KR102388176B1

KR102388176B1 - 본 빌리브란트 인자(vWF)의 함량 조절이 가능한 제8인자 및 본 빌리브란트 인자를 포함하는 조성물의 제조방법

Info

Publication number: KR102388176B1
Application number: KR1020207013083A
Authority: KR
Inventors: 안지원; 고관영; 윤정혜; 백승호; 김민정; 여근혜; 임정애; 김수광
Original assignee: 주식회사 녹십자홀딩스
Priority date: 2017-10-27
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2022-04-19
Also published as: US20200247843A1; KR20200060504A; CN111491949B; EP3719034A4; WO2019083319A3; US11608358B2; CA3079956A1; EP3719034A2; CA3079956C; WO2019083319A2; CN111491949A

Abstract

본 발명은 본 빌리브란트 인자(vWF)의 함량 조절이 가능한 제8인자(FVIII) 및 본 빌리브란트 인자(vWF)를 포함하는 조성물의제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 혈장으로부터 하나의 공정에서 제8인자(FVIII)와 본 빌리브란트 인자(vWF)를 각각 정제하고 이를 적절한 비율로 혼합함으로써 본 빌리브란트 인자(vWF)의 함량 조절이 가능한 제8인자(FVIII) 및 본 빌리브란트 인자(vWF)를 포함하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 제8인자(FVIII)의 단독 정제 산물에 비해 본 빌리브란트 인자(vWF) 이외의 불순물 양을 증가시키지 않고, 제8인자(FVIII)의 단독 정제 공정에 비해 공정시간을 크게 증가시키지 않으면서도(3시간 이내), 제8인자(FVIII)의 수율 변화없이 본 빌리브란트 인자(vWF)의 함량을 다양하게 변화시킨 제8인자(FVIII) 및 본 빌리브란트 인자(vWF)를 포함하는 조성물를 제조/정제할 수 있는 효과가 있다.

Description

본 빌리브란트 인자(VWF)의 함량 조절이 가능한 제8인자 및 본 빌리브란트 인자를 포함하는 조성물의 제조방법

본 발명은 본 빌리브란트 인자(vWF)의 함량 조절이 가능한 제8인자 및 본 빌리브란트 인자(FVIII and vWF)를 포함하는 조성물의 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 혈장으로부터 하나의 공정에서 제8인자(FVIII)와 본 빌리브란트 인자(vWF)를 각각 정제하고 이를 적절한 비율로 혼합함으로써 본 빌리브란트 인자(vWF)의 함량 조절이 가능한 제8인자 및 본 빌리브란트 인자(FVIII and vWF)를 포함하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

항 혈우병인자(제8인자)는 혈액응고 과정에서 제10인자(Factor Ⅹ)의 활성을 촉진시켜 피브린 혈전의 형성이 촉진되도록 하는 기능을 가진 단백질 조효소이다. 제8인자는 혈우병 환자의 혈장에서 혈액응고의 결함을 보정하는 기능을 하며, 본 빌리브란트 인자(von Willebrand factor, 이하 편의상 'vWF'라 함)와 복합체를 이루어 혈장 내를 순환한다.

vWF는 본 빌리브란트 결핍증에 있어 혈소판 기능의 결함을 변화시킬 수 있는 단백질로서 제8인자와 복합체를 이룬다. vWF는 혈관 내피 세포나 골수 거핵구에서 생산되어, 2050 아미노산 잔기(단량체 약 250 kDa)를 포함하는 단일 서브유닛이 이황화결합으로 연결된 다량체 구조(분자량 500 내지 20,000 kDa)로 존재하고 있는 지혈 인자이다. 혈중 농도는 약 10 ㎍/㎖이고, 일반적으로 고분자량일수록 비활성이 높다. vWF에는 두 가지의 큰 지혈 인자로서의 기능이 있는데, 그 중 하나는 혈액 응고 제8인자와 결합하여 이것을 안정화시키는 캐리어 단백질로서의 기능이고, 다른 하나는 상해 혈관벽의 혈관 내피 세포하의 조직에 혈소판을 점착_·응집시켜, 혈소판 혈전을 형성시키는 기능이다.

제8인자/본 빌리브란트 복합체 중에서 혈액응고 활성을 가진 부분을 인자 VIII 혈액응고 단백질, VIII 응고 활성 또는 단순히 VIII:C 인자라 하고, 본 빌리브란트 결핍증에 있어서 혈소판 기능의 결함을 보정하는 활성을 가진 다른 부분을 인자 VIII관련 항원, VIII:Ag, VIII:RP인자, vWF라 한다. 이 복합체는 비공유결합으로 형성되며, 적당한 조건에서는 각각의 독립된 특성을 가진 두 가지 단백질로 나누어질 수 있다.

FVIII/VWF 제품은 FVIII만 고순도로 정제한 산물 보다 A형 혈우병 환자에게서 면역원성(Immunogenicity) 발생 빈도가 낮다는 연구 결과가 최근 임상 SIPPET 연구에서 밝혀지고 있다.

VIII:C 인자에 기인하는 혈액응고 활성의 의약적 가치와, VIII:C/vWF 복합체, VIII:C 인자 및 vWF의 구조를 확인하기 위해, VIII:C 인자와 vWF를 분리 정제하고 그를 농축하려는 많은 시도가 있어 왔다. 이때 사용된 기술은 일반적으로 면역흡착(immunoadsorption)이나 이온교환 크로마토그래피에 근거하고 있는데, 이러한 기술들은 전하를 띤 이온성 물질로부터 단백질의 활성에 영향 없이 목적 단백질을 탈리시키거나 동일 활성을 가진 상태로 단백질을 회수하기가 곤란하다는 문제점을 갖고 있어, 산업적으로 적용되지 못하고 있는 실정이다.

투덴햄(Tuddenham) 등은 면역흡착 크로마토그래피를 사용하여 vWF로부터 VIII:C 인자를 분리하는 방법을 보고하였다(참조: E.G.D. Tuddenham et al., Journal of Laboratory Clinical Medicine, 93:40(1979)). 즉, vWF에 대한 다가 항혈청(anti-vWF)이 결합된 아가로즈비드를 충진시킨 칼럼 크로마토그래피를 이용하여, vWF와 다른 혈장 단백질들로부터 VIII:C 인자를 분리한다. VIII:C/vWF를 포함하는 혈장을 VIII:C 인자와 vWF 둘 모두를 흡착하는 칼럼에 통과시켜, 다른 원하지 않는 혈장 단백질들은 완충용액으로 세척하여 칼럼으로부터 제거하고, 원하는 VIII:C 인자는 그 후 칼슘이온으로 용출시켜 얻는다. 이 방법은 VIII:C 인자의 순도와 효율면에서 개선된 것이기는 하지만, 최종산물에는 여전히 vWF와 다른 혈장 단백질들이 포함되어 있다. 이러한 불순물들은 아가로즈비드에 결합하는 다가 항혈청을 사용했기 때문인 것으로 예측된다. 항혈청을 구성하는 대부분의 면역글로불린은 vWF에 특이적이 아니기 때문에, vWF에 특이적인 항체가 아가로즈에 결합하는 정도는 다른 종류의 항체와의 경쟁 때문에 상대적으로 적어, 최종산물에는 다른 혈장 단백들이 오염된 경우가 많다.

또한, 오스틴(Austen) 등은 아미노헥실(aminohexyl)로 치환된 아가로즈가 충진된 컬럼 크로마토그래피를 통하여, vWF와 리스토세틴 보조인자(ristocetin cofactor)로부터 VIII:C 인자를 분리하는 방법을 보고하였다(참조: D.E.G. Austen, British Journal of Haematology, 43:669(1979)). 이 방법은 인간과 돼지의 VIII:C/vWF 복합체에 대하여 보다 개선된 방법이나, 최종 산물에 불순물이 포함되는 결함을 갖고 있다.

상기 투덴햄 등과 오스틴 등의 방법들은 모두 최종 정제산물의 농도가 낮고 불순물을 다량 포함하고 있다는 단점이 있다.

나아가, 짐머만(Zimmerman) 등은 2단계 정제를 이용하여 고순도의 VIII:C 인자를 vWF로부터 고농도로 분리하는 방법을 보고하였다(참조: USP 4,361,509). 즉, 1단계는 혈장과 농축액에 포함된 VIII:C 인자의 면역 흡착 단계인데, 사용된 흡착제는 vWF에 특이적인 단일클론 항체를 아가로즈비드와 같은 적절한 매질에 결합시킨 것이다. 이때, 단일클론 항체는 생쥐 복수에서 생산된 것을 정제하여 사용한다. VIII:C/vWF를 포함하는 혈장을 전기 흡착제가 충진된 칼럼에 통과시켜 VIII:C/vWF를 먼저 흡착시킨 다음, 완충용액으로 세척하여 흡착되지 않은 단백질을 칼럼으로부터 제거하고, 칼슘을 포함하는 용액으로 처리하여 흡착된 VIII:C 인자만을 용출시킨다. vWF 부분은 매질에 결합된 항 vWF 단일클론 항체에 흡착된 채 남아 있다. 이렇게 회수된 VIII:C 인자는 순도가 높고 불순물이 거의 없지만, 의약용으로 사용하기에는 농도가 너무 묽다는 단점이 있다. 그래서, 이 공정의 제2단계는 친화성 크로마토그래피 기술을 이용하여 정제된 VIII:C 인자를 농축하는 과정이다. 제1단계에서 얻은 약 10∼20 IU(international unit)의 VIII:C 인자 함유 용액을 아미노헥실로 치환된 아가로즈가 충진된 칼럼에 주입하고, 완충용액으로 충분히 세척한 다음, 칼슘이온 함유 용액을 주입하여, 1000 unit/ml 이상의 농도를 가진 VIII:C 인자를 용출시키는데, 이는 혈장으로부터 약 160,000배 이상 농축된 것에 해당하는 양이다. 그러나 이 정제방법은 VIII:C 인자의 용출시 매질에 결합된 항 vWF 단일클론 항체(생쥐 복수에서 생산된)가 탈리됨으로 인하여, 최종 용출액에는 생쥐 유래의 단백질 즉, 항 vWF 단일클론 항체가 공존하게 되며, 이 용출액을 VIII:C 인자 요구의 사람에게 투여하기에는 적절히 못하다는 문제점을 갖고 있었다.

현재까지 제8인자/본 빌리브란트 복합체 정제 공정에 있어, 제8인자를 인위적으로 버리지 않는 이상, 40~60% 수준의 고수율을 유지하면서 본 빌리브란트 인자 함량을 원하는 대로 조절할 수 없으며, 더욱이 본 빌리브란트 인자 이외의 불순물 함량을 조절 전에 비해 낮은 수준으로 할 수 있는 공정은 보고된 바가 없다.

따라서, 불순물의 오염을 최소화시키면서, vWF 함량을 조절하여 제8인자(VIII)와 vWF이 적절한 비율로 결합된 복합체를 고농도로 분리 정제할 수 있는 새로운 정제방법의 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 혈장으로부터 제8인자(VIII)와 vWF를 분리정제하는 공정에서, 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 2회의 용출 과정 및 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 추가적인 1회의 용출 과정을 거치며 하나의 공정 내의 각 용출과정에서 용출된 용출액을 필요에 따라 원하는 비율로 혼합함으로써 vWF 함량을 조절할 수 있고, 이로부터 vWF 함량 및 제8인자(VIII)와 vWF의 함량비가 인위적으로 조절된 조성물을 고순도/고농도로 분리정제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 제8인자(FVIII)의 수율 변화없이 본 빌리브란트 인자(vWF)의 함량을 다양하게 변화시킨 제8인자/본 빌리브란트 인자(FVIII/vWF)를 포함하는 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 인체로부터 분리된 혈장시료에 대해 음이온교환 크로마토그래피를 수행하고, 제1 용출버퍼를 이용하여 1차 용출액을 수득하는 단계;

(b) 상기 1차 용출액에 대해 양이온교환 크로마토그래피를 수행하여 용출액을 수득하는 단계;

(c) 상기 (a) 단계의 음이온교환 크로마토그래피에서 1차 용출액을 용출한 컬럼에 제2 용출버퍼를 가하여 2차 용출액을 수득하는 단계; 및

(d) 상기 (b) 단계에서 수득된 양이온교환 크로마토그래피의 용출액과, (c) 단계에서 수득된 음이온교환 크로마토그래피의 2차 용출액을 혼합하는 단계;를 포함하는, 본 빌리브란트 인자(vWF)의 함량이 조절된 제8인자(FVIII) 및 본 빌리브란트 인자(vWF)를 포함하는 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 제8인자(FVIII)와 본 빌리브란트 인자(vWF)를 포함하는 조성물을 유효성분으로 포함하는 혈액 응고 장애 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 혈액 응고 장애 질환이 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 혈액 응고 장애 질환 치료방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 혈액 응고 장애 질환의 치료를 위한 의약품 제조를 위한 상기 조성물의 용도를 제공한다.

도 1은 본 발명에 따른 제8인자(FVIII) 및 본 빌리브란트 인자(vWF)를 포함하는 조성물의 제조 공정을 나타내는 순서도이다.
도 2는 본 발명에 따른 공정에서 주요 불순물인 피브리노겐, 피브로넥틴, FⅡ, FⅩ, IgA, IgM의 제거 양상을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 공정에서 각 공정단계로부터 얻은 산물들에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 공정에서 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서 단백질 분포도로, 검정색 직사각형은 컬럼 로딩 단계, 연회색 직사각형은 컬럼 세척 단계, 진회식 직사각형은 컬럼 용출 단계를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 공정의 AEX 용출액과 CEX 용출액을 혼합한 후 농축을 진행하여 얻은 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 표준 인간 혈장(lane 1)과 본 발명에 따른 3 개의 정제 산물 배치(lane 2, 3, 4)에서 vWF 다량체 패턴을 비교한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 산물의 크기 배제 크로마토그래피 결과를 280 nm에서 확인한 결과이다.

발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 혈장으로부터 제8인자(FVIII)와 본 빌리브란트 인자(vWF)를 분리정제하는 공정에서, 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 2회의 용출 과정 및 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 추가적인 1회의 용출 과정을 거치며 각 용출 과정에서 용출된 용출액을 혼합하면 음이온 교환 크로마토그래피 과정에서 손실된 본 빌리브란트 인자(vWF)의 손실을 보상할 수 있고 본 빌리브란트 인자(vWF) 함량을 조절할 수 있으며, 이로부터 본 빌리브란트 인자(vWF) 함량이 조절된 제8인자(FVIII)와 본 빌리브란트 인자(vWF)의 복합체를 고순도/고농도로 분리/정제할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일관점에서 본 빌리브란트 인자(vWF)의 함량이 조절된 제8인자(FVIII) 및 본 빌리브란트 인자(vWF)를 포함하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 제조방법은,

(d) 상기 (b) 단계에서 수득된 양이온교환 크로마토그래피의 용출액과, (c) 단계에서 수득된 음이온교환 크로마토그래피의 2차 용출액을 혼합하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명에서의 상기 인체로부터 분리된 혈장시료는, (i) 인체로부터 분리된 혈장시료를 동결 후 침전물을 용해한 다음 냉침전물을 형성시켜 제거하는 단계; 및 (ii) 상기 (i) 단계의 생성물에 계면활성제를 처리하여 살균하는 단계;를 포함하는 방법으로 수득될 수 있다.

본 발명에서는 인체로부터 분리된 혈장시료로부터 제8인자(FVIII) 및 본 빌리브란트 인자(vWF)를 정제할 수 있으며, 상기 동결된 혈장 침전물에 존재하는 제8인자(FVIII) 및 본 빌리브란트 인자(vWF)를 추출하기 위해, 상기 동결된 혈장 침전물을 용해하는 단계에서는 동결된 혈장 침전물을 추출액에 넣어, 200~300rpm으로 교반하며, 23~27℃의 온도에서 3~5시간 동안 동결된 혈장 침전물을 용해 시킨 후 사용할 수 있다.

본 발명에서는 동결된 혈장 침전물을 헤파린: 1.5±0.5 IU/cryopaste kg(녹십자, 헤파린산 나트륨, Cat. No. 50-1341-7), 에탄올: 1±0.5%/cryopaste kg (한국알콜, Cat. No. 40000533), 주사용수: 3 L/cryopaste kg을 포함하는 추출액에 넣어 용해시켰으나, 이는 당업계에서 일반적으로 사용하는 추출액으로 대체하여 사용할 수 있으며, 동결되지 않은 혈장을 사용하는 경우 침전물을 용해하는 단계는 이에 부합하게 변형되어 실시될 수 있다.

FⅡ, FⅦ, FⅨ, FⅩ 등의 비타민 K 의존적인 단백질(vitamin K dependent proteins)를 제거하기 위해, 상기와 같이 용해된 침전물 용해액은 수산화알루미늄 겔을 첨가하여 냉침전물을 형성시키는데, 구체적으로는 용해된 침전물 용해액을 22~28 ℃에서 5~10분 동안 200~300rpm으로 교반하고, pH를 6.1~6.6으로 조정한 후, 약 30분~1시간 30분에 걸쳐 서서히 용해액의 온도를 10~14 ℃가 되도록 떨어뜨려 냉침전물을 형성시킨다. 상기 수산화알루미늄 겔은 동결된 혈장 침전물 1kg 당 1~3% 수산화 알루미늄 겔 현탁액의 제형으로 150~250g 첨가하는 것이 바람직하나, 이는 혈장 침전물의 상태에 따라 적절히 가감할 수 있다.

수산화알루미늄 겔 및 불순물을 제거하기 위해, 이후 원심분리기의 회전속도를 3000 rpm 이상으로 하고, 온도를 10~14℃로 유지하며 원심분리기에 냉침전완료액을 5~7 L/분의 속도로 투입하여 원심분리하고, 원심분리된 액은 청정 여과하여 수집한다.

상기 (i) 단계의 생성물에 계면활성제를 처리하여 살균하게 되는데, 이 때 사용될 수 있는 용매 및 계면활성제는 바이러스, 특히 지질외피바이러스를 불활성화시킬 수 있는 특성을 가진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용 가능하다. 계면활성제는 비이온성 및 이온성 계면활성제로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 실질적으로 비변성인 것이 바람직하다. 특히, 제거의 용이성 측면에서, 비이온성 계면활성제가 바람직하며, 용매는 미국등록특허 제4,764,369호에 개시된 바와 같이 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP: Tri-n-butyl phosphate)가 가장 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명을 수행하는 데 특히 바람직한 바이러스-비활성화제는 TNBP 및 폴리소르베이트 80(트윈(Tween) 80), 트리톤 X-100 및 트리톤 X-45 중에서 선택되는 하나 이상인 것의 혼합물이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직한 계면활성제 혼합물은 상기 청정여과된 용액 중 TNBP 농도가 0.2 내지 0.6 중량% 범위 이내, 구체적으로는 0.24 내지 0.36 중량%가 되도록 첨가되며, 폴리소르베이트 80의 농도는 0.6 내지 1.5중량% 범위 이내, 구체적으로는 0.8 내지 1.2중량%의 농도가 되도록 첨가한다.

상기 계면활성제 혼합물은 지질외피바이러스를 비활성화시켜, 실질적으로 바이러스 위험성이 없는 용액을 생성시키는 조건 하에서 수행된다. 상기 조건에서 반응온도는 구체적으로는 4 내지 30℃, 더 구체적으로는 19 내지 28℃, 가장 구체적으로는 26 내지 27℃이며, 반응시간은 구체적으로는 1 내지 24시간, 더 구체적으로는 4 내지 12시간, 가장 구체적으로는 약 5~7시간이며, 계면활성제 혼합물은 40~80rpm으로 서서히 교반하며 처리하는 것이 바람직하다.

상기 (a) 단계의 음이온 교환 크로마토그래피에서는, 음이온 교환 수지로 토요펄 DEAE 650M 수지(Toyopearl DEAE 650M resin)을 사용하였으며, 상기 계면활성제 처리된 용액의 Na⁺ 농도가 120~150 mmol/L가 되도록, Na⁺조정액을 첨가한 후, pH를 6.8~7.2로 조절하고, 80~120cm/hour 유속으로 컬럼에 투입하여 수지에 흡착시켰다. 이후, 재평형 완충액을 80~120cm/hour 유속으로 컬럼 부피의 4~6배 투입하여 재평형을 실시한 후, 제1 용출버퍼를 80~120cm/hour 유속으로 컬럼 부피의 4~6배 투입하여 1차 용출액을 용출하였다. 상기 제1 용출버퍼는 150~170mM NaCl, 8~12mM Na-citrate·H₂O, 100~140mM 글리신(Glycine), 0.5~1.5mM CaCl_2·2H₂0를 포함하고, pH는 구체적으로 6.6~7.4, 더욱 구체적으로 pH 6.8~7.2, 가장 구체적으로 pH 6.9~7.1가 되도록 조절하여 사용할 수 있다.

상기 (b) 단계의 양이온 교환 크로마토그래피에서는, 양이온 교환 수지로 SP sepharose 수지를 사용하였으며, 상기 1차 용출액을 180~200cm/hour 유속으로 컬럼에 투입하여 수지에 흡착시키고, 상기 1차 용출액이 흡착된 컬럼에 용출버퍼를 230~270cm/hour 유속으로 컬럼 부피의 4~6배 투입하여 용출액을 용출하였다. 상기 양이온교환 크로마토그래피로부터 용출액을 용출하기 위한 용출버퍼는 380~420mM NaCl, 8~12mM Na-citrate·H₂O, 100~140mM 글리신(Glycine), 0.5~1.5mM CaCl_2·2H₂0를 포함하고 있으며, pH는 구체적으로는 6.0~7.0, 더욱 구체적으로는 pH 6.3~6.7, 가장 구체적으로는 pH 6.4~6.6이 되도록 조절하여 사용할 수 있다.

이후, (c) 단계에서는, 1차 용출액을 용출한 컬럼에 제2 용출버퍼를 30~60cm/hour 유속으로 컬럼 부피의 2~4배 가하여 2차 용출액을 용출할 수 있다. 상기 제2 용출버퍼는 230~270mM NaCl, 8~12mM Na-citrate·H₂O, 100~140mM 글리신(Glycine), 0.5~1.5mM CaCl_2·2H₂0를 포함하고 있으며, pH는 구체적으로는 6.6~7.4, 더욱 구체적으로는 pH 6.8~7.2, 가장 구체적으로는 pH 6.9~7.1가 되도록 조절하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계와 (c) 단계의 순서는 동시에 실시할 수 있거나, 또는 서로 적절히 변경하여 실시할 수 있다. 한편, 상기 (a) 단계의 음이온교환 크로마토그래피의 용출액은 제8인자와 vWF의 혼합물을 포함하고, 상기 (b) 단계의 양이온교환 크로마토그래피의 용출액은 vWF를 포함하며, 제8인자는 0.01 wt% 이하로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 (b) 단계의 양이온 교환크로마토그래피의 용출액과 (c) 단계의 음이온교환 크로마토그래피의 2차 용출액은 9 : 1 내지 1 : 9의 부피비로 혼합되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 음이온 교환 수지는 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 사차암모니움(Quaternary ammonium)기들로 치환된 것들을 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로는 강염기성의 사차암모니움기를 가지는 그룹이나 또는 약염기성의 디에틸아미노에틸(DEAE) 그룹을 가지는 음이온 교환수지 중에서 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다.

예를 들면, 강염기성의 음이온교환 수지로는 Q 세파로오스 패스트 플로우(Sepharose Fast Flow), Q 세파로오스 하이 퍼포먼스(Sepharose High Performance), 리소스 Q(Resource Q), 소스15Q(Source 15Q), 소스 30Q(Source 30Q), 모노 Q(Mono Q), 미니 Q(Mini Q), 캡토 Q(Capto Q), 캡토 Q ImpRes(Capto Q ImpRes), Q 하이퍼셀(Q HyperCel), Q세르믹하이퍼D F(Q CermicHyperD F), 누비아Q(Nuvia Q), UNOsphere Q, 마크로-프렙 하이 A(Macro-Prep High Q), 마크로-프렙25 Q(Macro-Prep 25 Q), 프락토겔EMD TMAE(S)(Fractogel EMD TMAE(S)), 프락토겔 EMD TMAE Hicap (M), 프락토겔 EMD TMAE (M), Eshmono Q, 토요펄 QAE-550C(Toyopearl QAE-550C), 토요펄 SuperQ-650C, 토요펄 GigaCap Q-650M, 토요펄 Q-600C AR, 토요펄 SuperQ-650M, 토요펄 SuperQ-650S,TSKgel SuperQ-5PW(30), TSKgel SuperQ-5PW (20), TSKgel SuperQ-5PW 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 당업계에 공지된 강염기성 음이온교환 수지를 사용할 수 있다. 또한, 예를 들면, 약염기성의 음이온교환 수지로는, 토요펄 DEAE(Toyopearl DEAE), DEAE 세파로오스 패스트 플로우(Sepharose fast flow), Eshmono Q, 프락토겔 EMD DEAE 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업계에 공지된 약염기성 음이온 교환 수지를 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 음이온교환 크로마토그래피는, 토요펄 DEAE(Toyopearl DEAE), Q 세파로오스 패스트 플로우(Sepharose Fast Flow), DEAE 세파로오스 패스트 플로우, 모노 Q(Mono Q), 캡토 Q(Capto Q), 프락토겔 EMD TMAE(M), Eshmono Q, 토요펄GigaCap Q-650M 및 프락토겔 EMD DEAE로 구성된 군에서 선택된 음이온 교환 수지를 이용하여 수행될 수 있다.

음이온교환 크로마토그래피에 사용되는 수지의 적절한 부피는 컬럼 치수, 즉, 컬럼의 직경과 수지의 높이에 의해 반영되고, 예컨대, 적용되는 용액의 면역글로불린 용액양과 사용되는 수지의 결합 성능에 따라 달라진다. 음이온교환 크로마토그래피를 수행하기 전에, 음이온교환 수지는 구체적으로는 완충액으로 평형화시켜, 수지가 그의 짝 이온과 결합할 수 있도록 한다.

본 발명에서는, 음이온 교환 수지로 토요펄 DEAE 650M(Toyopearl DEAE 650M) 수지를 사용하였으며, 컬럼 완충액으로는 인산나트륨 완충액, 구연산 완충액, 아세트산 완충액 등 당업계에 공지된 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer), 세척버퍼(wash buffer) 및 용출버퍼(elution buffer)를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 양이온교환 수지는 세파덱스(Sephardex), 세파로즈(Sepharose) 하이퍼셀(HyperCell) 또는 소스(Source), SP 세파로오스(SP sepharose), SP 세파로오스 패스트 플로우, 프락토겔 EMD SO3 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 다른 당업계에 공지된 양이온교환 수지를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 양이온교환 수지로 SP 세파로오스 수지를 사용하였다. 한편, 컬럼 완충액으로는 인산나트륨 완충액, 구연산 완충액, 아세트산 완충액 등 당업계에 공지된 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer), 세척버퍼(wash buffer) 및 용출버퍼(elution buffer)를 사용할 수 있다.

본 발명의 (d) 단계에서는, (b) 단계에서 수득된 양이온교환 크로마토그래피의 용출액과, (c) 단계에서 수득된 음이온교환 크로마토그래피의 2차 용출액을 혼합하는데, 제8인자(FVIII)와 본 빌리브란트 인자(vWF)의 역가가 1: 0.6~1.4, 구체적으로 1:1이 되도록 혼합한다. 이 경우, 1차 용출액, 2차 용출액 내의 제8인자(FVIII)와 본 빌리브란트 인자(vWF)의 역가 및 용출액(양이온교환 크로마토그래피를 수행한 후에 수득된 용출액) 내의 본 빌리브란트 인자(vWF)의 역가를 측정하여 혼합 정도를 결정한다.

본 발명에서 상기 (d) 단계 이후에, (e) 제8인자(FVIII)의 농도가 125U/mL 이상이 되도록 혼합액을 농축하는 단계; 및 (f) 상기 (c) 단계에서 수득된 2차 용출액을 첨가하여 제8인자(FVIII)와 본 빌리브란트 인자(vWF)의 역가를 추가로 조절하는 단계;를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 (e)단계에서는 상기 혼합물을 농축한 후, 미세여과를 진행하는데, 본 발명에서는 아세트산 셀룰로오스(Cellulose acetate) 재질의 멤브레인 컷 오프 사이즈(membrane cut off size) 100kDa 멤브레인을 이용하여 농축하였다. 본 발명에 있어서, 상기 농축에 의해 제8인자(FVIII)의 농도는 125 IU/mL 이상이 되도록 농축하는 것이 바람직하다.

상기 (f) 단계에서는 상기 (c) 단계에서 수득된 2차 용출액을 첨가하여 제8인자(FVIII)와 본 빌리브란트 인자(vWF)의 역가를 추가로 조절 할 수 있다. 이 때, 첨가되는 2차 용출액의 양에 따라 제8인자(FVIII)와 본 빌리브란트 인자(vWF)의 역가가 조절된다.

상기 제8인자(FVIII)와 본 빌리브란트 인자(vWF)의 역가를 조절한 후에는 제형 완충액을 첨가하여 제형화하였는데, 제형 완충액은 8.9~9.1 mg/mL 글리신, 2.8~3.2 mg/mL Na-citrate·2H₂O, 0.1~0.2 mg/mL CaCl₂·2H₂O, 20~30 mg/mL 수크로오스(Sucrose), 1.0~1.5mg/mL 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80)을 포함하여 구성될 수 있다.

한편, 본 발명의 각 단계에서는 적절히 미세여과를 실시하여 제8인자(FVIII)와 본 빌리브란트 인자(vWF)가 고순도로 정제될 수 있도록 하였다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 제조방법에 의해 제조된 제8인자(FVIII)와 본 빌리브란트 인자(vWF)를 포함하는 조성물을 유효성분으로 포함하는 혈액 응고 장애 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 상기 제8인자(FVIII)와 본 빌리브란트 인자(vWF)의 역가는 1: 0.2~3.0, 바람직하게는 1: 0.6~2.8인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 혈액 응고 장애 질환은 혈우병 A 또는 본 빌리브란트 결핍증인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 본 발명의 조성물에 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다. 상기 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 조성물은 통상의 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 혈액 응고 장애 질환이 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 혈액 응고 장애 질환 치료방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택가능하다. 또한, 상기 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명은 또한, 혈액 응고 장애 질환의 치료를 위한 의약품 제조를 위한 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 제8인자/본 빌리브란트 인자(FVIII/vWF) 복합체 정제 공정

1-1. 침전물 용해

혈장이 동결된 크라이오 침전물을 추출액 (Heparin: 1.5±0.5 IU/cryopaste kg(녹십자, 헤파린산 나트륨, Cat. No. 50-1341-7), 에탄올: 1±0.5%/cryopaste kg (한국알콜), 및 주사용수: 3 L/cryopaste kg)에 넣어 250rpm으로 교반하며, 25±1℃에서 크라이오 침전물을 투입한 시간으로부터 4시간 동안 용해시킨 후 pH를 7.1±0.1로 조정하였다.

1-2. 냉침전 / 원심분리

침전물 용해액에 2% 수산화알루미늄 겔 [Al(OH)₃ Gel, Brenntag, Cat. No. A1090S] 현탁액 200 g/cryopaste kg을 첨가하고 24~26℃에서 5~10분 동안 250rpm으로 교반하였다. pH를 6.3~6.4로 조정한 후, 60분 동안 서서히 액온을 10~13℃가 되도록 떨어뜨려 냉 침전물을 형성시켰다. 원심분리기(GEA, BKB45)의 회전속도를 5,400rpm로 맞춘 후, 온도를 10~14℃로 유지하며 원심분리기에 냉침전완료액을 5~7 L/분의 속도로 투입하여 원심분리를 진행하고, 원심분리된 액을 2.0/1.2 ㎛ 필터(Merck Millipore, polysep II)를 통해 청정 여과하여 수집하였다.

1-3. S/D(Solvent/Detergent: 용매/계면활성제) 전처리

청정여과가 완료된 액의 온도를 26~27℃로 조정하고 pH를 6.9~7.1로 조정하였다. pH가 조정된 액을 350 rpm으로 돌리면서 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP : Tri-n-butyl phosphate)(Merck Millipore, Cat. No. 1.00002)를 0.3±0.06%, polysorbate 80(J.T.Baker, Cat. No. 4117)을 1.0±0.2%가 되도록 불활화 액을 20~60분간 투입하고 30분간 추가 교반한 후, 추가 교반이 완료된 액을 0.45/0.2 ㎛ 필터(Sartorius, Sartobran P)를 통해 미세 여과하여 수집하였다.

1-4. S/D(Solvent/Detergent) 처리

S/D 전처리 완료액을 40~80 rpm으로 천천히 교반하며, 26~27℃에서 5~7시간 동안 불활화히였다.

1-5. 음이온 교환 크로마토그래피 공정

Toyopearl DEAE 650M 수지(Tosoh, Cat. No. 0007974)를 컬럼에 23±2 cm 높이가 되도록 팩킹하였다. S/D 처리 완료액의 Na⁺ 농도가 135±13.5 mmol/L가 되도록 Na⁺ 조정액을 첨가한 후, pH를 6.9~7.1로 조정하였다. pH가 조정된 액을 청정 여과한 후, 컬럼에 투입하여 100 cm/hour 유속으로 흡착을 실시하였다. 흡착 이후, 재평형 완충액(120 mM NaCl, 10 mM Na-citrate·2H₂O, 120 mM Glycine, pH 7.0 ± 0.1)을 100 cm/hour 유속으로 4~6CV 만큼 흘려, 재평형을 실시하였다. 재평형 이후, 제1 용출버퍼(160 mM NaCl, 10 mM Na-citrate·2H₂O, 120 mM Glycine, 1 mM CaCl_2·2H₂O, pH 7.0 ± 0.1)을 100 cm/hour 유속으로 4~6 CV 만큼 흘려, 1차 용출을 실시하였다. 1차 용출 이후, 제2 용출버퍼(250 mM NaCl, 10 mM Na-citrate·2H₂O, 120 mM Glycine, 1 mM CaCl_2·2H₂O, pH 7.0 ± 0.1)을 45 cm/hour 유속으로 3 CV 만큼 흘려, 2차 용출을 실시하였다.

1-6. 양이온 교환 크로마토그래피 공정

SP sepharose 수지(GE, Cat. No. 17-0729)를 컬럼에 17±1.7 cm 높이가 되도록 팩킹하였다. 음이온 교환 크로마토그래피로부터 수집된 1차 용출액을 0.45/0.2 um 필터(Sartorius, Sartobran P)로 미세 여과하여 수집하였다. 미세 여과가 완료된 액을 컬럼에 투입하여 200 cm/hour 유속으로 흡착을 실시하였다. 흡착 후, 세척 완충액(260 mM NaCl, 10 mM Na-citrate·2H₂O, 120 mM Glycine, 1 mM CaCl₂·2H₂O, pH 6.5 ± 0.1)을 사용하여 250 cm/hour 유속으로 5 CV 만큼 흘려, 세척을 실시하였다. 세척 후, 용출 완충액(400 mM NaCl, 10 mM Na-citrate·2H₂O, 120 mM Glycine, 1 mM CaCl₂·2H₂O, pH: 6.5 ± 0.1)을 사용하여 250 cm/hour 유속으로 5 CV 만큼 흘려, 용출을 실시하였다. 수집된 용출액(3차 용출액)에 용출액 부피의 0.6배에 해당하는 양의 CEX 평형 버퍼(10 mM Na-citrate·2H₂O, 120 mM Glycine, 1 mM CaCl₂·2H₂O, pH 6.5 ± 0.1)를 섞어 주었다.

1-7. FVIII의 활성 역가 분석

1-7-1. 표준품 준비

표준품(NIBSC, 혈액 응고 인자 VIII:C 농축물, human(07/350) 또는 이와 동등 수준의 표준품)은 1.0 IU/mL가 되도록 FVIII 결핍 혈청(FVIII deficient plasma)(Siemens, Cat. No. OTXW100)로 희석한 후, 알부민이 1%로 첨가된 CA 시스템 버퍼(CA System buffer)(Siemens, Cat. No. B4265-35)로 5, 10, 20, 및 40배 희석하였다.

1-7-2. 시료 준비

각 시료는 FVIII 결핍 혈청(FVIII deficient plasma)(Siemens, Cat. No. OTXW100)로 제8인자(Factor VIII) 1.0 IU/mL가 되도록 희석한 후, 알부민이 1%로 첨가된 CA 시스템 버퍼(CA System buffer)로 16, 18, 20 및 22배 희석하였다.

1-7-3. 역가 측정

aPTT(Activated partial thromboplastin time)분석을 위해 코어큘로미터(coagulometer) (Merlin medical, MC10 Plus)를 이용하여 표준품 및 시료의 응고(clotting) 되는데 걸린 시간을 구하였다.

시료의 clotting 되는데 걸린 측정 시간과 표준품의 측정 시간 대비 %가 출력되면 아래 계산식을 통해 시료의 역가 값을 구하였다.

계산식) 시료의 역가 값 (IU/mL)

=시료 측정 결과 (%) x 희석배수 x 0.002 (보정계수) x 표준품 역가 (IU/mL)

1-8. vWF 첨가

수집된 음이온 교환 크로마토그래피 2차 용출액과 희석된 양이온 교환 크로마토그래피 용출액(3차 용출액)에 대해 공정검사를 진행하고, FVIII과 vWF 총 역가의 비율이 1:1이 되도록 혼합된 액을 0.45/0.2 um 필터(Sartorius, Sartobran P)로 미세 여과하여 수집하였다.

1-9. 농축 및 미세여과

아세트산 셀룰로오스(Cellulose acetate) 재질의 멤브레인 컷 오프 사이즈(membrane cut off size) 100kDa 멤브레인(Sartorius, Hydrosart)을 이용하여 vWF 첨가액의 FVIII 농도가 125 IU/mL 이상이 되도록 농축하였다. 농축된 액을 0.45/0.2 um 필터(Sartorius, Sartobran P)로 미세 여과하여 수집하고 이를 원획분으로 하였다.

1-10. 역가조정

음이온 교환 크로마토그래피 제2 용출버퍼(250mM NaCl, 10 mM Na-citrate·2H₂O, 120 mM Glycine, 1 mM CaCl₂·2H₂O, pH 7.0 ± 0.1)을 첨가하여 FVIII 역가를 125 IU/mL로 조정하였다

1-11. 제형화

제형 완충액(8.97 mg/mL Glycine, 2.936 mg/mL Na-citrate·2H₂O, 0.16 mg/mL CaCl₂·2H₂O, 25.0 mg/mL Sucrose, 1.25 mg/mL Polysorbate 80)을 첨가하여 역가를 100 IU/mL, Na⁺ 농도를 200±50 mM로 조정하였다.

1-12. 제균여과

0.45/0.2 um 필터(Sartorius, Sartobran P)로 제균 여과하여 수집된 여액을 최종원액으로 하며 충전 전까지 냉장 보관하였다.

전체 공정을 요약하면 하기 표 1과 같다.

실시예 2: 정제 공정에서 주요 불순물에 대한 제거 양상 확인

상기 공정의 각 단계에서 주요 불순물인 피브리노겐, 피브로넥틴, FⅡ, FⅩ, IgA, IgM의 제거 양상을 확인하였다.

피브리노겐, 피브로넥틴, FⅡ, FⅩ, IgA, IgM의 제거 양상확인은 모두 ELISA 법으로 진행하였다. 세부적인 실험방법은 다음과 같다.

피브리노겐 함량시험은 상용화 된 Human Fibrinogen ELISA 키트(제조사 Assaypro, Cat. No. EF1040-1)을 사용하여 해당 키트 제조사에서 제공하는 매뉴얼(manual)에 따라 시험하였다.

피브로넥틴 함량시험은 상용화 된 Human Fibronectin ELISA 키트 (제조사 Assaypro, Cat. No. EF1045-1)을 사용하여 해당 키트 제조사에서 제공하는 매뉴얼에 따라 시험하였다.

FII 함량시험은 상용화 된 Human prothrombin ELISA 키트 (제조사 Assaypro, Cat. No. EP3023-1)을 사용하여 해당 kit 제조사에서 제공하는 매뉴얼에 따라 시험하였다.

FX 함량시험은 상용화 된 Human Fibrinogen ELISA kit (제조사 Assaypro, Cat. No. EF1010-1)을 사용하여 해당 키트 제조사에서 제공하는 매뉴얼에 따라 시험하였다.

IgA 함량시험은 상용화 된 Human IgA ELISA Quantitation Set (제조사 Bethyl, Cat. No. E80-102) 및 ELISA Starter Accessory Kit(제조사 Bethyl, Cat. No. E101)을 사용하여 해당 키트 제조사에서 제공하는 매뉴얼에 따라 시험하였다.

IgM 함량시험은 상용화 된 Human IgM ELISA Quantitation Set(제조사 Bethyl, Cat. No. E80-102) 및 및 ELISA Starter Accessory Kit(제조사 Bethyl, Cat. No. E101)을 사용하여 해당 키트 제조사에서 제공하는 매뉴얼에 따라 시험하였다.

그 결과, 피브리노겐은 냉침전 및 원심분리 공정까지 90.6%, AEX 공정까지 99.9% 이상의 제거율을 보였고, 피브로넥틴은 냉침전 및 원심분리 공정까지 95.9%, AEX 공정까지 99.9% 이상 제거되었다. 즉, 피브리노겐과 피브로넥틴은 주로 냉침전 및 원심분리 공정을 통해 제거됨을 확인하였다. 또한, FⅡ와 FⅩ는 냉침전 및 원심분리 공정까지 각각 97.4%, 97.3% 제거되었다. 이후 AEX 공정에서는 FⅡ는 93.6%, FⅩ은 85.1%가 각각 제거되었다. 용해 공정부터 AEX 공정까지 FⅡ는 99.8%, FⅩ은 99.6%가 제거되었으며, 대다수의 FⅡ와 FⅩ 모두 냉침전 및 원심분리 공정에서 제거됨을 확인하였다. 한편, IgA와 IgM은 상기 네 종류의 불순물과는 달리, AEX 공정에서 가장 많이 제거되었다. 냉침전 및 원심분리 공정까지의 제거율이 IgA는 18.9%, IgM은 55.6%로 다른 불순물에 비해 상대적으로 낮았으나, AEX 공정까지 거치면 각각 99.9%, 99.2%까지 제거되었다. 즉, IgA와 IgM은 주로 AEX 공정을 통해 제거됨을 확인하였다. CEX Load액에 포함된 피브리노겐과 피브로넥틴, FⅩ은 CEX 공정을 통해 99.9% 이상 제거되었다. IgA와 IgM은 각각 95.6%, 97.4% 제거되었으며, FⅡ는 87.7%의 제거율로 다른 불순물에 비해 낮은 제거율을 나타내었다(도 2).

상기 분석을 통해, 주요 불순물인 피브리노겐, 피브로넥틴, FⅡ, FⅩ은 냉침전 및 원심분리 공정에서의 제거가, IgA와 IgM은 AEX 공정에서의 제거가 품질에 중요한 공정임을 확인하였다. 또한, AEX 1차 용출액에 잔존하는 일부 불순물은 CEX 공정을 통해서 제거됨을 확인하였으며, 본 발명의 공정에 따른 불순물 잔존량은 하기 표 2와 같이 확인되었다. 하기 표에서 볼 수 있듯이, 정제 산물의 안전성에 영향을 줄 수 잇는 불순물의 수준이 기존 제품들과 비교하여 동등 이상임을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 공정단계별 공정 산물의 SDS-PAGE[비환원 조건(non-reducing condition)] 분석

각 공정단계로부터 얻어진 산물들에 대한 SDS-PAGE 분석을 진행하였다. 3~8% Tris-acetate gel에 각 시료를 7.5 ug/well이 되도록 non-reducing loading buffer에 희석하여 loading 한 후, 100 V에서 90분간 전기영동을 진행하였다.

그 결과, AEX 컬럼 공정을 거치면서 70 kDa 이하의 불순물과 230~270 kDa의 불순물이 제거됨을 확인하였다. CEX 컬럼 공정이 460 kDa 이상의 multimeric vWF만을 고순도로 정제하는데 효율적임을 확인하였다(도 3).

실시예 4: 음이온 교환 크로마토그래피 공정단계에서의 vWF 손실

FVIII 정제에 사용된 AEX 공정에서 각 단계의 중간체를 분석하였다. 그 결과, 도 4에서와 같이 AEX 컬럼에 투입한 샘플(load sample)은 FVIII(IU) 함량에 비해 2배가 넘은 vWF(IU) 함량을 가지고 있었으나, 최종 용출액에서는 FVIII(IU) 함량에 비해 vWF(IU) 함량이 0.4배에 불과한 것으로 나타나, 많은 양의 vWF가 AEX 세척 단계에서 손실되는 것을 알 수 있었다(도 4).

실시예 5: 음이온 교환 크로마토그래피 공정단계에서의 FVIII 역가 회수율 분석

AEX 공정단계에서 FVIII의 역가 회수율을 확인하였다. 3개의 배치 분석 결과, 하기 표 3에서 볼 수 있듯이, AEX 공정에서 FVIII 역가 회수율은 85% 수준이었으며, 컬럼 공정에서 버려지는 미흡착액 및 세척액의 FVIII 은 load 대비 약 15% 수준이었다.

실시예 6: 양이온 교환 크로마토그래피 융출액 첨가에 따른 특성 분석

6-1. vWF 손실의 회복

AEX 용출액과 CEX 용출액을 혼합하여 농축한 후, 4~12 % Bis-Tris gel에 각 시료를 동량으로 각각 환원 로딩 버퍼(reducing loading buffer) 및 비-환원 로딩 버퍼(non-reducing loading buffer)에 희석하여 로딩(loading)하고, 120 V에서 90 분간 전기영동을 진행한 결과, vWF 비율이 향상된 산물을 획득할 수 있음을 확인하였다(도 5).

CEX 용출액을 AEX 용출액에 혼합하는 경우, AEX 공정에 의해 정제된 vWF:Rco/FVIII:OS의 비율에 비해, vWF:Rco/FVIII:OS의 비율이 높아졌으며(표 4), 이로부터 혼합 전에 비해 혼합 후 vWF 함량이 2배 이상 증가하였음을 알 수 있었다.

한편, CEX 용출액 혼합 전후의 FVIII (IU) 에 대한 불순물의 함량은 변화가 없는 것으로 나타났는데, 이는 CEX 과정에서 효과적으로 불순물이 제거되었기 때문으로 판단된다. 한편, CEX 용출액 혼합 전후의 FVIII 활성을 비교한 결과, 혼합 후 FVIII의 활성은 혼합 전과 유사하거나 혼합 전에 비해 오히려 증가하는 것을 알 수 있었다(표 4).

6-2. 최종 산물의 특성 분석

최종 산물의 특성에 대해 3개의 배치에서 정밀분석한 결과는 표 5에서와 같으며, vWF:Rco/FVIII:OS 비율과 vWF:Rco/FVIII:CS 비율에서 차이가 없었다. 따라서, 혈우병 A 제품을 위해 FVIII 함량을 조정하여 충전하는 최종 산물은 FVIII:OS 활성 분석이 이용되거나 FVIII:CS 활성 분석이 이용되는 경우 모두 용이할 것임을 알 수 있었다. 원재료(cryoprecipitate)로부터 유래한 불순물 및 헤파린, 알루미늄과 같이 공정 관련 불순물의 잔존 함량은 모두 매우 낮은 값으로 측정되었다.

한편, vWF:Rco/vWF:Ag 비율은 약 0.9로 나타나, 최종 산물이 고분자량의 다량체(HMWM)를 형성함으로써 혈소판 응집을 촉진시키는데 매우 효과적일 수 있음을 예상할 수 있다. HMWM은 점막 출혈의 치료에 매우 효과적인 것으로 알려져 있으며, 효과적인 VWD 치료를 위한 농축액의 vWF:Rco/vWF:Ag 비율은 0.7 이상으로 알려져 있다.

vWF 다량체 패턴은 풍부한 고분자량의 다량체를 함유하는 정상 혈장과 유사한 것으로 나타났다(도 6). 이는 저비율 vWF:Rco/FVIII:C에 정제된 vWF를 첨가하는 경우, 고분자량 vWF 다량체를 함유하는 산물을 생산할 수 있음을 의미한다.

FVIII가 vWF와 복합체를 형성하는지 여부를 크기 배제 크로마토그래피로 분석해 본 결과, 4 개의 주요 피크가 확인되었는데(도 7), 각 피크를 분획하고 각 분획의 FVIII 및 vWF 활성을 분석하자, 670 kDa 이상의 피크 1에서 vWF 활성 뿐만 아니라 FVIII 활성을 나타내는 것을 확인하였고, 그 밖의 작은 크기를 나타내는 3개의 피크에서는 vWF 활성과 FVIII 활성이 모두 확인되지 않았다. FVIII의 크기가 약 270 kDa이라는 점을 고려하면, 대부분의 FVIII는 vWF와 결합하여 안정적인 복합체 형태로 존재함을 알 수 있었다.

실시예 7: FVIII 및 vWF의 혼합비율을 조정한 산물의 정제

실시예 1의 AEX 용출액에는 농축된 FVIII와 vWF가 함께 존재하고, CEX 용출액에는 vWF가 존재한다(도 3, Lane 5 및 Lane 9 참조). 이 경우, AEX 용출액과 CEX 용출액의 혼합 비율에 따라 FVIII와 vWF의 비율이 조정 가능하다. 하기 표 6은 AEX 용출액과 CEX 용출액의 혼합 비율에 따라 FVIII와 vWF의 비율을 조정한 것으로, 혼합 비율을 조정하여도 FVIII의 역가 단위 당 주요 불순물의 함량은 차이가 거의 없는 것으로 나타났다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명에 따르면, 제8인자(FVIII)의 단독 정제 산물에 비하여, i) 본 빌리브란트 인자(vWF) 이외의 불순물 양을 거의 증가시키지 않고, ii) 제8인자(FVIII)의 단독 정제 공정에 비해 공정 시간도 크게 증가시키지 않으면서(3시간 이내), iii) 제8인자(FVIII) 수율의 감소 없이, 본 빌리브란트 인자(vWF)의 함량을 다양하게 변화시킨 제8인자(FVIII)및 본 빌리브란트 인자(vWF)를 포함하는 조성물을 제조할 수 있는 효과가 있다.

Claims

다음 단계를 포함하는 본 빌리브란트 인자(vWF)의 함량이 조절된 제8인자(FVIII)와 본 빌리브란트 인자(vWF)를 포함하는 조성물의 제조방법:
(a) 인체로부터 분리된 혈장시료에 대해 음이온교환 크로마토그래피를 수행하고, 제1 용출버퍼를 이용하여 1차 용출액을 수득하는 단계;
(b) 상기 1차 용출액에 대해 양이온교환 크로마토그래피를 수행하여 용출액을 수득하는 단계;
(c) 상기 (a) 단계의 음이온교환 크로마토그래피에서 1차 용출액을 용출한 컬럼에 제2 용출버퍼를 가하여 2차 용출액을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 (b) 단계에서 수득된 양이온교환 크로마토그래피의 용출액과, (c) 단계에서 수득된 음이온교환 크로마토그래피의 2차 용출액을 혼합하는 단계,
여기서,
상기 제1 용출버퍼는 140~170mM NaCl, 8~12mM Na-citrate·H₂O, 100~140mM 글리신(Glycine), 0.5~1.5mM CaCl₂·2H₂O을 포함하고, pH가 6.8~7.2이며,
상기 (b) 단계의 용출액은 380~420mM NaCl, 8~12mM Na-citrate·H₂O, 100~140mM 글리신(Glycine), 0.5~1.5mM CaCl₂·2H₂O를 포함하고, pH가 6.3~6.7이며,
상기 제2 용출버퍼는 230~270mM NaCl, 8~12mM Na-citrate·H₂O, 100~140mM 글리신(Glycine), 0.5~1.5mM CaCl₂·2H₂O를 포함하고, pH가 6.8~7.2인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 음이온교환 크로마토그래피의 1차 용출액은 제8인자와 vWF의 혼합물을 포함하고,
상기 (b) 단계의 양이온교환 크로마토그래피의 용출액은 vWF를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계의 양이온 교환크로마토그래피의 용출액과 (c) 단계의 음이온교환 크로마토그래피의 2차 용출액은 9 : 1 내지 1 : 9의 부피비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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제1항에 있어서,
상기 제1 용출버퍼는 80~120 cm/hour 유속으로 컬럼 부피의 4~6배를 가하여 1차 용출액을 수득하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 제2 용출버퍼는 30~60 cm/hour 유속으로 컬럼 부피의 2~4배를 가하여 2차 용출액을 수득하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서의 음이온교환 크로마토그래피는, 토요펄 DEAE(Toyopearl DEAE), Q 세파로오스 패스트 플로우(Sepharose Fast Flow), DEAE 세파로오스 패스트 플로우, 모노 Q(Mono Q), 캡토 Q(Capto Q), 프락토겔 EMD TMAE(M), Eshmono Q, 토요펄GigaCap Q-650M 및 프락토겔 EMD DEAE로 구성된 군에서 선택된 음이온 교환 수지를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계의 용출액은 230~270cm/hour 유속으로 컬럼 부피의 4~6배의 용출버퍼를 가하여 수득하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서의 양이온교환 크로마토그래피는 SP 세파로오스(sepharose), SP 세파로오스 패스트 플로우 및 프락토겔 EMD SO3로 구성된 군에서 선택된 양이온 교환 수지를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 인체로부터 분리된 혈장시료는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수득되는 것을 특징으로 하는 제조방법:
(i) 인체로부터 분리된 혈장시료를 동결 후 침전물을 용해한 다음 냉침전물을 형성시켜 제거하는 단계; 및
(ii) 상기 (i) 단계의 생성물에 계면활성제를 처리하여 살균하는 단계.
제12항에 있어서, 상기 (a) 단계는 계면활성제가 처리된 용액의 Na⁺ 농도가 120~150 mmol/L가 되도록 Na⁺ 조정액을 첨가한 후, pH를 6.8~7.2로 조절하고, 80~120cm/hour 유속으로 컬럼에 투입하여 흡착시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 (a) 단계는 흡착 이후 재평형 완충액을 80~120cm/hour 유속으로 컬럼부피의 4~6배 투입하여 재평형을 실시하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 재평형 완충액은 80~120mM NaCl, 8~12mM Na-citrate·H₂O, 100~140mM 글리신(Glycine)을 포함하고, pH가 6.8~7.2인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, (d) 단계는 제8인자(FVIII)와 본 빌리브란트 인자(vWF)의 역가가 1: 0.6~1.4(IU/mL)가 되도록 (c) 단계에서 수득된 2차 용출액과 (b) 단계에서 수득된 용출액을 혼합하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (d) 단계 이후에 하기 단계를 추가적으로 포함하는 제조방법:
(e) 혼합액을 농축하는 단계; 및
(f) 상기 (c) 단계에서 수득된 2차 용출액을 첨가하여 제8인자(FVIII)와 본 빌리브란트 인자(vWF)의 역가를 추가로 조절하는 단계.
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