CN115947825A - 一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及血液制品生产技术领域，具体涉及一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺，包括以下依次进行的步骤：使用乙醇处理血浆并经压滤获得组分Ⅰ沉淀或者对血浆进行低温离心处理获得冷沉淀；使用沉淀洗涤液对上述沉淀进行多次洗涤，获得洗涤后沉淀；在洗涤后沉淀中加入沉淀溶解液，过滤获得滤液；对滤液进行灭活操作，获得灭活后滤液；调整灭活后滤液的pH和电导率再过滤；制品上样阴离子交换层析柱，先后上样层析缓冲液、层析洗涤液和洗脱液；洗脱液经超滤处理获得目的产品。本技术方案可以解决现有的制备工艺获得的纤维蛋白原的纯度和得率不理想的技术问题，并同时简化工艺流程、提升工艺安全系数，具有良好的应用推广前景。

Description

一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺

技术领域

本发明涉及血液制品生产技术领域，具体涉及一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺。

背景技术

纤维蛋白原（Fibrinogen,Fg），即凝血因子Ⅰ（FⅠ），是凝血系统中的“中心”蛋白质之一，相对分子量340kDa，具有2964（6）个氨基酸残基，分子长度约45nm，宽度最大直径为4.8nm，半衰期为96～144小时，等电点为5.1～5.5，沉降系数为7.7～7.9。Fg主要由肝脏合成，是一种糖蛋白，含碳水化合物3%-5%，由两个相同的部分组成，每个部分含有3个肽链，即Aα、Bβ、γ链，分别由610/461和410个氨基酸残基构成。每部分由12个二硫键相连，两个部分之间通过两条γ链的半胱氨酸8、9及Aα链的半胱氨酸28所形成的3个二硫键在氨基酸相连。

大部分Fg存在于人体血浆中，约15%存在于血管外，正常人血浆中Fg的含量为2.0-4.0g/L，是血浆粘滞性的主要决定因素，止血需要量约为正常的25%-50%，血浆水平低于1-1.5g/L可能引起凝血障碍。纤维蛋白原在凝血酶的作用下裂解释放纤维蛋白肽A和B，形成纤维蛋白，与血小板一起形成稳固的纤维蛋白血栓，完成止血机制。Fg是由健康人血浆经分离、提纯并经病毒灭活处理制成的，临床主要应用于先天性、获得性纤维蛋白原减少或缺乏症，如严重肝脏损伤、肝硬化、DIC以及手术或者产后大出血等的治疗，是临床上用于大出血止血的必备急救药品之一。此外，还有文献报道，Fg还具有诱导平滑肌细胞增殖及趋化作用来促进受损组织修复的能力。可见，纤维蛋白原在临床应用发挥着重要作用。

提取纤原的原料主要包括低温乙醇工艺产生的组分Ⅰ（FⅠ）沉淀和血浆冷沉淀两种。国内外大多数血液制品厂家基本以FⅠ沉淀作为提取人纤原的原料。FⅠ沉淀主要含纤维蛋白原、FⅧ、纤维结合蛋白Fn等成分。冷沉淀是新鲜冰冻血浆在低温解冻后产生的白色絮状沉淀，其中含丰富的FⅧ、von Willebrand因子、纤维蛋白原、纤维结合蛋白等。同时冷沉淀也是制备FⅧ的主要起始原料。

纯化技术方面，低温乙醇法是世界血浆蛋白分离工业化生产的基础，随着科技进步，血液制品分离纯化方法日益增多，如离心法、辛酸盐沉淀法、压滤法、层析法、超滤法等。提取和纯化纤原的方法有低温乙醇沉淀法和甘氨酸沉淀法，二者单独或组合应用。也有研究人员进一步引进了层析技术来提高产品纯度。例如，中国专利CN101703763A（人纤维蛋白原的生产方法）报道了DEAE SephadexA50凝胶吸附在纤维蛋白原制备中的应用。中国专利CN103351432A（从血浆组分沉淀中提取人凝血因子Ⅷ和人纤维蛋白原的工艺）报道了氢氧化铝凝胶在纤维蛋白原制备中的应用。但是，现有技术的方法均存在种种缺点：现有技术的制备方法存在纤维蛋白原收率和纯度不理想的问题；乙醇沉淀法由于大量使用乙醇，给工艺操作安全造成隐患；DEAE Sephadex A50凝胶在膨胀状态时的机械强度较差，在柱层析中体积和流速会发生变化，导致工艺可控性降低以及影响产品质量；DEAE Sephadex A50、氢氧化铝吸附剂等特殊物料，还可能对最终成品造成一定的污染，影响产品质量。

综上所述，亟需开发一种新型的纤维蛋白原的制备工艺，提升纤维蛋白原收率和纯度，以满足市场对于高质量血液制品的需求。

发明内容

本发明意在提供一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺，以解决现有的制备工艺获得的纤维蛋白原的纯度和得率不理想的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺，包括以下依次进行的步骤：

S1洗涤沉淀：使用沉淀洗涤液对粉碎后的组分Ⅰ沉淀或者冷沉淀进行多次洗涤，获得洗涤后沉淀；

S2溶解沉淀：在洗涤后沉淀中加入沉淀溶解液，经过溶解和过滤后，获得滤液；

S3灭活操作：对滤液进行灭活操作，获得灭活后滤液；调整灭活后滤液的pH和电导率，再经过滤获得调整后滤液；

S4层析操作：将调整后滤液上样于阴离子交换层析柱，先后上样层析缓冲液、层析洗涤液和洗脱液，收集洗脱液的流穿液。

本方案的原理及优点是：

在本技术方案中，以组分Ⅰ沉淀或冷沉淀为原料，甘氨酸洗涤+层析的工艺制作纤维蛋白原。本专利避免大量使用乙醇沉淀法，提升了工艺操作安全系数，保证蛋白活性。本技术方案也规避了使用DEAE Sephadex A50、氢氧化铝吸附剂等特殊物料，减少物料对最终成品的污染。本专利流程简单，操作便捷，设备投入低，最终生产的产品纯度高，目前《中国药典》三部规定纤维蛋白原产品纯度需不低于70%，本专利生产的纤维蛋白原纯度达到90%以上。由于纤维蛋白原为大分子长链蛋白，蛋白不稳定，极易形成沉淀。同时由于在组分Ⅰ沉淀制作时，极易被其他凝血因子激活，形成纤维蛋白沉淀，故收率较低。本专利采用洗涤、沉淀工艺制作，纤维蛋白原的收率和纯度得到了有效提升。并且本技术方案还可以简化操作步骤，提升生产过程中的安全系数。

进一步，在S1中，所述组分Ⅰ沉淀由如下方法获取：调整血浆的蛋白质含量、电导率、pH值和乙醇含量分别为40～65g/L、12.0～14.0mS/cm、6.80～7.30和7～10%，获得沉淀体系；所述沉淀体系经1～3h搅拌反应和压滤后，获得组分Ⅰ沉淀；

所述冷沉淀由如下方法获取：离心处理血浆并取沉淀即得。

进一步，在S1中，沉淀洗涤液为含有0.06±0.02mol/L氨丁三醇和1.5±0.5mol/L甘氨酸的溶液，且pH值为7.00±0.5，温度为2～8℃。

进一步，在S1中，洗涤温度为0～5℃、洗涤次数为2-3次，每次洗涤时间为30～60min。

进一步，在S2中，沉淀溶解液为含有0.03～0.08M的氨丁三醇的缓冲液，pH 值为9.00～9.80，温度为20～30℃；溶解时间为1～3h。

进一步，在S3中，灭活操作采用的是S/D灭活；S/D溶液为含110g/L的聚山梨酯80和33g/L的磷酸三丁酯的溶液，温度为25±5℃；S/D溶液的用量为所述滤液体积的十分之一。

进一步，在S3中，调整后滤液的pH值为9.00～9.80、电导率为1.0～3.00mS/cm。

进一步，在S4中，层析缓冲液为含有0.03～0.08M的氨丁三醇的缓冲液，pH值为9.00～9.80；层析洗涤液为含有0.01～0.03M的氯化钠和0.03～0.08M的氨丁三醇的缓冲液，pH值为 9.00～9.80；洗脱液为含有0.03～0.08M的氨丁三醇的缓冲液，pH值为7.00～7.80。

进一步，在S4中，层析缓冲液为含有0.03～0.08M的氨丁三醇的缓冲液，pH值为9.00～9.80；层析洗涤液为含有0.01～0.03M的谷氨酸钠和0.03～0.08M的氨丁三醇的缓冲液，pH值为 9.00～9.80；洗脱液为含有0.03～0.08M的氨丁三醇的缓冲液，pH值为7.30～8.30，并使用谷氨酸钠调整电导率至2.5-3.5mS/cm。

进一步，还包括S5超滤透析：对洗脱液的流穿液进行超滤透析处理，分装获得成品。

综上所述，本技术方案使用组分Ⅰ沉淀、冷沉淀作为原料生产纤维蛋白原，先使用氨丁三醇+甘氨酸组成的沉淀洗涤液对粉碎后的沉淀进行洗涤，促进纤维蛋白原在沉淀中的富集。然后使用氨丁三醇组成的沉淀溶解液将洗涤后的沉淀溶解。经过S/D灭活和过滤之后，使用阴离子交换层析进一步对纤维蛋白原进行富集，最终获得纯度和收率均理想的成品。

本技术方案的有益效果具体如下：

（1）采用先洗涤沉淀再溶解和S/D灭活的工艺顺序，获得的中间产品可以通过阴离子交换层析一步处理，即可获得符合要求的成品。而现有技术中的纤维蛋白原的层析纯化方式需要采用包括阴离子交换层析、阳离子交换层析以及亲和层析等多个步骤。可见本技术方案简化了工艺流程，提升了生产效率。由于工艺流程的缩短，减少了杂质或者污染物引入的几率，同时提升了产品质量。

（2）沉淀洗涤液和沉淀溶解液的类型的选取，对于实现工艺目的非常重要，发明人通过对大量候选方案的研究，发现了氨丁三醇+甘氨酸组成的沉淀洗涤液和氨丁三醇组成的沉淀溶解液，相对于其他大大提升了产品质量和工艺效率，获得了预料不到的技术效果。

（3）使用本方案的阴离子交换层析替换现有技术的大量层析方式的组合，这对待层析样品的处理方式和阴离子交换层析的条件，有着比较严格的要求。本方案采用的待层析样品的制备方法以及层析缓冲液、层析洗涤液和洗脱液类型，保证了通过阴离子交换层析可以获得纯度较高的纤维蛋白原产品，并同时增加了收率。

（4）由于工艺流程的缩短以及本方案特殊的工艺流程，获得的纤维蛋白原的活性大幅度提升，显著优于同类产品。

（5）本技术方案可以减少低温乙醇沉淀法使用的频率，在制备获得组分Ⅰ沉淀之后，不再使用该法，大大提升了工艺安全性，减少了防爆车间的建设成本。

附图说明

图1为实验例3的使用TAME为层析柱的洗脱图谱（展示电导率线性洗脱峰）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例

一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺，大致工艺过程如下：

（1）血浆融合：挑选健康人血浆在-5～5℃条件下化冻3～10h，用75%乙醇溶液对血浆袋表面进行消毒再破袋，混合后在-5～5℃条件下溶解血浆。本步骤用到的血浆即《中国药典》中所指的人血浆：血液制品生产用人血浆系以单采血浆术采集的供生产血浆蛋白制品用的健康人血浆，为血液离心去除细胞后的上清，含有蛋白质、无机盐和水等，不含血细胞。

（2）组分Ⅰ沉淀制作：溶解后血浆用2.0～8.0℃注射用水稀释蛋白质含量至40～65g/L、用氯化钠颗粒调整电导率至12.0～14.0mS/cm。用1.0mol/L醋酸溶液调整血浆pH至6.80～7.30，调整制品中乙醇浓度为7%～10%（体积百分数），搅拌反应1～3h后压滤分离，获得组分Ⅰ沉淀。组分Ⅰ沉淀的获取方法为现有技术的常规手段，本技术方案主要是在获得组分Ⅰ沉淀之后，如何从其中分离纯化出纤维蛋白原进行研究。

（3）组分Ⅰ沉淀洗涤：取组分I沉淀粉碎，加入10～15倍沉淀量（质量）的沉淀洗涤液（0.06±0.02mol/L氨丁三醇tris+1.5±0.5mol/L 甘氨酸，pH 7.00±0.5，2～8℃），控制温度0～5℃，搅拌洗涤30～60min，洗涤结束后4000rpm，离心20min，洗涤2～3次。

（4）组分Ⅰ沉淀溶解：向洗涤离心后的组分Ⅰ沉淀中加入5～8倍沉淀量（质量）的沉淀溶解液（0.03～0.08M tris，pH 9.00～9.80，20～30℃）保持温度溶解1～3h。

（5）过滤：溶解后制品使用深层滤器过滤（过滤操作为达到澄清效果，孔径为1μm），获得滤液。

（6）S/D灭活：根据制品体积（滤液）缓慢加入制品体积十分之一的S/D溶液（含110g/L聚山梨酯80和33g/L的磷酸三丁酯，温度25±5℃），获得灭活后滤液。

（7）制品调整：用0.5M NaoH调整滤液pH 9.00～9.80、电导率1.0～3.00mS/cm。采用终端为0.2μm滤芯过滤（可先用滤板或大孔径滤芯预过滤）制品，获得调整后滤液。

（8）阴离子交换层析：可选用TMAE层析填料、Q层析填料（配基为季氨基团，例如：Nanogle 50Q）、DEAE层析填料（配基为二乙基氨基乙基，例如：Unigel 80DEAE）等阴离子交换层析填料，采用现有技术常规手段填装与层析柱中，进行阴离子交换层析。作为具体的示例，后续的实施例、实验例和对比例中，如果未进行特别说明，具体使用Fractgel EMD TMAE(M)凝胶进行层析纯化。上述提及的多种阴离子交换层析填料都能达到相同的分离效果。上样前用3～8倍柱床体积溶液（组成为0.03～0.08M Tris溶液，pH 9.00～9.80）处理层析柱，层析柱通过现有技术常规手段完成柱平衡后，再上样制品（即（7）中调整后滤液）。后续实施例和对比例采用统一的柱平衡方式，即，采用8倍柱床体积溶液（组成同淋洗缓冲液）平衡层析柱。制品的上样载量不高于15g蛋白/L凝胶，上样流速不高于120cm/h，用3～8倍柱床体积的缓冲液（层析缓冲液、淋洗缓冲液）（0.03～0.08M Tris，pH9.00～9.80）进行淋洗，再用3～8倍柱床体积的层析洗涤液（0.03～0.08Mtris+0.01～0.03M 氯化钠，pH 9.00～9.80）进行洗涤，淋洗液和洗涤液均废弃，再用3～6倍柱床体积洗脱液（0.03～0.08Mtris，pH 7.00～7.80）进行洗脱，收集洗脱液（流穿液）。

（9）洗脱液使用50KD膜包进行常规的超滤透析，以达到浓缩蛋白的目的。将洗脱液蛋白超滤浓缩至15～25g/L，使用透析液（透析液配方为0.5～4.0g/L枸橼酸钠+10～17g/L氯化钠+8～13g/L精氨酸+2～6g/L甘氨酸+10～15g/L蔗糖，pH7.20±0.50，盐酸调整pH，温度20℃～30℃）等体积透析3～5倍后，获得纤维蛋白原样品。获得的纤维蛋白原样品经过浓度调整至成品规定的蛋白浓度，再分装到试剂瓶中，获得纤维蛋白原成品。在本技术方案中，纤维蛋白原成品分装至试剂瓶中的量为25mL，蛋白浓度为25g/L。后续实施例和对比例采用统一的超滤和透析条件，将洗脱液蛋白超滤浓缩至20g/L，然后使用透析液等体积透析4倍，透析液配方为：3.0g/L枸橼酸钠、15g/L氯化钠、11g/L精氨酸、4g/L甘氨酸、12g/L蔗糖，pH7.20，温度25℃。

（10）样品检验：

纤维蛋白原纯度检测按照2020版《中国药典》三部进行，纯度计算方法为：用0.85%～0.90%生理盐水将供试品稀释至每1ml含纤维蛋白原2-3mg，测定蛋白质含量P1（通则0731第一法）；取供试品溶液10ml，加入等量含3IU/ml的凝血酶溶液（含0.05mmol/L氯化钙），于37℃放置20分钟，以每分钟2500转离心或过滤分离沉淀，用生理盐水洗3次后，测定可凝固蛋白质含量P2,计算纤维蛋白原纯度（%）=P2/P1*100。

凝固活力：用生理盐水分别稀释凝血酶溶液至3IU/ml，供试品溶液至3mg/ml备用。于反应管内加入已预热至37℃的凝血酶溶液（3mg/ml），摇匀。置于37℃用自动检测仪器记录凝固时间。两次测定结果平均值应不超过60秒。

收率为每吨血浆制备获得的层析洗脱液中的纤原总量。

按照上述方法进行纤维蛋白原的制备，具体参数选取参见表1。

表1：组1-3的参数设置以及成品检验结果（*：纤维蛋白原成品的规格为：蛋白含量25g/L、每瓶25mL，至少需＞800瓶/吨血浆；#至少需＞70%，最好＞85%）

实验例1：针对步骤（3）中沉淀洗涤液的筛选实验

为提高工艺稳定性以及提升纤维蛋白原品质，发明人对组分Ⅰ沉淀的洗涤液进行了测试和筛选，候选沉淀洗涤液详见表2。本实验例的纤维蛋白原的制备过程参见表1的组1，不同测试间的差异在于具体沉淀洗涤液的类型以及相应的参数设置。

编号8的实验与组1基本一致，与组1的不同点在于：在“（3）组分Ⅰ沉淀洗涤”中，将组分I沉淀粉碎，加入常温沉淀洗涤液（25℃）中，然后降温至5℃，进行搅拌洗涤，洗涤结束后离心取沉淀。即，编号8的实验的沉淀洗涤液没有经过预冷处理。

编号9的实验与组1基本一致，与组1的不同点在于：在“（3）组分Ⅰ沉淀洗涤”中，将组分Ⅰ沉淀加入沉淀洗涤液中，经过搅拌洗涤之后静置，弃上清。即洗涤过程中没有通过离心来进行固液分离。

表2：候选沉淀洗涤液、相关参数设置以及纤维蛋白原样品检测结果

编号	沉淀洗涤液组成	搅拌洗涤温度（℃）	纤维蛋白原纯度（%）	纤维蛋白原收率（瓶/吨血浆）
					1（组1）	0.06mol/L tris；  1.5mol/L 甘氨酸；  pH 7.00	5	91	950
2	0.06mol/L氯化钠；  1.5mol/L 甘氨酸；  pH 7.00	5	80	720
					3	0.2mol/L tris；  3mol/L 甘氨酸；  pH 7.00	5	89	1050
4	0.01mol/L tris；  0.5mol/L 甘氨酸；  pH 7.00	5	90	550
					5	0.06mol/L tris；  1.5mol/L 甘氨酸；  pH 8.00	5	92	890
6	0.06mol/L tris；  1.5mol/L 甘氨酸；  pH 6.00	5	87	880
					7	0.06mol/L tris；  1.5mol/L 甘氨酸；  pH 7.00	10	83	430
8	0.06mol/L tris；  1.5mol/L 甘氨酸；  pH 7.00	5	88	500
					9	0.06mol/L tris；  1.5mol/L 甘氨酸；  pH 7.00	5	75	480

根据表2的实验结果可知，本方案采用由tirs和甘氨酸组成的沉淀洗涤液能够较为理想地保证纤维蛋白原产品的纯度和收率（组1）。如果将沉淀洗涤液更换为氯化钠和甘氨酸的组合，在本工艺条件下，会比较严重地降低纤维蛋白原的纯度和收率（表2的编号2），还会导致写层析前制品浑浊（即，洗涤、溶解、过滤后制品浑浊）。tris和甘氨酸的浓度也是影响工艺效果的关键因素。编号3的甘氨酸的浓度较高，造成其它杂蛋白也与纤维蛋白原同时沉淀，在提升收率的同时也会导致纯度下降，再加之较高的tris和甘氨酸浓度也会引入更多杂质和导致试剂的浪费，所以相对组1，编号3并不是理想选择。编号4的甘氨酸的浓度较低，纤维蛋白原的沉淀效果差，导致纤维蛋白原收率过低。沉淀洗涤液的pH值也较为显著地影响的成品性能。编号5的pH值过高，导致纤维蛋白原的收率下降；编号6的pH值过低，导致纤维蛋白原的纯度和收率均下降。

除了沉淀洗涤液本身因素，其他工艺操作方式也会对成品新能产生显著影响。编号7在搅拌洗涤的过程中温度比较高，导致收率和纯度均呈现出较大幅度的下降。编号8的实验没有对沉淀洗涤液预冷，也导致收率和纯度均呈现出较大幅度的下降。编号9的实验没有在洗涤沉淀的过程中采用离心的手段进行固液分离，也导致收率和纯度均呈现出较大幅度的下降。

综上所述，通过实验研究我们可以发现，采用适当的沉淀洗涤液和洗涤方式，可以将组分I沉淀中的纤维蛋白原成分充分沉淀和富集，除去其他非目的的蛋白或者其他组分，使得纤维蛋白原得到充分富集，提升纤维蛋白原纯度和收率，提升产品质量。

实验例2：针对步骤（4）的沉淀溶解液的筛选实验

为提高工艺稳定性以及提升纤维蛋白原品质，发明人对组分Ⅰ沉淀的沉淀溶解液进行了测试和筛选。出于保护原料中的蛋白的目的，发明人尝试了在沉淀溶解液中加入了一些保护性物质，以期避免蛋白质降解以及提升产品品质。但是，经过测试发现，保护性的物质的加入，会比较严重地干扰层析效果，造成获得纤维蛋白原产品的品质下降，以及纤维蛋白原收率下降。例如，发明人尝试将表1的组1中的沉淀溶解液0.05Mtris更换成15g/L枸橼酸钠+8g/L氯化钠+10g/L蔗糖+0.05M tris（pH9.5），或者更换为15g/L枸橼酸钠+0.05Mtris（pH 9.5），或者15g/L枸橼酸钠+8g/L氯化钠+10g/L蔗糖（pH 7.0）、或者15g/L枸橼酸钠+8g/L氯化钠+8g/L精氨酸（pH7.0）、或者10g/L枸橼酸钠+8g/L氯化钠+4g/L精氨酸（pH7.0），其他条件同组1。但是，上述沉淀溶解液溶解沉淀之后形成的溶液无法上样层析，严重影响层析柱效率，获得的洗脱液中纤维蛋白原难以实现富集，无法和杂蛋白分开。因此，本技术方案最终采用了不加额外蛋白保护剂的方案，只使用tris溶液溶解沉淀。

除此之外，使用tris溶液溶解沉淀的温度对成品性能也会产生较大影响。发明人在组1的基础上将沉淀溶解液的温度调整至35℃，高温条件下，纤维蛋白原不稳定，易沉淀。纤原沉淀溶解不完成，过滤后制品浑浊，无法进行下一步试验。发明人在组1的基础上将沉淀溶解液的温度调整至15℃，纤维蛋白原在tris溶液中的溶解性差，在此温度过滤，纤维蛋白原沉淀无法溶解。在溶解洗涤后沉淀时，沉淀无法全部溶解，还是沉淀状态，溶解液中纤原含量低，未再进行下一步试验。

实验例3：针对步骤（8）的层析条件的筛选实验

为提高工艺稳定性以及提升纤维蛋白原品质，发明人对阴离子交换层析中使用到的各种缓冲液进行了测试和筛选，候选缓冲液详见表3。本实验例的纤维蛋白原的制备过程参见表1的组1，不同测试间的差异在于具体缓冲液类型的选取。

表3：层析缓冲液、层析洗涤液和洗脱液的筛选以及纤维蛋白原样品检测结果

分组	层析缓冲液	层析洗涤液	洗脱液	纤维蛋白原纯度（%）	纤维蛋白原收率（瓶/吨血浆）
						1（组1）	0.05M Tris  pH 9.50	0.05M tris  0.02M 氯化钠  pH9.50	0.05M tris  pH 7.50	91	950
2	0.05M Tris  pH 9.50	0.05M Tris  pH 9.50	0.05M tris  pH 7.50	80	1300
						3	0.05M tris  0.02M 氯化钠pH 9.50	0.05M tris  0.02M 氯化钠  pH9.50	0.05M tris  pH 7.50	92	700
4	0.05M Tris  pH 9.50	0.05M tris  0.02M 氯化钠  pH9.50	0.01mol/L磷酸氢二钠  0.01mol/L磷酸二氢钠  pH 7.50	85	600

编号2的实验在组1的基础上，将层析洗涤液更换为不含有氯化钠的tris溶液，虽然收率提高了，但是纤维蛋白原的纯度下降较大，所以层析洗涤液中加入氯化钠是保证产品纯度的较为关键的因素。编号3的实验在组1的基础上，将层析缓冲液更换为含有氯化钠的tris溶液，制备的纤维蛋白原成品虽然纯度符合要求，但是收率大大降低。发明人分析原因在于，由于氯化钠的加入使得纤维蛋白原等蛋白无法充分吸附到柱材料上，导致原料的损失较大，所以收率下降比较多。编号4的实验将洗脱液进行了调整，在洗脱液pH值不变的情况下，成品的纯度和收率受到了比较大的影响。磷酸氢二钠和磷酸二氢钠作为缓冲液的使用，不但引入了新的杂质，而且还会导致样品中蛋白的析出（在洗脱液的流穿液中可以观测到析出的蛋白），并且对纤维蛋白原的保护效果不如tris，所以最终导致了纤维蛋白原的纯度和收率均不理想。

除了TMAE层析填料外，发明人还尝试了其他厂家的阴离子层析填料，包括配基为DEAE（二乙基氨基乙基）、Q（季氨基团）的填料，都能达到相同的分离效果。TAME层析填料典型洗脱曲线参见图1。

发明人还尝试了在组1的基础上，将层析洗涤液中的氯化钠更换为谷氨酸钠（等量替换），以及在洗脱液中加入谷氨酸钠，也能够将纤维蛋白原和其他的杂蛋白分开，获得较为理想的效果。参见表4中的实验数据，其中，在洗脱液0.05M tris的基础上使用常规方式调整pH值至指定水品，并使用谷氨酸钠调整电导率至指定水平。其他工艺步骤和试剂使用情况同组1。由表4的实验数据可知，适当的条件的谷氨酸的使用可以在不大幅度降低收率的情况下，提升纤维蛋白原的纯度。即洗脱液的pH值维持在7.3-8.3，电导率维持在2.5-3.5mS/cm，纤维蛋白原的纯度可达到94-95%，收率可以达到850瓶/吨血浆以上。

表4：采用谷氨酸钠作为洗脱液纯度及收率

实验例4：针对原料的筛选实验

本技术方案使用组分I沉淀作为原料进行纤维蛋白原的纯化，相比于使用一般的冷沉淀，提升了纤维蛋白原的收率。冷沉淀的具体制备方法为：原料血浆融合后，在0～2℃条件下，在大于10000rpm的转速条件下离心形成沉淀。离心后血浆上清可用于本专利工艺中制作组分I沉淀等过程的制品参数调整。实验结果参见表5，使用组分I沉淀作为原料可以提升纤维蛋白原收率，并且采用本工艺不论是使用组分I沉淀还是冷沉淀作为原料，均可以保证较为理想的纤维蛋白原纯度。

表5：使用不同原料的情况下纤维蛋白原收率以及纯度情况

原料	纤维蛋白原纯度（%）	纤维蛋白原收率（瓶/吨血浆）
			组分I沉淀	91	950
冷沉淀	91	850

对比例1

本对比例基本同表1中的组1，不同点在于步骤（8）TMAE层析之前的用于层析上样的制品（调整后滤液）的获取过程，具体不同点如下：

参照步骤（1）和（2）获得组分Ⅰ沉淀，然后参照步骤（4）将组分Ⅰ沉淀溶解，接下来参照步骤（5）和步骤（6）对溶解后的组分Ⅰ沉淀进行S/D灭活，获得灭活后滤液。将灭活后滤液温度调整至3℃，加入-25℃的低温乙醇至乙醇的终浓度为10%，温度控制在3℃，搅拌反应2h后压滤分离，获得低温乙醇沉淀。参照步骤（3）和步骤（4），使用tris+甘氨酸洗涤沉淀以及使用tris将沉淀溶解。再参照步骤（7）调整pH和电导率以及过滤，获得用于层析上样的制品（调整后滤液）。

采用本对比例的方法，将S/D灭活和甘氨酸洗涤的工艺顺序进行了调整，并增加了中间的低温乙醇沉淀步骤。低温乙醇沉淀操作需要使用大量乙醇，有安全风险，同时乙醇对蛋白结构会产生一定影响，进而影响产品的活性。除此之外，操作工艺顺序的变更还较为显著地影响到了产品品质和生产效率，由本实施例的方法获得的纤维蛋白原样品，纤维蛋白原纯度为92%，纤维蛋白原收率低于500瓶/吨血浆。本对比例在获得组分Ⅰ沉淀后使用了低温乙醇沉淀步骤，增加了工艺复杂性，却未能使得成品的纯度有所提升，且收率降低。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (9)

1.一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺，其特征在于：包括以下依次进行的步骤：

S1洗涤沉淀：使用沉淀洗涤液对粉碎后的组分Ⅰ沉淀或者冷沉淀进行多次洗涤，获得洗涤后沉淀；

S2溶解沉淀：在洗涤后沉淀中加入沉淀溶解液，经过溶解和过滤后，获得滤液；

S3灭活操作：对滤液进行灭活操作，获得灭活后滤液；调整灭活后滤液的pH和电导率，再经过滤获得调整后滤液；

S4层析操作：将调整后滤液上样于阴离子交换层析柱，先后上样层析缓冲液、层析洗涤液和洗脱液，收集洗脱液的流穿液。

2.根据权利要求1所述的一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺，其特征在于：在S1中，所述组分Ⅰ沉淀由如下方法获取：调整血浆的蛋白质含量、电导率、pH值和乙醇含量分别为40～65g/L、12.0～14.0mS/cm、6.80～7.30和7～10%，获得沉淀体系；所述沉淀体系经1～3h搅拌反应和压滤后，获得组分Ⅰ沉淀；

所述冷沉淀由如下方法获取：离心处理血浆并取沉淀即得。

3. 根据权利要求1所述的一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺，其特征在于：在S1中，沉淀洗涤液为含有0.06±0.02mol/L氨丁三醇和1.5±0.5mol/L 甘氨酸的溶液，且pH值为7.00±0.5，温度为2～8℃。

4.根据权利要求3所述的一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺，其特征在于：在S1中，洗涤温度为0～5℃、洗涤次数为2-3次，每次洗涤时间为30～60min。

5. 根据权利要求1所述的一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺，其特征在于：在S2中，沉淀溶解液为含有0.03～0.08M的氨丁三醇的缓冲液，pH 值为9.00～9.80，温度为20～30℃；溶解时间为1～3h。

6.根据权利要求1所述的一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺，其特征在于：在S3中，灭活操作采用的是S/D灭活；S/D溶液为含110g/L的聚山梨酯80和33g/L的磷酸三丁酯的溶液，温度为25±5℃；S/D溶液的用量为所述滤液体积的十分之一。

7.根据权利要求6所述的一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺，其特征在于：在S3中，调整后滤液的pH值为9.00～9.80、电导率为1.00～3.00mS/cm。

8. 根据权利要求1所述的一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺，其特征在于：在S4中，层析缓冲液为含有0.03～0.08M的氨丁三醇的缓冲液，pH值为 9.00～9.80；层析洗涤液为含有0.01～0.03M的氯化钠和0.03～0.08M的氨丁三醇的缓冲液，pH值为9.00～9.80；洗脱液为含有0.03～0.08M的氨丁三醇的缓冲液，pH值为7.00～7.80。

9. 根据权利要求1所述的一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺，其特征在于：在S4中，层析缓冲液为含有0.03～0.08M的氨丁三醇的缓冲液，pH值为 9.00～9.80；层析洗涤液为含有0.01～0.03M的谷氨酸钠和0.03～0.08M的氨丁三醇的缓冲液，pH值为9.00～9.80；洗脱液为含有0.03～0.08M的氨丁三醇的缓冲液，pH值为7.30～8.30，并使用谷氨酸钠调整电导率至2.5-3.5mS/cm。

10， 根据权利要求1所述的一种基于层析方法的纤维蛋白原制备工艺，其特征在于：还包括S5超滤透析：对洗脱液的流穿液进行超滤透析处理，分装获得成品。

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