CN109705208B - 一种单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药的技术领域，涉及一种单步层析从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中制备高纯度血管性血友病因子的工艺,具体为一种单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺。工艺步骤包括：冷沉淀溶解、调节pH并分离制备酸沉淀、酸沉淀上清液经阴离子交换层析制备凝血因子Ⅷ，收集流穿和洗涤部分，并向提取凝血因子Ⅷ之后的废料其中加入制备的低电负性明胶，混匀；经阴离子交换凝胶Fractogel^®EMD TMAE层析，采用不同盐浓度缓冲液分别进行洗涤和洗脱，去除杂蛋白并收获高纯度的VWF产品。从凝血因子Ⅷ生产工艺的废料开始，仅使用单步阴离子交换层析就完成了VWF产品的纯化，特别是能够有效去除产品中与VWF很难分离的纤维结合蛋白成分。

Description

一种单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺

技术领域

本发明属于生物制药的技术领域，涉及一种单步层析从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中制备高纯度血管性血友病因子的工艺,具体为一种单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺。

背景技术

血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）是一种具有多聚体的血浆糖蛋白，其分子量从250kDa到2000万kDa不等，形成血浆中己知的最大分子量可溶性蛋白。大小不等的多聚体，对维持VWF正常生物活性具有重要意义。血浆VWF在原发性止血中起着重要作用。

血管性血友病（VWD）是常见的遗传性出血性疾病之一。据国外报道，每10万人口，VWD发病率约为2.3~11，仅次于甲型血友病。从血浆中纯化制备的VWF制品，主要用于治疗先天性、获得性血管性血友病(VWD)。

血浆冷沉淀中富含纤维蛋白原、纤维结合蛋白、凝血因子Ⅷ、VWF等成分，因此也曾在临床上用于治疗甲型血友病、vWD等疾病。目前已经开发了从冷沉淀中纯化纤维蛋白原、凝血因子Ⅷ的相关技术，并实现了商业化。而凝血因子Ⅷ和VWF通常都是在同一种制剂中，如Wilate^®（Octapharma）中FVIII/VWF约为1:1。法国LFB公司首先实现了凝血因子Ⅷ与VWF的分离纯化，并开发出高纯的VWF制剂Wilfactin^®。中国专利（申请公布号CN 105622746 A）也提供了一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中制备VWF的工艺。

但是，无论是LFB还是中国专利CN 105622746 A提供的方法，都必须使用两步层析才能够从凝血因子Ⅷ的废料中分离纯化VWF。第一步为阴离子交换层析，能够去除制品中的纤维蛋白原和其他杂蛋白，但是由于制品中的纤维结合蛋白与VWF有类似的电负性，阴离子交换层析技术无法去除其中的纤维结合蛋白。第二步层析是昂贵的明胶亲和层析。明胶亲和层析凝胶是将明胶分子（不均一的小分子多肽）与层析凝胶基质（如交联琼脂糖）共价偶联，利用明胶分子与纤维结合蛋白的亲和力，捕获VWF粗制品中的纤维结合蛋白，从而进一步提高VWF产品的纯度。虽然明胶是一种非常廉价的原料，广泛用于食品和制药领域，但是明胶亲和层析凝胶非常昂贵，来源有限。而且，由于明胶分子对酸碱的耐受性较差，导致明胶亲和层析凝胶适用的pH（3~10）非常狭窄。血液制品作为高风险产品（病毒污染），必须在每批生产之后对层析凝胶和层析设备进行清洗消毒，通常使用0.1~0.5mol/L（pH值13以上）以上浓度的NaOH溶液，以防止批间交叉污染。再生使用明胶亲和层析凝胶并不符合相关的生产质量管理规范。除非把昂贵的明胶亲和层析凝胶作为一次性使用的层析填料，显然这会大大提高生产成本。

本公司已获得授权的中国专利（公开号CN102295696A）中提供了一种从冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的工艺方法。该方法公开的用上清液生产凝血因子Ⅷ的工艺过程中，会产生一种废料，即上清液经过阴离子交换层析柱，并经过低盐缓冲液洗涤后，用高盐缓冲液洗脱收获凝血因子Ⅷ的层析过程中，所获得的流穿液和洗涤液，其中富含VWF，而该专利中并未描述这种废料再利用的方法。本发明专利将公开再利用这种废料的工艺技术，解决VWF纯化的工艺难题。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种单步层析从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中制备高纯度血管性血友病因子的工艺，具体为一种单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺。

本发明的技术方案为：

一种单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺，步骤包括：

（1）制备低电负性明胶：明胶溶于磷酸钠缓冲液（PBS）中，制成明胶溶液；阴离子交换凝胶 Fractogel^® EMD TMAE5~10L装填层析柱，并用PBS平衡3~5个柱体积，待用；将上述明胶溶液通过平衡过的层析柱，收集流穿液，并将流穿液浓缩脱水干燥或冻干即为低电负性明胶；

（2）向冷沉淀提取凝血因子Ⅷ之后的废料中，加入过量的低电负性明胶，混匀，经过阴离子交换凝胶Fractogel^® EMD TMAE (Merck)层析处理，采用不同盐浓度的缓冲液分别进行洗涤和洗脱，收集洗脱液，获得高纯度的VWF产品。

进一步优选，步骤（2）中，每升废料中加入低电负性明胶0.5~1g，充分溶解。

进一步优选，步骤（1）制备低电负性明胶：具体操作为，称取明胶500g溶于100升10mmol/L的磷酸钠缓冲液中（PBS），pH 7.0±0.5，制成明胶溶液；阴离子交换凝胶Fractogel® EMD TMAE (Merck) 5~10L装填层析柱，并用10mmol/L的PBS（pH 7.0±0.5）平衡3~5个柱体积，待用；将上述明胶溶液通过平衡过的层析柱，线流速60~180cm/h，收集流穿液，并将流穿液浓缩脱水干燥或冻干即为低电负性明胶。

在制备低电负性明胶步骤中，因为电负性较高的明胶分子被层析柱捕获，从而获得低电负性明胶；凝胶层析柱可以经过常规的再生处理，如高盐洗脱后，可以反复使用，可以一次制备大量的低电负性明胶，用于多批次的VWF生产。

本发明的单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺，具体制备工艺步骤包括：冷沉淀溶解、调节pH并分离制备酸沉淀、酸沉淀上清液经阴离子交换层析制备凝血因子Ⅷ，收集流穿和洗涤部分（即提取凝血因子Ⅷ之后的废料），并向提取凝血因子Ⅷ之后的废料其中加入制备的低电负性明胶，混匀；经阴离子交换凝胶 Fractogel^® EMD TMAE层析，采用不同盐浓度缓冲液分别进行洗涤和洗脱，去除杂蛋白并收获高纯度的VWF产品。

本发明的一种单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺的技术方案，详细如下：

一种单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺，具体步骤为：

（1）冷沉淀用注射用水在15~35℃范围内搅拌溶解，用0.1mol/L的乙酸调节pH值为6.6~7.0，电导率小于4 mS/cm，加入平衡好的Sephadex A50凝胶，搅拌吸附40~60分钟，离心除去凝胶和未溶解的沉淀；

（2）步骤1中离心后的上清液再用0.1mol/L的乙酸调节pH值为6.2~6.5，并降低温度至12~18℃，纤维蛋白原和纤维结合蛋白会形成沉淀，通过离心分离沉淀，而凝血因子Ⅷ和VWF则留在上清液当中；

（3）步骤2中离心后的上清液富含凝血因子Ⅷ和VWF，经过澄清过滤后，加入1%的聚山梨酸酯-80和0.3%的磷酸三丁酯，24℃孵育6小时，可以有效灭活潜在的脂包膜病毒，如HBV；

（4）步骤3中经过病毒灭活的溶液经过弱阴离子交换层析，吸附其中的凝血因子Ⅷ，大部分杂蛋白从层析柱上流穿，吸附后的层析柱经过洗涤除去残留的杂蛋白和聚山梨酸酯-80、磷酸三丁酯，用洗脱液从层析柱上洗下凝血因子Ⅷ；经过浓缩、配制、除菌、分装、冻干、100℃/30min干热病毒灭活，即可得到凝血因子Ⅷ制品，然后收集流穿和洗涤部分，即收集提取凝血因子Ⅷ之后的废料，待用；

（5）制备低电负性明胶：称取明胶500g溶于100升10mmol/L的磷酸钠缓冲液中（PBS），pH 7.0±0.5，制成明胶溶液；阴离子交换凝胶 Fractogel® EMD TMAE (Merck) 5~10L装填层析柱，并用10mmol/L的PBS（pH 7.0±0.5）平衡3~5个柱体积，待用；将上述明胶溶液通过平衡过的层析柱，线流速60~180cm/h，收集流穿液，并将流穿液浓缩脱水干燥或冻干即为低电负性明胶；

（6）将步骤4中收集的流穿和洗涤部分，即收集的提取凝血因子Ⅷ之后的废料，加入步骤5中制备的低电负性明胶，每升料液中加入低电负性明胶0.5~1g，充分溶解；

（7）VWF纯化：步骤5中的层析柱（装填阴离子交换凝胶 Fractogel® EMD TMAE）用平衡液平衡3~5个柱体积；平衡液：磷酸钠10mmol/L、氯化钠180~250mmol/L、氯化钙1mmol/L；使步骤6中混匀的料液经过平衡好的层析柱，用平衡液洗涤层析柱5~10个柱体积，再用洗脱液洗脱层析柱上吸附的VWF，并收集；洗脱液：磷酸钠10mmol/L、氯化钠350~450mmol/L、氯化钙1mmol/L，pH6.8~7.6；上样、洗涤、洗脱的线流速为60~180cm/h；

（8）步骤7中收集到的含有VWF的洗脱液，经过配制、除菌、灌装、冻干、100℃/30min干热病毒灭活，即得到高纯的VWF产品。

本发明的技术方案原理如下：

在冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料（富含VWF）中加入特制的低电负性明胶，通过低电负性明胶分子与料液中纤维结合蛋白分子的结合，改变纤维结合蛋白-明胶复合物的电负性，从而改变其在阴离子交换层析中的吸附能力，使改变后的纤维结合蛋白-明胶复合物与VWF的电负性（在阴离子交换层析中的吸附能力）产生明显差异，从而在利用阴离子交换层析去除纤维蛋白原等其他杂蛋白的同时，还能够有效去除其中的纤维结合蛋白，实现单步层析制备高纯度VWF产品的目的。

本发明的有益效果为：

（1）从凝血因子Ⅷ生产工艺的废料开始，仅使用单步阴离子交换层析就完成了VWF产品的纯化，特别是能够有效去除产品中与VWF很难分离的纤维结合蛋白成分，避免了使用昂贵而又复杂的第二步明胶亲和层析工艺，缩短了工艺时间，减少了厂房、设备、人工、耗材等投入，降低了生产成本。

（2）单步阴离子交换层析中，VWF中的两种主要杂质纤维蛋白原和纤维结合蛋白，特别是纤维结合蛋白，与VWF的分离效果可以在较宽的盐浓度范围内实现，即产品的纯度对于平衡和洗涤过程中的盐浓度不敏感（在180~250mmol/L氯化钠的范围内），扩充了平衡液（同时也用于洗涤）的盐浓度设计空间，提高了生产工艺的可控性。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明作进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。

实施例1、一种单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺，具体步骤为：

第一步：取冷沉淀10kg，加入30kg30℃的注射用水，搅拌溶解1小时，用0.1mol/L的乙酸调节pH值为6.8，用去乙酸约1.4L。加入平衡好的Sephadex A50凝胶，搅拌吸附40分钟，采用连续流离心机（管式离心机）离心除去凝胶和少量未溶解的沉淀，收集上清液。

在第一步之前应作如下准备：称取Sephadex A50凝胶（干胶）20g。干胶置于烧杯中，加入80mmol/L氯化钠溶液1L溶胀6小时。配制平衡液：20mmol/L枸橼酸钠、60mmol/L氯化钠、pH为6.8。弃去烧杯中上层溶胀液，保留下层凝胶，再加入1L平衡液，搅拌均匀，并平衡10~20分钟，抽滤除去平衡液，再添加新的平衡液，反复平衡3~5次。

第二步：收集第一步中的上清液40.5kg。继续加0.1mol/L的乙酸约1.8L，调节pH至6.3。加乙酸的同时用冰水浴降温，调节温度至14℃。温度和pH达到要求后离心分离沉淀（称为酸沉淀）和上清液。

第三步：收集第二步所得上清液35kg，用0.45μm滤芯过滤。向滤液中加入1%的聚山梨酸酯-80和0.3%的磷酸三丁酯，混合均匀，24℃孵育6小时，灭活病毒。

第四步：用Toyopeal DEAE-650M凝胶装填层析柱，柱床体积为5L（柱床高度10cm，直径25cm）。配制平衡液：10mmol/L枸橼酸钠、80mmol/L氯化钠、80mmol/L甘氨酸，pH为6.8。需平衡5个柱床体积。将第三步中灭活后的溶液用蠕动泵泵入层析柱，流速为0.5L/min。然后依次用洗涤液和洗脱液冲洗层析柱。洗涤液含10mmol/L枸橼酸钠、150mmol/L氯化钠、120mmol/L甘氨酸，pH为6.8。洗涤4个柱床体积。收集流穿液和洗涤液中富含VWF的部分35kg，收集提取凝血因子Ⅷ之后的废料，待用。

第五步：制备低电负性明胶：称取明胶500g溶于100L 10mmol/L的磷酸钠缓冲液中（PBS），pH 7.0±0.5。阴离子交换凝胶 Fractogel® EMD TMAE (Merck) 10L装填层析柱，并用10mmol/L的PBS（pH 7.0±0.5）平衡5个柱体积，待用。将上述明胶溶液通过平衡过的层析柱，线流速120cm/h，收集流穿液，浓缩脱水干燥或冻干即为低电负性明胶，因为电负性较高的明胶分子被层析柱捕获。凝胶层析柱可以经过常规的再生处理（如高盐洗脱，见凝使用胶说明书）后可以反复使用。可以一次制备大量的低电负性明胶，用于多批次的VWF生产。

第六步：在第四步骤收集的流穿液和洗涤液中加入第五步中制备的低负电性明胶，每升料液添加量为0.5g，充分溶解并混匀。

第七步：阴离子交换凝胶 Fractogel® EMD TMAE (Merck) 10L装填层析柱，用平衡液（磷酸钠10mmol/L、氯化钠180mmol/L、氯化钙1mmol/L，pH6.8~7.6）平衡3个柱体积。使第六步中混匀的料液经过平衡好的层析柱，再用平衡液洗涤层析柱5个柱体积，再用洗脱液（磷酸钠10mmol/L、氯化钠350mmol/L、氯化钙1mmol/L，pH6.8~7.6）洗脱层析柱上吸附的VWF，并收集。平衡、上样、洗涤、洗脱的线流速为60cm/h。

第八步：步骤8中收集到的含有VWF的洗脱液，经过配制、除菌、灌装、冻干、100℃/30min干热病毒灭活，即得到高纯的VWF产品。

实施例2、一种单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺，具体步骤为：

第一步：取冷沉淀10kg，加入30kg30℃的注射用水，搅拌溶解1小时，用0.1mol/L的乙酸调节pH值为6.8，用去乙酸约1.4L。加入平衡好的Sephadex A50凝胶，搅拌吸附40分钟，采用连续流离心机（管式离心机）离心除去凝胶和少量未溶解的沉淀，收集上清液。

在第一步之前应作如下准备：称取Sephadex A50凝胶（干胶）20g。干胶置于烧杯中，加入80mmol/L氯化钠溶液1L溶胀6小时。配制平衡液：20mmol/L枸橼酸钠、60mmol/L氯化钠、pH为6.8。弃去烧杯中上层溶胀液，保留下层凝胶，再加入1L平衡液，搅拌均匀，并平衡10~20分钟，抽滤除去平衡液，再添加新的平衡液，反复平衡3~5次。

第二步：收集第一步中的上清液40.5kg。继续加0.1mol/L的乙酸约1.8L，调节pH至6.3。加乙酸的同时用冰水浴降温，调节温度至14℃。温度和pH达到要求后离心分离沉淀（称为酸沉淀）和上清液。

第三步：收集第二步所得上清液35kg，用0.45μm滤芯过滤。向滤液中加入1%的聚山梨酸酯-80和0.3%的磷酸三丁酯，混合均匀，24℃孵育6小时，灭活病毒。

第四步：用Toyopeal DEAE-650M凝胶装填层析柱，柱床体积为5L（柱床高度10cm，直径25cm）。配制平衡液：10mmol/L枸橼酸钠、80mmol/L氯化钠、80mmol/L甘氨酸，pH为6.8。需平衡5个柱床体积。将第三步中灭活后的溶液用蠕动泵泵入层析柱，流速为0.5L/min。然后依次用洗涤液和洗脱液冲洗层析柱。洗涤液含10mmol/L枸橼酸钠、150mmol/L氯化钠、120mmol/L甘氨酸，pH为6.8。洗涤4个柱床体积。收集流穿液和洗涤液中富含VWF的部分35kg，即收集提取凝血因子Ⅷ之后的废料，待用。

第五步：制备低电负性明胶：称取明胶500g溶于100L 10mmol/L的磷酸钠缓冲液中（PBS），pH 7.0±0.5。阴离子交换凝胶 Fractogel® EMD TMAE (Merck) 10L装填层析柱，并用10mmol/L的PBS（pH 7.0±0.5）平衡5个柱体积，待用。将上述明胶溶液通过平衡过的层析柱，线流速120cm/h，收集流穿液，浓缩脱水干燥或冻干即为低电负性明胶，因为电负性较高的明胶分子被层析柱捕获。凝胶层析柱可以经过常规的再生处理（如高盐洗脱，见凝使用胶说明书）后可以反复使用。可以一次制备大量的低电负性明胶，用于多批次的VWF生产。

第六步：在第四步骤收集的流穿液和洗涤液中加入第五步中制备的低负电性明胶，每升料液添加量为0.8g，充分溶解并混匀。

第七步：阴离子交换凝胶 Fractogel® EMD TMAE (Merck) 10L装填层析柱，用平衡液（磷酸钠10mmol/L、氯化钠210mmol/L、氯化钙1mmol/L，pH6.8~7.6）平衡4个柱体积。使第六步中混匀的料液经过平衡好的层析柱，再用平衡液洗涤层析柱8个柱体积，再用洗脱液（磷酸钠10mmol/L、氯化钠400mmol/L、氯化钙1mmol/L，pH6.8~7.6）洗脱层析柱上吸附的VWF，并收集。平衡、上样、洗涤、洗脱的线流速为120cm/h。

第八步：步骤8中收集到的含有VWF的洗脱液，经过配制、除菌、灌装、冻干、100℃/30min干热病毒灭活，即得到高纯的VWF产品。

实施例3、一种单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺，具体步骤为：

第一步：取冷沉淀10kg，加入30kg30℃的注射用水，搅拌溶解1小时，用0.1mol/L的乙酸调节pH值为6.8，用去乙酸约1.4L。加入平衡好的Sephadex A50凝胶，搅拌吸附40分钟，采用连续流离心机（管式离心机）离心除去凝胶和少量未溶解的沉淀，收集上清液。

在第一步之前应作如下准备：称取Sephadex A50凝胶（干胶）20g。干胶置于烧杯中，加入80mmol/L氯化钠溶液1L溶胀6小时。配制平衡液：20mmol/L枸橼酸钠、60mmol/L氯化钠、pH为6.8。弃去烧杯中上层溶胀液，保留下层凝胶，再加入1L平衡液，搅拌均匀，并平衡10~20分钟，抽滤除去平衡液，再添加新的平衡液，反复平衡3~5次。

第二步：收集第一步中的上清液40.5kg。继续加0.1mol/L的乙酸约1.8L，调节pH至6.3。加乙酸的同时用冰水浴降温，调节温度至14℃。温度和pH达到要求后离心分离沉淀（称为酸沉淀）和上清液。

第三步：收集第二步所得上清液35kg，用0.45μm滤芯过滤。向滤液中加入1%的聚山梨酸酯-80和0.3%的磷酸三丁酯，混合均匀，24℃孵育6小时，灭活病毒。

第四步：用Toyopeal DEAE-650M凝胶装填层析柱，柱床体积为5L（柱床高度10cm，直径25cm）。配制平衡液：10mmol/L枸橼酸钠、80mmol/L氯化钠、80mmol/L甘氨酸，pH为6.8。需平衡5个柱床体积。将第三步中灭活后的溶液用蠕动泵泵入层析柱，流速为0.5L/min。然后依次用洗涤液和洗脱液冲洗层析柱。洗涤液含10mmol/L枸橼酸钠、150mmol/L氯化钠、120mmol/L甘氨酸，pH为6.8。洗涤4个柱床体积。收集流穿液和洗涤液中富含VWF的部分35kg，即收集提取凝血因子Ⅷ之后的废料，待用。

第五步：制备低电负性明胶：称取明胶500g溶于100L 10mmol/L的磷酸钠缓冲液中（PBS），pH 7.0±0.5。阴离子交换凝胶 Fractogel® EMD TMAE (Merck) 10L装填层析柱，并用10mmol/L的PBS（pH 7.0±0.5）平衡5个柱体积，待用。将上述明胶溶液通过平衡过的层析柱，线流速120cm/h，收集流穿液，浓缩脱水干燥或冻干即为低电负性明胶，因为电负性较高的明胶分子被层析柱捕获。凝胶层析柱可以经过常规的再生处理（如高盐洗脱，见凝使用胶说明书）后可以反复使用。可以一次制备大量的低电负性明胶，用于多批次的VWF生产。

第六步：在第四步骤收集的流穿液和洗涤液中加入第五步中制备的低负电性明胶，每升料液添加量为1g，充分溶解并混匀。

第七步：阴离子交换凝胶 Fractogel® EMD TMAE (Merck) 10L装填层析柱，用平衡液（磷酸钠10mmol/L、氯化钠250mmol/L、氯化钙1mmol/L，pH6.8~7.6）平衡5个柱体积。使第六步中混匀的料液经过平衡好的层析柱，再用平衡液洗涤层析柱10个柱体积，再用洗脱液（磷酸钠10mmol/L、氯化钠450mmol/L、氯化钙1mmol/L，pH6.8~7.6）洗脱层析柱上吸附的VWF，并收集。平衡、上样、洗涤、洗脱的线流速为180cm/h。

第八步：步骤8中收集到的含有VWF的洗脱液，经过配制、除菌、灌装、冻干、100℃/30min干热病毒灭活，即得到高纯的VWF产品。

本发明方法制备的产品与《欧洲药典中》描述的VWF关键质量指标的对比见表1；同时，本发明还对产品纯度（比活性）、VWF回收率与平衡液（同时也用于洗涤）盐浓度之间的敏感性进行了小试研究，见表2。

表1. 本发明方法制备的产品与《欧洲药典》中收录的VWF关键质量指标的对比

表2. 本发明中产品纯度（比活性）、VWF回收率与平衡液盐浓度之间的敏感性小试研究

通过表2说明：平衡液（洗涤液）氯化钠含量低于180mmol/L时，VWF比活性显著下降，纤维蛋白原含量显著上升，产品质量降低；氯化钠含量高于250mmol/L时，产品质量无显著变化，但是VWF回收率显著下降；氯化钠含量在180~250mmol/L范围内，VWF比活性、纤维蛋白原含量、纤维结合蛋白含量、单步层析VWF回收率都保持相对稳定且较优的结果。结果表明，产品质量和单步层析VWF回收率在180~250mmol/L范围内对氯化钠含量的变化并不敏感，有利于生产过程中的质量控制。

Claims (1)

1.一种单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺，其特征在于，具体步骤为：

（1）冷沉淀用注射用水在15~35℃范围内搅拌溶解，用0.1mol/L的乙酸调节pH值为6.6~7.0，电导率小于4 mS/cm，加入平衡好的Sephadex A50凝胶，搅拌吸附40~60分钟，离心除去凝胶和未溶解的沉淀；

（2）步骤1中离心后的上清液再用0.1mol/L的乙酸调节pH值为6.2~6.5，并降低温度至12~18℃，纤维蛋白原和纤维结合蛋白会形成沉淀，通过离心分离沉淀，而凝血因子Ⅷ和VWF则留在上清液当中；

（3）步骤2中离心后的上清液富含凝血因子Ⅷ和VWF，经过澄清过滤后，加入1%的聚山梨酸酯-80和0.3%的磷酸三丁酯，24℃孵育6小时，有效灭活潜在的脂包膜病毒；

（4）步骤3中经过病毒灭活的溶液经过弱阴离子交换层析，吸附其中的凝血因子Ⅷ，大部分杂蛋白从层析柱上流穿，吸附后的层析柱经过洗涤除去残留的杂蛋白和聚山梨酸酯-80、磷酸三丁酯，用洗脱液从层析柱上洗下凝血因子Ⅷ；经过浓缩、配制、除菌、分装、冻干、100℃/30min干热病毒灭活，即可得到凝血因子Ⅷ制品，然后收集流穿和洗涤部分，即收集提取凝血因子Ⅷ之后的废料，待用；

（5）制备低电负性明胶：称取明胶500g溶于100升10mmol/L的磷酸钠缓冲液中，pH 7.0±0.5，制成明胶溶液；阴离子交换凝胶Fractogel® EMD TMAE 5~10L装填层析柱，并用10mmol/L的磷酸钠缓冲液平衡3~5个柱体积，磷酸钠缓冲液的pH为7.0±0.5，待用；将上述明胶溶液通过平衡过的层析柱，线流速60~180cm/h，收集流穿液，并将流穿液浓缩脱水干燥或冻干即为低电负性明胶；

（6）将步骤4中收集的流穿和洗涤部分，即收集的提取凝血因子Ⅷ之后的废料，加入步骤5中制备的低电负性明胶，每升料液中加入低电负性明胶0.5~1g，充分溶解；

（7）VWF纯化：步骤5中阴离子交换凝胶 Fractogel® EMD TMAE装填层析柱用平衡液平衡3~5个柱体积；平衡液：磷酸钠10mmol/L、氯化钠180~250mmol/L、氯化钙1mmol/L；使步骤6中混匀的料液经过平衡好的层析柱，用平衡液洗涤层析柱5~10个柱体积，再用洗脱液洗脱层析柱上吸附的VWF，并收集；洗脱液：磷酸钠10mmol/L、氯化钠350~450mmol/L、氯化钙1mmol/L，pH6.8~7.6；上样、洗涤、洗脱的线流速为60~180cm/h；

（8）步骤7中收集到的含有VWF的洗脱液，经过配制、除菌、灌装、冻干、100℃/30min干热病毒灭活，即得到高纯的VWF产品。