CN113584006A - 一种冻干人凝血酶原复合物及其制备方法 - Google Patents

一种冻干人凝血酶原复合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种冻干人凝血酶原复合物及其制备方法。本发明制备方法包括以下步骤：将新鲜冰冻的健康人血浆依次经离心，第一次凝胶吸附，洗涤，洗脱，超滤、透析，S/D灭活，第二次凝胶吸附，第二次洗涤，第二次洗脱，第二次超滤、透析后，然后分装、冻干，即得到冻干人凝血酶原复合物。本发明使用成本较为低廉的DEAESephadex A‑50凝胶进行纯化；通过两次纯化步骤的工艺，分别达到控制FⅦ因子含量和有效提升FⅨ的比活性，调整四种因子比例的效果。

Description

一种冻干人凝血酶原复合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种冻干人凝血酶原复合物及其制备方法，属于医药生物技术领域。
背景技术
人凝血酶原复合物含有维生素K依赖在肝脏合成的四种凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ。维生素K缺乏或者严重的肝脏疾病均可导致这四种因子缺乏，进而导致凝血障碍。输入人凝血酶原复合物可以提高血液中凝血因子的浓度。因此，主要用于治疗先天性和获得性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ缺乏症。另外，在治疗因长期输注FⅧ的甲型血友病患者产生FⅧ抑制剂而引起出血的症状也得到肯定。在国外，人凝血酶原复合物还广泛用于治疗因过量服用维生素K拮抗剂作为抗凝药物引起的出血症状。近年来，随着临床医生的认同，人凝血酶原复合物的需求量越来越大。
人凝血酶原复合物自问世以来，不断有血栓、心肌梗塞、弥漫性血管凝血等并发症的报道。目前人凝血酶原复合物致栓的机理尚不明确，有文献报道：人凝血酶原复合物的致栓性与活化的凝血因子、高比例的FⅡ、FⅩ、抗凝蛋白水平等因素相关。另有文献报道：高端人凝血酶原复合物中FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ四种因子的比例接近1:1:1:1，且含有一定水平的抗凝蛋白，其致栓风险较低。
现有的人凝血酶原复合物生产包括两步阴离子交换层析吸附纯化工序，第一次纯化包括以下工序：新鲜低温冰冻的健康人血浆→冷沉淀离心→DEAE Sephadex A50凝胶吸附→洗涤、洗脱→超滤→人凝血酶原复合物粗品。以此生产的人凝血酶原复合物粗品存在两个问题：FⅦ效价与FⅨ比活无法同时达到较高的水平；FⅡ、FⅩ两种因子含量较高，约为FⅨ的130％～160％。
第二次纯化包括以下工序：人凝血酶原复合物粗品→S/D灭活→阴离子交换凝胶吸附→洗涤、洗脱→超滤→分装、冻干→干热灭活。大多数文献对第二次纯化部分都没有进行系统的研究以及各工艺之间的对比。
中国专利CN201710114703.7公开了一种人凝血酶原复合物生产工艺，该工艺对离子强度进行调整，得到了FⅦ因子收率较高的人凝血酶原复合物。但该工艺FⅡ、FⅩ因子含量偏高，四种因子比例并不均衡。
中国专利CN201710118663.7公开了一种人凝血酶原复合物制备方法，使用DEAEA-50凝胶从血浆中直接吸附出人凝血酶原复合物，将吸附后的A-50凝胶装填在固定床层析柱内，使用蠕动泵泵入溶液进行在线洗涤和洗脱，洗脱液经S/D灭活进行固定床二次层析纯化，使生产过程中凝胶的损耗降低20％以上，但其得到的凝血因子比活较低。
中国专利CN201810055362.9一次层析纯化使用DEAE Sephadex A-50凝胶进行层析纯化，二次层析使用Capto DEAE凝胶进行层析纯化，所得人凝血酶原复合物FⅡ、FⅨ、FⅩ因子比活较高，但FⅦ因子比活较低。且使用Capto DEAE凝胶进行层析纯化成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种冻干人凝血酶原复合物及其制备方法。
本发明使用成本较为低廉的DEAE Sephadex A-50凝胶进行纯化；两次纯化步骤的工艺，分别达到控制FⅦ因子含量和有效提升FⅨ的比活性，调整四种因子比例的效果。
本发明提供的一种冻干人凝血酶原复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)离心：新鲜冰冻的健康人血浆经融浆，混浆后，于0～4℃进行冷沉淀离心，取上清液；
(2)第一次凝胶吸附：采用平衡液Ⅰ平衡1.5～2.5g/L DEAE Sephadex A-50凝胶的pH，然后与所述上清液混合，经吸附后过滤，取第一次吸附后的凝胶；
所述平衡液Ⅰ为0.01～0.02mol/L枸橼酸钠+0.05～0.15mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；
(3)洗涤：将所述第一次吸附后的凝胶依次采用平衡液Ⅰ、洗涤液洗涤；
所述平衡液Ⅱ为0.01～0.02mol/L枸橼酸钠+0.05～0.15mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；所述洗涤液为0.01～0.02mol/L枸橼酸钠+0.12～0.25mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；
(4)洗脱：将经步骤(3)洗涤后的所述吸附后的凝胶采用洗脱液洗脱，收集滤液；
所述洗脱液为0.01～0.02mol/L枸橼酸钠+0.5～2.0mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；
(5)超滤、透析：将所述滤液进行超滤并透析，得到浓缩后制品；
(6)S/D灭活：将所述浓缩后制品使用稀释液Ⅰ调整浓度，然后加入S/D溶液灭活，再用稀释液Ⅱ调整电导率，得到S/D灭活的溶液；
所述稀释液Ⅰ为0.01～0.02mol/L枸橼酸钠+0.12～0.15mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；所述稀释液Ⅱ为0.01～0.02mol/L枸橼酸钠+0～0.05mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；
(7)第二次凝胶吸附：将所述S/D灭活的溶液与所述平衡液Ⅱ平衡后的0.3～0.9g/LDEAE Sephadex A-50凝胶混合，吸附后过滤，得到第二次吸附后的凝胶；
所述平衡液Ⅱ为0.01～0.02mol/L枸橼酸钠+0.05～0.15mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1，电导率为6～17ms/cm；
(8)第二次洗涤：将第二次吸附后的凝胶采用所述平衡液Ⅱ洗涤；
(9)第二次洗脱：将经步骤(8)洗涤后的凝胶采用所述洗脱液进行洗脱，收集洗脱液；
(10)第二次超滤、透析：将所述洗脱液进行超滤、透析，得到人凝血酶原复合物原液；
(11)分装、冻干：所述人凝血酶原复合物原液经除菌过滤分装，然后冻干后，即得到冻干人凝血酶原复合物。
本发明中，步骤(2)中，所述平衡液Ⅰ具体可为0.01mol/L枸橼酸钠+0.1mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；
步骤(3)中，所述平衡液Ⅱ具体可为0.01mol/L枸橼酸钠+0.09mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；所述洗涤液具体可为0.01mol/L枸橼酸钠+0.16mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；
步骤(4)中，所述洗脱液为0.01mol/L枸橼酸钠+1.0mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1。收集滤液；
步骤(6)中，所述稀释液Ⅰ具体可为0.01mol/L枸橼酸钠+0.14mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；所述稀释液Ⅱ为0.01mol/L枸橼酸钠+0mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；
步骤(7)中，所述平衡液Ⅱ具体可为0.01mol/L枸橼酸钠+0.09mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1，电导率为12ms/cm；
步骤(8)中，所述平衡液Ⅱ具体可为0.01mol/L枸橼酸钠+0.14mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；
步骤(9)中，所述洗脱液为0.01mol/L枸橼酸钠+1.0mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1。
上述的制备方法中，步骤(2)中，所述凝胶的质量与所述上清液的体积比可为1.5～2.5g/L；
所述平衡至pH值可为7.0±0.2；
所述上清液在混合之前经离心，并调整其pH值可为7.0±0.2；
所述吸附的条件如下：5±3℃搅拌吸附50±10分钟，具体可为5±3℃搅拌吸附50分钟。
上述的制备方法中，步骤(3)中，所述平衡液Ⅱ与所述第一次吸附后的凝胶的体积比可为1～2:1，具体可为1:1；
所述平衡液Ⅱ洗涤的次数可为3～6次，具体可为5次、3～5次、5～6次；
所述洗涤液洗涤的次数可为4～8次，具体可为6次、4～6次、6～8次。
上述的制备方法中，步骤(4)中，所述洗脱液与所述的凝胶的体积比可为1～2:1，具体可为1:1；
所述洗脱液洗脱的次数可为2～5次；
步骤(5)中，所述浓缩后制品中蛋白浓度可为60±20g/L，具体可为60g/L。
上述的制备方法中，步骤(6)中，所述稀释液Ⅰ调整浓度至所述浓缩后制品中蛋白浓度可为10～30g/L，具体可为20g/L、10～20g/L、20～30g/L或15～25g/L；
加入所述S/D溶液使混合液中吐温为11±0.1g/L、磷酸三丁酯为3±0.1g/L；
所述灭活的条件如下：温度25±1℃搅拌至少6小时，具体可为6～8小时；
所述稀释液Ⅱ调整电导率至6～14ms/cm，优选8～10ms/cm，更优选可为10ms/cm。
上述的制备方法中，步骤(7)中，所述吸附的条件如下：5±3℃搅拌吸附50±10分钟。
上述的制备方法中，步骤(8)中，所述第二次吸附后的凝胶与所述平衡液Ⅱ的体积比为1：1～2；
所述第二次洗涤的次数可为5～9次。
上述的制备方法中，步骤(9)中，所述的凝胶与所述洗脱液的体积比可为1：1；
步骤(10)中，所述人凝血酶原复合物原液中蛋白浓度可为40±20g/L，具体可为40g/L；
所述人凝血酶原复合物原液中包括如下浓度的组分：肝素钠0.2±0.1IU/IX，甘氨酸200±20mmol/L；具体可为肝素钠0.2IU/IX，甘氨酸200mmol/L。
上述的制备方法中，步骤(11)中，所述冻干的过程为将分装的滤液加半塞入冻干机内，经过预冻、抽真空、升华干燥、解析干燥压塞出柜轧盖；
所述的方法中，在步骤(11)之后还包括将轧盖后的所述冻干人凝血酶原复合物进行干热灭活后，进行真空检测的步骤。
本发明还提供了上述的制备方法制备得到的冻干人凝血酶原复合物。
本发明中，所述冻干人凝血酶原复合物中FⅡ:FⅦ:FⅨ:FⅩ的比可为1～1.4:0.5～1.2:1:1.2～1.4，优选比例可为1.2:1:1:1.1。
本发明具有以下优点：
1、本发明采用常用的DEAE Sephadex A-50凝胶作为吸附试剂，成本较低。
2、本发明仅通过简单的吸附(两次层析纯化)、洗涤条件调整，对人凝血酶原复合物中的FⅡ、FⅨ、FⅩ因子进行调整优化，使其比例更加均衡，降低产品致栓风险，提升产品质量。如，使FⅡ含量约为FⅨ含量的100％～120％，FⅦ含量约为FⅨ含量的80％～110％，FⅩ含量约为FⅨ含量的100％～120％。
3、本发明在调整FⅡ:FⅦ:FⅨ:FⅩ四种因子更加均衡的基础上，同时保证产品中FⅨ比活性约为0.8IU/mg蛋白，符合国家药典标准。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、
(1)离心：新鲜冰冻的健康人血浆经融浆，混浆后，于0～4℃进行冷沉淀离心，取所得上清液15L。使用0.01mol/L醋酸溶液调节pH值至7.0±0.2。
(2)第一次凝胶吸附：使用平衡液Ⅰ将37.5g DEAE Sephadex A-50凝胶平衡至pH＝7.0±0.2，与上清液混合，5±3℃搅拌吸附50分钟后过滤。平衡液Ⅰ为0.01mol/L枸橼酸钠+0.1mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1。
(3)洗涤：使用670ml平衡液Ⅱ洗涤凝胶5次(平衡液Ⅱ与第一次吸附后的凝胶的体积比可为1:1，37.5g DEAE Sephadex A-50凝胶经溶胀后体积约为670ml)。使用670ml洗涤液洗涤凝胶6次；平衡液Ⅱ为0.01mol/L枸橼酸钠+0.09mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；洗涤液为0.01mol/L枸橼酸钠+0.16mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1。
(4)洗脱：使用670ml洗脱液洗脱3次(洗脱液与凝胶的体积比为1:1，凝胶经溶胀后体积约为670ml)，洗脱液为0.01mol/L枸橼酸钠+1.0mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1。收集滤液。
(5)超滤、透析：将滤液进行超滤并透析，控制最终蛋白浓度为60g/L。
(6)S/D灭活：使用稀释液Ⅰ调整超滤后溶液蛋白浓度为20g/L，加入S/D溶液使最终浓度为吐温11g/L、磷酸三丁酯3g/L，控制温度25±1℃搅拌6小时以上。降温，使用稀释液Ⅱ调整电导率至6～14ms/cm(具体为10ms/cm)。稀释液Ⅰ为0.01mol/L枸橼酸钠+0.14mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；稀释液Ⅱ为0.01mol/L枸橼酸钠+0mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1。
(7)第二次凝胶吸附：将S/D灭活后所得溶液与使用平衡液Ⅱ平衡好的9g DEAESephadex A-50凝胶混合，5±3℃搅拌吸附50分钟后过滤，平衡液Ⅱ具体为0.01mol/L枸橼酸钠+0.09mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1，电导率为12ms/cm。
(8)第二次洗涤：使用375ml洗涤液(采用平衡液Ⅱ)洗涤凝胶6次，平衡液Ⅱ具体为0.01mol/L枸橼酸钠+0.14mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1。
(9)第二次洗脱：188ml洗脱液进行洗脱3次(凝胶与洗脱液的体积比具体可为1:1)，收集滤液。洗脱液为0.01mol/L枸橼酸钠+1.0mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1。
(10)第二次超滤、透析：将步骤(8)中洗脱液进行超滤透析，控制最终蛋白浓度为40g/L。
(11)配制：最终制品含肝素钠0.2IU/IX，甘氨酸200mmol/L。
(12)分装、冻干：原液经除菌过滤分装，加半塞入冻干机内，经过预冻、抽真空、升华干燥、解析干燥压塞出柜轧盖。
(13)干热灭活：将轧盖后的制品在100±5℃恒温30分钟，降温，进行真空检测。
实施例2～5、
实施例2～5与本发明实施例1中方法步骤及条件相同，不同点为进行第一次吸附的吸附条件，具体如表1所示。
表1实施例1～5的第一次凝胶吸附的吸附条件
凝胶加量(g/L血浆上清液) 上清液pH
实施例1 2.5 7.0
实施例2 1.5 6.4
实施例3 2 7.4
实施例4 2.5 6.4
实施例5 1.5 7.4
实施例6～10、
实施例6～10与本发明实施例1中方法步骤及条件相同，不同点为洗涤条件，具体如表2所示。
表2、实施例6～10的洗涤条件
枸橼酸钠(mol/L) 氯化钠(mol/L)
实施例6 0.01 0.12
实施例7 0.01 0.15
实施例8 0.01 0.16
实施例9 0.01 0.18
实施例10 0.01 0.20
实施例11～16、
实施例11～16与本发明实施例1中方法步骤及条件相同，不同点为第二次凝胶吸附的吸附条件如表3所示。
表3实施例11～21的第二次凝胶吸附的吸附条件
Figure BDA0003221357520000061
Figure BDA0003221357520000071
实验结果：
实施例1～5对第一次吸附的凝胶加量、上清液电导率进行了实验，实验结果如表4、表5所示。
表4第一次凝胶吸附FⅦ吸附收率
FⅦ吸附收率
实施例1 83.70％
实施例2 40.90％
实施例3 62.02％
实施例4 73.08％
实施例5 43.99％
表5第一次凝胶吸附的不同条件下最终制品的质量指标
FⅡ:FⅦ:FⅨ:FⅩ FⅨ比活性
实施例1 1.2:1:1:1.1 0.82
实施例2 1.2:0.4:1:1.2 0.8
实施例3 1.2:0.7:1:1.2 0.78
实施例4 1.2:0.8:1:1.2 0.81
实施例5 1.2:0.5:1:1.2 0.79
上述实施例6～10对洗涤液盐浓度进行了实验，结果见表6。
表6不同盐浓度的洗涤液对制品指标的影响
FⅡ:FⅦ:FⅨ:FⅩ FⅨ比活性
实施例6 1.2:1.2:1:1.2 0.76
实施例7 1.2:1:1:1.2 0.8
实施例8 1.2:0.9:1:1.2 0.82
实施例9 1.2:0.7:1:1.2 0.96
实施例10 1.2:0.5:1:1.2 1.08
上述实施例11～16对第二次吸附的条件进行了实验，结果见表7。
表7第二次吸附条件对制品指标的影响
FⅡ:FⅦ:FⅨ:FⅩ FⅨ比活性 FⅨ收率
实施例11 1.3:0.7:1:1.3 1.33 36万IU
实施例12 1.4:0.8:1:1.3 0.72 57万IU
实施例13 1:0.7:1:1.4 1.38 33万IU
实施例14 1:0.7:1:1.2 1.38 32万IU
实施例15 1:0.8:1:1.3 0.7 58万IU
实施例16 1.2:0.9:1:1.2 0.88 56万IU
实施例17 1.2:0.9:1:1.1 0.86 55万IU
实施例18 1.3:0.7:1:1.3 1.28 36万IU
实施例19 1.2:0.9:1:1.3 0.83 55万IU
实施例20 1.4:0.7:1:1.3 0.7 58万IU
实施例21 1.4:0.7:1:1.4 0.69 60万IU
表6-7中可知，所得人凝血酶原复合物的四种因子比例范围为1～1.4:0.5～1.2:1:1.2～1.4，本发明实施例1中为制得的最优的人凝血酶原复合物中四种因子的比例为1.2:1:1:1.1。通过上述大量的实验发现，当第二次凝胶吸附的平衡液比S/D后制品的电导率略高的时候，同时与适当的凝胶加量所形成的交互作用，可以达到选择性吸附FⅦ、FⅩ，当第二次凝胶吸附的洗涤液盐浓度达到0.13mol/L以上时，可以达到洗涤FⅡ因子的效果。两步相结合，可以达到调整人凝血酶原复合物四种因子比例的目的。
通过以上分析，本发明制备的人凝血酶原复合物具有以下技术优点：
采用常用的DEAE Sephadex A-50凝胶，成本较低。
使用主流的吸附工艺，仅通过简单的吸附、洗涤条件调整，对人凝血酶原复合物中的FⅡ、FⅨ、FⅩ因子进行调整，使其比例更加均衡。
上述结果可知，本发明在调整FⅡ:FⅦ:FⅨ:FⅩ四种因子更加均衡的基础上，同时能保证FⅨ比活性符合国家药典标准。

Claims (10)

1.一种冻干人凝血酶原复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)离心：新鲜冰冻的健康人血浆经融浆，混浆后，于0～4℃进行冷沉淀离心，取上清液；
(2)第一次凝胶吸附：采用平衡液Ⅰ平衡1.5～2.5g/L DEAE Sephadex A-50凝胶的pH，然后与所述上清液混合，经吸附后过滤，取第一次吸附后的凝胶；
所述平衡液Ⅰ为0.01～0.02mol/L枸橼酸钠+0.05～0.15mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；
(3)洗涤：将所述第一次吸附后的凝胶依次采用平衡液Ⅱ、洗涤液洗涤；
所述平衡液Ⅱ为0.01～0.02mol/L枸橼酸钠+0.05～0.15mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；所述洗涤液为0.01～0.02mol/L枸橼酸钠+0.12～0.25mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；
(4)洗脱：将经步骤(3)洗涤后的所述吸附后的凝胶采用洗脱液洗脱，收集滤液；
所述洗脱液为0.01～0.02mol/L枸橼酸钠+0.5～2.0mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；
(5)超滤、透析：将所述滤液进行超滤并透析，得到浓缩后制品；
(6)S/D灭活：将所述浓缩后制品使用稀释液Ⅰ调整浓度，然后加入S/D溶液灭活，再用稀释液Ⅱ调整电导率，得到S/D灭活的溶液；
所述稀释液Ⅰ为0.01～0.02mol/L枸橼酸钠+0.12～0.15mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；所述稀释液Ⅱ为0.01～0.02mol/L枸橼酸钠+0～0.05mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1；
(7)第二次凝胶吸附：将所述S/D灭活的溶液与所述平衡液Ⅱ平衡后的0.3～0.9g/LDEAE Sephadex A-50凝胶混合，吸附后过滤，得到第二次吸附后的凝胶；
所述平衡液Ⅱ为0.01～0.02mol/L枸橼酸钠+0.05～0.15mol/L氯化钠，pH＝7.0±0.1，电导率为6～17ms/cm；
(8)第二次洗涤：将第二次吸附后的凝胶采用所述平衡液Ⅱ洗涤；
(9)第二次洗脱：将经步骤(8)洗涤后的凝胶采用所述洗脱液进行洗脱，收集洗脱液；
(10)第二次超滤、透析：将所述洗脱液进行超滤、透析，得到人凝血酶原复合物原液；
(11)分装、冻干：所述人凝血酶原复合物原液经除菌过滤分装，然后冻干后，即得到冻干人凝血酶原复合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述凝胶的质量与所述上清液的体积比为1.5～2.5g/L；
所述平衡至pH值为7.0±0.2；
所述上清液在混合之前经离心，并调整其pH值为7.0±0.2；
所述吸附的条件如下：5±3℃搅拌吸附50±10分钟。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述平衡液Ⅱ与所述第一次吸附后的凝胶的体积比为1～2:1；
所述平衡液Ⅱ洗涤的次数为3～6次；
所述洗涤液洗涤的次数为4～8次。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述洗脱液与所述的凝胶的体积比为1～2:1；
所述洗脱液洗脱的次数为2～5次；
步骤(5)中，所述浓缩后制品中蛋白浓度为60±20g/L。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(6)中，所述稀释液Ⅰ调整浓度至所述浓缩后制品中蛋白浓度为10～30g/L；
加入所述S/D溶液使混合液中吐温为11±0.1g/L、磷酸三丁酯为3±0.1g/L；
所述灭活的条件如下：温度25±1℃搅拌至少6小时；
所述稀释液Ⅱ调整电导率至6～14ms/cm。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(7)中，所述吸附的条件如下：5±3℃搅拌吸附50±10分钟。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(8)中，所述第二次吸附后的凝胶与所述平衡液Ⅱ的体积比为1：1～2；
所述第二次洗涤的次数为5～9次。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(9)中，所述的凝胶与所述洗脱液的体积比为1：1；
步骤(10)中，所述人凝血酶原复合物原液中蛋白浓度为40±20g/L；
所述人凝血酶原复合物原液中含如下浓度的组分：肝素钠0.2±0.1IU/IX，甘氨酸200±20mmol/L。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(11)中，所述冻干的过程为将分装的滤液加半塞入冻干机内，经过预冻、抽真空、升华干燥、解析干燥压塞出柜轧盖；
所述的方法中，在步骤(11)之后还包括将轧盖后的所述冻干人凝血酶原复合物进行干热灭活后，进行真空检测的步骤。
10.权利要求1-9中任一项所述的制备方法制备得到的冻干人凝血酶原复合物。
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