化血浆中加入一定浓度的乙醇并降温后使冷胶与组分I一起沉淀，沉淀中含有8％的乙醇，会造成沉淀中的人凝血因子VIII的变性失活。
近年来也有报道采用层析的方式制备Fg，如CN105504046A《一种人纤维蛋白原的制备方法》中采用Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析法；CN107827974A《一种人纤维蛋白原的制备方法》中所采用的是赖氨酸亲和层析和阳离子交换层析法；CN107540743A《一种双层析法制备人纤维蛋白原的方法》中采用Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和肝素亲和层析法等，层析的方法对Fg纯度有一定的提升，但存在的问题是层析填料有使用寿命，随着使用次数的增加，其纯化效果会减弱，制品的长期稳定性是否会受到影响还有待研究，同时层析填料价格昂贵，增加了生产成本，会造成药品价格昂贵，增加病人的治疗压力。
发明内容
针对以上问题，为了提升纤维蛋白原的内在质量和收率以及保证制品的长期稳定性，同时降低生产成本，本发明公开了一种大幅度提高纤维蛋白原纯度的生产工艺。本发明在传统纤维蛋白原的生产工艺基础上对其进行优化改进，使得到的最终产品收率由过去的1000瓶/吨血浆达到2000瓶/吨血浆以上，产品纯度达到92％以上；凝固活力为18～22s；复融时间短，为5～10min；冻干后外观更加均一、稳定。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种纤维蛋白原的生产方法，包括以下步骤：
(1)采集血浆和速冻血浆；
(2)融浆和去冷沉淀：将速冻后的血浆预融；之后融浆，离心分离，得到冷沉淀和上清液；
(3)制取组分I沉淀：将步骤(2)得到的上清液，调整pH值，调整乙醇浓度，之后离心，得到组分I沉淀和上清液；
(4)组分I沉淀的溶解：将步骤(3)得到的组分I沉淀溶解于溶解缓冲液I，过滤，得到滤液A；
(5)将滤液A采用S/D病毒灭活法灭活病毒，得到病毒灭活液；
(6)第一次乙醇沉淀：向步骤(5)得到的病毒灭活液中加入乙醇溶液,得到混合液A；
(7)第一次离心分离沉淀：将步骤(6)得到的混合液A离心，得到纤维蛋白原沉淀；
(8)第一次离心的纤维蛋白原溶解：将步骤(7)得到的纤维蛋白原沉淀用溶解缓冲液II溶解，得到溶解液，将溶解液过滤；
(9)第二次乙醇沉淀：将步骤(8)过滤后的溶解液加入乙醇溶液，得到混合液B；
(10)第二次离心分离沉淀：对步骤(9)得到的混合液B离心，得到纤维蛋白原沉淀；
(11)配制半成品：将步骤(10)得到的纤维蛋白原沉淀用溶解缓冲液III溶解，调节组分含量,得到半成品；
(12)除菌、分装；
(13)冻干；
(14)干热病毒灭活。
本发明的有益效果是：本发明提供的纤维蛋白原的生产方法，是一种可以提高纤维蛋白原纯度的低温乙醇生产方法，克服了传统低温乙醇方法造成纤维蛋白原纯度低、凝固活力低、外观和复溶效果差、收率低、血浆综合利用率相对较差的问题，本发明制备的纤维蛋白原制品纯度高、凝固活力好、复融时间短、外观和稳定性好，收率高，通过3年的长期稳定性数据表明该方法制备的人纤维蛋白原稳定、安全、可靠。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，纤维蛋白原的生产方法可以包括以下步骤：
(1)采集血浆和速冻血浆；
(2)融浆和去冷沉淀：将速冻后的血浆预融，预融时间为1～2小时；之后融浆；融浆后离心分离，转速为5000～5600rpm，离心机的进液量为900～1100L/min，得到冷沉淀和上清液；
(3)制取组分I沉淀：将步骤(2)得到的上清液，调整pH值7.00～7.20，调整乙醇浓度至8％，之后离心，离心的转速为5000～5600rpm，离心机的进液量为700～800L/min，得到组分I沉淀和上清液；
(4)组分I沉淀的溶解：将步骤(3)得到的组分I沉淀溶解于溶解缓冲液I，溶解缓冲液I的pH为7.2～7.4，溶解缓冲液I的重量为组分I沉淀重量的15～18倍，溶解时间为1～1.5小时，过滤，过滤的滤芯为1只30SP和4只90SP的深层滤芯串联，得到滤液A；
(5)将滤液A采用S/D病毒灭活法灭活病毒，得到病毒灭活液；
(6)第一次乙醇沉淀：向步骤(5)得到的病毒灭活液中加入乙醇溶液,得到混合液A；乙醇溶液的滴加速率为0.5～0.7kg/min；
(7)第一次离心分离沉淀：将步骤(6)得到的混合液A进行连续流离心，转速为6500rpm，离心机的进液流量为1～2L/min，出液温度为0～2℃，得到纤维蛋白原沉淀；
(8)第一次离心的纤维蛋白原溶解：将步骤(7)得到的纤维蛋白原沉淀用溶解缓冲液II溶解，溶解缓冲液II的pH为7.2～7.4，温度为34～35℃，时间为1小时，得到溶解液，之后用滤芯过滤溶解液，采用的滤芯为4只90SP的深层滤芯；
(9)第二次乙醇沉淀：将步骤(8)过滤后的溶解液加入乙醇溶液，得到混合液B，加入乙醇溶液后再搅拌30min，乙醇溶液的滴加速率为0.5～0.7kg/min；
(10)第二次离心分离沉淀：对步骤(9)得到的混合液B进行连续流离心，得到纤维蛋白原沉淀，离心转速控制在6500rpm，离心机的进液流量控制在1～2L/min，出液温度控制在0～2℃之间；
(11)配制半成品：将步骤(10)得到的纤维蛋白原沉淀用溶解缓冲液III溶解，溶解缓冲液III的pH为7.2～7.4，调节各组分含量,得到半成品；
(12)除菌、分装；
(13)冻干：将步骤(12)分装后的制品进行冻干，冻干条件包括：0℃保温2h～3h、-10℃冷却制品2h，-46℃～-48℃冷却保温4h～7h；-5℃～-2℃升华干燥50h～55h；30℃～32℃解析干燥16h～20h；
(14)干热病毒灭活。
采取上述方案的有益效果为：
步骤(2)中，本发明将原料血浆在0～4℃的预融时间由传统4～6小时缩短为1～2小时，避免了传统的冰冻血浆在室温自然融化，或预融时间过长造成纤维蛋白原的激活变性而影响纯度和收率，如发明专利《人纤维蛋白原的生产方法》(申请公布号：103405754A)等记载的方法。本发明采用融浆后离心分离，离心分离的转速为5000～5600rpm，离心机的进液量为900～1100L/min,采用这样的转速和进液量有利于提升纤维蛋白原的质量和收率及制品的稳定性。转速为5000～5600rpm的离心速度能够保证冷沉淀充分离心分离出来，同时能够保证纤维蛋白原的结构完整，进而保证纤维蛋白原制品的生物学活性，对降低溶解时间和提升凝固活力有一定的作用，进液量为900～1100L/min既能够保证冷沉淀能够充分离心分离出来，同时该流量能够保证制品处在0～4℃的低温条件，进而保证纤维蛋白原的生物学活性，对其凝固活力有一定的提升；如果转速过低容易导致冷沉淀离心分离不彻底，影响最终制品的纯度等问题，如果转速过高容易导致离心剪切力过大，易造成蛋白质的结构被破坏，进而影响其生物学活性，使最终制品的溶解时间过长，凝固活力过低等问题；如果进液量过少容易导致蛋白制品会快速被离心机降温，会使其药液低于0℃，进而出现冷冻结冰现象，使其冷沉淀分离不彻底，影响最终纤维蛋白原纯度等问题，如果进液量过多容易导致降温不彻底，蛋白质易超过4℃，进而导致蛋白变性影响最终制品溶解时间和凝固活力等问题。
步骤(3)中，离心的转速为5000～5600rpm，离心机的进液量为700～800L/min，采用这样的转速和进液量有利于提升纤维蛋白原的质量和收率及制品的稳定性。转速为5000～5600rpm的离心速度能够保证组分I沉淀充分离心分离出来，进而保证纤维蛋白原的收率，同时该离心转速有利于保持纤维蛋白原的生物学活性，进液量为700～800L/min既能够保证组分I沉淀能够充分离心分离出来，同时该流量能够保证制品处在-1～-3℃的低温条件，进而保证纤维蛋白原的生物学活性，能够降低最终制品的溶解时间和提升其凝固活力；如果转速过低容易导致组分I沉淀离心分离不彻底，影响最终制品的收率等问题，如果转速过高容易导致离心剪切力过大，易造成蛋白质的结构被破坏，进而影响其生物学活性，使最终制品的溶解时间过长，凝固活力过低等问题；如果进液量过少容易导致蛋白制品会快速被离心机降温，会使其药液低于-3℃，进而出现冷冻结冰现象，使其组分I沉淀分离不彻底，影响最终纤维蛋白原收率等问题，如果进液量过多容易导致降温不彻底，蛋白质易超过-1℃，进而导致纤维蛋白原变性影响最终制品溶解时间和凝固活力等问题。
步骤(2)和步骤(3)中，虽然都涉及了离心的步骤，但是离心的作用不同，故设置的操作参数有差别。步骤(2)中的离心是离心去除冷沉淀的步骤(冷沉淀是不需要的蛋白质)，步骤(3)的离心得到的沉淀是组分I沉淀，该沉淀用于制备纤维蛋白原，两种蛋白质的分子量、结构不同，对环境的要求不同，故在离心时设置的参数有所不同。
步骤(4)中，本发明将组分I的溶解时间由传统的10～13倍提高的15～18倍，在1～1.5h内使组分I中的纤维蛋白原快速、充分溶解，避免了因溶解不充分或是溶解时间过长造成纤维蛋白原的变性激活，使其纯度和收率降低。过滤的滤芯为1只30SP和4只90SP的深层滤芯串联，采用这样的设置有利于目标蛋白即纤维蛋白原充分过滤，杂蛋白被截留，有利于提升制品最终的纯度。
步骤(4)、(8)和(11)中，本发明将溶解缓冲液的pH由6.6～6.8调整为7.2～7.4，使纤维蛋白原在这个pH范围内达到其等电点，使其沉淀更加充分，收率较过去的pH 6.6～6.8大幅度提高。现有技术的溶解沉淀pH通常设置为6.8左右。
步骤(6)和步骤(9)中，本发明将滴加乙醇溶液的速率由1.0～1.2kg/min降低为0.5～0.7kg/min，在保证纤维蛋白原活性的前提下使其充分沉淀。滴加乙醇的速率过快，易导致酒精浓度变化过于剧烈造成纤维蛋白原的变性，影响其质量和收率，滴加乙醇速率过慢易导致制备纤维蛋白原的制作时间过长，使其活性受到影响。故本发明在保证纤维蛋白原活性的前提下使其沉淀更加充分，纯度更高，经过摸索确定最适的乙醇滴加速率，由过去的1.0～1.2kg/min降低为0.5～0.7kg/min。
步骤(7)和步骤(10)中，本发明将离心分离沉淀的进液速率由4～5L/min降低为1～2L/min，使沉淀能够被充分的离心沉降。现有技术离心分离沉淀的进液速率为2.5～3.0L/min，如发明专利《人纤维蛋白原制剂的制备方法》(申请公布号：101229367A)。离心速率过快可能会导致纤维蛋白原离心不充分造成损失，故本发明经过摸索所采用的离心分离沉淀的进液速率为1～2L/min，使纤维蛋白原沉降充分，保证其纯度和收率。
步骤(7)和步骤(10)中，离心的转速为6500rpm，出液温度为0～2℃，这样设置有利于转速为6500rpm的离心速度能够保证组分I精制沉淀能够充分离心分离出来，进而保证纤维蛋白原的收率，同时该离心转速有利于去除杂蛋白，进而保证纤维蛋白原的纯度，出液温度为0～2℃能够保证制品处在低温条件，进而保证纤维蛋白原的生物学活性，能够降低最终制品的溶解时间和提升其凝固活力。离心的转速过低容易导致杂蛋白无法被充分去除，进而影响最终制品纯度等问题，离心的转速过高容易导致离心剪切力过大，易造成蛋白质的结构被破坏，进而影响其生物学活性，使最终制品的溶解时间过长，凝固活力过低等问题。出液温度过低容易导致蛋白制品会快速被离心机降温，进而出现冷冻结冰现象，使其组分I精制沉淀分离不彻底，影响最终纤维蛋白原收率等问题，出液温度过高容易导致降温不彻底，进而导致纤维蛋白原变性影响最终制品溶解时间和凝固活力等问题。
步骤(8)中，溶解缓冲液II溶解过程中，温度控制为34～35℃，时间控制为1小时，采用这样设置有利于组分I精制沉淀的充分溶解，进而提升人纤维蛋白原的收率和纯度。温度如果过低容易导致组分I精制沉淀溶解不充分，不溶解的沉淀易被激活变性，进而影响纤维蛋白原最终的收率、纯度、溶解时间和凝固活力等问题，温度如果过高容易造成纤维蛋白原被激活形成纤维蛋白，进而影响纤维蛋白原的收率、纯度、凝固活力和溶解时间等问题。时间过短容易导致溶解不充分，不溶解的纤维蛋白原易被激活变性形成不溶的人纤维蛋白，进而影响纤维蛋白原的收率、纯度、凝固活力和溶解时间等问题，时间过长容易导致溶解过程的搅拌桨长时间接触制品，产生的剪切力易造成纤维蛋白原的结构被破坏，使其变性，影响纤维蛋白原的收率、凝固活力和溶解时间等问题。
之后，采用的滤芯为4只90SP的深层滤芯过滤溶解液，采用这种滤芯有利于目标蛋白即纤维蛋白原充分过滤，杂蛋白被截留，有利于提升制品最终的纯度和收率。
步骤(13)中，本发明通过调整冻干过程中预冻、一次干燥和解析干燥的时间，使其纤维蛋白原的冻干时间为3～4天，制品稳定，外观均一，复融时间短为5～10min，解决了传统的冻干时间在3～4天内造成最终纤维蛋白原制品结构不均一，冻干形状差，复融时间长和稳定性差等问题。
在该步骤中，冻干条件设置为：0℃保温2h～3h、-10℃冷却制品2h，-46℃～-48℃冷却保温4h～7h；-5℃～-2℃升华干燥50h～55h；30℃～32℃解析干燥16h～20h。采用该种冻干的温度和时间具有赋型好，外观均匀，溶解时间短、凝固活力高同时制品长期稳定性表现良好，适合制品的长期保存等优点。第一阶段：板温0℃保温2～3小时是确保制品在到亚稳定状态前的稳定均匀；第二阶段：板温设定在-10℃保温2小时是为了让制品平稳的经过亚稳定状态，可以使制品的外观更好结晶更细腻；第三阶段：板温设定-46～-48℃保持4-7小时是为了使制品快速的冻结并保持一段时间稳固其结构；第四阶段：板层温度-5～-2℃保持50～55小时，可以让制品在一次升华整体一直处于共熔点以下并且在接近升华结束时制品温度会向板温接近，这样有利于保持制品的生物活性不受影响同时保证其冻干外观的均匀；第五阶段：30℃～32℃解析干燥16h～20h是为了保证最终制品的水分含量达到3％左右，有利于制品的长期保存。
发明人在研究中摸索了很多冻干条件，例如：一次升华把板温控制在-5～0℃进行升华、一次升华把板温控制在-15℃进行升华、二次升华板温控制在28℃保持12小时、二次升华板温控制在32.5℃保持16-20小时等。通过比较发现，本发明采用的冻干条件是最优的冻干条件。当采用一次升华把板温控制在-5～0℃进行升华的方法，试验后出现制品外观不合格的现象。当采用一次升华把板温控制在-15℃进行升华的方法，试验后发现一次升华时间过长并且导致制品的复溶时间过长(溶解时间20分钟以上)，制品的质量下降。当采用二次升华板温控制在28℃保持12小时的方法，试验后发现制品的水分含量过高且复溶时间变长(制品的溶解时间20分钟以上)。当采用二次升华板温控制在32.5℃保持16-20小时的方法后，试验后发现制品的水分含量偏低不利于制品的长期保存。而采用本发明的冻干方法，得到的制品纯度高(可达到92％以上)、凝固活力高(为18～21s)、复融时间短(为5～8min)、收率高(大于2000瓶/吨血浆)、稳定性好(36个月长期保持稳定)。
本发明采用低温乙醇沉淀法从人的血浆中制备纤维蛋白原，通过改变传统的工艺方法，得到的制品纯度高，可达到92％以上；凝固活力高，为18～22s；复融时间短，为5～10min；冻干后外观更加均一、稳定，改善了传统低温乙醇法提取纤维蛋白原的缺陷，如制品纯度低，一般70％～80％；蛋白稳定性差；冻干制品外观较差、复融时间长，一般在20分钟以上。现有技术也有用层析的方法从组分I中提取人纤维蛋白原，如发明专利《柱层析法从组分I中提取人纤维蛋白原的方法》(申请公布号：1012212129A)，但层析法较低温乙醇法的成本高出很多，而且凝胶长期使用会产生不可逆的磨损，导致工艺参数不稳定最终影响产品收率和质量，相比较该层析法，本发明经过改造优化后的低温乙醇法制备的人纤维蛋白原其收率、纯度、凝固活力、复溶时间等指标均优于该层析法制备的产品，而且其生产成本低，条件可控，适合大规模工艺生产。
本发明从血浆组分I沉淀中提取纤维蛋白原，收率高于2000瓶/吨血浆。也有报道从冷沉淀中提取人纤维蛋白原，如发明专利《人纤维蛋白原的生产方法》(申请公布号：101703763A)由于冷沉淀中的纤维蛋白原的含量较低，产品最终收率没有从组分I中提取高，并且冷沉淀是作为人凝血因子VIII的起始原料，如果用于生产纤维蛋白原，势必会影响凝血而因子VIII的产量，造成其收率低，降低血浆的综合利用率，同时增加其生产成本。
目前还未有报道任何方法所制备的纤维蛋白原的长期稳定性结果，长期稳定性的结果决定着制品是否能在长时间保存后其质量不受任何影响，对于未来上市销售的药品有着重要的意义，本发明做了36个月的长期稳定性试验，试验结果表明其纯度、凝固活力、复溶时间等质量指标与刚制备出来的制品未有显著差异。说明本发明的制品长期稳定性好，经过36个月的长期稳定性试验仍能保证很好的内在质量。
进一步，步骤(1)中，将采集的新鲜血浆在30min内速冻并放入-30℃冷库中保存，速冻的技术为平板直冷速冻技术。
采用上述方案的有益效果是：采用平板直冷速冻技术代替传统强制对流速冻技术快速冻结原料血浆，使原料血浆由传统的4个小时的冻结时间缩短为30分钟之内，这能极大的保护凝血因子类产品如纤维蛋白原的活性，避免因为速冻时间长而造成纤维蛋白原激活变性，使其蛋白含量和纯度大幅度提升，复溶时间降低，稳定性极大提高。
进一步，步骤(2)中，预融的方法包括：将速冻后的血浆从-30℃条件转移至0～4℃条件预融，再经10℃以下的注射用水喷淋，75％的酒精喷淋消毒和注射用水冲洗酒精并吹干；融浆的方法包括：将预融后的血浆破袋后转运至融浆罐，通过夹层温度30℃的注射用水循环融化血浆；融浆后，以5000～5600rpm的速度进行连续分离离心，得到冷沉淀和上清液，并于-30℃条件保存。
采用上述方案的有益效果是：经过0～4℃条件预融有利于纤维蛋白原的提取，能够提升最终制品的纯度和收率，通过夹层温度30℃的注射用水循环融化血浆既能保证纤维蛋白原的生物学活性，同时能够使血浆快速溶解，防止其融化时间过长导致纤维蛋白原被激活形成变性的纤维蛋白，影响最终制品的凝固活力和溶解时间，该方法也能提升制品的长期稳定性。
进一步，步骤(3)中，将步骤(2)得到的上清液转移至反应罐中，控制血浆温度在0～1℃之间，用pH4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值7.00～7.20；用53.3％的乙醇溶液以≤1.5kg/min的速率滴加至血浆中，使血浆最终的乙醇浓度为8％，滴加的过程中降温，控制血浆的温度为-1～-3℃；将血浆在-1～-3℃条件下离心，转速为5000～5600rpm，得到组分I沉淀和上清液。
采用上述方案的有益效果是：血浆的pH值7.00～7.20，最终乙醇浓度8％有利于纤维蛋白原充分沉降分离，杂蛋白不会被沉降下来，进而保证纤维蛋白原的收率和纯度，乙醇溶液的滴加速度≤1.5kg/min能够保证制品一直处在一个较低的温度条件下，不会因为滴加乙醇速度过快导致制品局部温度升高而变性，滴加过程中降温，使血浆的温度为-1～-3℃，同时在-1～-3℃条件下离心，该温度范围能够保证纤维蛋白原的生物学活性，进而提升最终制品的凝固活力和溶解时间，转速为5000～5600rpm的离心速度能够保证组分I沉淀能够充分离心分离出来，进而保证纤维蛋白原的收率，同时该离心转速有利于保持人纤维蛋白原的生物学活性。
进一步，步骤(4)中，将步骤(3)离心分离得到的组分I沉淀切成碎块，称取重量，按照沉淀重量的15～18倍配制溶解缓冲液I,在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，时间为1～1.5h，采用滤芯对溶解液进行过滤；溶解缓冲液I的配方包括：柠檬酸钠的浓度为1.2％，Tris的浓度为0.27％，盐酸赖氨酸的浓度为0.44％，蔗糖的浓度为1％，氯化钠的浓度为1％，溶剂为注射用水，pH值为7.2～7.4。
采用上述方案的有益效果是：15～18的溶解倍数有利于组分I沉淀充分溶解，能够提升最终制品的收率和纯度；34～35℃、溶解时间1～1.5h的溶解条件有利于组分I沉淀的充分溶解但不会导致蛋白被激活变性，同时杂蛋白充分析出，进而提升纤维蛋白原的收率和纯度，溶解pH值为7.2～7.4，该pH远离纤维蛋白原的等电点，有利于纤维蛋白原的充分溶解，同时该pH能够充分沉降杂蛋白，有利于提升制品的纯度和凝固活力。
进一步，步骤(5)中，按步骤(4)得到的滤液A重量的0.1倍配制S/D溶液，并将S/D溶液以≤0.6kg/min的速度滴加至滤液A中,得到混合液，控制该混合液温度24～26℃，持续缓慢搅拌，保温6h进行脂包膜病毒的灭活，得到病毒灭活液；所述S/D溶液的配方包括：吐温80、磷酸三丁酯和注射用水；S/D溶液中，吐温80的质量分数为11％、磷酸三丁酯的质量分数为3.3％；使用时，将S/D溶液以≤0.6kg/min的速度滴加至滤液A中，使混合液中吐温80的终浓度为1.1％，磷酸三丁酯的终浓度为0.33％。
采用上述方案的有益效果是：采用吐温80和磷酸三丁酯有机溶剂作为凝血因子类产品的病毒灭活剂是经典的病毒灭活方法，能够充分灭活脂包膜病毒，提升制品的安全性，同时能够保证纤维蛋白原的生物学活性不受影响。
进一步，步骤(6)中，将步骤(5)得到的病毒灭活液的温度降至0～1℃，在搅拌的过程中加入-25℃的50％乙醇溶液，得到混合液A，使混合液A中的乙醇浓度达到8％，温度控制在-2至-2.5℃；滴加完毕后再持续搅拌30min；滴加50％乙醇溶液的速率为0.5～0.7kg/min。
采用上述方案的有益效果是：加入预冷-25℃的50％乙醇溶液使制品最终乙醇浓度8％有利于纤维蛋白原充分沉降分离，杂蛋白不会被沉降下来，进而保证纤维蛋白原的收率和纯度，乙醇的滴加速度0.5～0.7kg/min能够保证制品一直处在一个较低的温度条件下，不会因为滴加乙醇速度过快导致制品局部温度升高而变性，也不会因为滴加速度过慢，使制品一直处在搅拌的剪切中进而导致纤维蛋白原被激活变性影响最终制品的凝固活力和收率，滴加过程中降温，使血浆的温度为-2～-2.5℃，该温度范围能够保证纤维蛋白原不会因温度过低而结冰，同时也不会因为温度过高而变性，有利于保证纤维蛋白原的生物学活性，进而提升最终制品的凝固活力和溶解时间。
进一步，步骤(8)中，根据步骤(7)离心得到的纤维蛋白原沉淀重量配制溶解缓冲液II，将沉淀切碎投入溶解罐中，在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，时间为1h；所述溶解缓冲液II的配方包括：柠檬酸钠的浓度为1.2％，Tris的浓度为0.27％，盐酸赖氨酸的浓度为0.44％，蔗糖的浓度为1％，氯化钠的浓度为1％，溶剂为注射用水，pH值为7.2～7.4。
采用上述方案的有益效果是：本发明将溶解缓冲液的pH由6.6～6.8调整为7.2～7.4，使纤维蛋白原在这个pH范围内达到其等电点，使其沉淀更加充分，收率较过去的pH6.6～6.8大幅度提高。溶解温度为34～35℃，有利于组分I精制沉淀的充分溶解而不会被激活变性，同时杂蛋白充分析出，进而提升纤维蛋白原的收率和纯度。
进一步，步骤(9)中，将步骤(8)的过滤后的溶解液温度降至0～1℃，在搅拌的过程中加入-25℃的50％乙醇溶液，得到混合液B，使混合液B中的乙醇浓度达到8％，温度控制在-2～-2.5℃；滴加乙醇溶液完毕后再持续搅拌30min。
采用上述方案的有益效果是：加入-25℃的50％乙醇溶液有利于通过控制低温乙醇提取法中乙醇的浓度，进而充分的沉降纤维蛋白原，去除杂蛋白，进而保证最终制品的纯度和收率，也能够提升其凝固活力，滴加乙醇溶液完毕后再持续搅拌30min有利于乙醇和制品充分接触混匀进而保证纤维蛋白原充分的沉淀提纯，保证最终制品的收率和纯度。
进一步，步骤(11)中，根据步骤(10)离心得到的纤维蛋白原沉淀重量配制溶解缓冲液III，将沉淀切碎投入溶解罐中，在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，时间为1h，进行蛋白含量的测定，根据测定的蛋白含量结果，用溶解缓冲液III调节蛋白浓度，使半成品中蛋白浓度为2.7％；并调节蔗糖含量、甘氨酸含量和pH值，使半成品中蔗糖含量为5％、甘氨酸含量为1％、pH值为7.2～7.4；溶解缓冲液III的配方包括：柠檬酸钠的浓度为1.5％、Tris的浓度为0.27％、氯化钠的浓度为0.82％、蔗糖的含量为5％、甘氨酸的含量为1％，溶剂为注射用水，pH值为7.2～7.4。
采用上述方案的有益效果是：本发明将溶解缓冲液的pH由6.6～6.8调整为7.2～7.4，使纤维蛋白原在这个pH范围内达到其等电点，使其沉淀更加充分，收率较过去的pH6.6～6.8大幅度提高。
溶解缓冲液III的各组分的作用为：柠檬酸钠和Tris能够增强溶液的缓冲能力，进而保证制品的长期稳定，氯化钠能够保证最终制品的摩尔渗透压浓度，蔗糖和甘氨酸作为冻干成品的骨架保证制品最终的形状。采用1.5％柠檬酸钠和0.27％的Tris能够保证制品的缓冲体系稳定，进而保证制品的长期稳定性，0.82％的氯化钠浓度接近人体的生理浓度，提升了制品的安全性，同时该盐浓度有利于最终冻干制品的稳定；5％蔗糖含量和1％甘氨酸的浓度保证冻干骨架的稳定，有利于形成良好的冻干形状，同时该浓度能够提升最终冻干制品的复溶时间。
进一步，步骤(12)中，使用灭菌好的滤芯对步骤(11)所得的半成品进行除菌过滤，并对其进行分装，分装量为25mL/瓶；采用的滤芯为1只0.22um孔径的除菌滤芯。
采用上述方案的有益效果是：对配制好的制品进行除菌过滤，保证制品无菌，保证制品的安全性。
进一步，步骤(13)中，冻干之后真空封口，且冻干过程中制品温度不超过34℃，整个冻干过程为3～4天。
采用上述方案的有益效果是：真空封口是为了保证制品处在真空的状态，能够提升制品的长期稳定性，有利于制品的储存和运输。
进一步，步骤(14)中，将步骤(13)冻干的人纤维蛋白原制品在98～100℃的水浴中保温30min，进行干热病毒灭活。
采用上述方案的有益效果是：98～100℃的水浴中保温30min是为了灭活制品中的非脂包膜病毒，提升制品的安全性。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明提供一种纤维蛋白原的生产方法，针对现有技术存在的不足进行了多项改进，例如，包括但不限于以下方面：(1)采用平板直冷速冻技术代替传统强制对流速冻技术快速冻结原料血浆；(2)血浆在0～4℃的预融时间为1～2个小时；(3)离心去冷沉淀的FrI的溶解缓冲液倍数15～18倍；(4)溶解缓冲液的pH为7.2～7.4；(5)滴加50％乙醇溶液速率为0.5～0.7kg/min；(6)离心分离沉淀的进液速率为1～2L/min。(7)改进冻干工艺，冻干时间为3～4天。(8)生产中采用S/D法和98～100℃保温水浴热处理法双重病毒灭活，有效的灭活脂包膜病毒和非脂包膜病毒，保证了制品的安全性。本发明提供的生产方法的优点是：人纤维蛋白原纯度得以极大提升，可达到92％以上；凝固活力高，为18～22s；复融时间短，为5～10min；冻干后外观更加均一、稳定，收率达到2000瓶/吨血浆，高于本领域现有技术的收率。双重病毒灭活使临床用药更加安全，无不良反应。本发明的制品长期稳定性好，经过36个月的长期稳定性试验仍能保证很好的内在质量。
具体的，本发明所述纤维蛋白原的生产方法可以包括以下步骤：
(1)血浆采集和速冻：将采集的新鲜血浆通过平板直冷速冻技术在30min内速冻并放入-30℃冷库中保存。
(2)融浆和去冷沉淀：从-30℃冷库中转移至0～4℃预融间预融1～2个小时，再经10℃以下的注射用水喷淋，75％的酒精喷淋消毒和注射用水冲洗酒精并吹干。将原料血浆破袋后转运至融浆罐，通过夹层温度30℃的注射用水循环融化血浆，以5000～5600rpm的速度进行连续分离离心，离心机的进液量为900～1100L/min，得到冷沉淀和上清液，并于-30℃冷库保存。
(3)组分I沉淀的制取：将步骤(2)分离冷沉淀后的上清液转移至反应罐中，控制血浆温度在0～1℃之间，用pH4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值7.00～7.20。用53.3％的乙醇溶液以≤1.5kg/min的速率滴加至血浆中，使血浆中乙醇的最终浓度为8％，滴加的过程中降温，控制血浆的温度为-1～-3℃。将血浆在-1～-3℃条件下离心，转速为5000～5600rpm，离心机的进液量为700～800L/min，得到组分I沉淀和上清液。
(4)组分I沉淀的溶解：将步骤(3)离心分离得到的组分I沉淀切成碎块，称取重量，按照沉淀重量的15～18倍配制溶解缓冲液I,在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，溶解pH值为7.2～7.4，时间为1～1.5h，采用1只30SP和4只90SP的深层滤芯串联对溶解液进行过滤。
(5)S/D病毒灭活：按照步骤(4)过滤后的滤液重量的0.1倍配制S/D溶液，将S/D溶液并以≤0.6kg/min的速度滴加至步骤(4)过滤后的滤液中，得到混合液，控制混合液温度24～26℃，持续缓慢搅拌，保温6h进行脂包膜病毒的灭活，得到病毒灭活液。
(6)第一次乙醇沉淀：将步骤(5)的病毒灭活液的温度降至0～1℃，在搅拌的过程中加入-25℃的50％乙醇溶液，乙醇溶液的滴加速率为0.5～0.7kg/min，得到混合液A，使混合液A中的乙醇浓度达到8％，温度控制在-2～-2.5℃。滴加完毕后再持续搅拌30min。
(7)第一次离心分离沉淀：连接离心机，对步骤(6)得到的混合液A进行连续流离心，每台离心转速控制在6500rpm，离心机的进液流量控制在1～2L/min，出液温度控制在0～2℃之间。离心分离得到纤维蛋白原沉淀。
(8)首次离心的纤维蛋白原溶解：根据步骤(7)离心得到的纤维蛋白原沉淀重量配制溶解缓冲液II，将沉淀切碎投入溶解罐中，在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，溶解pH值为7.2～7.4，时间为1h。采用4只90SP的深层滤芯对溶解液进行过滤，得到过滤液。
(9)第二次乙醇沉淀：将步骤(8)的过滤后的溶解液温度降至0～1℃，在搅拌的过程中加入-25℃的50％乙醇溶液，乙醇溶液的滴加速率为0.5～0.7kg/min，得到混合液B,使混合液B中的乙醇浓度达到8％，温度控制在-2～-2.5℃。乙醇溶液滴加完毕后再持续搅拌30min。
(10)第二次离心分离沉淀：连接离心机，对步骤(9)得到的混合液B进行连续流离心，每台离心转速控制在6500rpm，离心机的进液流量控制在1～2L/min，出液温度控制在0～2℃之间。得到纤维蛋白原沉淀。
(11)半成品的配制：根据步骤(10)离心得到的纤维蛋白原沉淀重量配制溶解缓冲液III，将沉淀切碎投入溶解罐中，在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，溶解pH值为7.2～7.4，时间为1h，进行蛋白含量的测定，并调节各组分含量，得到半成品；根据测定的蛋白含量结果，用溶解缓冲液III调节蛋白浓度，使半成品中蛋白浓度为2.7％；并调节蔗糖含量、甘氨酸含量和pH值，使半成品中蔗糖含量为5％，甘氨酸含量为1％，pH值为7.2～7.4。
(12)除菌、分装：使用灭菌好的1只0.22um孔径的除菌滤芯对步骤(11)所得的半成品进行除菌过滤，并对其进行分装，分装量为25mL/瓶。
(13)冻干：将对步骤(12)分装后的制品进行0℃保温2h～3h、-10℃冷却制品2h，-46℃～-48℃冷却保温4h～7h；-5℃～-2℃升华干燥50h～55h；30℃～32℃解析干燥16h～20h。冻干之后真空封口，且冻干过程中制品温度不超过34℃。
(14)干热病毒灭活：将步骤(13)冻干的人纤维蛋白原制品在98～100℃的水浴中保温30min，进行干热病毒灭活。
具体的，步骤(4)中，所述溶解缓冲液I的配制方法：将柠檬酸钠、Tris、盐酸赖氨酸、蔗糖、氯化钠混合，加入注射用水溶解后，搅拌均匀，用12M的HCL调节pH值为7.2～7.4；溶解缓冲液I中，柠檬酸钠的浓度为1.2％，Tris的浓度为0.27％，盐酸赖氨酸的浓度为0.44％的，蔗糖的浓度为1％，氯化钠的浓度为1％。
步骤(5)中，所述S/D溶液的配制方法：11％的吐温80,3.3％的磷酸三丁酯，加入注射用水充分溶解后以≤0.6kg/min的速度滴加至步骤(4)过滤后的滤液中，使吐温80的终浓度为1.1％，磷酸三丁酯的终浓度为0.33％。
步骤(8)中，所述溶解缓冲液II的配制方法：将柠檬酸钠、Tris、盐酸赖氨酸、蔗糖、氯化钠混合，加入注射用水溶解后，搅拌均匀，用12M的HCL调节pH值为7.2～7.4，溶解缓冲液II中，柠檬酸钠的浓度为1.2％，Tris的浓度为0.27％，盐酸赖氨酸的浓度为0.44％，蔗糖的浓度为1％，氯化钠的浓度为1％。
步骤(11)中，所述溶解缓冲液III的配制方法：将柠檬酸钠、Tris和氯化钠混合，加入注射用水溶解后，搅拌均匀，用12M的HCL调节pH值为7.2～7.4；溶解缓冲液III中，柠檬酸钠的浓度为1.5％，Tris的浓度为0.27％和氯化钠的浓度为0.82％。
下面通过具体的实施例进行介绍。
本发明中的百分数，若无特别说明，为质量百分数。
实施例1
(1)血浆采集和速冻：将采集3.48t的新鲜人类血浆通过平板直冷速冻技术在30min内速冻并放入-30℃冷库中保存。该批血浆经病毒检测合格，并且符合国家规定的检疫期。
(2)融浆和去冷沉淀：从-30℃冷库中将该批合格血浆转移至0～4℃预融间预融1个小时，再经10℃以下的注射用水喷淋，75％的酒精喷淋消毒和注射用水冲洗酒精并吹干。将原料血浆破袋后转运至融浆罐，通过夹层温度30℃的注射用水循环融化血浆，以5000～5600rpm的速度进行连续分离离心，离心机的进液量为900L/min，得到冷沉淀17.9kg和上清液，并于-30℃冷库保存。
(3)组分I沉淀的制取：将步骤(2)分离冷沉淀后的上清液转移至反应罐中，控制血浆温度在0～1℃之间，用pH4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值7.00。用53.3％的乙醇溶液以1.3kg/min的速率滴加至血浆中，使血浆中乙醇的最终浓度为8％，滴加的过程中降温，控制血浆的温度为-1℃。将血浆在-1℃条件下离心，转速为5000～5600rpm，离心机的进液量为700～800L/min，离心分离得到组分I沉淀31.8kg和上清液。
(4)组分I沉淀的溶解：将步骤(3)离心分离得到的31.8kg组分I沉淀切成碎块，称取重量，按照沉淀重量的15倍配制约480kg溶解缓冲液I,在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，得到溶解液，溶解pH值为7.2，时间为1h，之后，采用1只30SP和4只90SP的深层滤芯串联对溶解液进行过滤，得到滤液A，滤液A的重量为511.2kg。溶解缓冲液I的配制方法：将柠檬酸钠、Tris、盐酸赖氨酸、蔗糖、氯化钠溶解于注射用水后，搅拌均匀，用12M的HCL调节pH值为7.2，溶解缓冲液I中，柠檬酸钠的浓度为1.2％，Tris的浓度0.27％，盐酸赖氨酸的浓度为0.44％，蔗糖的浓度为1％，氯化钠的浓度为1％。
(5)S/D病毒灭活：按照步骤(4)滤液A重量的0.1倍配制约52kg的S/D溶液，并将S/D溶液以0.5kg/min的速度滴加至滤液A中，得到混合液，控制混合液温度24℃，持续缓慢搅拌，保温6h进行脂包膜病毒的灭活，得到病毒灭活液。其中S/D溶液包括：吐温80的浓度为11％,磷酸三丁酯的浓度为3.3％，溶剂为注射用水，配制好后以≤0.6kg/min的速度将S/D溶液滴加至滤液A中，使吐温80的终浓度为1.1％，磷酸三丁酯的终浓度为0.33％。
(6)第一次乙醇沉淀：将步骤(5)得到的病毒灭活液的温度降至0～1℃，在搅拌的过程中加入-25℃的50％乙醇溶液，乙醇溶液的滴加速率为0.5kg/min，得到混合液A，使混合液A中的乙醇浓度达到8％，温度控制在-2～-2.5℃。乙醇溶液滴加完毕后再持续搅拌30min。
(7)第一次离心分离沉淀：连接离心机，对步骤(6)得到的混合液A进行连续流离心，每台离心转速控制在6500rpm，离心机的进液流量控制在1L/min，出液温度控制在0～2℃之间。最终的离心分离得到纤维蛋白原沉淀(纤维蛋白原沉淀重为25.5kg)。
(8)第一次离心的纤维蛋白原溶解：根据步骤(7)离心得到的25.5kg纤维蛋白原沉淀重量配制500kg溶解缓冲液II，将沉淀切碎投入溶解罐中，在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，溶解pH值为7.2，时间为1h，得到溶解液。采用4只90SP的深层滤芯对溶解液进行过滤，得到过滤液525kg。其中溶解缓冲液II的配制方法：将柠檬酸钠、Tris、盐酸赖氨酸、蔗糖、氯化钠混合，加入注射用水溶解后，搅拌均匀，用12M的HCL调节pH值为7.2；溶解缓冲液II中，柠檬酸钠的浓度为1.2％，Tris的浓度为0.27％，盐酸赖氨酸的浓度为0.44％，蔗糖的浓度为1％，氯化钠的浓度为1％。
(9)第二次乙醇沉淀：将步骤(8)过滤后的溶解液温度降至0～1℃，在搅拌的过程中加入-25℃的50％乙醇溶液，乙醇溶液滴加速率为0.5kg/min，得到混合液B,使混合液B中的乙醇浓度达到8％，温度控制在-2～-2.5℃。乙醇溶液滴加完毕后再持续搅拌30min。
(10)第二次离心分离沉淀：连接离心机，对步骤(9)得到的混合液B进行连续流离心，每台离心转速控制在6500rpm，离心机的进液流量控制在1L/min，出液温度控制在0～2℃之间。得到纤维蛋白原沉淀23.8kg。
(11)半成品的配制：根据步骤(10)离心得到的纤维蛋白原沉淀重量配制溶解缓冲液III，将沉淀切碎投入溶解罐中，在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，溶解pH值为7.2，时间为1h，进行蛋白含量的测定，根据测定的蛋白含量结果，调节各组分含量，得到半成品；用溶解缓冲液III调节蛋白浓度，使半成品中蛋白浓度为2.7％；并调节蔗糖含量、甘氨酸含量和pH值，使半成品中蔗糖含量为5％，甘氨酸含量为1％，pH值为7.2。其中溶解缓冲液III的配制方法：将柠檬酸钠、Tris、氯化钠混合，加入注射用水溶解后，搅拌均匀，用12M的HCL调节pH值为7.2；缓冲液III中，柠檬酸钠的浓度为1.5％，Tris的浓度为0.27％，氯化钠的浓度为0.82％。
(12)除菌、分装：使用灭菌好的1只0.22um孔径的除菌滤芯对步骤(11)所得的半成品进行除菌过滤，并对其进行分装，分装量为25mL/瓶。
(13)冻干：将对步骤(12)分装后的制品进行0℃保温2h、-10℃冷却制品2h，-46℃～-48℃冷却保温4h；-5℃～-2℃升华干燥50h；30℃～32℃解析干燥16h。冻干之后真空封口，且冻干过程中制品温度不超过34℃。
(14)干热病毒灭活：将步骤(13)冻干的人纤维蛋白原制品在98～100℃的水浴中保温30min，进行干热病毒灭活。
实施例2
(1)血浆采集和速冻：将采集3.51t的新鲜人类血浆通过平板直冷速冻技术在30min内速冻并放入-30℃冷库中保存。该批血浆经病毒检测合格，并且符合国家规定的检疫期。
(2)融浆和去冷沉淀：从-30℃冷库中将该批合格血浆转移至0～4℃预融间预融1.5个小时，再经10℃以下的注射用水喷淋，75％的酒精喷淋消毒和注射用水冲洗酒精并吹干。将原料血浆破袋后转运至融浆罐，通过夹层温度30℃的注射用水循环融化血浆，以5000～5600rpm的速度进行连续分离离心，离心机的进液量为1000L/min，得到冷沉淀18.3kg和上清液，并于-30℃冷库保存。
(3)组分I沉淀的制取：将步骤(2)分离冷沉淀后的上清液转移至反应罐中，控制血浆温度在0～1℃之间，用pH4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值7.10。用53.3％的乙醇溶液以1.4kg/min的速率滴加至血浆中，使血浆中乙醇的最终浓度为8％，滴加的过程中降温，控制血浆的温度为-2℃。将血浆在-2℃条件下离心，转速为5000～5600rpm，离心机的进液量为700～800L/min，离心分离得到组分I沉淀32.5kg和上清液。
(4)组分I沉淀的溶解：将步骤(3)离心分离得到的32.5kg组分I沉淀切成碎块，称取重量，按照沉淀重量的17倍配制约552kg溶解缓冲液I,在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，得到溶解液，溶解pH值为7.3，时间为1.2h，采用1只30SP和4只90SP的深层滤芯串联对溶解液进行过滤，得到滤液A，滤液A的重量为584.2kg。其中溶解缓冲液I的配制方法：将柠檬酸钠、Tris、盐酸赖氨酸、蔗糖、氯化钠混合，加入注射用水溶解后，搅拌均匀，用12M的HCL调节pH值为7.3；溶解缓冲液I中，柠檬酸钠的浓度为1.2％，Tris的浓度为0.27％，盐酸赖氨酸的浓度为0.44％，蔗糖的浓度为1％，氯化钠的浓度为1％。
(5)S/D病毒灭活：按照步骤(4)滤液A重量的0.1倍配制约59kg的S/D溶液，并将S/D溶液以0.6kg/min的速度滴加至滤液A中，得到混合液，控制混合液温度25℃，持续缓慢搅拌，保温6h进行脂包膜病毒的灭活，得到病毒灭活液。其中S/D溶液的配制方法：11％的吐温80,3.3％的磷酸三丁酯，加入注射用水充分溶解后以≤0.6kg/min的速度滴加至滤液A中，使吐温80的终浓度为1.1％，磷酸三丁酯的终浓度为0.33％。
(6)第一次乙醇沉淀：将步骤(5)的病毒灭活液的温度降至0～1℃，在搅拌的过程中加入-25℃的50％乙醇溶液，乙醇溶液滴加速率为0.6kg/min，得到混合液A，使混合液A中的乙醇浓度达到8％，温度控制在-2～-2.5℃。滴加完毕后再持续搅拌30min。
(7)第一次离心分离沉淀：连接离心机，对步骤(6)得到的混合液A进行连续流离心，每台离心转速控制在6500rpm，离心机的进液流量控制在1.5L/min，出液温度控制在0～2℃之间。最终的离心分离得到纤维蛋白原沉淀(重为26.1kg)。
(8)首次离心的纤维蛋白原溶解：根据步骤(7)离心得到的26.1kg纤维蛋白原沉淀重量配制500kg溶解缓冲液II，将沉淀切碎投入溶解罐中，在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，溶解pH值为7.3，时间为1h，得到溶解液。采用4只90SP的深层滤芯对溶解液进行过滤，得到过滤液525.7kg。溶解缓冲液II的配制方法：将柠檬酸钠、Tris、盐酸赖氨酸、蔗糖、氯化钠混合，加入注射用水溶解后，搅拌均匀，用12M的HCL调节pH值为7.3；溶解缓冲液II中，柠檬酸钠的浓度为1.2％，Tris的浓度为0.27％，盐酸赖氨酸的浓度为0.44％，蔗糖的浓度为1％，氯化钠的浓度为1％。
(9)第二次乙醇沉淀：将步骤(8)的过滤后的溶解液温度降至0～1℃，在搅拌的过程中加入-25℃的50％乙醇溶液，乙醇溶液的滴加速率为0.6kg/min，得到混合液B,使混合液B中的乙醇浓度达到8％，温度控制在-2～-2.5℃。乙醇溶液滴加完毕后再持续搅拌30min。
(10)第二次离心分离沉淀：连接离心机，对步骤(9)得到的混合液B进行连续流离心，每台离心转速控制在6500rpm，离心机的进液流量控制在1.5L/min，出液温度控制在0～2℃之间。最终的到纤维蛋白原沉淀24.2kg。
(11)半成品的配制：根据步骤(10)离心得到的纤维蛋白原沉淀重量配制溶解缓冲液III，将沉淀切碎投入溶解罐中，在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，溶解pH值为7.3，时间为1h，进行蛋白含量的测定，根据测定的蛋白含量结果，调节各组分含量，得到半成品；用溶解缓冲液III调节蛋白浓度，使半成品中蛋白浓度为2.7％；并调节蔗糖含量、甘氨酸含量和pH值，使半成品中蔗糖含量为5％，甘氨酸含量为1％，pH值为7.3。其中溶解缓冲液III的配制方法：将柠檬酸钠、Tris和氯化钠混合，加入注射用水溶解后，搅拌均匀，用12M的HCL调节pH值为7.3；溶解缓冲液III中，柠檬酸钠的浓度为1.5％，Tris的浓度为0.27％和氯化钠的浓度为0.82％。
(12)除菌、分装：使用灭菌好的1只0.22um孔径的除菌滤芯对步骤(11)所得的半成品进行除菌过滤，并对其进行分装，分装量为25mL/瓶。
(13)冻干：将对步骤(12)分装后的制品进行0℃保温2.5h、-10℃冷却制品2h，-46℃～-48℃冷却保温5h；-5℃～-2℃升华干燥52h；30℃～32℃解析干燥18h。冻干之后真空封口，且冻干过程中制品温度不超过34℃。
(14)干热病毒灭活：将步骤(13)冻干的人纤维蛋白原制品在98～100℃的水浴中保温30min，进行干热病毒灭活。
实施例3
(1)血浆采集和速冻：将采集3.45t的新鲜人类血浆通过平板直冷速冻技术在30min内速冻并放入-30℃冷库中保存。该批血浆经病毒检测合格，并且符合国家规定的检疫期。
(2)融浆和去冷沉淀：从-30℃冷库中将该批合格血浆转移至0～4℃预融间预融2个小时，再经10℃以下的注射用水喷淋，75％的酒精喷淋消毒和注射用水冲洗酒精并吹干。将原料血浆破袋后转运至融浆罐，通过夹层温度30℃的注射用水循环融化血浆，以5000～5600rpm的速度进行连续分离离心，离心机的进液量为1100L/min，得到冷沉淀16.9kg和上清液，并于-30℃冷库保存。
(3)组分I沉淀的制取：将步骤(2)分离冷沉淀后的上清液转移至反应罐中，控制血浆温度在0～1℃之间，用pH4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值7.20。用53.3％的乙醇溶液以1.5kg/min的速率滴加至血浆中，使血浆中乙醇的最终浓度为8％，滴加的过程中降温，控制血浆的温度为-3℃。将血浆在-3℃条件下离心，转速为5000～5600rpm，离心机的进液量为700～800L/min，离心分离得到组分I沉淀30.2kg和上清液。
(4)组分I沉淀的溶解：将步骤(3)离心分离得到的30.2kg组分I沉淀切成碎块，称取重量，按照沉淀重量的18倍配制约544kg溶解缓冲液I,在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，得到溶解液，溶解pH值为7.4，时间为1.5h，采用1只30SP和4只90SP的深层滤芯串联对溶解液进行过滤，得到滤液A，滤液A的重量为574.0kg。其中溶解缓冲液I的配制方法：将柠檬酸钠、Tris、盐酸赖氨酸、蔗糖、氯化钠混合，加入注射用水溶解后，搅拌均匀，用12M的HCL调节pH值为7.4；溶解缓冲液I中，柠檬酸钠的浓度为1.2％，Tris的浓度为0.27％，盐酸赖氨酸的浓度为0.44％，蔗糖的浓度为1％，氯化钠的浓度为1％。
(5)S/D病毒灭活：按照步骤(4)滤液A重量的0.1倍配制约58kg的S/D溶液，并将S/D溶液以0.6kg/min的速度滴加至组分I溶解液中，得到混合液，控制混合液温度25℃，持续缓慢搅拌，保温6h进行脂包膜病毒的灭活，得到病毒灭活液。其中S/D溶液的配制方法：11％的吐温80,3.3％的磷酸三丁酯，加入注射用水充分溶解后以≤0.6kg/min的速度滴加至组分I溶解液中，使吐温80的终浓度为1.1％，磷酸三丁酯的终浓度为0.33％。
(6)第一次乙醇沉淀：将步骤(5)的病毒灭活液的温度降至0～1℃，在搅拌的过程中加入-25℃的50％乙醇溶液，乙醇溶液的滴加速率为0.7kg/min，得到混合液A，使混合液A中的乙醇浓度达到8％，温度控制在-2～-2.5℃。滴加完毕后再持续搅拌30min。
(7)第一次离心分离沉淀：连接离心机，对步骤(6)得到的混合液A进行连续流离心，每台离心转速控制在6500rpm，离心机的进液流量控制在2L/min，出液温度控制在0～2℃之间。最终的离心分离得到纤维蛋白原沉淀(重为25.1kg)。
(8)首次离心的纤维蛋白原溶解：根据步骤(7)离心得到的25.1kg纤维蛋白原沉淀重量配制500kg溶解缓冲液II，将沉淀切碎投入溶解罐中，在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，溶解pH值为7.4，时间为1h，得到溶解液。采用4只90SP的深层滤芯对溶解液进行过滤，得到过滤液524.7kg。其中溶解缓冲液II的配制方法：将柠檬酸钠、Tris、盐酸赖氨酸、蔗糖、氯化钠混合，加入注射用水溶解后，搅拌均匀，用12M的HCL调节pH值为7.4；溶解缓冲液II中，柠檬酸钠的浓度为1.2％，Tris的浓度为0.27％，盐酸赖氨酸的浓度为0.44％，蔗糖的浓度为1％，氯化钠的浓度为1％。
(9)第二次乙醇沉淀：将步骤(8)过滤后的溶解液温度降至0～1℃，在搅拌的过程中加入-25℃的50％乙醇溶液，乙醇溶液的滴加速率为0.7kg/min，得到混合液B,使混合液B中的乙醇浓度达到8％，温度控制在-2～-2.5℃。乙醇溶液滴加完毕后再持续搅拌30min。
(10)第二次离心分离沉淀：连接离心机，对步骤(9)得到的混合液B进行连续流离心，每台离心转速控制在6500rpm，离心机的进液流量控制在2L/min，出液温度控制在0～2℃之间。得到纤维蛋白原沉淀23.1kg。
(11)半成品的配制：根据步骤(10)离心得到的纤维蛋白原沉淀重量配制溶解缓冲液III，将沉淀切碎投入溶解罐中，在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，溶解pH值为7.4，时间为1h，进行蛋白含量的测定，根据测定的蛋白含量结果，调节各组分含量，得到半成品；用溶解缓冲液III调节蛋白浓度，使半成品中蛋白浓度为2.7％；并调节蔗糖含量、甘氨酸含量和pH值，使半成品中蔗糖含量为5％，甘氨酸含量为1％，pH值为7.4。其中溶解缓冲液III的配制方法：将柠檬酸钠、Tris和氯化钠混合，加入注射用水溶解后，搅拌均匀，用12M的HCL调节pH值为7.4；溶解缓冲液III中，柠檬酸钠的浓度为1.5％，Tris的浓度为0.27％，氯化钠的浓度为0.82％。
(12)除菌、分装：使用灭菌好的1只0.22um孔径的除菌滤芯对步骤(11)所得的半成品进行除菌过滤，并对其进行分装，分装量为25mL/瓶。
(13)冻干：将对步骤(12)分装后的制品进行0℃保温3h、-10℃冷却制品2h，-46℃～-48℃冷却保温7h；-5℃～-2℃升华干燥55h；30℃～32℃解析干燥20h。冻干之后真空封口，且冻干过程中制品温度不超过34℃。
(14)干热病毒灭活：将步骤(13)冻干的人纤维蛋白原制品在98～100℃的水浴中保温30min，进行干热病毒灭活。
质量检验
对实施例1、2、3所得到的制品依照《中华人民共和国药典》2015版(三部)规定的试验方法和试验标准进行检测，主要的质量指标结果如表一所示。表1中，制品1为实施例1制备的制品，制品2为实施例2制备的制品，制品3为实施例3制备的制品。
表一 制品1、2、3中主要质量指标检测结果
从以上数据可以看出，本发明采用经过优化的新式低温乙醇沉淀法从人的血浆中制备纤维蛋白原，并经过S/D和100℃、30分钟的水浴处理进行病毒灭活，凝固活力高，为18～21s；复融时间短，为5～8min，收率高，大于2000瓶/吨血浆，冻干后外观更加均一、稳定。其相关质量指标远高于现行国家药典标准和改进工艺前的标准、也高于现有技术中其它同行业用低温乙醇法和层析法制备出的产品的质量，相关的质量数据对比分析详见表二。
表二、本发明产品与改善优化工艺前的产品及国内其它企业产品质量比较
优化工艺前的本厂产品的制备方法参照以下专利公开的方法：公开号为CN101143211A，专利申请名称为《耐热人纤维蛋白原的生产方法》。
国内某厂家(柱层析法)的制备方法参照以下专利公开的方法：专利申请名称为《一种人纤维蛋白原的制备方法》，公开号为CN105504046A的专利发明内容和具体实施方式部分记载的制备方法。
国内某厂家(低温乙醇法)的制备方法参照以下专利公开的方法：专利名称为《人纤维蛋白原制剂的制备方法》，公开号为CN101229367A的专利发明内容和具体实施方式部分记载的制备方法。
从表2中可以看出，与其他方法制备的纤维蛋白原相比，本发明制备的纤维蛋白原具有复溶时间短、纯度高、枸橼酸离子含量低、氯离子含量低、蔗糖含量低、凝固活力时间短、无磷酸三丁酯残留、其余各项指标均符合规定等优点。
本发明做了36个月的长期稳定性试验，试验结果表明其纯度、凝固活力、复溶时间等质量指标与刚制备出来的制品未有显著差异，证明本发明的工艺经过长期保存后其质量不受任何影响，具体结果见表三。
表三、本发明实施例1的产品长期稳定性(36个月)质量指标检测结果
实施例2和实施例3制备的产品经过长期稳定性的检测，也能得到与实施例1一致的结论，在经过长期保存后其质量不受影响，具有稳定好的优点。说明本发明的制品长期稳定性好，经过36个月的长期稳定性试验仍能保证很好的内在质量。
综上所述，本发明提供的人纤维蛋白原的生产方法，是一种大幅度提高人纤维蛋白原纯度的生产方法，本发明在传统人纤维蛋白原的生产工艺基础上对其进行优化改进，包括：原料血浆的速冻方式、血浆预融时间、组分I的溶解倍数、溶解缓冲液的pH、乙醇的滴加速度和离心分离沉淀的进液速率等工艺参数，同时改进冻干工艺，使得到的最终产品收率由过去的1000瓶/吨血浆达到2000瓶/吨血浆以上，产品纯度达到90％以上；凝固活力为18～22s；复融时间短，为6～10min；冻干后外观更加均一、稳定。提升了Fg的内在质量和收率，同时降低生产成本。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集血浆和速冻血浆；
(2)融浆和去冷沉淀：将速冻后的血浆预融；之后融浆，离心分离，得到冷沉淀和上清液；
(3)制取组分I沉淀：将步骤(2)得到的上清液，调整pH值，调整乙醇浓度，之后离心，得到组分I沉淀和上清液；
(4)组分I沉淀的溶解：将步骤(3)得到的组分I沉淀溶解于溶解缓冲液I，过滤，得到滤液A；
(5)将滤液A采用S/D病毒灭活法灭活病毒，得到病毒灭活液；
(6)第一次乙醇沉淀：向步骤(5)得到的病毒灭活液中加入乙醇溶液,得到混合液A；
(7)第一次离心分离沉淀：将步骤(6)得到的混合液A离心，得到纤维蛋白原沉淀；
(8)第一次离心的纤维蛋白原溶解：将步骤(7)得到的纤维蛋白原沉淀用溶解缓冲液II溶解，得到溶解液，将溶解液过滤；
(9)第二次乙醇沉淀：将步骤(8)过滤后的溶解液加入乙醇溶液，得到混合液B；
(10)第二次离心分离沉淀：对步骤(9)得到的混合液B离心，得到纤维蛋白原沉淀；
(11)配制半成品：将步骤(10)得到的纤维蛋白原沉淀用溶解缓冲液III溶解，调节组分含量,得到半成品；
(12)除菌、分装；
(13)冻干；
(14)干热病毒灭活。
2.根据权利要求1所述一种纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集血浆和速冻血浆；
(2)融浆和去冷沉淀：将速冻后的血浆预融，预融时间为1～2小时；之后融浆；融浆后离心分离，转速为5000～5600rpm，离心机的进液量为900～1100L/min，得到冷沉淀和上清液；
(3)制取组分I沉淀：将步骤(2)得到的上清液，调整pH值7.00～7.20，调整乙醇浓度至8％，之后离心，离心的转速为5000～5600rpm，离心机的进液量为700～800L/min，得到组分I沉淀和上清液；
(4)组分I沉淀的溶解：将步骤(3)得到的组分I沉淀溶解于溶解缓冲液I，溶解缓冲液I的pH为7.2～7.4，溶解缓冲液I的重量为组分I沉淀重量的15～18倍，溶解时间为1～1.5小时，过滤，过滤的滤芯为1只30SP和4只90SP的深层滤芯串联，得到滤液A；
(5)将滤液A采用S/D病毒灭活法灭活病毒，得到病毒灭活液；
(6)第一次乙醇沉淀：向步骤(5)得到的病毒灭活液中加入乙醇溶液,得到混合液A；乙醇溶液的滴加速率为0.5～0.7kg/min；
(7)第一次离心分离沉淀：将步骤(6)得到的混合液A进行连续流离心，转速为6500rpm，离心机的进液流量为1～2L/min，出液温度为0～2℃，得到纤维蛋白原沉淀；
(8)第一次离心的纤维蛋白原溶解：将步骤(7)得到的纤维蛋白原沉淀用溶解缓冲液II溶解，溶解缓冲液II的pH为7.2～7.4，温度为34～35℃，时间为1小时，得到溶解液，之后，用滤芯过滤溶解液，采用的滤芯为4只90SP的深层滤芯；
(9)第二次乙醇沉淀：将步骤(8)过滤后的溶解液加入乙醇溶液，得到混合液B，加入乙醇溶液后再搅拌30min，乙醇溶液的滴加速率为0.5～0.7kg/min；
(10)第二次离心分离沉淀：对步骤(9)得到的混合液B进行连续流离心，得到纤维蛋白原沉淀，离心转速控制在6500rpm，离心机的进液流量控制在1～2L/min，出液温度控制在0～2℃之间；
(11)配制半成品：将步骤(10)得到的纤维蛋白原沉淀用溶解缓冲液III溶解，溶解缓冲液III的pH为7.2～7.4，调节各组分含量,得到半成品；
(12)除菌、分装；
(13)冻干：将步骤(12)分装后的制品进行冻干，冻干条件包括：0℃保温2h～3h、-10℃冷却制品2h，-46℃～-48℃冷却保温4h～7h；-5℃～-2℃升华干燥50h～55h；30℃～32℃解析干燥16h～20h；
(14)干热病毒灭活。
3.根据权利要求1或2所述一种纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(1)中，将采集的新鲜血浆在30min内速冻并放入-30℃冷库中保存，速冻的技术为平板直冷速冻技术。
4.根据权利要求1或2所述一种纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，预融的方法包括：将速冻后的血浆从-30℃条件转移至0～4℃条件预融，再经10℃以下的注射用水喷淋，75％的酒精喷淋消毒和注射用水冲洗酒精并吹干；融浆的方法包括：将预融后的血浆破袋后转运至融浆罐，通过夹层温度30℃的注射用水循环融化血浆；融浆后，以5000～5600rpm的速度进行连续分离离心，得到冷沉淀和上清液，并于-30℃条件保存；步骤(3)中，将步骤(2)得到的上清液转移至反应罐中，控制血浆温度在0～1℃之间，用pH4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值7.00～7.20；用53.3％的乙醇以≤1.5kg/min的速率滴加至血浆中，使血浆最终的乙醇浓度为8％，滴加的过程中降温，控制血浆的温度为-1～-3℃；将血浆在-1～-3℃条件下离心，转速为5000～5600rpm，得到组分I沉淀和上清液。
5.根据权利要求1或2所述一种纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(4)中，将步骤(3)离心分离得到的组分I沉淀切成碎块，称取重量，按照沉淀重量的15～18倍配制溶解缓冲液I,在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，时间为1～1.5h，采用滤芯对溶解液进行过滤；溶解缓冲液I的配方包括：柠檬酸钠的浓度为1.2％，Tris的浓度为0.27％，盐酸赖氨酸的浓度为0.44％，蔗糖的浓度为1％，氯化钠的浓度为1％，溶剂为注射用水，pH值为7.2～7.4。
6.根据权利要求1或2所述一种纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(5)中，按步骤(4)得到的滤液A重量的0.1倍配制S/D溶液，并将S/D溶液以≤0.6kg/min的速度滴加至滤液A中,得到混合液，控制该混合液温度24～26℃，持续缓慢搅拌，保温6h进行脂包膜病毒的灭活，得到病毒灭活液；所述S/D溶液的配方包括：吐温80、磷酸三丁酯和注射用水；S/D溶液中，吐温80的质量分数为11％、磷酸三丁酯的质量分数为3.3％；使用时，将S/D溶液以≤0.6kg/min的速度滴加至滤液A中，使混合液中吐温80的终浓度为1.1％，磷酸三丁酯的终浓度为0.33％。
7.根据权利要求1或2所述一种纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(6)中，将步骤(5)得到的病毒灭活液的温度降至0～1℃，在搅拌的过程中加入-25℃的50％乙醇溶液，得到混合液A，使混合液A中的乙醇浓度达到8％，温度控制在-2至-2.5℃；滴加完毕后再持续搅拌30min；滴加50％乙醇溶液的速率为0.5～0.7kg/min。
8.根据权利要求1或2所述一种纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(8)中，根据步骤(7)离心得到的纤维蛋白原沉淀重量配制溶解缓冲液II，将沉淀切碎投入溶解罐中，在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，时间为1h；所述溶解缓冲液II的配方包括：柠檬酸钠的浓度为1.2％，Tris的浓度为0.27％，盐酸赖氨酸的浓度为0.44％，蔗糖的浓度为1％，氯化钠的浓度为1％，溶剂为注射用水，pH值为7.2～7.4；步骤(9)中，将步骤(8)过滤后的溶解液温度降至0～1℃，在搅拌的过程中加入-25℃的50％乙醇溶液，得到混合液B，使混合液B中的乙醇浓度达到8％，温度控制在-2～-2.5℃；滴加乙醇溶液完毕后再持续搅拌30min。
9.根据权利要求1或2所述一种纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(11)中，根据步骤(10)离心得到的纤维蛋白原沉淀重量配制溶解缓冲液III，将沉淀切碎投入溶解罐中，在34～35℃的条件下均匀搅拌至沉淀溶解，时间为1h，进行蛋白含量的测定，根据测定的蛋白含量结果，用溶解缓冲液III调节蛋白浓度，使半成品中蛋白浓度为2.7％；并调节蔗糖含量、甘氨酸含量和pH值，使半成品中蔗糖含量为5％、甘氨酸含量为1％、pH值为7.2～7.4；溶解缓冲液III的配方包括：柠檬酸钠的浓度为1.5％，Tris的浓度为0.27％，氯化钠的浓度为0.82％、蔗糖含量为5％、甘氨酸的含量为1％，溶剂为注射用水，pH值为7.2～7.4。
10.根据权利要求1或2所述一种纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(12)中，使用灭菌好的滤芯对步骤(11)所得的半成品进行除菌过滤，并对其进行分装，分装量为25mL/瓶；采用的滤芯为1只0.22um孔径的除菌滤芯；步骤(13)中，冻干之后真空封口，且冻干过程中制品温度不超过34℃，整个冻干过程为3～4天；步骤(14)中，将步骤(13)冻干的纤维蛋白原制品在98～100℃的水浴中保温30min，进行干热病毒灭活。
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| CN111518197B (zh) | 2024-01-05 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| CB02 | Change of applicant information | ||
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Address after: No.77 Siping Road, Limin Economic Development Zone, Hulan District, Harbin City, Heilongjiang Province Applicant after: Harbin pesfico biopharmaceutical Co.,Ltd. Address before: No.77 Siping Road, Limin economic and Technological Development Zone, Harbin, Heilongjiang, 150025 Applicant before: HARBIN PAISI FEIKE BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. |
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |