CN109651502B - 一种从人血浆中同时分离纯化凝血因子ix、x和ⅶ的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从人血浆中同时分离纯化凝血因子IX、X和Ⅶ的方法，通过离心除杂、凝胶吸附及超滤浓缩以制备的凝血酶原复合物，经阴离子交换树脂柱分离出凝血因子Ⅶ和含Ⅸ、Ⅱ的混合液，再将含Ⅸ、Ⅱ的混合液经亲和层析分离出凝血因子Ⅱ和Ⅸ。本发明通过将阴离子交换层析与肝素亲和层析相结合，实现了同时对3种凝血因子Ⅱ、Ⅶ和Ⅸ进行分离、制备，不仅原料利用高，且操作简单、耗时短；同时通过在层析过程中通过对电信号的检测，准确收集相应的凝血因子，有效提高凝血因子纯度，提高经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物大分子分离纯化技术领域，特别涉及一种从人血浆中同时分离纯化凝血因子IX、X和Ⅶ的方法。
背景技术
凝血因子是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分，在出血时被激活，和血小板粘连在一起并且补塞血管上的创口，是治疗血友病的特效药物。目前凝血因子Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ和凝血酶原复合物(主要还有凝血因子Ⅱ，Ⅶ，Ⅸ，Ⅹ)已经开发成药物，用于甲型或乙型血友病的治疗。
凝血因子Ⅸ(Coagulation factor IX，简写为FIX)临床上应用于乙型血友病患者的治疗，因此从凝血酶原复合物中进一步纯化获得高纯度的凝血因子Ⅸ，具有临床应用价值。此外，凝血因子Ⅶ在临床上应用于先天性Ⅶ缺乏症患者、凝血因子Ⅷ或Ⅸ的抑制物＞5BU的先天性血友病患者和获得性血友病患者。目前国外已经有纯化了的凝血因子Ⅶ上市，用于上述患者的治疗。凝血因子Ⅱ又被称为凝血酶原，可以用来制备凝血酶，而凝血酶作为一种新型的止血剂，主要用于消化道出血、妇产科出血、临床抢救等外科止血。从凝血因子复合物中纯化制备凝血因子Ⅶ、Ⅸ、Ⅱ，不仅可丰富血液制品种类，为临床患者提供有针对性的药物，同时提高血浆原料的利用率。
蔡骏等人在《柱层析法制备高纯人血FⅨ研究初探》中报告了一种用DEAE-SephadexA50，DEAE-Sepharose FF和Heparin-Sepharose CL-6B制备高纯度凝血因子Ⅸ的方法，最终Ⅸ比活为35±2.0IU/mg，回收率为30±4％，纯化3500倍。赵彦鼎等人在《自制填充介质对人血浆凝血因子Ⅸ的层析分离》中采用自制的DEAE Bio-Sep FF和肝素Bio-Sep介质，从低温离心去除冷沉淀后的人血浆中在不同的淋洗条件下，经过两步弱阴离子交换和一步亲和层析分离纯化Ⅸ。Ⅸ比活达到99.40IU/mg，纯化倍数为3823倍，回收率约为30％。但上述方法只能实现对凝血因子Ⅸ纯化，不能同时纯化Ⅱ和Ⅶ。
凝血因子Ⅱ又被称为凝血酶原。传统工艺分离凝血酶原和其他成分可通过改变凝血酶的溶解度使其沉淀，如等电点沉淀法，或者无机盐对其吸附作用从而进行提取，如等电点沉淀法、钡盐吸附法、氢氧化镁吸附法。招健华等人《凝血酶制备工艺的研究进展》一文中说明了上述凝血酶原分离纯化方法。王永成等人在《一种制备凝血酶的方法》中国专利,200410074753.3[P]中公开一种制备凝血酶的方法，采用加入抗凝剂的猪血浆为原料，离心后收集上清液，并将上清液上阴离子层析柱层析，洗脱层析柱后即得凝血酶原溶液。上述文献提供的纯化方法，均是针对凝血因子Ⅱ的纯化技术，公开的技术方案不能同时纯化得到其他种类的凝血因子。
申请号为201110001483.3，名为一种高效提取纯化凝血因子IX和凝血因子X的方法，包括血液的收集、处理、取血浆以及自血浆中提取IX粗提物和X粗提物及其纯化，所述的纯化是凝血因子IX粗提物和X粗提物分别用FIX/FX-bp-Sepharose 4B进行亲和层析纯化，所述的亲和配基FIX/FX-bp选自ACF I、ACF II或AHP。纯化后凝血因子IX可直接作为药物应用，纯化后凝血因子X可直接作为试剂使用。该方法可实现同时对凝血因子IX和X的纯化。
凝血因子Ⅱ、Ⅶ和Ⅸ都是酶原，在长时间的纯化处理过程中，它们会被活化。目前文献报道凝血因子Ⅱ、Ⅶ和Ⅸ分离纯化常用到的技术手段是吸附法、沉淀法、离子交换层析或亲和层析，上述方法不仅步骤繁琐，耗费时间长，且只能对凝血因子中的1种或2种进行分离纯化，目前尚未见到一种技术方案或一套工艺路线可同时实现凝血因子Ⅱ、Ⅶ和Ⅸ的分离纯化。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种从人血浆中同时分离纯化凝血因子IX、X和Ⅶ的方法，所述的制备方法可同时对3种凝血因子Ⅱ、Ⅶ和Ⅸ进行分离、制备，原料利用高，操作简单、耗时短；且通过在层析过程中对电信号检测，可有效提高凝血因子纯度，提高经济效益。
本发明提供了一种从人血浆中同时分离纯化凝血因子IX、X和Ⅶ的方法，包括如下步骤：
(1)制备凝血酶原复合物；
(2)通过阴离子交换树脂柱分离凝血因子Ⅶ和含Ⅸ、Ⅱ的混合液；
(3)步骤(2)的含Ⅸ、Ⅱ的混合液经亲和层析分离凝血因子Ⅱ和Ⅸ。
进一步的，所述的阴离子交换柱为Toyopearl DEAE 650M；所述的亲和层析柱为Heparin Sepharose FF。
更进一步的，步骤(1)中包括如下步骤：1.1离心去除冷沉淀：将血浆融化后在0～4.0℃下离心，收集清液并升温至6.0±2.0℃，用0.2-10μm滤芯过滤后备用；1.2凝胶吸附、洗涤及洗脱：将过滤后清液与经平衡液处理的凝胶按0.5-1.5g(凝胶)/L(清液)混合后，保持6.0±2.0℃，搅拌吸附20-60min后收集凝胶。用1-3倍凝胶体积量的平衡液洗涤凝胶2-6次，搅拌混匀，洗涤液废弃；用1-3倍凝胶体积量的洗脱液洗脱凝胶2-6次，搅拌混匀，抽滤收集洗脱液；1.3超滤浓缩：用截留分子量为10k的超滤膜浓缩，并用3-5倍体积的透析液进行恒体积超滤透析，得到符合条件的凝血酶原复合物。
进一步的，步骤(1)中所述的平衡液为含有50～100mM氯化钠的5～15mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值6.0～8.0；所述洗脱液为含有400～600mM氯化钠的10～15mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值6.0～8.0。
更进一步的，所述的凝血酶原复合物满足下述条件：电导率为10-20ms/cm，蛋白浓度为15-50g/L，pH值为6.0-7.5。
进一步的，步骤(2)中包括如下步骤：2.1稀释、上柱：将凝血酶原复合物稀释至液电导率介于6～10ms/cm，泵入到平衡好的层析柱中，根据流出液的OD280值收集上样流穿液，至上样结束。2.2层析柱冲洗及洗脱：用1-3倍体积的平衡液冲洗层析柱，之后用1-3倍体积的洗脱液洗脱，根据流出液的OD280值分段收集。
进一步的，当AbsOD280吸收值＞50mAu，收集主要成分为凝血因子Ⅶ的收集液；当50mAu＞AbsOD280＞20mAu，收集主要含Ⅸ、Ⅱ的混合液。
进一步的，步骤(3)具体为将含Ⅸ、Ⅱ的混合液泵入到平衡好的层析柱中，根据流出液的OD280值收集上样流穿液，至上样结束；用1-3倍体积的平衡液冲洗层析柱，之后用1-3倍体积的洗脱液洗脱，根据流出液的OD280值分段收集。
进一步的，所述的平衡液为为10～20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值6.0～8.0；所述洗脱液为含有100～200mM氯化钠的10～20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值6.0～8.0。
再进一步的，当AbsOD280吸收值＞50mAu，收集作为凝血因子Ⅱ的收集液；当50mAu＞AbsOD280＞20mAu，收集作为凝血因子Ⅸ的收集液。
上述凝血因子Ⅶ、Ⅸ及Ⅱ的收集液分别用10k分子量的超滤膜进行浓缩，然后恒体积透析，分别得到凝血因子IX、Ⅱ、Ⅶ的浓缩液，最后冷冻干燥。
相对于现有技术，本发明所述的一种从人血浆中同时分离纯化凝血因子IX、X和Ⅶ的方法具有以下优势：
1、通过特定的离子交换层析介质与层析条件，实现凝血因子Ⅶ的分离，同时通过特定的亲和层析介质与层析条件实现对凝血因子Ⅱ和Ⅸ的分离，且操作简单、耗时短。
2、通过由离子交换层析和亲和层析组成的工艺，可同时对3种凝血因子Ⅱ、Ⅶ和Ⅸ进行分离、制备，以实现对原料的充分利用，提高经济效益。
3、在层析过程中通过对电信号的检测，可准确收集相应的凝血因子，有效提高凝血因子纯度。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明所述的一种从人血浆中同时分离纯化凝血因子IX、X和Ⅶ的方法的工艺流程示意图；
图2为本发明所述的一种从人血浆中同时分离纯化凝血因子IX、X和Ⅶ的方法的工艺过程SDS-PAGE电泳检测图谱；
图3为本发明所述的一种从人血浆中同时分离纯化凝血因子IX、X和Ⅶ的方法中从凝血酶原复合物中通过阴离子交换层析分离凝血因子Ⅶ和Ⅸ的层析图谱；
图4为本发明所述的一种从人血浆中同时分离纯化凝血因子IX、X和Ⅶ的方法中利用肝素亲和层析从阴离子交换层析洗脱液中分离提取凝血因子Ⅱ和Ⅸ的层析图谱；
图5为本发明所述的一种从人血浆中同时分离纯化凝血因子IX、X和Ⅶ的方法的工艺过程中各组分凝血因子Ⅱ、Ⅶ和Ⅸ活性分布图；
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，应理解的是，本发明实施例仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下，对本发明的简单改进均属于本发明要求保护的范围。
本发明实施例基于血浆中凝血因子Ⅱ、Ⅶ和Ⅸ在特定缓冲溶液中，蛋白表面电荷密度或糖基化修饰的差异，进而研发了一种基于层析技术手段，可同时纯化制备凝血因子Ⅱ、Ⅶ和Ⅸ制剂的工艺技术方法。
实施例1
本发明所述的一种从人血浆中同时分离纯化凝血因子IX、X和Ⅶ的方法的工艺流程如图1，具体步骤包括：
1、凝血酶原复合物的制备
S101.血浆离心去除冷沉淀提前预冷离心机，将血浆融化后在2.0℃环境下离心，分离去除冷沉淀，收集分离后血浆升温至6.0℃，用10.0um联合1.0um滤芯逐级过滤至吸附罐。
S102.血浆吸附及凝胶洗涤吸附凝胶介质为DEAE-Sephadex-A50，凝胶平衡液为含有75mM氯化钠的10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值7.0。将2倍凝胶体积量的吸附平衡液泵入吸附罐中，搅拌混匀，抽滤废弃，重复至抽滤液pH值为7.0。将血浆与凝胶按一定比例混合后，保持6.5℃，搅拌吸附40min，抽滤血浆收集凝胶。
S103.凝胶平衡、洗涤、洗脱用2倍凝胶体积量的凝胶平衡液洗涤凝胶4次，搅拌混匀，抽滤废弃；用2倍凝胶体积量的凝胶洗涤液洗涤凝胶4次，搅拌混匀，抽滤废弃；用2倍凝胶体积量的凝胶洗脱液洗涤凝胶3次，搅拌混匀，抽滤收集洗脱液，用0.2um滤芯过滤至超滤罐。上述凝胶洗涤液为含有100mM氯化钠的10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值7.0；凝胶洗脱液为含有500mM氯化钠的10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值7.0。
S104.凝胶再生凝胶再生缓冲液为2000mM氯化钠。用2倍凝胶体积量的再生缓冲液对凝胶进行再生。
S105.超滤透析透析液为10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值7.0。将凝胶洗脱液用10KD的膜包进行超滤浓缩后，开始进行等体积超滤透析，透析液体积采用4倍浓缩液量的透析液对制品进行，使制品电导为15.00ms/cm，蛋白浓度控制为40g/L，pH值为7.0，得到凝血酶原复合物。
2、从凝血酶原复合物中通过阴离子交换层析分离凝血因子Ⅶ和Ⅸ
S201.从人血浆制备的凝血酶原复合物使用纯化水或枸橼酸钠缓冲液(pH7.0)稀释，使稀释后的溶液电导率为8ms/cm，加入盐酸或氢氧化钠溶液调节溶液pH值为7.0。
S202.层析柱平衡层析柱装填介质为Toyopearl DEAE 650M(东曹(上海)生物科技有限公司商业化产品)，层析平衡液为10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值7.0。将层析平衡液泵入到层析柱中，检测层析柱流出液，当流出液pH值与层析平衡液pH相同时，层析柱平衡结束。
S203.层析柱上样将步骤S01中配制好的凝血酶原复合物溶液，泵入到步骤S02平衡好的层析柱中，通过紫外检测器于280nm波长下，监测层析柱流出液，当OD280吸收值大于50mAu时开始收集上样流穿液(主要为凝血因子Ⅶ)，至上样结束。
S204.层析柱冲洗上样结束后使用层析平衡液泵入层析柱中，以冲洗层析柱中残留的样品，期间继续监控OD280吸收值，并收集OD280吸收值大于50mAu部分的冲洗流穿液(主要为凝血因子Ⅶ)。直至OD280吸收值趋近基线。
S205.层析柱洗脱层析洗脱液为含有160mM氯化钠的10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值7.0。层析柱冲洗完毕后，在层析柱中泵入层析洗脱液对层析柱进行洗脱，通过紫外检测器于280nm波长下，监测层析柱流出液，当OD280吸收值大于20mAu时开始收集洗脱液(洗脱产物主要为凝血因子Ⅱ和Ⅸ)，至OD280吸收值趋近基线时，洗脱结束，具体层析图谱见图3。
S206.层析柱再生。再生缓冲液为1000mM氯化钠。层析柱洗脱完毕后，在层析柱中泵入3倍层析柱体积的再生缓冲液，对层析柱进行再生。
3、从阴离子交换层析洗脱液中分离提取凝血因子Ⅱ和Ⅸ
S301.层析柱平衡层析柱装填介质为Heparin Bestarose FF(博格隆(上海)生物技术有限公司商业化产品)，层析平衡液为10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值7.5。将平衡液泵入到层析柱中，检测层析柱流出液，当流出液pH值与层析平衡液pH相同时，层析柱平衡结束。
S302.层析柱上样将实施例2中的阴离子层析洗脱液，泵入到步骤S01平衡好的层析柱中，通过紫外检测器于280nm波长下，监测层析柱流出液，当OD280吸收值大于50mAu时开始收集上样流穿液(凝血因子Ⅱ即存在流穿液中)，至上样结束。
S303.层析柱冲洗上样结束后使用层析平衡液泵入层析柱中，以冲洗层析柱中残留的样品，期间继续监控OD280吸收值，并收集OD280吸收值大于50mAu部分的冲洗流穿液(主要为凝血因子Ⅱ)，直至OD280吸收值趋近基线。
S304.层析柱洗涤层析洗涤液为含有160mM氯化钠的10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值7.5。层析柱冲洗完毕后，在层析柱中泵入层析洗涤液对层析柱进行洗涤，通过紫外检测器于280nm波长下，监测层析柱流出液，当OD280吸收值大于20mAu时开始收集洗涤液，至OD280吸收值趋近基线时，洗涤结束。
S305.析柱洗脱层析洗脱液为含有320mM氯化钠的10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值7.5。层析柱冲洗完毕后，在层析柱中泵入层析洗脱液对层析柱进行洗脱，通过紫外检测器于280nm波长下，监测层析柱流出液，当OD280吸收值大于20mAu时开始收集洗脱液至OD280吸收值趋近基线时，洗脱结束。纯化的凝血因子Ⅸ即存在洗脱液中，具体该步的层析图谱见图4。
S306.层析柱再生层析柱洗脱完毕后，在层析柱中泵入3倍层析柱体积的再生缓冲液(1000mM氯化钠)，对层析柱进行再生。
使用电泳测定该工艺过程中IX、Ⅱ、Ⅶ的纯度，使用SDS-PAGE鉴定电泳条带，用酶底物法检测FIX、FX的活力，电泳检测图谱如图2所示，凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ在各部中的活性变化见表1，具体的活性分布如图5所示。
上述凝血因子Ⅶ、Ⅸ及Ⅱ的收集液分别用10k分子量的超滤膜进行浓缩，然后恒体积透析，最终得到凝血因子IX、Ⅱ、Ⅶ的浓缩液，最后冷冻干燥的成品。
表1工艺过程中凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ比活检测结果
实施例2
1、凝血酶原复合物的制备
S101血浆离心去除冷沉淀提前预冷离心机，将血浆融化后在0℃环境下离心，分离去除冷沉淀，收集分离后血浆升温至4.0℃，用10μm滤芯过滤至吸附罐。
S102血浆吸附及凝胶洗涤吸附凝胶介质为DEAE-Sephadex-A50，凝胶平衡液为含有50mM氯化钠的15mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值6.0。将1倍凝胶体积量的吸附平衡液泵入吸附罐中，搅拌混匀，抽滤废弃，重复至抽滤液pH值为6.0。将血浆与凝胶按一定比例混合后，保持8.0℃，搅拌吸附20min，抽滤血浆收集凝胶。
S103凝胶平衡、洗涤、洗脱凝胶洗涤液为含有50mM氯化钠、15mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值6.0；凝胶洗脱液为含有600mM氯化钠的10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值8.0。用凝胶平衡液洗涤凝胶，抽滤废弃洗涤后上清；用凝胶洗涤液洗涤凝胶，抽滤废弃洗涤后上清；用凝胶洗脱液洗涤凝胶，抽滤收集洗脱液，并过滤至超滤罐。
S104凝胶再生。凝胶再生缓冲液为2000mM氯化钠。用1倍凝胶体积量的再生缓冲液对凝胶进行再生。
S105超滤。透析液为20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值8.0。将凝胶洗脱液按11±1L/吨血浆的比例，用10KD的膜包进行超滤浓缩，用3倍体积的透析液对制品进行等体积超滤浓缩透析，得到凝血酶原复合物。
2、从凝血酶原复合物中通过阴离子交换层析分离凝血因子Ⅶ和Ⅸ
S201步骤1中得到的凝血酶原复合物使用纯化水或枸橼酸钠缓冲液(pH7.0)稀释，使稀释后的溶液电导率为10ms/cm，加入0.01mol/L盐酸溶液调节溶液pH值为6.0。
S202层析柱平衡层析柱装填介质为Toyopearl DEAE 650M)，层析平衡液为20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值8.0。将层析平衡液泵入到层析柱中，检测层析柱流出液，当流出液pH值与层析平衡液pH相同时，层析柱平衡结束。
S203层析柱上样将配制好的凝血酶原复合物溶液，泵入到步骤②平衡好的层析柱中，通过紫外检测器于280nm波长下，监测层析柱流出液，当OD280吸收值大于50mAu时开始收集上样流穿液(主要为凝血因子Ⅶ)，至上样结束。
S204层析柱冲洗。上样结束后使用层析平衡液泵入层析柱中，以冲洗层析柱中残留的样品，期间继续监控OD280吸收值，并收集OD280吸收值大于50mAu部分的冲洗流穿液(主要为凝血因子Ⅶ)。直至OD280吸收值趋近基线。
S205层析柱洗脱。层析洗脱液为含有200mM氯化钠的10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值8.0。层析柱冲洗完毕后，在层析柱中泵入层析洗脱液对层析柱进行洗脱，通过紫外检测器于280nm波长下，监测层析柱流出液，当OD280吸收值大于20mAu时开始收集洗脱液(主要为凝血因子Ⅱ和Ⅸ)，至OD280吸收值趋近基线时，洗脱结束。
S206层析柱再生再生缓冲液为1000mM氯化钠。层析柱洗脱完毕后，在层析柱中泵入3倍层析柱体积的再生缓冲液，对层析柱进行再生。
3、从步骤2的阴离子交换层析洗脱液中分离提取凝血因子Ⅱ和Ⅸ
S301层析柱平衡层析柱装填介质为Heparin Bestarose FF(博格隆(上海)生物技术有限公司商业化产品)，层析平衡液为20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值6.0。将平衡液泵入到层析柱中，检测层析柱流出液，当流出液pH值与层析平衡液pH相同时，层析柱平衡结束。
S302层析柱上样将步骤2的阴离子交换层析洗脱液泵入到S301平衡好的层析柱中，通过紫外检测器于280nm波长下，监测层析柱流出液，当OD280吸收值大于50mAu时开始收集上样流穿液(主要为凝血因子Ⅱ)，至上样结束。
S303层析柱冲洗上样结束后使用层析平衡液泵入层析柱中，以冲洗层析柱中残留的样品，期间继续监控OD280吸收值，并收集OD280吸收值大于50mAu部分的冲洗流穿液(主要为凝血因子Ⅱ)，直至OD280吸收值趋近基线。
S304层析柱洗涤层析洗涤液为20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值6.0。层析柱冲洗完毕后，在层析柱中泵入层析洗涤液对层析柱进行洗涤，通过紫外检测器于280nm波长下，监测层析柱流出液，当OD280吸收值大于20mAu时开始收集洗涤液，至OD280吸收值趋近基线时，洗涤结束。
S305层析柱洗脱层析洗脱液为含有200mM氯化钠的10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值8.0。层析柱冲洗完毕后，在层析柱中泵入层析洗脱液对层析柱进行洗脱，通过紫外检测器于280nm波长下，监测层析柱流出液，当OD280吸收值大于20mAu时开始收集洗脱液(主要为Ⅸ)，至OD280吸收值趋近基线时，洗脱结束。
S306层析柱再生层析柱洗脱完毕后，在层析柱中泵入2倍层析柱体积的再生缓冲液(1000mM氯化钠)，对层析柱进行再生。
上述凝血因子Ⅶ、Ⅸ及Ⅱ的收集液分别用10k分子量的超滤膜进行浓缩，然后恒体积透析，最终得到凝血因子IX、Ⅱ、Ⅶ的浓缩液，最后冷冻干燥的成品。
实施例3
1、凝血酶原复合物的制备
S101血浆离心去除冷沉淀提前预冷离心机，将血浆融化后在8℃环境下离心，分离去除冷沉淀，收集分离后用0.2μm滤芯过滤至吸附罐。
S102血浆吸附及凝胶洗涤吸附凝胶介质为DEAE-Sephadex-A50，凝胶平衡液为含有100mM氯化钠的5mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值8.0。将1.5倍凝胶体积量的吸附平衡液泵入吸附罐中，搅拌混匀，抽滤废弃，重复至抽滤液pH值为8.0。将血浆与凝胶按一定比例混合后，搅拌吸附60min，抽滤血浆收集凝胶。
S103凝胶平衡、洗涤、洗脱凝胶洗涤液为含有100mM氯化钠、5mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值8.0；凝胶洗脱液为含400mM氯化钠的12mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值6.0。分别用凝胶平衡液、洗脱液洗涤凝胶，抽滤收集洗脱液，并过滤至超滤罐。
S104超滤透析液为20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值6.0。将凝胶洗脱液按12L/吨血浆的比例，用10KD的膜包进行超滤浓缩，用3倍体积的透析液对制品进行等体积超滤浓缩透析，得到凝血酶原复合物。
2、从凝血酶原复合物中通过阴离子交换层析分离凝血因子Ⅶ和Ⅸ
S201步骤1中得到的凝血酶原复合物使用纯化水或枸橼酸钠缓冲液稀释，使稀释后的溶液电导率为20ms/cm，加入0.01mol/L盐酸溶液调节溶液pH值为7.5。
S202层析柱平衡层析柱装填介质为Toyopearl DEAE 650M，将层析平衡液泵入到层析柱中，检测层析柱流出液，当流出液pH值与层析平衡液pH相同时，层析柱平衡结束。
S203层析柱上样将配制好的凝血酶原复合物溶液，泵入到S202平衡好的层析柱中，通过紫外检测器于280nm波长下，监测层析柱流出液，当OD280吸收值大于50mAu时开始收集上样流穿液(主要为凝血因子Ⅶ)，至上样结束。
S204层析柱冲洗上样结束后使用层析平衡液泵入层析柱中，监测OD280吸收值，并收集OD280吸收值大于50mAu部分的冲洗流穿液(主要为凝血因子Ⅶ)。
S205层析柱洗脱层析洗脱液为含有100mM氯化钠的20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值6.0。层析柱冲洗完毕后，在层析柱中泵入层析洗脱液对层析柱进行洗脱，通过紫外检测器于280nm波长下，监测层析柱流出液，当OD280吸收值大于20mAu时开始收集洗脱液(主要为凝血因子Ⅱ和Ⅸ)，至OD280吸收值趋近基线时，洗脱结束。
3、从步骤2的阴离子交换层析洗脱液中分离提取凝血因子Ⅱ和Ⅸ
S301层析柱平衡层析柱装填介质为Heparin Bestarose FF，将平衡液泵入到层析柱中，检测层析柱流出液，当流出液pH值与层析平衡液pH相同时，层析柱平衡结束。
S302层析柱上样将步骤2的阴离子交换层析洗脱液泵入到S301平衡好的层析柱中，通过紫外检测器于280nm波长下，监测层析柱流出液，当OD280吸收值大于50mAu时开始收集上样流穿液(主要为凝血因子Ⅱ)，至上样结束。
S303层析柱冲洗上样结束后使用层析平衡液泵入层析柱中，以冲洗层析柱中残留的样品，收集OD280吸收值大于50mAu部分的冲洗流穿液(主要为凝血因子Ⅱ)。
S304层析柱洗涤层析洗涤液为含有100mM氯化钠的10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值8.0。层析柱冲洗完毕后，在层析柱中泵入层析洗涤液对层析柱进行洗涤，通过紫外检测器于280nm波长下，监测层析柱流出液，当OD280吸收值大于20mAu时开始收集洗涤液，至OD280吸收值趋近基线时，洗涤结束。
S305层析柱洗脱层析洗脱液为含有100mM氯化钠的20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值8.0。层析柱冲洗完毕后，在层析柱中泵入层析洗脱液对层析柱进行洗脱，通过紫外检测器于280nm波长下，监测层析柱流出液，当OD280吸收值大于20mAu时开始收集洗脱液(主要为Ⅸ)，至OD280吸收值趋近基线时，洗脱结束。
上述凝血因子Ⅶ、Ⅸ及Ⅱ的收集液分别用10k分子量的超滤膜进行浓缩，然后恒体积透析，最终得到凝血因子IX、Ⅱ、Ⅶ的浓缩液，最后冷冻干燥的成品。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种从人血浆中同时分离纯化凝血因子Ⅱ、Ⅶ和IX的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备凝血酶原复合物；包括：
1.1离心去除冷沉淀：将血浆融化后在0～4.0℃下离心，收集清液并升温至6.0±2.0℃，用0.2-10μm滤芯过滤后备用；
1.2凝胶吸附、洗涤及洗脱：将过滤后清液与经平衡液处理的凝胶按0.5-1.5g(凝胶)/L(清液)混合后，保持6.0±2.0℃，搅拌吸附20-60min后收集凝胶；用1-3倍凝胶体积量的平衡液洗涤凝胶2-6次，搅拌混匀，洗涤液废弃；用1-3倍凝胶体积量的洗脱液洗脱凝胶2-6次，搅拌混匀，抽滤收集洗脱液；
1.3超滤浓缩：用截留分子量为10k的超滤膜浓缩，并用3-5倍体积的透析液进行恒体积超滤透析，得到符合条件的凝血酶原复合物；所述的凝血酶原复合物满足下述条件：电导率为10-20ms/cm，蛋白浓度为15-50g/L，pH值为6.0-7.5；
(2)通过阴离子交换树脂柱Toyopearl DEAE 650M分离凝血因子Ⅶ和含Ⅸ、Ⅱ的混合液；包括：
2.1稀释、上柱：将凝血酶原复合物稀释至溶液电导率介于6～10ms/cm，泵入到平衡好的层析柱中，根据流出液的OD280值收集上样流穿液，至上样结束；根据上样流穿液的OD280分段收集，当AbsOD280吸收值＞50mAu，收集作为凝血因子Ⅶ的收集液；
2.2层析柱冲洗及洗脱：用1-3倍体积的平衡液冲洗层析柱，之后用1-3倍体积的洗脱液洗脱，根据流出液的OD280值分段收集；当50mAu＞AbsOD280＞20mAu，收集作为含Ⅸ、Ⅱ的混合液；
(3)步骤(2)分离的含Ⅸ、Ⅱ的混合液经亲和层析柱Heparin Sepharose FF分离出凝血因子Ⅱ和Ⅸ；
将含Ⅸ、Ⅱ的混合液泵入到平衡好的层析柱中，根据流出液的OD280值收集上样流穿液，至上样结束；当AbsOD280吸收值＞50mAu，收集作为凝血因子Ⅱ的收集液；用1-3倍体积的平衡液冲洗层析柱，之后用1-3倍体积的洗脱液洗脱，根据流出液的OD280值分段收集；当50mAu＞AbsOD280＞20mAu，收集作为凝血因子Ⅸ的收集液。
2.根据权利要求1所述的一种从人血浆中同时分离纯化凝血因子Ⅱ、Ⅶ和IX的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的平衡液为含有50～100mM氯化钠的5～15mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值6.0～8.0；所述洗脱液为含有400～600mM氯化钠的10～15mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值6.0～8.0。
3.根据权利要求1所述的一种从人血浆中同时分离纯化凝血因子Ⅱ、Ⅶ和IX的方法，其特征在于：步骤(2)、(3)中所述的平衡液为10～20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值6.0～8.0；所述洗脱液为含有100～200mM氯化钠的10～20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，pH值6.0～8.0。
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