CN101796065A - 纯化因子VIII和Von Willebrand因子的方法 - Google Patents

纯化因子VIII和Von Willebrand因子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及纯化方法，包括从选自(i)含有FVIII和FvW的混合物的溶液，(ii)含有FvW的溶液，(iii)源于非人动物的分泌物的溶液，和(iv)源于含有FVIII的植物提取物的溶液开始在离子交换色谱过滤型膜上吸附FVIII或FvW的步骤。

Description

纯化因子VIII和Von Willebrand因子的方法
发明领域
本发明领域涉及在药物中用作活性剂的因子VIII以及VonWillebrand因子的纯化。
现有技术
因子VIII(下面也称作“FVIII”)是以低浓度存在于人血浆中的血浆蛋白质。然而，其代表了凝结级联中的关键点。事实上，这一蛋白质起因子IX(或“FIX”)的辅因子的作用以便活化因子X(或“FX”)。一旦被活化，因子X将凝血酶原转变成凝血酶，后者再将纤维蛋白原转变成纤维蛋白，从而导致止血纤维蛋白凝块的形成。
罹患A型血友病的人具有FVIII缺陷，这自发地或在源于事故或外科手术的创伤后造成严重的失血。
通常通过注射纯化的血浆源FVIII来治疗那些个体。由于此注射通常为多次且重复，所以可获得高纯度FVIII浓缩物是至关重要的。事实上，如果FVIII浓缩物未充分纯化，它们可能含有大量的纤维蛋白原和免疫球蛋白，这可能诱导不期望的免疫应答。
因此，提供血浆源蛋白质用于治疗目的需要血浆源FVIII纯化方法以获得高纯度产物。
最通常从冷沉淀的人血浆级分来制备因子VIII浓缩物。通常在工业中心获得的用于治疗人血浆的因子VIII浓缩物的纯度通常约1IU/mg并且通常不超过10至20IU/mg的最大范围。最常见的纯化方法都意味着沉淀步骤，该步骤针对于除去(通常不够充分)蛋白源污染物如纤维蛋白原、纤连蛋白以及免疫球蛋白。这些方法可使用或组合低温沉淀(10℃)，或者添加蛋白沉淀剂，像亲水聚合物如PEG(Newman等人，Br.J.Haematol21：1-20，1971；Hao等人，Methods of Plasma Protein Fractionation，Academic Press 1980，pp.57-74)，聚乙烯吡咯烷酮(Casillas和Simonetti，Br.J.Haemato，50：665-672，1982)、葡聚糖、聚糖体、珀可、羟乙基淀粉以及氧化铝也被建议用作沉淀剂。Thorell和
Figure GPA00001037550200021
推荐的甘氨酸以及氯化钠的使用(Thorell和
Figure GPA00001037550200022
Thromb Res.1984 Aug 15；35(4)：431-50)也适用于沉淀剂。类似地，一些作者(Ng等人，ThrombosisRes.，42：825-834，1986)成功地将三种沉淀剂PEG、甘氨酸和氯化钠组合以获得具有比活性在10至16IU/mg范围的因子VIII浓缩物。
也通过在生产过程中包括与多孔硅珠的接触步骤来生产因子VIII浓缩物，该接触步骤旨在截留低分子量蛋白源污染物(Margolis等人，VoxSang.46：341-348，1984)。产物的比活性仍旧保持相对较差：1UI/mg。
出现了制备非常高纯度因子VIII浓缩物的方法。事实上，提出了通过免疫亲和色谱法来获得浓缩物(Zimmerman和Fulcher，Thrombosis Res.，Suppl.VII，p.58，1987；Berntorp和Nilsson，Thrombosis Res.，Suppl.VII，p.60，1987；Levine等人，Thombosis Res，Suppl.VII，1987)。此种方法在于利用固定到色谱底物的抗因子VIII：C或抗Von Willebrand因子抗体的方法来纯化因子VIII。此种方法是有效的但是却需要烈性(drastic)溶液的使用以将因子VIII从其抗体或从Von Willebrand因子解吸附。因此需要针对于除去不想要的化学剂的其他超滤步骤，但是这可能影响因子VIII的生物活性。生产期间，因子VIII的比活性可达到4000至10000IU/mg，但是其不稳定性需要在冻干步骤前加入稳定剂例如白蛋白，这将因子VIII的比活性降至3-5IU/mg。然而，免疫亲和纯化的主要缺点在于动物源残留抗体的存在并因此可能在患者中造成针对那些非人蛋白质的免疫反应的发生。
因此，通过可用于大规模工业环境的方法，所有这些方法都不允许提供完全没有非人蛋白质如动物源抗体的极高纯度的因子VIII浓缩物。
EP 0 343 275描述了从冷沉淀物制备因子VIII的方法，其特征在于，在病毒灭活处理之前，冷沉淀物悬浮于pH值在6.5至7.5范围的含有1至3U/ml肝素的水中，与氢氧化铝悬液反应并在10至18℃的温度下冷却以及将pH值调整至6至7的范围，离心或过滤，然后再经过后处理，尤其是通过使用亲水型离子交换树脂如Fractogel-DEAE(现在称作
Figure GPA00001037550200031
由Tosoh Bioscience公司出售)的色谱法进一步进行纯化。
这一文本因而描述了通过将非常特殊的预备步骤(尤其是特征为完全没有任何乙醇处理)与在亲水型树脂如Fractogel DEAE上的离子交换色谱联合使用，而只纯化因子VIII。
EP 0 359 593描述了阴离子交换色谱纯化方法，其使得在经深思熟虑而不需要任何后处理的条件下，在单个色谱柱上分离预期的蛋白质。此种方法使得能够从人或动物血浆分离因子VIII、纤维蛋白原、纤连蛋白和Von Willebrand因子蛋白质。此种方法可总结如下：将溶解于水的冷沉淀物级分通过使用基质为大交联乙烯聚合物凝胶类型的阴离子交换树脂的色谱法进行单次分离，该树脂由于其孔隙率特性而能够留住因子VIII-VonWillebrand因子复合物，然后通过连续增加洗脱缓冲液的离子强度而选择性地收集多种蛋白质。此种方法通过使用接枝到
Figure GPA00001037550200032
TSK-DEAE650树脂上的DEAE部分(现称作
Figure GPA00001037550200033
由TosohBioscience公司出售)而得到很好的结果。然而，此种方法虽然能获得纯化的FVIII，但不能获得足够纯的Von Willebrand因子。
另一方面，Von Willebrand因子(下文也称作“FvW”)通过发挥下述两种不同功能而在止血起至关重要的作用，即：作为粘着蛋白，它允许血小板分散，粘附并聚集到血管内皮下膜上，并因此参与损伤血管的快速愈合，以及另一方面，其保证因子VIII稳定并运输到血液循环中，而它并非与因子VIII共价相连。
FvW先天缺乏或这一因子的结构缺陷确实引起von Willebrand疾病，该疾病表现为皮肤和粘膜出血。当需要进行手术时，这一疾病的临床表现非常异类并且问题颇多。急需对von Willebrand疾病的治疗以矫正原发止血(出血时间)和凝结缺陷。
通常将使用富含FvW的人血浆衍生物(例如该血浆的冷沉淀物级分或含有足量与之相伴的FvW的因子VIII浓缩物)的替代疗法对该疾病进行治疗。
但是FvW是难于纯化的蛋白质。事实上，Von Willebrand因子是已知的在血浆中循环的最大蛋白质。其由一组二硫键连接的多聚体构成，该多聚体的基础元件具有分子量约260千道尔顿(kDa)。血浆中，FvW的最小形式是440至500kDa的二聚体，而最大形式是分子量可以达到两千万道尔顿的所述二聚体的多聚体。多聚体中亚基的排列可以是对于在其中形成它的细胞特异的：FvW在巨核细胞和内皮细胞中合成且聚合。
因此，由于其复杂性以及由于其与FVIII的结合，Von Willebrand因子分子的制备非常复杂。制备FvW浓缩物的多种方法通常组合这样的步骤，其在于沉淀血浆级分和/或色谱，该沉淀步骤移除不想要的蛋白质的主要部分(纤维蛋白原，纤连蛋白等)，而该色谱步骤(离子交换色谱、亲和色谱、免疫亲和色谱、空间排阻色谱等)针对于提供高比活性的高纯度浓缩物，同时保留多聚体形式的完整性，特别是高分子量的那些，其生物作用在治疗过程中是决定性的。
欧洲专利EP 0 503 991公开了以工业规模制备FvW浓缩物的方法，包括血浆冷沉淀物级分的预纯化步骤和三步连续的色谱步骤，第三步色谱是在琼脂糖固定的明胶柱上进行的亲和色谱。因此获得的FvW浓缩物具有以每mg蛋白质的瑞斯托菌素辅因子的活性单元来表示的比活性高于100VWF：RCo/mg，以及与初始血浆中相类似的高分子量多聚体水平。
欧洲专利申请EP 0 934 748描述了FvW制备方法，包括阴离子交换和阳离子交换色谱法的组合。得到的FvW级分具有以每mg蛋白质的FvW抗原单元来表示的比活性高于100 IU FvW：Ag/mg，但仍旧含有显著量的因子VIII。
美国专利US 6,579,723描述了通过免疫亲和色谱制备高纯度的FvW的方法，其中免疫吸附剂是抗FvW抗体。也可提供通过在肝素上的亲和色谱来纯化的额外步骤。然而，此种免疫亲和纯化的缺点是可能存在可诱导免疫反应的残留抗体。
欧洲专利EP 0 383 234教导了通过阴离子交换色谱的方法来制备FvW浓缩物，其使用含有碳水化合物的酸性溶液(pH范围5.5至6.5)来进行以在阴离子交换器上固定因子VIII。通过冲洗底物而回收FvW，以及未滞留的纤连蛋白和纤维蛋白原，确实需要额外的沉淀步骤以分离纯化的FvW浓缩物。
EP 1 632 501描述了从含有Von Willebrand因子的生物级分制备高纯度Von Willebrand浓缩物的方法，包括使用弱碱型乙烯基聚合物底物通过阴离子交换色谱的分离。有益地，此种方法可以非常容易地进行并且能够获得含有非常少的因子VIII的高特异性Von Willebrand因子。
FVIII和FvW是非常有用的血浆源蛋白质，并且其在一些人中的缺乏导致严重的止血病。因此最重要的是研发制备这些蛋白质的方法，该方法能够生产具有适于患者重复使用的纯度的产品。
先前技术中描述的方法能够获得纯的因子VIII，但是纯度差的VonWillebrand因子，或者是获得纯的FVIII和FvW，但是却要实施复杂且繁重的方法。
发明概述
本发明涉及纯化含有FVIII和FvW的混合物的溶液，或者含有FvW的溶液，或者源于动物、尤其是非人动物的分泌物的溶液，或者含有FVIII的植物提取物的方法，其特征在于，包括在可以吸附选自FVIII和FvW的蛋白质中至少一种的离子交换色谱过滤型膜上的色谱步骤。
发明详明
因此，本发明的一个目的在于提供一种从选自(i)含有FVIII和FvW的混合物的溶液，(ii)含有FvW的溶液，(iii)源于非人动物的分泌物的溶液，和(iv)源于含有FVIII的植物提取物的溶液来纯化FVIII或FvW的方法，所述方法的特征在于，包括在离子交换色谱过滤型膜上吸附FVIII或FvW的步骤。
如在此使用，“纯化方法”旨在意指将FVIII从介质中存在的其他分子分离的方法，或者将FvW从介质中存在的其他分子分离的方法，或者将FVIII从FvW分离的方法，或者将FVIII/FvW复合物从介质中存在的其他分子分离的方法。那些分子可以是不同于FVIII和FvW的蛋白质、病毒、细菌、孢子、培养基、胎牛血清，这一列表并非局限性的。
如在此使用，“FVIII”旨在意指任何形式的FVIII，尤其是能作用为FIX活化中的辅因子且能够与FvW形成复合物，特别是成熟FVIII，成熟FVIII生物活性衍生物如含有前肽(pro-FVIII)的pro-FVIII，包含非成熟FVIII的蛋白构建体，FVIII前体(pre-pro-FVIII)，切去信号肽和前肽后获得的成熟FVIII。本发明包括的其他FVIII生物活性衍生物是处于翻译后修饰或者转变成生物活性形式的前药，该生物活性形式例如截短形式、缺失形式如EP 218 712所述缺失定位于Arg-759和Ser-1709之间区域的一个或多个氨基酸的FVIII、嵌合形式以及包括不同于血浆天然成熟形式的翻译后修饰的形式。例如，这些多种FVIII形式可例如通过修饰成熟FVIII或者任何天然存在于血液中的其他形式而产生。编码此FVIII的核苷酸序列可源于多种来源，优选来自哺乳动物，包括人、猪、羊、牛、马科和羊亚科来源，这一列表并非局限性的。
如在此使用，“FvW”旨在意指任何FvW形式，尤其是成熟FvW，成熟FvW生物活性衍生物，例如含有前肽的pro-FvW，包含非成熟FvW的蛋白构建体，包括FvW前体(pre-pro-FvW))，FvW前肽(pro-FvW)，切去信号肽和前肽后获得的成熟FvW。本发明包括的其他FvW生物活性衍生物是经历翻译后修饰或者转变成生物活性形式的前药，该生物活性形式例如截短形式、缺失形式如抗蛋白水解的A2结构域缺失的FvW(Lankhof等人，Thromb.Haemost.77：1008-1013，1997)、Val449和Asn730之间包括糖蛋白1b结合结构域和用于胶原以及肝素的结合位点(Pietu等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.164：1339-1347，1989)的FvW片段，嵌合形式以及包括不同于血浆天然成熟形式的翻译后修饰的形式。例如，这些多种FvW形式可通过修饰成熟FvW或者任何天然存在于血液中的其他形式而制备。编码此FvW的核苷酸序列可源于多种来源，优选来自哺乳动物，包括人、猪、羊、牛、马科和羊亚科来源，这一列表并非局限性的。
如在此使用，“含有FVIII和FvW的混合物的溶液”旨在意指处于复合状态或分离状态的任何含有FVIII和FvW的溶液。这些溶液可以是血浆或重组或转基因来源的。
当该溶液是重组来源时，其源自单细胞体系，其中FVIII和FvW蛋白表达被诱导。可以提及任何转染有包括编码这些蛋白中各自的基因的载体的动物或人细胞系，优选编码人蛋白质的基因，其中所述细胞系可尤其选自CHO-K、CHO-LeC10、CHO Lec-1、CHO Pro-5、CHO dhfr-、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、YB2/0(ATCC CRL-1662)、BHK、K61-I6、NSO、SP2/0-Ag 14和P3X63Ag8.653、SK-Hep、HepG2、PERC6(Crucell)细胞系，以及植物细胞、细菌体系，例如E.Coli、真菌体系、使用病毒的体系，尤其是杆状病毒，这一列表并非局限性的。
此种细胞体系通过本领域技术人员公知的方法表达FvW和FVIII蛋白。可提及US 5,198,349作为实例，其内容在此通过引用并入本文。所述文献描述了FVIII和FvW共表达，尤其是在CHO细胞中，该CHO细胞一方面共转染有插入了FVIII编码序列的表达载体，而另一方面共转染有插入FvW编码序列的表达载体。
当该溶液是转基因来源时，其源自多细胞体系，尤其来自通过转基因获得的动物或植物，也就是说其中一种或多种细胞接收了重组DNA分子。其适合的实例包括狗、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、牛、山羊、绵羊、兔和猪、马、昆虫、植物如烟草、大豆，这一列表并非局限性的。
当通过动物生产FVIII和FvW时，这一生产可在由动物分泌的多种介质中发生，该介质例如尿、血液、唾液或乳汁，这一列表并非局限性的。此种生产方法可通过本领域技术人员公知的方法进行。可提及EP 0 741515和EP 807 170作为实例，这一列表并非局限性的。后者描述了以稳定方式在其基因组中整合编码FVIII和FvW的DNA分子的转基因动物的生产，以便表达它们并在乳汁中分泌它们。
当通过植物生产FVIII和FvW时，这一生产可通过本领域技术人员公知的方法进行，如在US 6,331,416和US 5,994,628中所述，这一列表并非局限性的。
当该溶液是血浆来源时，其可以是动物或人源血浆，或冷沉淀物，或者通过标准分级方法获得的级分(Cohn等人，J.Am.Chem.Soc.，68，459，1946以及Kistler等人，Vox Sang.，7，1962，414-424)。这些级分可任选地经过预纯化处理，例如在氢氧化铝上的吸附。
FVIII和FvW混合物意指这些蛋白质可以近乎相似的量存在，或者一种蛋白质相对于另一种是主导存在的，或者非常主导存在的。
如在此使用，“含有FvW的溶液”旨在意指任何含有FvW的溶液，并且基本上缺乏，也就是具有很少或者甚至极少的FVIII。这一溶液可以是重组、转基因或血浆来源。
当溶液是重组来源时，其源自单细胞体系，其中FvW蛋白表达被诱导。其适合的实例包括所有转染有包括编码这一蛋白的基因的载体的动物或人细胞系，优选编码人蛋白质的基因，其中所述细胞系可尤其选自CHO-K、CHO-LeC10、CHO Lec-1、CHO Pro-5、CHO dhfr-、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、YB2/0、BHK、K61-I6、NSO、SP2/0-Ag 14和P3X63Ag8.653、SK-Hep、HepG2细胞系，以及植物细胞、细菌体系，例如E.Coli、真菌体系、使用病毒的体系，尤其是杆状病毒，这一列表并非局限性的。
此种细胞体系表达FvW蛋白，并且可通过本领域技术人员公知的方法获得。可提及US 5,198,349和WO 89/06096作为适合的实例，这一列表并非局限性的。US 5,198,349描述了通过将编码人FvW的cDNA插入表达载体而在COS细胞中表达人FvW。
当该溶液是转基因来源时，其源自多细胞体系，尤其来自通过转基因获得的动物或植物，也就是说其中一种或多种细胞接收了编码FvW的重组DNA分子。其适合的实例包括狗、猫、小鼠、大鼠、牛、山羊、绵羊、兔和猪、马、昆虫、植物如烟草、大豆，这一列表并非局限性的。
当通过转基因动物生产FvW时，这一生产可由由动物分泌的多种介质实现，该介质例如尿、血液、唾液或乳汁，这一列表并非局限性的。此种生产方法可通过本领域技术人员公知的方法进行。WO 2001/022810和WO 1999/058699是其适合的实例，这一列表并非局限性的。这一方面，WO 2001/022810描述了在其乳汁中生产人FvW的雌性转基因小鼠的生产。
当通过植物生产FvW时，这一生产可由本领域技术人员公知的方法实现，如在US 6,331,416和US 5,994,628中所述，这一列表并非局限性的。
当该溶液是血浆来源时，其可以是动物或人源血浆级分，或冷沉淀物，或者通过标准分级方法获得的级分(Cohn等人，J.Am.Chem.Soc.，68，459，1946以及Kistler等人，Vox Sang.，7，1962，414-424)。这些级分可任选地经过预纯化处理，例如在氢氧化铝上的吸附。
如在此使用，“源自非人动物分泌物的含有FVIII的溶液”旨在意指任何源自任何分泌物，例如来自血浆、唾液、尿或乳汁，由经遗传改造以在前述分泌物之一中表达FVIII分子的转基因动物所生产的溶液。这种情况下，转基因动物不表达FvW。如在此使用，“源自含FVIII血浆的溶液”旨在也包括任何源自天然含有人或动物FVIII的血浆、基本上没有FvW的溶液。其可源自动物或人血浆级分，或冷沉淀物，或者通过标准分级方法获得的级分(Cohn等人，J.Am.Chem.Soc.，68，459，1946以及Kistler等人，Vox Sang.，7，1962，414-424)。这些级分可任选地经过预纯化处理例如在氢氧化铝上的吸附。
可通过本领域技术人员公知的方法进行从转基因动物生产方分泌物的方法。其适合的实例包括US 5,880,327和US 2007/0011752，这一列表并非局限性的。这一方面，US 5,880,327描述了在转基因小鼠的乳汁中生产人FVIII。US 2007/0011752描述了从多种动物的唾液生产人蛋白质例如FVIII。
如在此使用，“源自含FVIII植物提取物的溶液”旨在意指任何来自含FVIII蛋白质(尤其是人源)的植物的级分，其在经遗传改造以表达FVIII分子的植物或转基因植物的细胞中获得。
此提取物可通过将含编码FVIII的基因的核苷酸载体导入植物细胞而生产。此方法是本领域技术人员公知的，并且可通过属于本领域的诸多文献所描述，例如US 2005/0060775。
如在此使用，“离子交换色谱过滤型膜”旨在意指任何通过离子交换而使FVIII和/或FvW通过该膜时，具有吸附FVIII和/或FvW能力的物理半渗透屏障。此外，这一膜可以在膜与FVIII和/或FvW之间的离子交换相互作用不再足以将它们保留在膜上时，允许FVIII和FvW流过。
因此，为了实施根据本发明的纯化FVIII或FvW的方法，使用由大孔底物制成的离子交换过滤型膜，所述底物包括固定到其上的负电或正电包被，所述包被提供为过滤型膜离子交换特性。通常，负电或正电包被通过化学接枝固定到大孔底物上。
该大孔底物的孔隙率，也就是其平均孔径是使得过滤型膜允许FVIII和FvW流过。使用此种膜的首要益处在于使用可弃式交换过滤型膜的可能性，其提高了该方法的卫生安全级别。使用此种膜的第二个益处在于在待纯化溶液的极高流速下，进行根据本发明纯化方法，并且更准确地，离子交换色谱步骤的可能性。
任何类型的物理屏障底物可适合于适于根据本发明的实施的过滤型膜，例如多聚体膜、芯(wick)、空心纤维、稳定的纤维素、聚醚砜、或任何可以允许FVIII和FvW流过的三维结构。
过滤型膜与FVIII和FvW蛋白之间的离子交换相互作用源于固定到大孔底物上的正电或负电包被，所述包被包括可以被替代的碱性或酸性官能部分。
离子交换包被可为单官能类型，也就是包括只有一种官能部分，或者如果存在多种类型的官能部分，则是多官能类型，。
因此，由于FVIII和FvW蛋白质和膜之间的相互作用，过滤型膜使得能够同时捕获或吸附FVIII和FvW蛋白。在将含有FVIII和FvW的溶液施用至膜上时，由于离子交换相互作用，FvW和FVIII被膜保留。
当待纯化的产物不存在于冷沉淀物时，优选进行溶液预纯化步骤以在进行根据本发明的纯化方法前纯化，从而获得足以不含污染物的溶液。
这一预纯化步骤可以是有益的，尤其是用含有大量蛋白质的介质的复杂的溶液，例如源自乳汁或血浆。此预纯化步骤可尤其包括澄清步骤，例如如WO 2004/076695所述，或者提取步骤，例如如FR 06 04864或FR 0611536所述，这一列表并非局限性的。这一方面，FR 06 04864描述了至少一种存在于乳汁中的蛋白质的提取方法，所述蛋白质对所述乳汁的钙离子具有亲和性(无论复合与否)，包括由下面的步骤：
(i)通过沉淀钙化合物释放蛋白质，该化合物通过将乳汁与可溶性盐如磷酸钠接触而获得，依在此介质中形成所述不溶性钙化合物的能力选择该可溶性盐的阴离子，以便获得富含蛋白质的液相，
(ii)从钙化合物沉淀分离富含蛋白质的液相，进一步分离所述液相以形成脂相和水性、含有蛋白质的非脂相，和
(iii)回收该水性，含有蛋白质的非脂相。
此外，FR 06 11536描述了提取存在于乳汁中的蛋白质的方法，包括至少一种疏水袋和在乳汁的中性pH下的负电荷，包括下述步骤：
a)撇取所述乳汁并脱脂化，
b)在使得所述蛋白质保留于接枝有具疏水和离子特性的配体的色谱底物上的pH条件下，将含有所述蛋白质的脱脂化且经过撇取的级分施用到所述底物上，例如4-巯基-乙基-吡啶，
c)洗脱该蛋白质，
d)通过从所述洗脱级分中除去乳蛋白质而纯化该经洗脱的级分，和
e)回收所述蛋白质。
在通过细胞体系生产溶液的情况下，预纯化步骤可这样紧跟在细胞培养步骤本身后。可控制细胞培养基的组成以使由细胞生产的蛋白质分泌到细胞外介质中。此外，可进行细胞选择以便生成的蛋白质分泌到介质中。
此后，可能需要深层过滤步骤或切向微过滤以获得适于实施根据本发明纯化方法的步骤的预纯化。
本发明的一些具体实施方式中，过滤型膜是阳离子交换选择性膜。该膜携带的官能团的正平衡离子(positive counter-ion)由与FvW和FVIII具有相同正负号的电荷所代替。
可用于阳离子交换包被的官能团包括羧甲基(CM)、磷酰基和磺丙基(SP)、硫酸根(S)，这一列表并非局限性的。
在这些使用阳离子交换过滤型膜的实施方式中，可使用的缓冲液包括三-羟甲基-氨基甲烷、碳酸盐、乙二胺、咪唑或三乙醇胺，这一列表并非局限性的。
这些实施方式中，将根据本领域技术人员公知的常规方法，根据蛋白质的等电点来选择缓冲pH值，以便蛋白质在该pH值具有整体正电荷水平。
根据本发明的其他实施方式中，应用的过滤型膜是阴离子交换选择性膜。由膜携带的官能团的负平衡离子由与FvW和FVIII具有相同正负号的电荷所代替。
可用于阴离子交换包被的官能部分包括二乙基氨基乙基(DEAE)、二乙基(2-羟丙基)氨基乙基或季铵(QAE，Q)、二甲基氨基乙基(DMAE)和三甲基氨基乙基(TMAE)，这一列表并非局限性的。这些实施方式中，可使用的缓冲液是醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸、巴比妥酸盐，这一列表并非局限性的。
这些实施方式中，将根据本领域技术人员公知的常规方法，根据蛋白质的等电点来选择缓冲pH值，以便蛋白质在该pH值具有整体负电荷水平。
优选地，过滤型膜包括由强阴离子交换器组成的离子交换包被。
如在此使用，“强阴离子交换器”旨在意指任何能够吸附离子化差的蛋白质的阴离子交换膜。
此种过滤型膜是市售可得的。适合的实例包括携带QAE或Q部分的膜，尤其是
Figure GPA00001037550200131
膜(Pall)或Sartobind Q膜(Sartorius)，这一列表并非局限性的。
Mustang Q膜(Pall)是尤其引起关注的，因为它拥有高吸附能力和高色谱容量流量，并且因为它可以用于单循环(可弃式的)或多次循环。
此外，所述膜使得不需要进行底物冲洗的证实步骤，例如再生和卫生处理(病毒和朊病毒安全方法等)。
使用此过滤型膜也使得不需要进行对于标准底物而常规进行的老化研究。
因此，相比于现有技术的方法，使用此膜能够降低生产时间。
优选地，与溶液接触以纯化的过滤型膜的表面包括阴离子交换包被，该包被包括通过化学接枝固定到大孔底物上的季铵基团。
进一步的具体实施方式中，过滤型膜是大孔膜。
如在此使用，术语“大孔”旨在意指由孔径在0.3μm至1.0μm范围的膜构成的体系。更优选地，孔径在0.5μm至0.9μm的范围。最优选地，孔径为0.8μm。
根据本发明具体优选的实施方式中，膜底物为聚醚砜底物。
作为实例，此聚醚砜膜可为
Figure GPA00001037550200132
膜，由Pall出售。这一膜具有0.8μm直径的孔并且其接枝有季铵基团。
根据本发明的具体实施方式中，待纯化的溶液含有FVIII或FvW，并且是血浆源的。
根据本发明的优选实施方式中，待纯化的溶液含有FVIII和FvW的混合物，并且更优选地源于血浆。
因此，根据本发明的这些实施方式中，溶液源于天然的人或动物血浆，也就是源于分别天然含有人或动物FVIII和FvW的人或动物血浆。可从猪、兔、山羊收集此动物血浆，这一列表并非局限性的。
出人意料地，申请人观察到过滤型膜，并且尤其是膜具有比树脂或凝胶更高的FVIII和/或FvW吸附能力。如在此使用，“吸附能力”旨在意指固定到凝胶上的目标蛋白质的量，并且其通常由凝胶或树脂制造商以固定到凝胶或阴离子树脂上的BSA量(牛血清白蛋白)来表示。例如，对于常规用于纯化FVIII和/或FvW的
Figure GPA00001037550200141
凝胶，其在25至35mg/ml的范围，而对于
Figure GPA00001037550200142
膜，其高于或等于30mg/ml。
过滤型膜的较高吸附能力意味着相比于凝胶或树脂，使用较小量的凝胶等效物吸附等量FVIII和/或FvW的可能。作为说明，能够在DEAE上吸附50至80IU FvW和FVIII/ml凝胶，在
Figure GPA00001037550200143
膜上吸附200至250IU VWF和FVIII/ml凝胶等效物。
相比于凝胶或树脂，过滤型膜的最高吸附能力可源于FVIII和/或FvW对离子化位点的提高的可接近性，尤其是在它们形成FVIII/FvW复合物时。事实上，这些蛋白质具有大的尺寸，尤其是在它们形成FVIII/FvW复合物时，并且可以假定相比于接枝到凝胶或树脂上，当它们接枝到大孔过滤型膜上时，由于孔径，离子化位点更易于接近它们，而凝胶或树脂的情况中，离子化位点嵌入通道中，使得不容易被大蛋白质接近。
有利地，根据本发明的这一优选实施方式中，该方法包括下述步骤：
a)提供来自血浆的冷沉淀物，
b)在所述离子交换色谱膜上，并且更尤其在阴离子交换色谱膜上捕获，也就是吸附因子VIII和Von Willebrand因子，和
c)通过连续增加洗脱缓冲液的离子强度值来选择性地回收VonWillebrand因子和因子VIII。
有利地，在提供来自血浆的冷沉淀物的步骤后，可以进行通过在氧化铝凝胶上吸附因子VIII和Von Willebrand因子的预纯化步骤然后冷沉淀。
上述方法步骤c)中，本领域技术人员根据他对于FvW和FVIII蛋白质中每种的理化特性以及对于过滤型膜的离子交换特性的普通知识，可容易地调整洗脱缓冲液的离子强度值，该过滤型膜通常是市售可得的过滤型膜，其使用推荐由制造商提供。本领域技术人员基于他的普通知识尤其知晓从阴离子交换色谱底物用具有离子强度值高于从相同底物洗脱FvW所需的离子强度值的缓冲液来洗脱FVIII所。
因此，上述方法步骤c)中，本领域技术人员使用这样的缓冲液，其离子强度值适于洗脱(从底物解吸附)(i)FvW，(ii)FvW和FVIII或(iii)顺序地首先FvW，然后FVIII。根据对由顺序地首先洗脱FvW，然后FVIII所组成的备选的(iii)的第一实施方式，本领域技术人员可顺序地使用两种洗脱缓冲液，每种洗脱缓冲液具有分别针对于解吸附FvW或FVIII而调整的离子强度值。根据备选的(iii)的第二实施方式，本领域技术人员用能够产生渐增的离子强度梯度的缓冲液进行洗脱，利用该离子强度梯度，FvW，然后FVIII顺序地解吸附。
因此，如在此使用，对于上述方法步骤c)，“顺序增加洗脱缓冲液的离子强度值”包括线性增加洗脱缓冲液的离子强度值，这可通过添加盐，例如氯化钠、氯化钙而得到，这一列表非局限性的。
可以通过增加缓冲液的离子强度值而首先获得FvW洗脱物然后FVIII洗脱物。因此能够回收FvW并在获得FvW后停止洗脱，或者通过继续洗脱获得FVIII。
如在此使用，“冷沉淀物”旨在意指通过低温沉淀方法从人或动物血浆获得的沉淀物。可使用本领域技术人员公知的方法获得该冷沉淀物。作为实例，使冷冻血浆处于约-5℃至-15℃的温度，然后在搅拌下缓慢加热至不超过1℃或任选4℃的温度。在这些条件下，冷冻血浆融化以得到液相和固相。然后通过离心回收固相(即冷沉淀物)。冷沉淀物基本上由纤维蛋白原、纤连蛋白、因子VIII和Von Willebrand因子(vWF)构成。冷沉淀物中，FVIII通常与稳定FVIII的FvW相伴。
如在此使用，“选择性回收”旨在意指根据洗脱方法，根据期望的蛋白质，回收FVIII或者FvW或者FVIII和FvW的混合物的能力。
可以根据本领域技术人员公知的方法，通过改变pH值，或通过提高洗脱缓冲液的离子强度值来获得FvW或者FVIII或者FVIII和FvW的混合物(参见例如实施例1)。
其他实施方式中，待纯化的溶液含有重组或转基因来源的FVIII和FvW的混合物。
这一实施方式包括下述步骤：
a)提供包括FVIII和FvW的细胞培养物上清或预纯化的溶液，
b)在所述离子交换色谱膜，并且尤其在阴离子交换色谱膜上捕获因子VIII和Von Willebrand因子，和
c)通过连续增加洗脱缓冲液的离子强度值来选择性地回收VonWillebrand因子和因子VIII。
根据本发明的进一步的实施方式中，待纯化的溶液含有FVIII或FvW。
这一实施方式包括下述步骤：
a)提供含有FVIII或FvW的细胞培养物上清或纯化的溶液，
b)在所述离子交换色谱膜，并且尤其在阴离子交换色谱膜上捕获因子VIII或Von Willebrand因子，和
c)回收Von Willebrand因子或因子VIII。
有利地，利用血浆级分，本发明的方法使得降低了维生素K依赖性因子纤维蛋白原和纤连蛋白的量。
有利地，尤其在待纯化的溶液含有FVIII和FvW混合物时，选择性回收FvW和FVIII通过下述步骤实现：
c1)通过增加所述色谱膜的平衡缓冲液的离子强度值来洗脱FvW。例如可通过添加0.25M氯化钠至重量摩尔渗透压浓度在约600至660mOsm/Kg范围来增加离子强度值。
c2)通过增加所述色谱膜的平衡缓冲液的离子强度值甚至高于用来回收Von Willebrand因子的值来洗脱FVIII。例如可通过添加0.7M氯化钠，或0.35M氯化钙至重量摩尔渗透压浓度在约1400至170mOsm/Kg范围来增加离子强度值。
步骤c1)是选择性回收FvW的步骤，此步骤期间使用离子强度适于从离子交换过滤型膜解吸附FvW的缓冲液。
步骤c2)是选择性回收FVIII的步骤，此步骤期间使用离子强度适于从离子交换过滤型膜解吸附FVIII的缓冲液。步骤c2)中，使用离子强度值高于步骤c1)所用缓冲液的离子强度值的缓冲液。
在离子交换色谱过滤性膜上同时捕获FVIII和FvW后进行这些步骤。
在步骤c1)中洗脱的FvW含有极少FVIII。回收它并获得了纯化的FvW溶液。
此外，在步骤c2)中获得的FVIII含有比初始溶液更少的FvW。回收它并获得了FVIII纯化溶液。
任选地，能够实施额外步骤以解离高分子量FVIII-FvW复合物，例如如EP 1 037 923所述。任选地，然后能在孔隙率小于或等于20nm，尤其是等于15mn的亲水过滤膜上实施用于FVIII纯化溶液的额外过滤步骤，如在WO 2005/040214所述。
进一步具体实施方式中，本发明的方法通过在所述离子交换色谱过滤型膜上的FVIII和FvW同时吸附步骤后进行下述步骤而能够获得纯化的FvW溶液：
d)通过增加所述色谱膜的平衡缓冲液的离子强度值来洗脱FvW，
e)在离子交换色谱膜，更优选在与第一膜相同类型的膜上捕获VonWillebrand因子，和
f)通过增加所述色谱膜的平衡缓冲液的离子强度值来洗脱VonWillebrand因子。
这一实施方式中，任选地，能够在通过增加所述色谱膜的平衡缓冲液的离子强度值的FvW洗脱步骤d)后，通过增加所述色谱膜的平衡缓冲液的离子强度值甚至高于用来回收Von Willebrand因子的值来洗脱FVIII。因此，在简化的方法中，获得纯化的含FvW溶液和纯化的含FVIII溶液。
本发明方法因此有益地能够获得从含FVIII和FvW的溶液顺序或同时纯化FVIII和FvW。如果溶液是血浆源的，根据本发明的方法是尤其有益的，因为它能够尽可能有利地使用人或动物血浆。
有益地，这一具体实施方式还包括下述步骤：
g)在具有明胶配体的亲和凝胶柱上对步骤c)洗脱的富含VonWillebrand因子的级分进行色谱，和
h)回收没有滞留的且缺乏纤连蛋白的Willebrand因子级分。
例如，可根据本领域技术人员公知的方法，通过免疫比浊法，进行纤连蛋白检测。
因此，根据本发明方法的实施方式能够通过在离子交换色谱过滤型膜上的FVIII和FvW同时捕获步骤后进行下述步骤而获得纯化的FvW溶液和纯化的FVIII溶液：
a)通过增加所述色谱膜的平衡缓冲液的离子强度值来洗脱FvW，
b)通过增加所述色谱膜的平衡缓冲液的离子强度值甚至高于用来回收Von Willebrand因子的值来洗脱FVIII，
c)在离子交换色谱膜上捕获Von Willebrand因子，
d)通过增加所述色谱膜的平衡缓冲液的离子强度值来洗脱VonWillebrand因子，
e)在具有明胶配体的亲和凝胶柱上对步骤d)洗脱的富含VonWillebrand因子的级分进行色谱，和
f)回收没有在凝胶亲和上保留的富含Von Willebrand的级分。
因此，这一实施方式中，顺序获得纯化的FVIII溶液和纯化的FvW溶液。
根据本发明的方法，在其多种实施方式中，能够因此以简化的方式分离FVIII和FvW。
根据本发明的纯化步骤是唯一通过在阴离子交换色谱选择性膜上同时捕获两种蛋白质而能够从血浆分别或同时纯化因子VIII和VonWillebrand因子的步骤。
本发明的又一目的在于提供制备纯化的FVIII的方法，包括实施根据本发明的纯化方法。
本发明的又一目的在于提供制备纯化的FvW的方法，包括实施根据本发明的纯化方法。
将在下面实施例中描述本发明的其他方面和优点，这只为说明的目的而不以任何方式限制本发明的范围。
附图
图1：Von Willebrand因子纯化方法的图表。
图2：因子VIII纯化方法的图表。
实施例
实施例1：Von Willebrand因子的纯化方法
通过将新鲜的冷冻血浆融化至1℃和6℃之间的温度来制备冷沉淀物。
离心后，回收含有纤维蛋白原、纤连蛋白、Von Willebrand因子和因子VIII的冷沉淀物并在含有肝素钠(3IU/mL)的水性溶液中成为浆液。然后将溶液pH调至7.0±0.1。
通过在氧化铝凝胶上吸附以除去维生素K依赖的因子以及通过冷沉淀来除去纤维蛋白原和纤连蛋白，对冷沉淀物浆液进行预纯化。因此，搅拌中向悬液中加入氢氧化铝，搅拌5分钟。用乙酸0.1M将pH值调至6.5±0.2并在搅拌下冷却溶液至温度达到14至18℃的范围。然后离心溶液至温度为14-18℃。回收上清并通过在0.22μm过滤膜上过滤来澄清。
然后通过在足以对抗有包膜病毒的在聚山梨酯80(1％，w/v)和磷酸三正丁酯(0.3％，v/v)存在下的溶剂/去污剂处理来对预纯化的溶液进行病毒灭活步骤。用溶剂/去污剂的处理在pH值为7.1下进行至少6小时的时间。
然后使溶剂/去污剂处理的蛋白质溶液流经强阴离子交换接枝膜，例如Mustang Q膜盒，该膜之前用pH 6.9-7.1的富含氯化钠的碱性缓冲液平衡以达到370至390mOsm/Kg范围的重量摩尔渗透压浓度。
一旦该蛋白质溶液通过，用相同的缓冲液(重量摩尔渗透压浓度为370至390mOsm/Kg)洗涤膜盒直到柱洗脱液的光密度回到基线。未被膜吸附的蛋白质级分含有大量纤维蛋白原以及被加入用于基于溶剂/去污剂的病毒灭活处理的化学剂。
然后通过施用因加入氯化钠而增加离子强度以达到重量摩尔渗透压浓度为600-660mOsm/Kg的pH 6.9-7.1的碱性缓冲液来洗脱吸附在膜上的Von Willebrand。然后用不含氯化钠的pH 6.9-7.1的碱性缓冲液稀释洗脱后的级分直到达到重量摩尔渗透压浓度为370至390mOsm/Kg。
然后使稀释后的级分通过Mustang Q膜盒类型的强阴离子交换接枝膜，该膜之前用pH 6.9-7.1的富含氯化钠的碱性缓冲液平衡以达到370至390mOsm/Kg范围的重量摩尔渗透压浓度。一旦该蛋白质溶液通过，用相同的缓冲液(重量摩尔渗透压浓度为370至390mOsm/Kg)洗涤膜盒直到柱洗脱液的光密度回到基线。然后通过施用因加入氯化钠而增加离子强度以达到重量摩尔渗透压浓度为600-660mOsm/Kg的pH 6.9-7.1的碱性缓冲液来洗脱吸附在膜上的Von Willebrand。然后使用明胶配体在凝胶上对洗脱后的级分进行亲和色谱，该凝胶之前用因加入氯化钠而增加离子强度以达到重量摩尔渗透压浓度为600-660mOsm/Kg的pH 6.9-7.1的碱性缓冲液来平衡。一旦该蛋白质溶液通过，用相同的缓冲液(重量摩尔渗透压浓度为600至660mOsm/Kg)洗涤亲和凝胶直到柱洗脱液的光密度回到基线。包括凝胶冲洗液的未吸附级分表示高纯度的富含Von Willebrand的级分。
图1示出了纯化图表。
结果
表1：Von Willebrand因子的纯化
 步骤  产率(％)   比活性(IU/mg)
 初始冷沉淀物  100   0.46
 在Mustang Q XT5膜盒上的第一纯化步骤  ≥30(30-50)   20-30
 在Mustang Q XT5膜盒上+在明胶Sepharose上的色谱的第二纯化步骤  ≥70   ＞80
实施例2：纯化因子VIII的方法
通过将新鲜的冷冻血浆融化至1℃和6℃之间的温度来制备冷沉淀物。
离心后，回收含有纤维蛋白原、纤连蛋白、Von Willebrand因子和因子VIII的冷沉淀物并在含有肝素钠(3IU/mL)的水性溶液中成为浆液。然后将溶液pH调至7.0±0.1。
通过在氧化铝凝胶上吸附以除去维生素K依赖的因子以及通过冷沉淀来除去纤维蛋白原和纤连蛋白，来对冷沉淀物浆液进行预纯化。因此，搅拌下向悬液中加入氢氧化铝并搅拌5分钟。用乙酸0.1M将pH值调至6.5±0.2并在搅拌下冷却溶液至温度达到14至18℃的范围。然后离心溶液至温度为14-18℃。回收上清并通过在0.22μm过滤膜上过滤来澄清。
然后使溶剂/去污剂处理的蛋白质溶液流经强阴离子交换接枝膜，例如Mustang Q膜盒，该膜之前用pH 6.9-7.1的富含氯化钠的碱性缓冲液平衡以达到370至390mOsm/Kg范围的重量摩尔渗透压浓度。
一旦该蛋白质溶液通过，用相同的缓冲液(重量摩尔渗透压浓度为370至390mOsm/Kg)洗涤膜盒直到柱洗脱液的光密度回到基线。未被膜吸附的蛋白质级分含有大量纤维蛋白原以及被加入用于基于溶剂/去污剂的病毒灭活处理的化学剂。
然后通过施用因加入氯化钠而增加离子强度以达到重量摩尔渗透压浓度为600-660mOsm/Kg的pH 6.9-7.1的碱性缓冲液来洗脱吸附在膜上的Von Willebrand。可按照实施例1所述继续Von Willebrand因子的纯化。然后通过施用因加入氯化钠而增加离子强度以达到重量摩尔渗透压浓度为1400-1700mOsm/Kg的pH 6.9-7.1的碱性缓冲液来洗脱吸附在膜上的因子VIII。有利地，用通过加入氯化钙而获得的高离子强度值的pH 6.0的缓冲液洗脱因子VIII。
图2示出了纯化图表。
结果
表2：因子VIII的纯化
 步骤  产率(％)   比活性(IU/mg)
 初始冷沉淀物  100   0.38
 步骤  产率(％)   比活性(IU/mg)
 在Mustang Q XT5上的纯化步骤  ≥45(40-60)   ≥110

Claims (14)

1.从选自(i)含有FVIII和FvW的混合物的溶液，(ii)含有FvW的溶液，(iii)源于非人动物的分泌物的溶液，和(iv)源于含有FVIII的植物提取物的溶液来纯化FVIII或FvW的方法，所述方法的特征在于，包括在离子交换色谱过滤型膜上吸附FVIII或FvW的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中所述过滤型膜为阴离子交换色谱膜。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述过滤型膜为强阴离子交换器。
4.根据前述任一权利要求的方法，其中所述膜带有包括季铵基团的包被。
5.根据前述任一权利要求的方法，其中所述膜为大孔型膜。
6.根据前述任一权利要求的方法，其中所述膜为聚醚砜型膜。
7.根据前述任一权利要求的方法，其中所述溶液含有FVIII和FvW的混合物。
8.根据权利要求7的方法，其中所述溶液为血浆源的。
9.根据权利要求8的方法，其包括下述步骤：
a)提供来自血浆的冷沉淀物，
b)在所述离子交换色谱膜上吸附因子VIII和Von Willebrand因子，
c)通过使用具有适当离子强度值的洗脱缓冲液来回收因子VIII或VonWillebrand因子。
10.根据权利要求9的方法，其中根据下述步骤进行Von Willebrand因子和因子VIII的选择性回收：
c1)通过用具有适当离子强度值的缓冲液进行洗脱来选择性回收FvW，
c2)通过用具有高于步骤c1)所用缓冲液的离子强度值的适当离子强度值的缓冲液进行洗脱来选择性回收FVIII。
11.根据权利要求1-9中任一项的方法，其还包括下述步骤：
d)通过增加所述色谱膜的平衡缓冲液的离子强度值来洗脱FvW，
e)在离子交换色谱膜，更优选在与第一膜相同类型的膜上捕获VonWillebrand因子，
f)通过增加所述色谱膜的平衡缓冲液的离子强度值来洗脱VonWillebrand因子。
12.根据权利要求11的方法，其还包括下述步骤：
g)在具有明胶配体的亲和凝胶柱上对权利要求11的步骤c)洗脱的富含Von Willebrand因子的级分进行色谱，
h)回收没有纤连蛋白的未被滞留的Von Willebrand因子级分。
13.生产纯化的FVIII的方法，其包括实施根据权利要求1-10中任一项的方法。
14.生产纯化的FvW的方法，其包括实施根据权利要求1-12中任一项的方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104411716A (zh) * 2012-04-24 2015-03-11 诺和诺德A/S（股份有限公司） 适用于治疗血友病的化合物
CN105705516A (zh) * 2013-11-08 2016-06-22 杰特有限公司 浓缩von Willebrand因子或其络合物的新方法
CN106414491A (zh) * 2014-01-20 2017-02-15 奥克塔法马股份有限公司 一种制备FVIII:C/FVIII:Ag比例提高的因子VIII的方法
CN109705208A (zh) * 2018-12-29 2019-05-03 山东泰邦生物制品有限公司 一种单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2920429B1 (fr) * 2007-08-30 2012-10-05 Lfb Biotechnologies Procede de purification du facteur viii et du facteur von willebrand
US11197916B2 (en) 2007-12-28 2021-12-14 Takeda Pharmaceutical Company Limited Lyophilized recombinant VWF formulations
CN105816858A (zh) * 2007-12-28 2016-08-03 巴克斯特国际公司 重组vwf配方
FR2933496B1 (fr) * 2008-07-02 2012-10-05 Lfb Biotechnologies Procede de mesure du taux de facteur vii active dans un echantillon
CN102387784B (zh) * 2008-10-21 2014-04-02 巴克斯特国际公司 冻干的重组vwf配方
JP5722314B2 (ja) * 2010-04-30 2015-05-20 旭化成ファーマ株式会社 高純度可溶性トロンボモジュリン及びその製造方法
WO2012082933A1 (en) * 2010-12-15 2012-06-21 Baxter International, Inc. Eluate collection using conductivity gradient
US20140154233A1 (en) * 2012-12-05 2014-06-05 Csl Limited Method of purifying therapeutic proteins
GB201506113D0 (en) * 2015-04-10 2015-05-27 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Method for chromatography
GB201506117D0 (en) * 2015-04-10 2015-05-27 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Method for chromatography
KR102388176B1 (ko) * 2017-10-27 2022-04-19 주식회사 녹십자홀딩스 본 빌리브란트 인자(vWF)의 함량 조절이 가능한 제8인자 및 본 빌리브란트 인자를 포함하는 조성물의 제조방법
CN111989567A (zh) * 2018-04-19 2020-11-24 沃特世科技公司 用于色谱仪器的过滤装置

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6967239B1 (en) * 1997-12-15 2005-11-22 Laboratoire Francias Du Franctionnement Et Des Biotechnologies Method of filtering viruses from a factor VIII solution

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198349A (en) * 1986-01-03 1993-03-30 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor VIII:C and analogs
FR2632309B1 (fr) * 1988-06-07 1990-08-24 Lille Transfusion Sanguine Procede de purification par voie chromatographique de proteines, notamment de facteur viii, et les produits obtenus
FR2673632A1 (fr) * 1991-03-08 1992-09-11 Lille Transfusion Sanguine Procede de preparation de concentre de facteur von willebrand humain de tres haute purete, approprie a un usage therapeutique.
US5693506A (en) * 1993-11-16 1997-12-02 The Regents Of The University Of California Process for protein production in plants
US5880327A (en) * 1994-09-21 1999-03-09 American National Red Cross Transgenic mammals expressing human coagulation factor VIII
DE4435485C1 (de) * 1994-10-04 1996-03-21 Immuno Ag Verfahren zur Gewinnung von hochreinem von Willebrand-Faktor
AT404358B (de) * 1997-02-04 1998-11-25 Immuno Ag Verfahren zur chromatographischen reinigung bzw. fraktionierung von von willebrand-faktor aus einem vwf-hältigen ausgangsmaterial
AT406867B (de) * 1997-02-27 2000-10-25 Immuno Ag Verfahren zur gewinnung von hochreinem vwf oder faktor viii/vwf-komplex
WO1999037680A1 (en) * 1998-01-23 1999-07-29 Csl Limited Purification of fibrinogen
US20050060775A1 (en) * 1998-05-14 2005-03-17 Hooker Brian S. Production of human coagulation factor VIII from plant cells and whole plants
US6331416B1 (en) * 1999-06-10 2001-12-18 Cbd Technologies Ltd. Process of expressing and isolating recombinant proteins and recombinant protein products from plants, plant derived tissues or cultured plant cells
EP1148063A1 (de) * 2000-04-18 2001-10-24 Octapharma AG Haemostatisch aktives vWF enthaltendes Präparat und Verfahren zu seiner Herstellung
AUPR110100A0 (en) * 2000-10-30 2000-11-23 Life Therapeutics Limited Improved separation of macromolecules
FR2861395B1 (fr) * 2003-10-23 2006-02-17 Lab Francais Du Fractionnement Facteur viii viralement securise a faible teneur en multimeres superieurs
DE102004009400A1 (de) * 2004-02-24 2005-09-08 Zlb Behring Gmbh Fibrinogen Reinigung
FR2874216B1 (fr) * 2004-08-16 2006-11-03 Lab Francais Du Fractionnement Procede de preparation d'un concentre de facteur von willebrand (fvw) par voie chromatographique et concentre de fvw susceptible d'etre ainsi obtenu
PL1807101T3 (pl) * 2004-09-30 2016-11-30 Urządzenia i sposoby do zintegrowanego wytwarzania cząsteczek biologicznych w sposób ciągły
US20070011752A1 (en) * 2005-05-06 2007-01-11 American Integrated Biologics, Inc. Production of human proteins in transgenic animal saliva
US20100075375A1 (en) * 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
FR2920429B1 (fr) * 2007-08-30 2012-10-05 Lfb Biotechnologies Procede de purification du facteur viii et du facteur von willebrand

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6967239B1 (en) * 1997-12-15 2005-11-22 Laboratoire Francias Du Franctionnement Et Des Biotechnologies Method of filtering viruses from a factor VIII solution

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104411716A (zh) * 2012-04-24 2015-03-11 诺和诺德A/S（股份有限公司） 适用于治疗血友病的化合物
CN105705516A (zh) * 2013-11-08 2016-06-22 杰特有限公司 浓缩von Willebrand因子或其络合物的新方法
CN105705516B (zh) * 2013-11-08 2019-11-01 杰特有限公司 浓缩von Willebrand因子或其络合物的方法
CN106414491A (zh) * 2014-01-20 2017-02-15 奥克塔法马股份有限公司 一种制备FVIII:C/FVIII:Ag比例提高的因子VIII的方法
CN106414491B (zh) * 2014-01-20 2021-06-18 奥克塔法马股份有限公司 一种制备FVIII:C/FVIII:Ag比例提高的因子VIII的方法
CN109705208A (zh) * 2018-12-29 2019-05-03 山东泰邦生物制品有限公司 一种单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺
CN109705208B (zh) * 2018-12-29 2022-04-26 山东泰邦生物制品有限公司 一种单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺

Also Published As

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CA2697404A1 (fr) 2009-03-12
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