KR20130031262A - 고순도 가용성 트롬보모듈린 및 그 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 가용성 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 숙주 세포로 트랜스펙트하여 얻어진 형질 전환 세포에 의해 생성되는 가용성 트롬보모듈린으로서, 숙주 세포 유래 단백질의 함유율이 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율인 고순도 가용성 트롬보모듈린에 관한 것이다.

Description

고순도 가용성 트롬보모듈린 및 그 제조 방법{HIGH-PURITY SOLUBLE THROMBOMODULIN AND METHOD FOR PRODUCING SAME}
본 발명은 고순도 가용성 트롬보모듈린 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
트롬보모듈린은, 트롬빈과 특이적으로 결합하여 트롬빈의 혈액 응고 활성을 저해하는 동시에 트롬빈의 프로테인 C 활성화능을 현저히 촉진하는 작용을 갖는 물질로서 알려져, 강력한 혈액 응고 저해 작용을 갖는 것이 알려져 있다. 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 것이나, 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 것이 알려져 있다. 프로테인 C는, 혈액 응고 선용계에 있어서 중요한 역할을 하고 있는 비타민 K 의존성의 단백질이며, 트롬빈의 작용에 의해 활성화되어, 활성화 프로테인 C가 된다. 이 활성화 프로테인 C는, 생체내에서 혈액 응고계 인자의 활성형 제V 인자, 및 활성형 제VIII 인자를 실활시키고, 또 혈전 용해 작용을 갖는 플러스미노겐 액티베이터의 생성에 관여하고 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1). 따라서, 트롬보모듈린은, 이 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하여 항혈액 응고제 또는 혈전 용해제로서 유용하다고 알려져 있고, 응고 항진을 수반하는 질환의 치료, 예방에 유효하다고 하는 동물 실험에 관한 보고도 있다(비특허문헌 2).
종래, 트롬보모듈린은, 인간을 비롯한 여러가지 동물종의 혈관 내피 세포상에 발현하고 있는 당단백질로서 발견 취득되어, 그 후 클로닝에 성공했다. 즉, 유전자 공학적 방법을 이용하여 인간 폐 cDNA 라이브러리로부터 시그널 펩티드를 포함하는 인간 트롬보모듈린 전구체의 유전자를 클로닝하고, 그리고 트롬보모듈린의 전체 유전자 서열을 해석하여, 시그널 펩티드(통상은 18 아미노산 잔기가 예시됨)를 포함하는 575 잔기의 아미노산 서열이 밝혀져 있다(특허문헌 1). 시그널 펩티드가 절단된 성숙한 트롬보모듈린은, 그 성숙한 펩티드의 N 말단측으로부터 N 말단 영역(1-226번째 : 시그널 펩티드가 18 아미노산 잔기라고 생각한 경우의 위치 표시, 이하 동일), 6개의 EGF형 구조를 갖는 영역(227-462번째), O형 당쇄 부가 영역(463-498번째), 막관통 영역(499-521번째), 그리고 세포질내 영역(522-557번째)의 5개의 영역으로 구성되어 있고, 그리고 전체 길이의 트롬보모듈린과 동일한 활성을 갖는 부분(즉, 최소 활성 단위)으로서는, 6개의 EGF형 구조를 갖는 영역 중, 주로는 N 말단측으로부터 4, 5, 6번째의 EGF형 구조로 이루어진 부분인 것이 알려져 있다(비특허문헌 3).
전체 길이의 트롬보모듈린은 계면활성제의 존재하가 아니면 용해되기 어려워, 제제로서는 계면활성제의 첨가가 필수인 데 대해, 계면활성제의 비존재하에서도 깨끗하게 용해될 수 있는 가용성 트롬보모듈린이 존재한다. 가용성 트롬보모듈린은, 적어도, 막관통 영역의 일부 또는 전부를 함유시키지 않도록 조제하면 되고, 예컨대, N 말단 영역과 6개의 EGF형 구조를 갖는 영역과 O형 당쇄 부가 영역의 3개의 영역만으로 이루어진(즉, 서열번호 1의 제19～516위의 아미노산 서열로 이루어진) 가용성 트롬보모듈린은, 재조합 기술의 응용에 의해 취득할 수 있는 것, 그리고 그 재조합체 가용성 트롬보모듈린은, 천연의 트롬보모듈린의 활성을 갖고 있는 것이 확인되어 있다(특허문헌 1). 그 밖에 가용성 트롬보모듈린의 예로서 몇개의 보고가 있다(특허문헌 2～9). 또는 천연형으로서 인간뇨 유래의 가용성 트롬보모듈린 등도 예시된다(특허문헌 10, 11).
덧붙여, 유전자에 있어서는, 자연의 변이 또는 취득시의 변이에 의해, 많은 케이스에서 보이는 바와 같이, 인간에 있어서도 다형성의 변이가 발견되고 있고, 전술한 575 잔기의 아미노산 서열로 이루어진 인간 트롬보모듈린 전구체의 제473위의 아미노산에 있어서 Val인 것과, Ala인 것이 현재 확인되어 있다. 이 아미노산을 코드하는 염기 서열에 있어서는, 제1418위에 있어서, 각각 T와 C의 변이에 해당한다(비특허문헌 4). 그러나, 활성 및 물성에 있어서는 전혀 차이가 없고, 양자는 실질적으로 동일하다고 판단할 수 있다.
트롬보모듈린은 DIC의 치료에 있어서 효과가 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 5, 6). 트롬보모듈린의 용도로는 전술한 것 외에, 예컨대, 급성 관동맥 증후군(ACS), 혈전증, 말초 혈관 폐색증, 폐색성 동맥 경화증, 혈관염, 심장 수술에 속발하는 기능성 장애, 장기 이식의 합병증, 협심증, 일과성 뇌허혈 발작, 임신 중독증, 당뇨병, 간 VOD(Liver veno-occlusive disease; 극증 간염이나 골수 이식후의 간정맥 폐색증), 심부 정맥 혈전증(DVT; Deep venous thrombosis) 등이나, 나아가 성인 호흡 궁박 증후군(ARDS; Adult respiratory distress syndrome)의 질환의 치료 및 예방에 이용되는 것이 기대되고 있다.
의약품에의 이용을 고려하는 전제로서, 가용성 트롬보모듈린을, 대량으로, 그리고 보다 저렴하게 제조할 필요가 있는 것은 물론이지만, 제조 공정에서 유래하는 이종 단백질, 예컨대, 숙주 세포 유래의 단백질, 배지 유래의 소혈청 단백질, 항체 컬럼 유래의 마우스 IgG 등이 면역원성이 되어, 안전성의 면에서 문제가 될 가능성이 지적되고 있다(비특허문헌 7).
의약품에의 이용을 고려하여, 공업 레벨로 가용성 트롬보모듈린을 제조하는 방법으로는, 예컨대 주정제 공정으로서 트롬보모듈린에 대한 항체를 담지시킨 어피니티 컬럼 크로마토그래피를 이용하는 방법, 또한 어피니티 컬럼 크로마토그래피에 의해 얻어진 상기 가용성 트롬보모듈린을, 비전도도 25～34 ms/cm, pH 3～4의 조건하에, 양이온 교환체와 접촉시키는 공정에 있어서, 통과 획분으로서 상기 가용성 트롬보모듈린을 취득하는 것을 특징으로 하는 혈청 유래물 및 항체 유래물을 실질적으로 함유하지 않는 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조 방법이 알려져 있다(특허문헌 12). 또, 주정제 공정의 어피니티 컬럼 크로마토그래피 공정의 후에 강음이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 조합한 정제 방법이 알려져 있다(특허문헌 13).
특허문헌 1 : 일본 특허공개 소64-6219호 공보 특허문헌 2 : 일본 특허공개 평2-255699호 공보 특허문헌 3 : 일본 특허공개 평3-133380호 공보 특허문헌 4 : 일본 특허공개 평3-259084호 공보 특허문헌 5 : 일본 특허공개 평4-210700호 공보 특허문헌 6 : 일본 특허공개 평5-213998호 공보 특허문헌 7 : WO92/00325호 공보 특허문헌 8 : WO92/03149호 공보 특허문헌 9 : WO93/15755호 공보 특허문헌 10 : 일본 특허공개 평3-86900호 공보 특허문헌 11 : 일본 특허공개 평3-218399호 공보 특허문헌 12 : 일본 특허공개 평11-341990호 공보 특허문헌 13 : WO2008/117735호 공보
비특허문헌 1 : 스즈키코지, 이가쿠노아유미, 제125권, 901페이지(1983년) 비특허문헌 2 : K. Gomi 외 Blood 75. 1396-1399(1990) 비특허문헌 3 : M. Zushi 외, J. Biol. Chem., 246, 10351-10353(1989) 비특허문헌 4 : D. Z. Wen 외, Biochemistry, 26, 4350-4357(1987) 비특허문헌 5 : S. M. Bates 외, Br. J. Pharmacol., 144, 1017-1028(2005) 비특허문헌 6 : H. Saito 외, J. Thromb Haemost, 5(1), 31(2007) 비특허문헌 7 : 하야카와타카오, 바이오의약품의 개발과 품질ㆍ안전성 확보, 273-274(2007)
본 발명의 과제는, 숙주 세포 유래 단백질의 농도가 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율인 고순도 가용성 트롬보모듈린 및 그 제조 방법을 제공하는 것에 있다.
특허문헌 13에는, 정제된 가용성 트롬보모듈린이 기재되어 있다. 특히, 상기 문헌의 실시예 14에는, 숙주 유래의 단백질(이하, 본 명세서에 있어서 「HCP」로 약칭하는 경우가 있음)의 농도가 「N.D.」(명기는 되어 있지 않지만 「검출되지 않음」을 의미하는 것으로 생각됨)로 기재된 가용성 트롬보모듈린이 개시되어 있다. 상기 기재를 본 당업자는, HCP의 혼입이 저감된 고순도 가용성 트롬보모듈린은 충분히 달성되어 있어, 이제는 가용성 트롬보모듈린 중의 HCP를 저감하려고는 생각하지 않는, 즉 가용성 트롬보모듈린 중의 HCP의 혼입을 저감하고자 하는 동기 등은 작용하지 않는 것이 통상이다.
그러나, 본 발명자들은 정제된 가용성 트롬보모듈린을 의약품으로서 이용하는 경우, HCP가 혼입되어 있으면 그것이 아나필락시 쇼크 등의 예기치 않은 사태를 야기하여, 경우에 따라서는 죽음에 이르는 리스크가 있는 것을 큰 문제점으로서 강하게 인식했다. 따라서, 본 발명자들은, 상기 특허문헌 13의 실시예 14에 「N.D.」로 기재되어 있기 때문에 충분히 HCP의 혼입이 저감되어 있다고 당업자라면 통상 생각할 것인 가운데, 상기 특허문헌 13의 실시예 14에 기재된 정제된 가용성 트롬보모듈린의 HCP 농도를 측정한 바, 정량 한계이기는 하지만 혼입되는 HCP 농도가 가용성 트롬보모듈린 10,000 U(후술하는 참고예 1에 기재된 바와 같이, 특별히 언급하지 않는 한 「U」는 프로테인 C 활성화를 촉진하는 작용(이하, APC 활성으로 약칭하는 경우가 있음)을 나타내는 단위를 의미한다. 이하에 있어서도 동일하다.)에 대하여 70～80 ng 미만이라는 비율을 나타내고, HCP의 저감에 관해서는 아직 개선의 여지가 있을 가능성이 있는 것을 본 발명자들은 처음으로 확인했다. 상기 HCP 농도에 관해서는, 특허문헌 13에는 개시가 없는 농축 공정이라는 새로운 공정을 HCP 측정에 있어서 채택함으로써, 농도를 정확하게 측정할 수 있다고 본 발명자들은 독자적으로 생각하고 있다.
상기 사실을 처음으로 발견한 본 발명자들은, 가용성 트롬보모듈린을 의약품으로서 보다 안전하게 이용하는 것을 생각하여, 가용성 트롬보모듈린 중의 HCP 함량을 더욱 저감시킨 정제된 트롬보모듈린을 취득하여, 아나필락시 쇼크의 리스크를 최소한으로 한다고 하는 신규 과제를 발견했다.
본 발명자들은, HCP의 혼입이 더욱 저감된 고순도 가용성 트롬보모듈린을 공업 레벨로 제조하기 위해, 새로운 컬럼 크로마토그래피 공정의 도입을 검토했다. 즉, 가장 HCP 제거 효과가 높다고 하는 어피니티 컬럼 크로마토그래피에 복수의 컬럼 크로마토그래피를 조합함으로써 HCP의 저감을 시도했지만, 컬럼 크로마토그래피 공정의 추가는 제조 시간이 증가하는 것 뿐만 아니라, 가용성 트롬보모듈린의 수율을 저하시킨다고 하는 문제가 발생했다. 또, 어피니티 컬럼 크로마토그래피에 복수의 컬럼 크로마토그래피를 조합하더라도, HCP 농도가 종래 이상으로 더욱 저감된 고순도 가용성 트롬보모듈린을 취득할 수 없었다. 또한, 컬럼 크로마토그래피는, pH 나 이온 강도 등이 약간 변화했을 뿐으로, HCP와 가용성 트롬보모듈린의 분리가 변화하여, 기대하는 결과가 재현되지 않는다고 하는 문제점도 있어, 고순도 가용성 트롬보모듈린을 취득하는 것은 곤란하였다.
따라서 본 발명자들은, 컬럼 크로마토그래피보다 조작이 간편하고, 가용성 트롬보모듈린의 수율을 저하시키지 않고, 공업 레벨로 HCP를 효율적으로 제거하여, HCP의 혼입이 더욱 저감된 고순도 가용성 트롬보모듈린을 취득하는 방법을 발견하기 위해 예의 검토한 결과, 나일론 및/또는 폴리에테르술폰, 그 중에서도 나일론을 이용함으로써 HCP 농도가 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만인 고순도 가용성 트롬보모듈린을 취득한다고 하는 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성했다.
즉 본 발명으로는 이하의 것을 들 수 있다.
〔1〕가용성 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 숙주 세포로 트랜스펙트하여 얻어진 형질 전환 세포에 의해 생성되는 가용성 트롬보모듈린으로서, 상기 숙주 세포 유래 단백질의 함유율이, 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율인 고순도 가용성 트롬보모듈린.
〔1-2〕고순도 가용성 트롬보모듈린이 총단백질 중 순도 99% 이상인 상기 〔1〕에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린.
〔1-3〕고순도 가용성 트롬보모듈린이 수용액의 형태인 상기 〔1〕 또는 〔1-2〕에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린.
〔1-4〕고순도 가용성 트롬보모듈린 수용액 중의 가용성 트롬보모듈린 농도가 8 ㎎/㎖ 이상의 농도인 상기 〔1-3〕에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린.
〔2〕가용성 트롬보모듈린이 상기 형질 전환 세포를 무혈청 배양에 의해 생성되는 트롬보모듈린인 상기 〔1〕～〔1-4〕 중 어느 하나에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린.
또한, 상기 〔1〕～〔1-4〕와 같이 인용하는 항번호가 범위로 표시되며, 그 범위내에 〔1-2〕 등의 지(枝)번호를 갖는 항이 배치되어 있는 경우에는, 〔1-2〕 등의 지번호를 갖는 항도 인용되는 것을 의미한다. 이하에 있어서도 동일하다.
〔2-2〕상기 숙주 세포 유래 단백질의 함유율을 측정할 때, 이하의 공정을 적어도 포함하는 방법으로 측정함으로써, 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 숙주 세포 유래 단백질 농도인 것을 확인하는 상기 〔1〕～〔2〕 중 어느 하나에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린;
(a) 가용성 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 숙주 세포로 트랜스펙트하여 얻어진 형질 전환 세포, 또는 그 숙주 세포 중의 어느 것을 무혈청 배양하여 얻어지는 배양 상청으로부터 숙주 세포 유래 단백질을 조제하는 공정,
(b) 상기 (a)의 상기 숙주 세포 유래 단백질을 토끼에게 감작하여 얻어지는 항혈청으로부터 항숙주 세포 유래 단백질 항체를 정제하는 공정,
(c1) 상기 (b)의 상기 항숙주 세포 유래 단백질 항체를 고상에 흡착시키는 공정,
(c2-1) 상기 항숙주 세포 유래 단백질 항체를 흡착시킨 상기 고상에, 상기 숙주 세포 유래 단백질의 혼입이 의심되는 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액을 접촉시키는 공정, 및 상기 항숙주 세포 유래 단백질 항체를 흡착시킨 상기 고상에 농도가 이미 알려진 숙주 세포 유래 단백질 함유 용액을 접촉시키는 공정,
(c3) 상기 고상에 비오틴화한 항숙주 세포 유래 단백질 항체를 첨가하는 공정,
(c4) 상기 고상에 아비딘화한 퍼옥시다아제 용액을 첨가하는 공정,
(c5) 효소 기질 용액을 첨가하고 발색시키는 공정, 및
(c6) 발색을 정지하고 그 흡광도를 측정하는 공정
을 포함하는 측정계를 구축하는 공정,
(d) 상기 측정계로 상기 숙주 세포 유래 단백질의 혼입이 의심되는 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액의 숙주 세포 유래 단백질 농도를 측정하고, 상기 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액의 숙주 세포 유래 단백질 농도가, 상기 측정계로 농도가 이미 알려진 숙주 세포 유래 단백질 함유 용액을 이용하여 측정함으로써 미리 확인한 상기 측정계에서의 정량 가능 범위에 들어가는지의 여부를 판단하는 공정,
(e-1) 상기 (d)에 있어서, 상기 숙주 세포 유래 단백질의 혼입이 의심되는 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액 중의 숙주 세포 유래 단백질 농도가 정량 가능 범위에 들어가는 경우, 상기 농도를 상기 숙주 세포 유래 단백질 농도로 하는 공정,
(e-2-1) 상기 (d)에 있어서, 상기 숙주 세포 유래 단백질의 혼입이 의심되는 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액 중의 숙주 세포 유래 단백질 농도가 정량 가능 범위에 들어가지 않는 경우, 상기 측정계에서의 정량 가능 범위에 들어가는 측정 가능한 농도로 하기 위해 필요에 따라서 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액을 농축 또는 희석하고, 그 농축률 또는 희석률을 기록하는 공정,
(e-2-2) 상기 (e-2-1)에 있어서 농축 또는 희석한 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액 중의 숙주 세포 유래 단백질 농도를, 상기 (c1)～(c6)으로 표시되는 측정계 중 (c2-1)을 이하에 나타내는 (c2-2)로 치환한 측정계로 측정하고, 농축률 또는 희석률을 고려하여 상기 숙주 세포 유래 단백질 농도를 구하는 공정,
(c2-2) 상기 항숙주 세포 유래 단백질 항체를 흡착시킨 상기 고상에, 필요에 따라서 농축 또는 희석한 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액을 접촉시키는 공정, 및 상기 항숙주 세포 유래 단백질 항체를 흡착시킨 상기 고상에 농도가 이미 알려진 숙주 세포 유래 단백질 함유 용액을 접촉시키는 공정, 및
(f) 별도 측정한 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액 단위 체적당의 트롬보모듈린의 APC 활성에 대한 (e-1) 또는 (e-2-2)에서 구한 숙주 세포 유래 단백질 농도의 비율을 산출하는 공정.
〔2-3〕상기 〔2-2〕(a)에서의 숙주 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포 DXB11 주인 상기 〔2-2〕에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린.
〔3〕상기 숙주 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포인 상기 〔1〕～〔2-3〕 중 어느 하나에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린.
〔4〕상기 가용성 트롬보모듈린이, 하기의 (1)～(5)의 성질을 갖는 가용성 트롬보모듈린인 상기 〔1〕～〔3〕 중 어느 하나에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린;
(1) 트롬빈과 선택적으로 결합하는 작용,
(2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용,
(3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용,
(4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용, 및
(5) 항염증 작용.
〔4-2〕상기 가용성 트롬보모듈린이, 하기의 (1)～(4)의 성질을 갖는 가용성 트롬보모듈린인 상기 〔1〕～〔3〕 중 어느 하나에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린;
(1) 트롬빈과 선택적으로 결합하는 작용,
(2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용,
(3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용, 및
(4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용.
〔5〕상기 가용성 트롬보모듈린의 분자량이 50,000～80,000인 상기 〔1〕～〔4-2〕 중 어느 하나에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린.
〔6〕상기 고순도 가용성 트롬보모듈린이 이하의 공정을 포함하는 방법에 의해 제조되는 상기 〔1〕～〔5〕 중 어느 하나에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린;
(a) 가용성 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 숙주 세포로 트랜스펙트하여 형질 전환 세포를 취득하는 공정,
(b) 상기 형질 전환 세포를 배양하여 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 취득하는 공정, 및
(c) 상기 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시켜, 숙주 세포 유래 단백질의 함유율이 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율인 고순도 가용성 트롬보모듈린을 얻는 공정.
〔7〕상기 가용성 트롬보모듈린이,
(i) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제367～480위의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 하기 (ii-1) 또는 (ii-2) 중의 어느 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로서, 상기 펩티드가 하기의 (1)～(5)의 성질을 갖는 가용성 트롬보모듈린인 상기 〔1〕～〔6〕 중 어느 하나에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린;
(ii-1) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제19～244위의 아미노산 서열, 또는
(ii-2) 상기 (ii-1)의 아미노산 서열의 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열,
(1) 트롬빈과 선택적으로 결합하는 작용,
(2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용,
(3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용,
(4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용, 및
(5) 항염증 작용.
〔7-2〕상기 가용성 트롬보모듈린이,
(i) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제367～480위의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 하기 (ii-1) 또는 (ii-2) 중의 어느 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로서, 상기 펩티드가 하기의 (1)～(4)의 성질을 갖는 가용성 트롬보모듈린인 상기 〔1〕～〔6〕 중 어느 하나에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린;
(ii-1) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제19～244위의 아미노산 서열, 또는
(ii-2) 상기 (ii-1)의 아미노산 서열의 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열,
(1) 트롬빈과 선택적으로 결합하는 작용,
(2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용,
(3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용, 및
(4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용.
〔7-3〕상기 가용성 트롬보모듈린이,
하기 (i-1) 또는 (i-2) 중의 어느 아미노산 서열을 포함하고, 또한 하기 (ii-1) 또는 (ii-2) 중의 어느 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로서, 상기 펩티드가 하기의 (1)～(5)의 성질을 갖는 가용성 트롬보모듈린인 상기 〔1〕～〔6〕 중 어느 하나에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린;
(i-1) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제367～480위의 아미노산 서열, 또는
(i-2) 상기 (i-1)의 아미노산 서열의 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열,
(ii-1) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제19～244위의 아미노산 서열, 또는
(ii-2) 상기 (ii-1)의 아미노산 서열의 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열,
(1) 트롬빈과 선택적으로 결합하는 작용,
(2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용,
(3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용,
(4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용, 및
(5) 항염증 작용.
〔8〕상기 가용성 트롬보모듈린이,
(i-1) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제19～516위의 아미노산 서열, 또는
(i-2) 상기 (i-1)의 아미노산 서열의 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 중의 어느 아미노산 서열을 갖는 펩티드로서, 상기 펩티드가 하기의 (1)～(5)의 성질을 갖는 가용성 트롬보모듈린인 상기 〔1〕～〔6〕 중 어느 하나에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린;
(1) 트롬빈과 선택적으로 결합하는 작용,
(2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용,
(3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용,
(4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용, 및
(5) 항염증 작용.
〔9〕상기 가용성 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA가, 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 DNA인 상기 〔1〕～〔6〕 중 어느 하나에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린.
〔10〕상기 〔1〕～〔9〕 중 어느 하나에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린 및 약학상 허용되는 담체를 함유하는 의약 조성물.
〔11〕숙주 세포 유래 단백질의 함유율이 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율인 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조 방법으로서, 가용성 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 숙주 세포로 트랜스펙트하여 얻어진 형질 전환 세포가 생성되는 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시키는 공정을 포함하는 제조 방법.
〔12〕가용성 트롬보모듈린을 상기 형질 전환 세포를 무혈청 배양함으로써 생성하는 상기 〔11〕에 기재된 제조 방법.
〔13〕상기 가용성 트롬보모듈린이, 하기의 (1)～(5)의 성질을 갖는 가용성 트롬보모듈린인 상기 〔11〕 또는 〔12〕에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조 방법;
(1) 트롬빈과 선택적으로 결합하는 작용,
(2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용,
(3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용,
(4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용, 및
(5) 항염증 작용.
〔14〕상기 숙주 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포인 상기 〔11〕～〔13〕 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
〔15〕상기 가용성 트롬보모듈린의 분자량이 50,000～80,000인 상기 〔11〕～〔14〕 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
〔16〕상기 가용성 트롬보모듈린이,
(i) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제367～480위의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 하기 (ii-1) 또는 (ii-2) 중의 어느 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로서, 상기 펩티드가 하기의 (1)～(5)의 성질을 갖는 가용성 트롬보모듈린인 상기 〔11〕～〔15〕 중 어느 하나에 기재된 제조 방법;
(ii-1) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제19～244위의 아미노산 서열, 또는
(ii-2) 상기 (ii-1)의 아미노산 서열의 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열,
(1) 트롬빈과 선택적으로 결합하는 작용,
(2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용,
(3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용,
(4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용, 및
(5) 항염증 작용.
〔17〕상기 가용성 트롬보모듈린이,
(i-1) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제19～516위의 아미노산 서열, 또는
(i-2) 상기 (i-1)의 아미노산 서열의 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 중의 어느 아미노산 서열을 갖는 펩티드로서, 상기 펩티드가 하기의 (1)～(5)의 성질을 갖는 가용성 트롬보모듈린인 상기 〔11〕～〔15〕 중 어느 하나에 기재된 제조 방법;
(1) 트롬빈과 선택적으로 결합하는 작용,
(2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용,
(3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용,
(4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용, 및
(5) 항염증 작용.
〔18〕상기 가용성 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA가, 서열번호 9 또는 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 DNA인 상기 〔11〕～〔15〕 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
〔19〕나일론 및/또는 폴리에테르술폰의 형태가 여과막의 형태인 상기 〔11〕～〔18〕 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
〔20〕여과막의 막면적이 숙주 세포 유래 단백질 1 ㎎에 대하여 0.01～0.5 ㎡인 상기 〔19〕에 기재된 제조 방법.
〔21〕나일론 및/또는 폴리에테르술폰이 나일론인 상기 〔11〕～〔20〕 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
〔22〕상기 〔11〕～〔20〕에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조 방법으로서, 〔1-2〕～〔1～4〕,〔2-2〕,〔2-3〕,〔7-2〕 또는〔7-3〕 중 어느 하나에 기재된 특징을 갖는 제조 방법.
〔23〕숙주 세포 유래 단백질의 함유율이 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율인 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조 방법으로서,
(a) 서열번호 9 또는 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 숙주 세포로 트랜스펙트하여 형질 전환 세포를 취득하는 공정,
(b) 상기 형질 전환 세포를 배양하여 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 취득하는 공정,
(c) 상기 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 총단백질 중 트롬보모듈린 순도 99% 이상으로 정제하는 공정, 및
(d) 상기 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 나일론에 접촉시켜, 숙주 세포 유래 단백질의 함유율이 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율인 고순도 가용성 트롬보모듈린을 단리하는 공정
을 포함하는 제조 방법으로서, 상기 숙주 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포인 상기 〔11〕～〔22〕 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
〔24〕상기 〔23〕에 기재된 방법에 의해 제조되는 고순도 가용성 트롬보모듈린.
〔25〕가용성 트롬보모듈린 중의 숙주 세포 유래 단백질을 제거하는 방법으로서, 가용성 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 숙주 세포로 트랜스펙트하여 얻어진 형질 전환 세포가 생성되는 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시키는 공정을 포함하는 방법.
〔26〕가용성 트롬보모듈린 중의 숙주 세포 유래 단백질을 제거하는 방법으로서, (a) 서열번호 9 또는 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 숙주 세포로 트랜스펙트하여 형질 전환 세포를 취득하는 공정,
(b) 상기 형질 전환 세포를 배양하여 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 취득하는 공정,
(c) 상기 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 총단백질 중 트롬보모듈린 순도 99% 이상으로 정제하는 공정, 및
(d) 상기 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 나일론에 접촉시키는 공정을 포함하는 방법으로서, 상기 숙주 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포인 상기 〔25〕에 기재된 방법.
〔27〕상기 〔25〕에 기재된 가용성 트롬보모듈린 중의 숙주 세포 유래 단백질을 제거하는 방법으로서, 상기 〔1〕～〔9〕 중 어느 하나에 기재된 특징을 갖는 방법.
본 발명의 제조 방법을 이용함으로써, 숙주 세포 유래 단백질의 함유율이 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율인 숙주 세포 유래 단백질의 혼입이 저감된 고순도 가용성 트롬보모듈린을 취득할 수 있다. 이로써, 의약품으로서 가용성 트롬보모듈린을 이용할 때의 아나필락시 쇼크의 리스크를 더욱 저감시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 몇개의 바람직한 양태(본 발명을 실시하기 위한 바람직한 형태 : 이하, 본 명세서에서 「실시형태」라고 약칭하는 경우가 있음)에 관해 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 하기에 설명하는 특정한 양태에 한정되지는 않는다.
본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린은 의약 원료로서 이용할 수 있다. 본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린을 다른 약학상 허용되는 담체와 조합하여 의약품으로서 사용할 수도 있다.
또, 본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린은, 가용성 트롬보모듈린 이외의 물질을 실질적으로 포함하지 않는, 고순도의 가용성 트롬보모듈린 함유 의약 조성물로서 사용할 수 있다. 본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린을 다른 약학상 허용되는 담체와 조합한 의약 조성물로서 사용할 수도 있다.
이하, 고순도 가용성 트롬보모듈린의 의약 원료를 포함하여 고순도 트롬보모듈린이라고 부르는 경우가 있다. 또, 가용성 트롬보모듈린 이외의 물질을 실질적으로 포함하지 않는 고순도 가용성 트롬보모듈린 함유 의약 조성물을 포함하여 고순도 가용성 트롬보모듈린이라고 부르는 경우가 있다.
본 실시형태에서의 트롬보모듈린은, (1) 트롬빈과 선택적으로 결합하여 (2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용을 갖는 것이 알려져 있다. 또, (3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용, (4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용, 및/또는 (5) 항염증 작용이 통상 보이는 것이 바람직하다. 이들 트롬보모듈린이 갖는 작용을 트롬보모듈린 활성이라고 부르는 경우가 있다.
트롬보모듈린 활성으로는, 상기 (1) 및 (2)의 작용을 가지며, 또한 상기 (1)～(4)의 작용을 갖고 있는 것이 바람직하다. 또, 트롬보모듈린 활성으로는, (1)～(5)의 작용을 모두 구비하고 있는 것이 보다 바람직하다.
트롬보모듈린의 트롬빈과의 결합 작용은, 예컨대, Thrombosis and Haemostasis 1993 70(3) : 418-422를 비롯한 각종 공지문헌에 기재된 시험 방법에 의해 확인할 수 있다. 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용은, 예컨대, 일본 특허공개 소64-6219호 공보를 비롯한 각종 공지문헌에 명확하게 기재된 시험 방법에 의해 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용의 활성량이나 그 유무를 용이하게 확인할 수 있는 것이다. 또, 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용, 및/또는 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용에 관해서도 마찬가지로 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 항염증 작용에 관해서도, 예컨대 blood 2008 112 : 3361-3670, The Journal of Clinical Investigation 2005 115 5 : 1267-1274를 비롯한 각종 공지문헌에 기재된 시험 방법에 의해 확인할 수 있다.
가용성 트롬보모듈린으로는, 계면활성제의 비존재하에서 물에 가용인 가용성 트롬보모듈린을 예로서 들 수 있다. 가용성 트롬보모듈린의 용해성의 바람직한 예시로는, 물, 예컨대 주사용 증류수에 대하여(트리톤 X-100이나 폴리도카놀 등의 계면활성제의 비존재하, 통상은 중성 부근에서), 1 ㎎/㎖ 이상 또는 10 ㎎/㎖ 이상을 들 수 있고, 바람직하게는 15 ㎎/㎖ 이상 또는 17 ㎎/㎖ 이상을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 20 ㎎/㎖ 이상, 25 ㎎/㎖ 이상 또는 30 ㎎/㎖ 이상이 예시되고, 특히 바람직하게는 60 ㎎/㎖ 이상을 들 수 있고, 경우에 따라서는, 80 ㎎/㎖ 이상 또는 100 ㎎/㎖ 이상을 각각 들 수 있다. 가용성 트롬보모듈린을 용해할 수 있었는지의 여부를 판단함에 있어서는, 용해한 후에, 예컨대 백색 광원의 바로 아래, 약 1000 룩스의 밝기의 위치에서 육안으로 관찰한 경우에, 징명하여 분명하게 보이는 정도의 불용성 물질을 포함하지 않는 것이 단적인 지표가 되는 것으로 이해된다. 또, 여과하여 잔사의 유무를 확인할 수도 있다.
가용성 트롬보모듈린은 상기에 나타낸 바와 같이, 트롬보모듈린 활성을 가지며, 가용성이라면 그 분자량은 한정되지 않지만, 분자량의 상한으로는 100,000 이하가 바람직하고, 90,000 이하가 보다 바람직하고, 80,000 이하가 더욱 바람직하고, 70,000 이하가 특히 바람직하고, 분자량의 하한으로는, 50,000 이상이 더욱 바람직하고, 60,000 이상이 특히 바람직하다. 가용성 트롬보모듈린의 분자량은, 단백질의 분자량을 측정하는 통상의 방법으로 용이하게 측정이 가능하지만, 질량 분석법으로 측정하는 것이 바람직하고, MALDI-TOF-MS법이 보다 바람직하다.
목적으로 하는 범위의 분자량의 가용성 트롬보모듈린을 취득하기 위해서는, 후술하는 바와 같이, 가용성 트롬보모듈린을 코드하는 DNA를 벡터에 의해 숙주 세포로 트랜스펙트하여 조제된 형질 전환 세포를 배양함으로써 취득되는 가용성 트롬보모듈린을 컬럼 크로마토그래피 등에 의해 분획함으로써 취득할 수 있다.
가용성 트롬보모듈린으로서는, 인간형의 트롬보모듈린에 있어서 서열번호 1의 제19～132위의 아미노산 서열, 및 서열번호 9 또는 서열번호 11의 제19～244위의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가되어 있어도 좋은 아미노산 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 상기 서열번호 1의 제19～132위의 아미노산 서열은, 트롬보모듈린 활성 중 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용에 관여하는 서열이다. 한편, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 제19～244위의 아미노산 서열은, 트롬보모듈린 활성 중 항염증 작용에 관여하는 서열이다. 가용성 트롬보모듈린이, 가용성 트롬보모듈린 전체로서 트롬보모듈린 활성을 갖는 한, 상기 서열번호 1의 제19～132위의 아미노산 서열은 자연 또는 인공적으로 변이되어 있어도 좋고, 즉 서열번호 1의 제19～132위의 아미노산 서열의 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가되어 있어도 좋다. 허용되는 변이의 정도는, 트롬보모듈린 활성을 갖는다면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 아미노산 서열로서 50% 이상의 상동성이 예시되고, 70% 이상의 상동성이 바람직하고, 80% 이상의 상동성이 보다 바람직하고, 90% 이상의 상동성이 더욱 바람직하고, 95% 이상의 상동성이 특히 바람직하고, 98% 이상의 상동성이 가장 바람직하다. 이와 같이 아미노산 서열의 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가되어 있는 아미노산 서열을 상동 변이 서열이라고 한다. 이들 변이에 관해서는 후술하는 바와 같이, 통상의 유전자 조작 기술을 이용하면 용이하게 취득 가능하다. 가용성 트롬보모듈린은 상기 서열을 가지며, 적어도 가용성 트롬보모듈린 전체로서 트롬빈과 선택적으로 결합하여 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용을 갖고 있다면 특별히 한정되지 않지만, 동시에 항염증 작용을 갖는 것이 바람직하다.
서열번호 3의 서열은, 서열번호 1의 서열의 제125위의 아미노산인 Val이 Ala로 변이된 것이지만, 본 실시형태에서의 가용성 트롬보모듈린으로서, 서열번호 3의 제19～132위의 아미노산 서열을 포함하고 있는 것도 바람직하다.
이와 같이 가용성 트롬보모듈린으로서는, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 제19～132위의 서열 또는 이들의 상동 변이 서열, 및 서열번호 9 또는 서열번호 11의 제19～244위의 서열 또는 이들의 상동 변이 서열을 적어도 가지며, 적어도 가용성 트롬보모듈린 전체로서 트롬빈과 선택적으로 결합하여 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용을 갖고 있다면 특별히 한정되지 않지만, 서열번호 1 또는 서열번호 3에서의 제19～132위 또는 제17～132위의 서열로 이루어진 펩티드 또는 상기 서열의 상동 변이 서열, 및 서열번호 9 또는 서열번호 11의 제19～244위의 서열 또는 이들의 상동 변이 서열로 이루어지고 적어도 가용성 트롬보모듈린 전체로서 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드를 바람직한 예로서 들 수 있고, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 제19～132위의 서열, 및 서열번호 9 또는 서열번호 11의 제19～244위의 서열 또는 이들의 상동 변이 서열로 이루어진 펩티드가 보다 바람직하다. 또, 서열번호 1 또는 서열번호 3에서의 제19～132위 또는 제17～132위의 상동 변이 서열, 및 서열번호 9 또는 서열번호 11의 제19～244위의 서열 또는 이들의 상동 변이 서열로 이루어지고 적어도 가용성 트롬보모듈린 전체로서 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드가 보다 바람직한 다른 양태도 있다.
가용성 트롬보모듈린은, 가용성 트롬보모듈린 전체로서 동시에 항염증 작용을 갖는 것이 바람직하다.
또, 가용성 트롬보모듈린의 다른 양태로서, 서열번호 5의 제19～480위의 아미노산 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하고, 서열번호 5의 제19～480위의 아미노산 서열을 포함하고 있다면 특별히 한정되지 않는다. 상기 서열번호 5의 제19～480위의 아미노산 서열은, 트롬보모듈린 활성을 갖는 한 그 상동 변이 서열이어도 좋다.
서열번호 7의 서열은, 서열번호 5의 서열의 제473위의 아미노산인 Val이 Ala로 변이된 것이지만, 본 실시형태에서의 가용성 트롬보모듈린으로서, 서열번호 7의 제19～480위의 아미노산 서열을 포함하고 있는 것도 바람직하다.
이와 같이, 가용성 트롬보모듈린으로서는, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 제19～480위의 서열 또는 이들의 상동 변이 서열을 적어도 가지며, 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드 서열을 포함하고 있다면 특별히 한정되지 않지만, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 각각에서의 제19～480위 또는 제17～480위의 서열로 이루어진 펩티드, 또는 상기 서열의 상동 변이 서열로 이루어지고 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드를 바람직한 예로서 들 수 있고, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 제19～480위의 서열로 이루어진 펩티드가 보다 바람직하다. 또, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 각각에서의 제19～480위 또는 제17～480위의 상동 변이 서열로 이루어지고 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드가 보다 바람직한 다른 양태도 있다.
가용성 트롬보모듈린은, 동시에 항염증 작용을 갖는 것이 바람직하다.
또 가용성 트롬보모듈린의 특히 바람직한 다른 양태로서, 서열번호 9의 제19～515위의 아미노산 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하고, 서열번호 9의 제19～515위의 아미노산 서열을 포함하고 있다면 특별히 한정되지 않는다. 상기 서열번호 9의 제19～515위의 아미노산 서열은, 트롬보모듈린 활성을 갖는 한 그 상동 변이 서열이어도 좋다.
서열번호 11의 서열은, 서열번호 9의 서열의 제473위의 아미노산인 Val이 Ala로 변이된 것이지만, 본 실시형태에서의 트롬보모듈린으로서, 서열번호 11의 제19～515위의 아미노산 서열을 포함하고 있는 것도 바람직하다.
이와 같이 가용성 트롬보모듈린으로는, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 제19～515위의 서열 또는 이들의 상동 변이 서열을 적어도 가지며, 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드 서열을 포함하고 있다면 특별히 한정되지 않지만, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 각각에서의 제19～516위, 제19～515위, 제19～514위, 제17～516위, 제17～515위 또는 제17～514위의 서열로 이루어진 펩티드, 또는 상기 서열의 상동 변이 서열로 이루어지고 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드를 보다 바람직한 예로서 들 수 있고, 서열번호 9에서의 제19～516위, 제19～515위, 제19～514위, 제17～516위, 제17～515위 또는 제17～514위의 서열로 이루어진 펩티드가 특히 바람직하다. 이들의 혼합물도 바람직한 예로서 들 수 있다. 또한, 서열번호 11의 각각에서의 제19～516위, 제19～515위, 제19～514위, 제17～516위, 제17～515위 또는 제17～514위의 서열로 이루어진 펩티드가 특히 바람직한 다른 양태도 있다. 이들의 혼합물도 바람직한 예로서 들 수 있다. 또 이들의 상동 변이 서열로 이루어지고, 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드도 바람직한 예로서 들 수 있다.
가용성 트롬보모듈린은, 동시에 항염증 작용을 갖는 것이 바람직하다.
상동 변이 서열을 갖는 펩티드란, 전술한 바와 같지만, 대상으로 하는 펩티드의 아미노산 서열 중 1개 이상, 즉 1개 또는 복수의 아미노산, 더욱 바람직하게는 여러개(예컨대 1～20개, 바람직하게는 1～10개, 보다 바람직하게는 1～5개, 특히 바람직하게는 1～3개)의 아미노산이 치환, 결실, 부가되어 있어도 좋은 펩티드도 의미한다. 허용되는 변이의 정도는, 트롬보모듈린 활성을 갖는다면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 아미노산 서열로서 50% 이상의 상동성이 예시되고, 70% 이상의 상동성이 바람직하고, 80% 이상의 상동성이 보다 바람직하고, 90% 이상의 상동성이 더욱 바람직하고, 95% 이상의 상동성이 특히 바람직하고, 98% 이상의 상동성이 가장 바람직하다.
또한, 가용성 트롬보모듈린으로는, 일본 특허공개 소64-6219호 공보에서의 서열번호 14의 서열(462 아미노산 잔기)로 이루어진 펩티드, 서열번호 8의 서열(272 아미노산 잔기)로 이루어진 펩티드 또는 서열번호 6의 서열(236 아미노산 잔기)로 이루어진 펩티드도 바람직한 예로서 들 수 있다.
가용성 트롬보모듈린으로서는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 제19～132위의 아미노산 서열 및 서열번호 9 또는 서열번호 11의 제19～244위의 서열 또는 이들의 상동 변이 서열을 적어도 가지며, 적어도 가용성 트롬보모듈린 전체로서 트롬보모듈린 활성을 갖고 있는 펩티드라면 특별히 한정되지 않지만, 그 중에서도 서열번호 5 또는 서열번호 7의 제19～480위의 아미노산 서열을 적어도 갖고 있는 펩티드인 것이 바람직하고, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 제19～515위의 아미노산 서열을 적어도 갖고 있는 펩티드인 것이 보다 바람직하다. 서열번호 9 또는 서열번호 11의 제19～515위의 아미노산 서열을 적어도 갖고 있는 펩티드로서는, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 각각에서의 제19～516위, 제19～515위, 제19～514위, 제17～516위, 제17～515위 또는 제17～514위의 서열로 이루어진 펩티드를 보다 바람직한 예로서 들 수 있다. 또, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 각각에서의 제19～516위, 제19～515위, 제19～514위, 제17～516위, 제17～515위 또는 제17～514위의 서열로 이루어진 펩티드의, 서열번호 9 또는 서열번호 11 각각에 관한 혼합물도 보다 바람직한 예로서 들 수 있다.
상기 혼합물의 경우, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 각각에서의 제17위로부터 시작되는 펩티드와 제19위로부터 시작되는 펩티드의 혼합 비율로서는, (30 : 70)～(50 : 50)이 예시되고, (35 : 65)～(45 : 55)를 바람직한 예로서 들 수 있다.
또, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 각각에서의 제514위, 제515위 및 제516위에서 끝나는 펩티드의 혼합 비율로서는, (0 : 0 : 100)～(0 : 90 : 10)이 예시되고, 경우에 따라서는, (0 : 70 : 30)～(10 : 90 : 0), (10 : 0 : 90)～(20 : 10 : 70)이 예시된다.
이들 펩티드의 혼합 비율은, 통상의 방법에 의해 구할 수 있다.
또한, 서열번호 1의 제19～132위의 서열은, 서열번호 9의 제367～480위의 서열에 해당하고, 서열번호 5의 제19～480위의 서열은, 서열번호 9의 제19～480위의 서열에 해당한다.
또, 서열번호 3의 제19～132위의 서열은, 서열번호 11의 제367～480위의 서열에 해당하고, 서열번호 7의 제19～480위의 서열은, 서열번호 11의 제19～480위의 서열에 해당한다.
또한, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 및 11의 각각에서의 제1～18위의 서열은, 모두 동일한 서열이다.
이들 가용성 트롬보모듈린은, 후술하는 바와 같이 예컨대 이들 펩티드를 코드하는 DNA(구체적으로는, 서열번호 10의 제1～732위의 염기 서열 및 서열번호 2의 제55～396위의 염기 서열을 갖는 염기 서열, 서열번호 10의 제1～732위의 염기 서열 및 서열번호 4의 제55～396위의 염기 서열을 갖는 염기 서열, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 12 등의 염기 서열)를 벡터에 의해 숙주 세포로 트랜스펙트하여 조제된 형질 전환 세포로부터 취득할 수 있다.
또한, 이들 펩티드는, 상기 아미노산 서열을 갖고 있으면 되고, 당쇄가 부가되어 있어도 좋고 부가되어 있지 않아도 좋으며, 이 점은 특별히 한정되지 않는다. 또 유전자 조작에 있어서는, 사용하는 숙주 세포의 종류에 따라, 당쇄의 종류나, 부가 위치나 부가의 정도는 상이하며, 어느 것이나 이용할 수 있다. 당쇄의 결합 위치 및 종류에 관해서는, 일본 특허공개 평11-341990호 공보에 기재된 사실이 알려져 있으며, 본 실시형태에서의 트롬보모듈린에 관해서도 동일한 위치에 동일한 당쇄가 부가되는 경우가 있다. 본 실시형태의 가용성 트롬보모듈린에는 푸코실바이안테나리형과 푸코실트리안테나리형의 2 종류의 N 결합형 당쇄가 결합하고, 그 비율은 (100 : 0)～(60 : 40)이 예시되고, (95 : 5)～(60 : 40)가 바람직하고, (90 : 10)～(70 : 30)를 보다 바람직한 예로서 들 수 있다. 이들 당쇄의 비율은, 생물화학실험법 23 당단백질 당쇄 연구법, 학회출판센터(1990년) 등에 기재된 2차원 당쇄 맵에 의해 측정할 수 있다. 또한, 본 실시형태의 가용성 트롬보모듈린의 당 조성을 조사하면, 중성당, 아미노당 및 시알산이 검출되고, 단백질 함량에 대하여, 각각 독립적으로 중량비로 1～30%의 비율이 예시되고, 2～20%가 바람직하고, 5～10%가 보다 바람직하다. 이들 당 함량은, 신생화학실험강좌 3 당질 I 당 단백질(상), 동경화학동인(1990년)에 기재된 방법(중성당 : 페놀-황산법, 아미노당 : 엘슨-모르간법, 시알산 : 과요오드산-레조르시놀법)에 의해 측정할 수 있다.
유전자 조작에 의해 가용성 트롬보모듈린을 취득하는 경우에는, 발현에 있어서 이용할 수 있는 시그널 서열로서는, 전술한 서열번호 9의 제1～18위의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열, 서열번호 9의 제1～16위의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열, 기타 공지의 시그널 서열, 예컨대, 인간 조직형 플러스미노겐 액티베이터의 시그널 서열을 이용할 수 있다(국제공개 88/9811호 공보).
가용성 트롬보모듈린을 코드하는 DNA 서열을 숙주 세포에 도입하는 경우에는, 바람직하게는 가용성 트롬보모듈린을 코드하는 DNA 서열을, 벡터, 특히 바람직하게는, 동물 세포에 있어서 발현 가능한 발현 벡터에 삽입하여 도입하는 방법을 들 수 있다. 발현 벡터란, 프로모터 서열, mRNA에 리보솜 결합 부위를 부여하는 서열, 발현하고자 하는 단백을 코드하는 DNA 서열, 스프라이싱 시그널, 전사 종결의 터미네이터 서열, 복제 기원 서열 등으로 구성되는 DNA 분자이며, 바람직한 동물 세포 발현 벡터의 예로서는, R. C. Mulligan 외[Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78. 2072(1981)]가 보고하고 있는 pSV2-X나, P. M. Howley 외[Method in Emzymology, 101, 387, Academic Press(1983)]가 보고하고 있는 pBP69T(69-6) 등을 들 수 있다. 또, 미생물에 있어서 발현 가능한 발현 벡터에 삽입하는 다른 바람직한 양태도 있다.
이들 펩티드를 제조할 때 이용할 수 있는 숙주 세포로서는, 동물 세포를 들 수 있다.
동물 세포로서는, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, COS-1 세포, COS-7 세포, VERO(ATCC CCL-81) 세포, BHK 세포, 개 신장 유래 MDCK 세포, 햄스터 AV-12-664 세포, NS0 세포 등을, 또한 인간 유래 세포로서는 HeLa 세포, WI38 세포, 인간 293 세포, PER. C6 세포를 들 수 있다. CHO 세포가 매우 일반적이고 바람직하며, CHO 세포에 있어서는, 디히드로엽산 환원 효소(DHFR) 결손 CHO 세포가 더욱 바람직하다.
또, 유전자 조작의 과정이나 펩티드의 제조 과정에 있어서, 대장균 등의 미생물도 많이 사용되며, 각각 적합한 숙주-벡터계를 사용하는 것이 바람직하고, 전술한 숙주 세포에 있어서도, 적절한 벡터계를 선택할 수 있다. 유전자 재조합 기술에 이용하는 트롬보모듈린의 유전자는, 클로닝되어 있고, 그리고 트롬보모듈린의 유전자 재조합 기술을 이용한 제조예가 개시되어 있고, 또한 그 정제품을 얻기 위한 정제 방법도 알려져 있다[일본 특허공개 소64-6219호 공보, 일본 특허공개 평2-255699호 공보, 일본 특허공개 평5-213998호 공보, 일본 특허공개 평5-310787호 공보, 일본 특허공개 평7-155176호 공보, J. Biol. Chem., 264 : 10351-10353(1989)]. 따라서 본 실시형태에서 이용하는 가용성 트롬보모듈린은, 상기 보고에 기재되어 있는 방법을 이용함으로써, 또는 이들에 기재된 방법에 준함으로써 제조할 수 있다. 예컨대 일본 특허공개 소64-6219호 공보에서는, 전체 길이의 트롬보모듈린을 코드하는 DNA를 포함하는 플라스미드 pSV2 트롬보모듈린 J2를 포함하는, Escherichia coli K-12 strain DH5(ATCC 기탁번호 67283호)가 개시되어 있다. 또, 이 균주를 생명연(현 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허 생물기탁센터)에 재기탁한 균주(Escherichia coli DH5/pSV2TM J2) (FERM BP-5570)를 이용할 수도 있다. 이 전체 길이의 트롬보모듈린을 코드하는 DNA를 원료로 하여, 공지의 유전자 조작 기술에 의해, 본 실시형태의 트롬보모듈린을 조제할 수 있다.
가용성 트롬보모듈린은, 종래 공지의 방법 또는 그것에 준하여 조제하면 되지만, 예컨대, 상기 야마모토 등의 방법[일본 특허공개 소64-6219호 공보] 또는 일본 특허공개 평5-213998호 공보를 참고로 할 수 있다. 즉 인간 유래의 가용성 트롬보모듈린 유전자를 유전자 조작 기술에 의해, 예컨대, 서열번호 9의 아미노산 서열을 코드하는 DNA로 하고, 또한 필요에 따른 개변을 행하는 것도 가능하다. 이 개변으로서는, 예컨대, 서열번호 11의 아미노산 서열을 코드하는 DNA(구체적으로는, 서열번호 12의 염기 서열로 이루어짐)로 하기 위해, 서열번호 9의 아미노산 서열의 제473위의 아미노산을 코드하는 코돈(특히 제1418위의 염기)에, 메소드 인 엔자이몰로지[Methods in Enzymology, 100 : 468(1983년), 아카데믹 프레스(Academic Press)]에 기재된 방법에 따라서, 부위 특이적 변이를 행한다. 예컨대, 서열번호 10의 제1418위의 염기 T는, 서열번호 13에 표시된 염기 서열을 갖는 변이용 합성 DNA를 이용하여 염기 C로 변환한 DNA로 할 수 있다.
이와 같이 하여 조제한 DNA를, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에 삽입하여 형질 전환 세포로 하고, 적절하게 선택하여, 이 세포를 배양하여 얻은 배양액으로부터, 공지의 방법에 의해 정제된 가용성 트롬보모듈린을 제조할 수 있다. 전술한 바와 같이 서열번호 9의 아미노산 서열을 코드하는 DNA(서열번호 10)를 상기 숙주 세포로 트랜스펙트하는 것이 바람직하다.
상기 형질 전환 세포를 배양함에 있어서는, 통상의 세포 배양에 이용되는 배지를 사용하는 것이 가능하고, 그 형질 전환 세포를 각종 배지에서 사전에 배양하고, 최적의 배지를 선택하는 것이 바람직하다. 예컨대, MEM 배지, DMEM 배지, 199 배지 등의 공지의 배지를 기본 배지로 하고, 더 개량하거나 또는 각종 배지용 첨가제를 첨가한 배지를 사용하면 된다. 배양 방법으로는, 혈청을 첨가한 배지로 배양하는 혈청 배양, 또는 혈청을 첨가하지 않은 배지에서 배양하는 무혈청 배양을 들 수 있다. 배양 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 무혈청 배양이 바람직하다.
혈청 배양에 있어서, 배지에 혈청을 첨가하는 경우는 소혈청이 바람직하다. 소혈청에는, 소태아 혈청, 신생 새끼소 혈청, 새끼소 혈청, 성우 혈청 등이 있지만, 세포 배양에 적합한 것이라면, 어느 것을 사용해도 좋다. 한편, 무혈청 배양에 있어서, 사용하는 무혈청 배지는, 시판하는 배지를 사용하는 것이 가능하다. 각종 세포에 적합한 무혈청 배지가 시판되고 있고, 예컨대 CHO 세포에 대해서는, 인비트로젠사에서 CD-CHO, CHO-S-SFMII, CHO-III-PFM이, 어바인 사이언티픽사에서 IS CHO, IS CHO-CD 배지 등을 판매하고 있다. 이들 배지를 그대로, 개량 또는 첨가제를 첨가하여 사용해도 좋다. 또한, 무혈청 배지로서는, 인슐린, 트랜스페린 및 아세렌산을 각각 5 ㎎/L가 되도록 첨가한 DMEM 배지가 예시된다. 이와 같이, 본 실시형태의 트롬보모듈린을 생성할 수 있는 배지라면, 특별히 한정되지 않는다. 배양 방법은 특별히 한정되지 않고, 배치 배양, 반복 배치 배양, 유가 배양, 관류 배양 등 어떠한 배양법이어도 좋다.
상기 세포 배양 방법에 의해 가용성 트롬보모듈린을 제조하는 경우, 단백질의 번역후 수식에 의해, N 말단 아미노산에 다양성이 보이는 경우가 있다. 예컨대, 서열번호 9에서의 제17위, 18위, 19위 또는 22위의 아미노산이 N 말단이 되는 경우가 있다. 또, 예컨대 제22위의 글루타민산이 피로글루타민산으로 변환되도록, N 말단 아미노산이 수식되는 경우도 있다. 제17위 또는 19위의 아미노산이 N 말단이 되는 것이 바람직하고, 제19위의 아미노산이 N 말단이 되는 것이 보다 바람직하다. 또, 제17위의 아미노산이 N 말단이 되는 것이 바람직한 다른 양태도 있다. 이상의 수식이나 다양성 등에 관해서는 서열번호 11에 관해서도 동일한 예를 들 수 있다.
또한, 서열번호 10의 염기 서열을 갖는 DNA를 이용하여 가용성 트롬보모듈린을 제조하는 경우, C 말단 아미노산의 다양성이 보이는 경우가 있고, 1 아미노산 잔기 짧은 펩티드가 제조되는 경우가 있다. 즉, 제515위의 아미노산이 C 말단이 되고, 또한 상기 제515위가 아미드화되거나 하는 것처럼, C 말단 아미노산이 수식되는 경우가 있다. 또, 2 아미노산 잔기 짧은 펩티드가 제조되는 경우도 있다. 즉, 제514위의 아미노산이 C 말단이 되는 경우가 있다. 따라서, N 말단 아미노산과 C 말단 아미노산이 다양성이 풍부한 펩티드, 또는 이들의 혼합물이 제조되는 경우가 있다. 제515위의 아미노산 또는 제516위의 아미노산이 C 말단이 되는 것이 바람직하고, 제516위의 아미노산이 C 말단이 되는 것이 보다 바람직하다. 또, 제514위의 아미노산이 C 말단이 되는 것이 바람직한 다른 양태도 있다. 이상의 수식이나 다양성 등에 관해서는 서열번호 12의 염기 서열을 갖는 DNA에 관해서도 동일하다.
상기 방법으로 얻어지는 트롬보모듈린은, N 말단 및 C 말단에 다양성이 보이는 펩티드의 혼합물인 경우가 있다. 구체적으로는, 서열번호 9에서의 제19～516위, 제19～515위, 제19～514위, 제17～516위, 제17～515위 또는 제17～514위의 서열로 이루어진 펩티드의 혼합물을 들 수 있다.
본 발명에 의해, HCP의 혼입이 저감된 고순도 가용성 트롬보모듈린이 제공된다.
본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린으로서는, 가용성 트롬보모듈린 이외의 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 높은 순도의 가용성 트롬보모듈린을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, HCP를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 들 수 있다. 바람직하게는, HCP, 마우스 IgG 및 소혈청 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 들 수 있다.
본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린은 인간 유래의 단백질은 포함하지 않는다.
HCP의 함량은, HCP를 실질적으로 포함하지 않는 상태라면 특별히 한정되지 않지만, 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 HCP가 10 ng 미만의 비율이 바람직하고, 8 ng 미만의 비율이 보다 바람직하고, 7 ng 미만의 비율이 더욱 바람직하고, 6 ng 미만의 비율이 특히 바람직하고, 5 ng 미만의 비율이 특히 바람직하다. 본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린은, 가용성 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 숙주 세포로 트랜스펙트하여 얻어진 형질 전환 세포에 의해 생성되며, 아무리 정제되었다 하더라도 현실적으로는 흔적량 정도의 HCP의 혼입이 있을 수 있다고 생각된다. HCP의 함량이 낮으면 낮을수록 바람직하지만, 예컨대 HCP의 함량의 하한으로서는, 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 HCP 0.001 ng의 비율이 예시된다.
마우스 IgG의 함량은, 마우스 IgG를 실질적으로 포함하지 않는 상태라면 특별히 한정되지 않지만, 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 마우스 IgG가 10 ng 미만의 비율이 바람직하고, 2 ng 미만의 비율이 보다 바람직하고, 0.6 ng 미만의 비율이 더욱 바람직하다.
소혈청 단백질의 함량은, 소혈청 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 상태라면 특별히 한정되지 않지만, 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율이 바람직하고, 2 ng 미만의 비율이 보다 바람직하고, 0.6 ng 미만의 비율이 더욱 바람직하다. 이들 단백질 농도는, ELISA법에 의해 측정하는 것이 바람직하고, 생화학실험법 11 엔자임 이뮤노어세이 동경화학동인(1992년) 등을 참고로 하여 측정할 수 있다.
또, 본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린의, 총단백질 중의 가용성 트롬보모듈린 순도로서는, HPLC법에 있어서, 99% 이상인 것이 바람직하고, 99.5% 이상인 것이 보다 바람직하고, 99.7% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 99.9% 이상의 순도인 것이 특히 바람직하다. HPLC법에서의 크로마토그래피는 가용성 트롬보모듈린의 순도를 측정할 수 있는 것이라면 한정은 되지 않지만, 겔 여과 액체 크로마토그래피, 이온 교환 액체 크로마토그래피 및 역상 액체 크로마토그래피 등이 예시되고, 겔 여과 액체 크로마토그래피가 바람직하다. 겔 여과 액체 크로마토그래피를 이용하는 경우에는, 사용하는 컬럼은 가용성 트롬보모듈린의 분자량에 맞춰 선택하면 되고, 예컨대, TOSOH TSKgel G3000SWXL(일본, 도소)을 이용하여, pH 7.3의 인산염 완충액으로 전개하는 방법을 들 수 있다. 일본약국방의 액체 크로마토그래피 <2.01>에 따라서 시험을 실시하면 된다.
또한 본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린은, 숙주 유래의 DNA 성분에 관해서는, 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 2 ng 미만의 비율인 것이 바람직하고, 0.2 ng 미만의 비율이 보다 바람직하고, 0.02 ng 미만의 비율이 더욱 바람직하다. DNA량의 측정은, 트레스홀드 시스템(Threshold system)(미국, 몰레큘러 디바이스)을 사용하면 용이하게 측정하는 것이 가능하다.
본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린은, HCP의 함량이 상기 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율이라면 그 형태는 특별히 한정되지 않고, 용액 또는 분말의 형태로 존재할 수 있다. 용액의 형태로 존재하는 것이 바람직하다. 또, 분말의 형태로 존재하는 것이 바람직한 다른 양태도 있다. 용액의 상태인 경우의 농도로서는, 상한으로는, 100 ㎎/㎖ 이하인 것이 바람직하고, 60 ㎎/㎖ 이하인 것이 보다 바람직하고, 30 ㎎/㎖ 이하인 것이 더욱 바람직하고, 15 ㎎/㎖ 이하인 것이 특히 바람직하고, 하한으로는, 2 ㎎/㎖ 이상인 것이 바람직하고, 4 ㎎/㎖ 이상인 것이 보다 바람직하고, 6 ㎎/㎖ 이상인 것이 더욱 바람직하고, 8 ㎎/㎖ 이상인 것이 특히 바람직하고, 10 ㎎/㎖ 이상인 것이 가장 바람직하다. 또, 분말의 형태로 존재하는 경우, 동결 건조의 형태를 바람직한 예로서 들 수 있다. 동결 건조체는 WO03/061687에 기재된 방법을 참고로 취득할 수 있다.
본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린은, 실질적으로 엔도톡신을 포함하지 않는 것으로서 취득 가능하다. 엔도톡신 함량으로서는, 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 1 엔도톡신 유닛(EU) 미만인 것이 바람직하고, 0.2 EU 미만인 것이 보다 바람직하고, 0.04 EU 미만인 것이 더욱 바람직하다. 엔도톡신량은 일본약국방 일반 시험법의 엔도톡신 시험법 <4.01>에 따라서 측정할 수 있다. 또, 본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린은, TFA 등 생체에 해가 되는 물질을 포함하지 않고, 무균에 가까운 상태로 취득되기 때문에, 의약품의 원료로서 사용할 수 있다.
본 실시형태의 HCP의 혼입이 저감된 고순도 가용성 트롬보모듈린은, 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 나일론 및/또는 폴리에테르술폰과 접촉시킴으로써 취득할 수 있지만, 나일론을 이용하는 것이 바람직하다. 또, 폴리에테르술폰을 이용하는 것이 바람직한 다른 양태도 있다.
본 실시형태의 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 접촉시키는 나일론으로서는, 지방족 골격을 포함하는 폴리아미드를 들 수 있고, 예컨대 나일론 6, 나일론 66, 나일론 46 또는 나일론 MXD6이 예시된다. HCP를 흡착하는 것이라면 그 종류는 한정되지 않지만, 나일론 6이 바람직하다. 나일론은, 예컨대 싸토리우스사에서 판매하고 있는 Minisart NY로서 입수 가능하다. 나일론의 형태에 관해서는, 막형, 부직포, 비드형 등, 용액을 접촉시키는 것이 가능하다면 특별히 한정되지 않지만, 막형으로 성형하여 여과막으로서 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우의 여과막의 구멍 직경은, HCP가 통과할 수 있는 크기라면 한정되지 않지만, 0.01～10 ㎛가 예시되고, 0.1～1 ㎛가 바람직하고, 0.01～0.06 ㎛가 보다 바람직하다. 나일론에 접촉시키는 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액의 양은, 사전에 일부의 용액을 소량의 나일론에 접촉시켜 HCP의 제거능을 평가함으로써 용이하게 결정할 수 있다.
본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린의 취득은, HCP를 포함하는 가용성 트롬보모듈린 함유 용액을 나일론에 접촉시킨 후의 용액 중의 HCP 함량이, 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율이 되어 있는 것을 확인하면서 행하며, HCP 함량이 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 이상이 되는 지점에서 취득을 그만두거나, 또는 사용중인 나일론을 미사용의 것으로 변경하여 고순도 가용성 트롬보모듈린의 취득을 재개하면 된다. HCP량과 나일론의 양의 관계를 예시한다고 하면, 예컨대 나일론이 여과막인 경우는, HCP 1 ㎎에 대하여 막면적이, 상한으로는 50 ㎡ 이하가 예시되고, 5 ㎡ 이하가 바람직하고, 0.5 ㎡ 이하가 보다 바람직하고, 0.1 ㎡ 이하가 더욱 바람직하고, 하한으로는 0.01 ㎡ 이상이 바람직하고, 0.02 ㎡ 이상이 보다 바람직하고, 0.03 ㎡ 이상이 더욱 바람직하다. 저감하고자 하는 HCP량에 따라서 막면적을 설정하는 것이 중요하다.
본 실시형태의 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 접촉시키는 폴리에테르술폰은, 예컨대, 싸토리우스사에서 판매하고 있는 Minisart High-Flow로서 입수 가능하다. 폴리에테르술폰의 형태에 관해서는, 막형, 부직포, 비드형 등, 용액을 접촉시키는 것이 가능하다면 특별히 한정은 되지 않지만, 막형으로 성형하여 여과막으로서 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우의 여과막의 구멍 직경은, HCP가 통과할 수 있는 크기라면 한정되지 않지만, 0.01～10 ㎛가 예시되고, 0.1～1 ㎛가 바람직하고, 0.01～0.06 ㎛가 보다 바람직하다. 폴리에테르술폰에 접촉시키는 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액의 양은, 사전에 일부의 용액을 소량의 폴리에테르술폰에 접촉시켜 HCP의 제거능을 평가함으로써 용이하게 결정할 수 있다.
본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린의 취득은, HCP를 포함하는 가용성 트롬보모듈린 함유 용액을 폴리에테르술폰에 접촉시킨 후의 용액 중의 HCP 함량이, 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율이 되어 있는 것을 확인하면서 행하며, HCP 함량이 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 이상이 되는 지점에서 취득을 그만두거나, 또는 사용중인 폴리에테르술폰을 미사용의 것으로 변경하여 고순도 가용성 트롬보모듈린의 취득을 재개하면 된다. HCP량과 폴리에테르술폰의 양의 관계를 예시한다고 하면, 예컨대 폴리에테르술폰이 여과막인 경우는 HCP 1 ㎎에 대하여 막면적이, 상한으로는 50 ㎡ 이하가 예시되고, 5 ㎡ 이하가 바람직하고, 0.5 ㎡ 이하가 보다 바람직하고, 하한으로는 0.02 ㎡ 이상이 바람직하고, 0.03 ㎡ 이상이 보다 바람직하고, 0.05 ㎡ 이상이 더욱 바람직하다. 저감하고자 하는 HCP량에 따라서 막면적을 설정하는 것이 중요하다.
본 실시형태의 HCP의 혼입이 저감된 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조 공정은, 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시키는 공정을 포함하며, HCP 함량이 상기 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율이 되도록 하면 특별히 한정되지 않지만, 이하의 제조 공정이 예시된다.
가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시키는 공정을 포함하는 (a)～(g)로 이루어진 제조 공정.
(a) 형질 전환 세포를 배양하여 배양액(생산액)을 회수하는 공정,
(b) 생산액을 여과하여 여과후 생산액을 얻는 공정,
(c) 여과후 생산액을 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피에 이용하여 조정제액을 얻는 공정,
(d) 조정제액을 항트롬보모듈린 모노클로날 항체를 담지시킨 어피니티 컬럼 크로마토그래피에 이용하여 정제액 1을 얻는 공정,
(e) 정제액 1을 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 공정에 이용하여 정제액 2를 얻는 공정,
(f) 농축한 정제액 2를 겔 여과 컬럼 크로마토그래피에 이용하여, 그 용출액을 농축하여 정제액 3을 얻는 공정, 및
(g) 정제액 3을 바이러스 제거막 및 무균 여과막으로 여과하는 공정.
상기 제조 공정에 있어서, 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시키는 공정은, (b)～(g) 중의 어느 공정 또는 복수의 공정에 포함되어도 좋지만, (d)～(g) 중의 어느 공정 또는 복수의 공정에 포함되는 것이 바람직하다. 효율적으로 HCP를 제거하기 위해서는 제조 공정의 마지막 공정, 즉 (g)의 후에 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시키는 공정을 추가하는 것이 매우 바람직하다.
또, 소혈청 단백질의 혼입을 0으로 하기 위해, (a)의 형질 전환 세포의 배양이 무혈청 배양인 것이 보다 바람직하다.
또한, 본 실시형태의 HCP의 혼입이 저감된 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조 공정으로는, 이하에 나타내는 제조 공정을 들 수 있다.
가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시키는 공정을 포함하는 (a)～(g)로 이루어진 제조 공정.
(a) 형질 전환 세포를 배양하여 배양액(생산액)을 회수하는 공정,
(b) 생산액을 여과하여 여과후 생산액을 얻는 공정,
(c) 여과후 생산액을 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피에 이용하여 조정제액 1을 얻는 공정,
(d) 조정제액 1을 소수 컬럼 크로마토그래피에 이용하여 조정제액 2를 얻는 공정,
(e) 조정제액 2를 항트롬보모듈린 모노클로날 항체를 담지시킨 어피니티 컬럼 크로마토그래피에 이용하여 정제액 1을 얻는 공정,
(f) 농축한 정제액 1을 겔 여과 컬럼 크로마토그래피에 이용하여 정제액 2를 얻는 공정, 및
(g) 정제액 2를 무균 여과막으로 여과하는 공정.
상기 제조 공정에 있어서, 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시키는 공정은, (b)～(g) 중의 어느 공정 또는 복수의 공정에 포함되어도 좋지만, (e)～(g) 중의 어느 공정 또는 복수의 공정에 포함되는 것이 바람직하다. 효율적으로 HCP를 제거하기 위해서는 제조 공정의 마지막 공정, 즉 (g)의 후에 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시키는 공정을 추가하는 것이 바람직한 경우도 있다.
또, 소혈청 단백질의 혼입을 0으로 하기 위해, (a)의 형질 전환 세포의 배양이 무혈청 배양인 것이 보다 바람직하다.
본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린의 취득은, HCP를 포함하는 가용성 트롬보모듈린 함유 용액을 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시킨 후의 용액 중의 HCP 함량이, 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율이 되어 있는 것을 확인하면서 행하며, HCP 함량이 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 이상이 되는 지점에서 취득을 그만두거나, 또는 사용중인 나일론 및/또는 폴리에테르술폰을 미사용의 것으로 변경하여 고순도 가용성 트롬보모듈린의 취득을 재개하면 된다. 또, 전술한 바와 같이, 본 실시형태의 HCP의 혼입이 저감된 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조 공정은, 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시키는 공정을 포함하며, HCP 함량이 상기 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율이 되도록 하면 특별히 한정되지 않는다. 즉, 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시키는 공정의 후에 정제 공정이 존재해도 좋고, 결과적으로 HCP의 함유율이 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율인 고순도 가용성 트롬보모듈린을 취득할 수 있으면 된다.
나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시키는 공정의 후에 존재해도 좋은 정제 공정으로는, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 어피니티 컬럼 크로마토그래피, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과 컬럼 크로마토그래피 또는 소수 컬럼 크로마토그래피 등의 컬럼 크로마토그래피 공정, 막농축 공정, 바이러스 제거, 무균 여과 등의 막여과 공정, 또는 이들 2종 이상의 조합을 들 수 있고, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과 컬럼 크로마토그래피, 막농축, 바이러스 제거, 무균 여과, 또는 이들 2종 이상의 조합이 바람직하다. 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시키는 공정의 후에, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과 컬럼 크로마토그래피, 막농축, 바이러스 제거 및 무균 여과가 존재하는 것이 바람직한 경우가 있다. 또, 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시키는 공정의 후에, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과 컬럼 크로마토그래피, 막농축, 바이러스 제거 및 무균 여과의 정제 공정이, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 막농축, 겔 여과 컬럼 크로마토그래피, 막농축, 바이러스 제거, 무균 여과의 순서로 존재하는 것을 보다 바람직한 예로서 들 수 있다. 또한, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피로는, SP Sepharose Fast Flow, DEAE Sepharose Fast Flow, Capto S, Capto DEAE(GE 헬스케어사), S HyperCel(폴사), TOYOPEARL GigaCap S-650(도소사)가 예시되고, SP Sepharose Fast Flow가 바람직하다. 농축막으로는, MICROZA UF(아사히카세이케미컬사), Kvick Flow 10KD(GE 헬스케어사), Pellicon 2(밀리포어사)가 예시되고, MICROZA UF가 바람직하다. 겔 여과 컬럼 크로마토그래피로는, Sephacryl S-300 HR, Superose 12 pg(GE 헬스케어사), TOYOPEARL HW(도소)가 예시되고, Sephacryl S-300 HR이 바람직하다. 바이러스 제거막으로는, PLANOVA 15N(아사히카세이메디컬), Biresolve NFP(밀리포어사), Ultipor VF(폴사)가 예시되고, PLANOVA 15N이 바람직하다. 무균 여과막으로는, Millipak, Millidisk(밀리포어사), Supore EVA(폴사), Sartopore 2(싸토리우스 스테딤)가 예시되고, Millipak이 바람직하다.
이와 같이, 본 실시형태의 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시킴으로써 취득되는 고순도 가용성 트롬보모듈린은, 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율인 HCP를 함유하는 것이다.
본 실시형태의 가용성 트롬보모듈린 1 U는, 프로테인 C의 활성화를 지표로 한 APC 어세이에서 1 분 동안에 0.1 ㎛ol의 p-니트로아닐린을 생성하는 양으로 정의되며, Biologicals(2002) 30, 69-76에 기재된 방법에 따라서 이하의 공정을 포함하는 방법으로 측정된다.
(a) 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액에 인간 트롬빈을 첨가하고 가온하는 공정,
(b) 인간 프로테인 C를 첨가하고 가온하는 공정,
(c) 헤파린-안티트롬빈 III을 첨가하고 가온하는 공정,
(d) 합성 기질 S-2366(pyroGlu-Pro-Arg-pNAㆍHCl)을 첨가하고 가온하는 공정,
(e) 아세트산을 첨가하고 기질 절단 반응을 중지하는 공정,
(f) 405 nm의 흡광도를 측정하는 공정, 및
(g) 이하의 식에 따라서 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액의 활성을 측정하는 공정.
Figure pct00001
Asample : 시료 용액의 흡광도
Ablank : 대조(물)의 흡광도
M : p-니트로아닐린의 몰 흡광계수 9.6×10-3 [1/μM]
V1 : 흡광도 측정시의 액량 (L)
V2 : 시료 용액의 액량 (㎖)
T : 기질 절단 반응 시간 (분)
k : 트롬보모듈린 1 U로부터 생성된 활성화 프로테인 C가 유리시키는 p-니트로아닐린의 몰수 0.1 (㎛ol/분/U)
본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린은 단백질 1 ㎎ 당 3,000 U의 활성을 갖는 것이 예시되고, 바람직하게는 4,000 U～9,000 U, 보다 바람직하게는 5,000 U～8,000 U, 더욱 바람직하게는 6,000 U～7,000 U이다. 단백질 농도는, 소혈청 알부민을 표준품으로 하여, 공지의 단백 농도 측정법에 따라서 측정할 수 있다. 예컨대, 로리법, 브래드포드법, BCA법 등이 예시된다.
본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린의 HCP 함량은, 적어도 이하의 공정을 포함하는 방법으로 측정된다.
(a) 가용성 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 숙주 세포로 트랜스펙트하여 얻어진 형질 전환 세포, 또는 그 숙주 세포 중의 어느 것을 무혈청 배양하여 얻어지는 배양 상청으로부터 숙주 세포 유래 단백질을 조제하는 공정,
(b) 상기 (a)의 상기 숙주 세포 유래 단백질을 토끼에게 감작하여 얻어지는 항혈청으로부터 항숙주 세포 유래 단백질 항체를 정제하는 공정,
(c1) 상기 (b)의 상기 항숙주 세포 유래 단백질 항체를 고상에 흡착시키는 공정,
(c2-1) 상기 항숙주 세포 유래 단백질 항체를 흡착시킨 상기 고상에, 상기 숙주 세포 유래 단백질의 혼입이 의심되는 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액을 접촉시키는 공정,
(c3) 상기 고상에 비오틴화한 항숙주 세포 유래 단백질 항체를 첨가하는 공정,
(c4) 상기 고상에 아비딘화한 퍼옥시다아제 용액을 첨가하는 공정,
(c5) 효소 기질 용액을 첨가하고 발색시키는 공정, 및
(c6) 발색을 정지하고 그 흡광도를 측정하는 공정
을 포함하는 측정계를 구축하는 공정,
(d) 상기 측정계로 상기 숙주 세포 유래 단백질의 혼입이 의심되는 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액의 숙주 세포 유래 단백질 농도를 측정하고, 상기 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액의 숙주 세포 유래 단백질 농도가, 상기 측정계로 농도가 이미 알려진 숙주 세포 유래 단백질 함유 용액을 이용하여 측정함으로써 미리 확인한 상기 측정계에서의 정량 가능 범위에 들어가는지의 여부를 판단하는 공정,
(e-1) 상기 (d)에 있어서, 상기 숙주 세포 유래 단백질의 혼입이 의심되는 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액 중의 숙주 세포 유래 단백질 농도가 정량 가능 범위에 들어가는 경우, 상기 농도를 상기 숙주 세포 유래 단백질 농도로 하는 공정,
(e-2-1) 상기 (d)에 있어서, 상기 숙주 세포 유래 단백질의 혼입이 의심되는 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액 중의 숙주 세포 유래 단백질 농도가 정량 가능 범위에 들어가지 않는 경우, 상기 측정계에서의 정량 가능 범위에 들어가는 측정 가능한 농도로 하기 위해 필요에 따라서 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액을 농축 또는 희석하고, 그 농축률 또는 희석률을 기록하는 공정,
(e-2-2) 상기 (e-2-1)에 있어서 농축 또는 희석한 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액 중의 숙주 세포 유래 단백질 농도를, 상기 (c1)～(c6)으로 표시되는 측정계 중 (c2-1)을 이하에 나타내는 (c2-2)로 치환한 측정계로 측정하고, 농축률 또는 희석률을 고려하여 상기 숙주 세포 유래 단백질 농도를 구하는 공정,
(c2-2) 상기 항숙주 세포 유래 단백질 항체를 흡착시킨 상기 고상에, 필요에 따라서 농축 또는 희석한 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액을 접촉시키는 공정, 및 상기 항숙주 세포 유래 단백질 항체를 흡착시킨 상기 고상에 농도가 이미 알려진 숙주 세포 유래 단백질 함유 용액을 접촉시키는 공정, 및
(f) 별도 측정한 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액 단위 체적당의 트롬보모듈린의 APC 활성에 대한, (e-1) 또는 (e-2-2)에서 구한 숙주 세포 유래 단백질 농도의 비율을 산출하는 공정.
본 명세서에 있어서, HCP는 가용성 트롬보모듈린을 생성하는 유전자 재조합 세포를 제작할 때 이용한 숙주 세포 유래의 단백질로서, 가용성 트롬보모듈린은 포함되지 않는다. HCP는 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA의 트랜스펙트에서 사용하는 것과 동종의 숙주 세포를 배양하여 얻어진 배양 상청으로부터 조제할 수 있다. 동종의 숙주 세포란, 예컨대 CHO 세포의 경우, CHO-K1 주(ATCC 번호 CCL-61), CHO-S 주(미국, 인비트로젠 카탈로그 번호 11619-012), CHO-DXB11, CHO-DG44 주(미국, 인비트로젠 카탈로그 번호 12610-010) 등, CHO 세포로 분류되는 주를 포함하는 개념을 나타내고, CHO 세포로 분류되는 것이라면 어떤 주를 이용하여 조제해도 좋다. CHO 세포에 관해 말하면, 동종의 숙주 세포로는 DXB11 주 또는 CHO-K1 주를 이용하는 것이 바람직하고, DXB11 주를 이용하는 것이 보다 바람직하다. 또, CHO-K1 주를 이용하는 것이 바람직한 다른 양태도 있다.
HCP는, 가용성 트롬보모듈린을 생성하는 유전자 재조합 세포를 제작할 때 이용한 숙주 세포 유래의 단백질이며, 적어도 상기 (a)～(f)의 공정을 포함하는 방법으로 측정되는 것으로서 정의되지만, HCP의 구성 요소로는, 시험예 6에 나타낸 바와 같이 히스톤 H2B(Biochimie, 61(1), 61-69(1979))를 들 수 있다.
또, 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 동종의 숙주 세포로 트랜스펙트하여 얻어지는 형질 전환 세포를 배양하여 얻어진 배양 상청으로부터 조제하는 경우는, 그 배양 상청을 트롬보모듈린에 특이적으로 결합하는 항체를 리간드로 한 항체 컬럼에 이용하여, 비흡착 획분을 회수하면 된다. 이 비흡착 획분은 트롬보모듈린의 APC 활성이 검출되지 않은 것을 확인한 후, HCP로서 사용할 수 있다. HCP는 필요에 따라서 한외여과막으로 농축하는 것이 바람직하다. 또한, 숙주 세포 또는 형질 전환 세포를 배양할 때 사용하는 배지는, 다른 단백질의 혼입을 피하기 위해, 무혈청 배지인 것이 바람직하고, 무혈청 배지가 무단백질 배지인 것이 보다 바람직하다. HCP를 토끼에게 감작하여 얻어진 항 HCP 항혈청으로부터의 항 HCP 항체 정제는, 컬럼 크로마토그래피를 이용하면 되고, 또한 유안염석법 및 컬럼 크로마토그래피의 조합이 예시된다. 항 HCP 항체 정제에서의 컬럼 크로마토그래피는 프로테인 A 컬럼을 사용하는 것이 바람직하다. HCP의 조제시에, 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 숙주 세포로 트랜스펙트하여 얻어지는 형질 전환 세포를 사용하는 경우는, 항 HCP 항체 정제시에는, 프로테인 A 컬럼으로 정제한 후에 트롬보모듈린 컬럼을 사용하고, 그 비흡착 획분을 취득하여 항 HCP 항체로 하는 것이 바람직한 다른 양태도 있다.
HCP 농도 측정계를 구축할 때에는, 그 정량 가능 범위를 명확하게 할 필요가 있고, 트롬보모듈린 10,000 U 당의 HCP 함량이 10 ng 미만인 것을 측정할 수 있는 것이라면 정량 가능 범위는 한정되지 않지만, 낮은 농도까지 측정할 수 있을수록 좋다. 정량 가능 범위로는, 하한으로서 100 ng/㎖ 이상이 예시되고, 50 ng/㎖ 이상이 바람직하고, 25 ng/㎖ 이상이 보다 바람직하고, 상한으로서 500 ng/㎖이 예시된다.
피험 용액을 농축하는 경우는, 통상의 단백질 농축법에 따르면 되고 특별히 한정은 되지 않지만, 한외여과막에 의한 농축이 바람직하다. 또, 동결 건조한 후에 소량의 물이나 완충액으로 용해함으로써 농축하는 방법이 바람직한 다른 양태도 있다. 또한, 농축함으로써, HCP 이외의 성분도 농축되고, 그것이 HCP 측정계에 영향을 미칠 가능성이 있기 때문에, 피검 용액은 HCP 측정계에 영향을 미치지 않는 범위내에서 농축할 필요가 있다. 예컨대, HCP 측정계에 영향을 미치지 않는 가용성 트롬보모듈린 함유 피검 용액 농도의 범위의 상한으로서 5 ㎎/㎖를 들 수 있다.
트롬보모듈린 10,000 U 당의 HCP 함량은, 이하의 식에 따라서 산출된다.
a/b×10,000
a : 시료 1 ㎖ 당의 HCP 함량 (ng/㎖)
b : 시료 1 ㎖ 당의 트롬보모듈린의 APC 활성 (U/㎖)
본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린은, 이 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하여 항 혈액 응고 작용과 혈전 용해 작용을 나타내는 활성형 프로테인 C를 대량으로 생성시키는 것이다. 따라서, 본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린은 생체에서의 항 혈액 응고 및 혈전 용해에 크게 기여하는 것이다. 본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린은 항 혈액 응고 작용과 혈소판 응집 억제 작용 및 혈전 용해 작용을 갖기 때문에, 혈액 응고를 제어하기 위한, 또는 혈소판 응집을 제어하기 위한 의약 조성물로서 이용하는 것이 가능하고, 구체적으로는, 예컨대, 심근경색, 혈전증, 색전증, 말초 혈관 폐색증, 폐색성 동맥 경화증, 혈관내 혈액 응고 증후군(DIC), 협심증, 일과성 뇌허혈 발작, 임신 중독증 등의 질환의 치료 및 예방에 이용할 수 있다.
본 실시형태의 의약 조성물을 조제할 때에는, 본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린과, 약학상 허용되는 담체를 혼합하면 된다. 즉, 상기 질환을 치료 또는 예방하기에 유효한 양의 본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린을 적당한 양의 담체와 섞어, 환자에게 효과적으로 투여하기에 적합한 의약 조성물을 조제할 수 있다. 본 실시형태의 의약 조성물로서는, 동결 건조된 제제로 하는 것이 바람직하다. 또 본 실시형태의 의약 조성물은 혈관내 주사용 제제로서 이용하는 것이 바람직하다. 나아가, 점적 정맥 주사용 제제로 하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 동결 건조 제제를 제조할 때에는, WO03/061687에 기재된 방법을 참고로 행할 수 있다.
주사제로서 이용하는 경우에, 상기 담체는, 약제로서 투여 가능하고, 또한 생리식염수 또는 포도당 주사액에 용해할 수 있는 담체인 것이 바람직하고, 이 담체로는, 자당, 정제 젤라틴, 알부민, 만니톨, 포도당 및 염화나트륨으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이 예시되고, 또 각종 무기염의 pH 조정제 등을 첨가하는 것도 바람직한 예로서 들 수 있지만, 그 경우에는 본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린과의 조합에 있어서, 의약 조성물 전체적으로 가용성이고, 또한 깨끗하게 동결 건조가 가능하여, 바람직하다. 또 본 실시형태에 있어서는, 상기 담체가 글리세린인 것도 또한 바람직하다. 상기 담체는, 제제를 조제할 때 첨가하는 것이 바람직하지만, 용시에 용해되었을 때에 있어서 첨가되는 것도 허용되는 것이다.
본 실시형태의 고순도 가용성 트롬보모듈린의 성인 1 회당 투여량은, 연령, 성별, 체중, 증상 등에 따라 다르지만, 일반적으로 약 0.1～200 ㎎이고, 1 일당 1 회 또는 필요에 따라서 수회, 예컨대 혈관내 주사, 바람직하게는 점적 정맥 주사에 의해 투여하는 방법이 예시된다. 본 실시형태의 의약 조성물에 관해서도, 유효 성분인 가용성 트롬보모듈린 환산으로 0.1～200 ㎎이 되도록 1 일당 1 회 또는 필요에 따라서 수회, 예컨대 혈관내 주사, 바람직하게는 점적 정맥 주사에 의해 투여하면 된다.
실시예
이하의 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 전혀 이들에 의해 한정되는 것이 아니다.
(참고예 1) 트롬보모듈린의 APC 활성의 측정 방법
Biologicals(2002) 30, 69-76에 따라서, 프로테인 C의 활성화를 지표로 한 트롬보모듈린의 APC 활성을 측정한다.
20 mM 염화칼슘 용액 75 ㎕에 0.05% 폴리솔베이트 20을 포함하는 트리스ㆍ이미다졸 완충액으로 희석한 시료 용액 25 ㎕를 첨가하여 빙랭한 후, 40 U/㎖의 인간 트롬빈(미국, 시그마) 용액 25 ㎕를 첨가 교반하고, 37℃로 가온한다. 인간 트롬빈 용액을 첨가하고 나서 10 분후에 12 U/㎖의 인간 프로테인 C(미국, 엔자임리서치) 용액 25 ㎕를 첨가 교반하고, 37℃로 가온한다. 인간 프로테인 C 용액을 첨가하고 나서 10 분후에, 헤파린-안티트롬빈 III 용액 100 ㎕를 첨가 교반하고, 37℃로 가온한다. 헤파린-안티트롬빈 III 용액을 첨가하고 나서 10 분 후에, 미리 37℃로 가온한 합성 기질 S-2366(스웨덴, 크로모제닉스) 용액 250 ㎕를 첨가 교반하고, 37℃로 가온한다. 기질 용액을 첨가하고 나서 10 분후에, 50% 아세트산 1.5 ㎖를 첨가 교반하고, 물을 대조로 하여 405 nm에서의 흡광도를 측정한다.
트롬보모듈린의 APC 활성은 이하의 식에 따라서 산출한다. 또한, 트롬보모듈린 1 U는, 1 분 동안에 0.1 ㎛ol의 p-니트로아닐린을 생성하는 양으로 정의한다.
Figure pct00002
Asample : 시료 용액의 흡광도
Ablank : 대조(물)의 흡광도
M : p-니트로아닐린의 몰흡광 계수 9.6×10-3 [1/μM]
V1 : 흡광도 측정시의 액량 2.0×10-3 (L)
V2 : 시료 용액의 액량 0.025 (㎖)
T : 기질 절단 반응 시간 10 (분)
k : 트롬보모듈린 1 U로부터 생성한 활성화 프로테인 C가 유리시키는 p-니트로아닐린의 몰수 0.1 (㎛ol/분/U)
또한, 시약은 이하와 같다.
<트리스ㆍ이미다졸 완충액>
B액 100 ㎖에 A액을 첨가하여 pH 8.4로 조정하고, 물로 10배로 희석한다.
A액 : 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올 3.03 g 및 이미다졸 1.70 g을 1 M 염산 50 ㎖에 용해하고, 물을 첨가하여 100 ㎖로 하고, 염화나트륨 11.7 g을 첨가하여 용해한다.
B액 : 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올 4.04 g, 이미다졸 2.27 g 및 염화나트륨 1.95 g을 물에 용해하여 100 ㎖로 하고, 염화나트륨 11.7 g 첨가하여 용해한다.
<20 mM 염화칼슘 용액>
60 mM 염화칼슘 용액 1 ㎖에 트리스ㆍ이미다졸 완충액 2 ㎖를 첨가한다.
<헤파린-안티트롬빈 III 용액>
2 U/㎖의 안티트롬빈 III(일본, 미쯔비시웰파마) 용액 7.5 ㎕, 트리스ㆍ이미다졸 완충액 42.5 ㎕ 및 30 U/㎖의 헤파린(일본, 모찌다 제약) 용액 50 ㎕를 첨가하여 흔들어 섞는다. 용시 조제하고, 사용 직전까지 빙랭한다.
(참고예 2) HCP 농도의 측정 방법
트롬보모듈린 유전자를 도입한 유전자 재조합 CHO 세포를 무혈청 배양한다. 배양 상청을 항트롬보모듈린 항체 컬럼에 이용하여 비흡착 획분을 얻는다. 이 비흡착 획분에 관해 참고예 1에 따라서 트롬보모듈린의 APC 활성을 측정하고, 활성이 검출되지 않은 것을 확인한 후, 한외여과막으로 농축한 것을 HCP로 한다. HCP를 항원으로서 토끼에게 감작하여 얻은 항 HCP 항혈청을 유안염석 및 프로테인 A 컬럼에 의해 정제한 후, 트롬보모듈린을 리간드로 한 어피니티 컬럼에 이용하여 비흡착 획분을 얻는다. 이와 같이 하여 트롬보모듈린을 인식하지 않은 토끼 항 HCP 항체를 얻는다.
예상되는 HCP 농도가 0～500 ng/㎖가 되도록 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 희석하여, 시료 용액으로 한다. 또한, 시료 용액의 HCP 농도가 낮은 경우는, 한외여과막 등을 사용하여 적절한 농도까지 농축한다. 별도로 HCP에 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS를 첨가하고, 그 1 ㎖ 중에 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25 및 0 ng을 포함하는 8 종류의 액을 조제하여, 표준 용액으로 한다.
폴리스티렌제 96 웰 플레이트에, 탄산나트륨 완충액으로 희석한 25 ㎍/㎖의 토끼 항 HCP 항체 용액을 1 웰당 100 ㎕씩 첨가한 후, 25℃에서 약 2 시간 정치한다. 이어서 250 ㎕의 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 각 웰을 5 회 세정하고, 1% 젤라틴을 포함하는 PBS를 200 ㎕씩 첨가하여, 25℃에서 약 1 시간 정치한다. 250 ㎕의 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 각 웰을 5 회 세정한 후, 100 ㎕의 시료 용액 및 표준 용액을 각각의 웰에 첨가하여, 25℃에서 약 16 시간 정치한다. 이어서 250 ㎕의 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 각 웰을 5 회 세정한 후, 비오틴화한 토끼 항 HCP 항체 용액을 100 ㎕씩 첨가하여, 25℃에서 약 2 시간 정치한다. 250 ㎕의 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 각 웰을 5 회 세정한 후, 아비딘-퍼옥시다아제 용액을 100 ㎕씩 첨가하여, 25℃에서 약 2 시간 정치한다. 250 ㎕의 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 각 웰을 5 회 세정한 후, 효소 기질 용액을 100 ㎕씩 첨가하여, 실온의 어두운 곳에 정치한다. 적당히 발색되면, 25% 황산을 50 ㎕씩 첨가하여 반응을 정지시키고, 96 웰 플레이트용 흡광도계(일본, 테칸재팬)로 492 nm의 흡광도를 측정한다. 표준 용액에 의한 검량선으로부터, 시료 1 ㎖ 중의 HCP 함량을 구한다. 또한, 본 측정법의 정량 한계의 일례는 25 ng/㎖이다. 필요에 따라서 다음 식에 따라서 트롬보모듈린 10,000 U 당의 HCP 함량을 산출한다.
트롬보모듈린 10,000 U 당의 HCP 함량 (ng/10,000 U)
=a/b×10,000
a : 시료 1 ㎖ 당의 HCP 함량 (ng/㎖)
b : 시료 1 ㎖ 당의 트롬보모듈린의 APC 활성 (U/㎖)
또한, 시약은 이하와 같다.
<탄산나트륨 완충액>
무수탄산나트륨 0.16 g 및 탄산수소나트륨 0.29 g에 물을 첨가하고 용해하여 100 ㎖로 한다.
<아비딘-퍼옥시다아제 용액>
아비딘 D를 결합한 서양 와사비 퍼옥시다아제 원액(미국, 벡터레보러토리즈)을, 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 약 30,000배로 희석한다.
<효소 기질 용액>
오르토-페닐렌디아민이염산염 10 ㎎을 시트르산ㆍ인산염 완충액(시트르산-수화물 2.56 g 및 인산수소이나트륨 12 수화물 9.12 g을 물에 용해하여 500 ㎖로 함) 20 ㎖에 첨가하여 용해하고, 사용하기 직전에 과산화수소수 10 ㎕를 첨가한다.
(참고예 3) 마우스 IgG 농도의 측정 방법
마우스 IgG를 항원으로서 토끼에게 감작하여 얻은 항마우스 IgG 항혈청을 유안염석 및 프로테인 A 컬럼에 의해 정제하여, 토끼 항마우스 IgG 항체를 얻는다.
예상되는 마우스 IgG 농도가 0～25 ng/㎖가 되도록 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 희석하여, 시료 용액으로 한다. 또한, 시료 용액의 IgG 농도가 낮은 경우는, 한외여과막 등을 사용하여 적절한 농도까지 농축한다. 별도로 마우스 IgG에 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS를 첨가하고, 그 1 ㎖ 중에 25, 20, 15, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.63 및 0 ng을 포함하는 9 종류의 액을 조제하여, 표준 용액으로 한다.
폴리스티렌제 96 웰 플레이트에, 탄산나트륨 완충액으로 희석한 1.5 ㎍/㎖의 토끼 항마우스 IgG 항체 용액을 1 웰당 100 ㎕씩 첨가한 후, 25℃에서 약 2 시간 정치한다. 이어서 250 ㎕의 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 각 웰을 5 회 세정하고, 1% 젤라틴을 포함하는 PBS를 200 ㎕씩 첨가하여, 25℃에서 약 1 시간 정치한다. 250 ㎕의 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 각 웰을 5 회 세정한 후, 100 ㎕의 시료 용액 및 표준 용액을 각각의 웰에 첨가하여, 25℃에서 약 16 시간 정치한다. 이어서 250 ㎕의 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 각 웰을 5 회 세정한 후, 비오틴화한 토끼 항마우스 IgG 항체 용액을 100 ㎕씩 첨가하여, 25℃에서 약 2 시간 정치한다. 250 ㎕의 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 각 웰을 5 회 세정한 후, 아비딘-퍼옥시다아제 용액을 100 ㎕씩 첨가하여, 25℃에서 약 2 시간 정치한다. 250 ㎕의 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 각 웰을 5 회 세정한 후, 효소 기질 용액을 100 ㎕씩 첨가하여, 실온 암소에 정치한다. 적당히 발색되면, 25% 황산을 50 ㎕씩 첨가하여 반응을 정지시키고, 96 웰 플레이트용 흡광도계(일본, 테칸재팬)로 492 nm의 흡광도를 측정한다. 표준 용액에 의한 검량선으로부터, 시료 1 ㎖ 중의 마우스 IgG 함량을 구한다. 본 측정법의 정량 한계의 일례는 0.63 ng/㎖이다. 필요에 따라서 다음 식에 따라서 트롬보모듈린 10,000 U 당의 마우스 IgG 함량을 산출한다.
트롬보모듈린 10,000 U 당의 마우스 IgG 함량 (ng/10,000 U)
=a/b×10,000
a : 시료 1 ㎖ 당의 마우스 IgG 함량 (ng/㎖)
b : 시료 1 ㎖ 당의 트롬보모듈린의 APC 활성 (U/㎖)
또한, 시약은 이하와 같다.
<탄산나트륨 완충액>
무수탄산나트륨 0.16 g 및 탄산수소나트륨 0.29 g에 물을 첨가하고 용해하여 100 ㎖로 한다.
<아비딘-퍼옥시다아제 용액>
아비딘 D를 결합한 서양 와사비 퍼옥시다아제 원액(미국, 벡터레보러토리즈)을, 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 약 30,000배로 희석한다.
<효소 기질 용액>
오르토-페닐렌디아민이염산염 10 ㎎을 시트르산ㆍ인산염 완충액(시트르산-수화물 2.56 g 및 인산수소이나트륨 12 수화물 9.12 g을 물에 용해하여 500 ㎖로 함) 20 ㎖에 첨가하여 용해하고, 사용하기 직전에 과산화수소수 10 ㎕를 첨가한다.
(참고예 4) 소혈청 단백질 농도의 측정 방법
소혈청을 항원으로서 토끼에게 감작하여 얻은 항 소혈청 단백질 항혈청을 유안염석 및 프로테인 A 컬럼에 의해 정제하여, 토끼 항 소혈청 단백질 항체를 얻는다.
예상되는 소혈청 단백질 농도가 0～25 ng/㎖가 되도록 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 희석하여, 시료 용액으로 한다. 또한, 시료 용액의 소혈청 단백질 농도가 낮은 경우는, 한외여과막 등을 사용하여 적절한 농도까지 농축한다. 별도로 소혈청에 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS를 첨가하고, 그 1 ㎖ 중에 25, 20, 15, 10, 5, 2.5, 1.25 및 0 ng을 포함하는 8 종류의 액을 조제하여, 표준 용액으로 한다.
폴리스티렌제 96 웰 플레이트에, 탄산나트륨 완충액으로 희석한 10 ㎍/㎖의 토끼 항 소혈청 단백질 항체 용액을 1 웰당 100 ㎕씩 첨가한 후, 25℃에서 약 2 시간 정치한다. 이어서 250 ㎕의 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 각 웰을 5 회 세정하고, 1% 젤라틴을 포함하는 PBS를 200 ㎕씩 첨가하여, 25℃에서 약 1 시간 정치한다. 250 ㎕의 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 각 웰을 5 회 세정한 후, 100 ㎕의 시료 용액 및 표준 용액을 각각의 웰에 첨가하여, 25℃에서 약 16 시간 정치한다. 이어서 250 ㎕의 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 각 웰을 5 회 세정한 후, 비오틴화한 토끼 항 소혈청 단백질 항체 용액을 100 ㎕씩 첨가하여, 25℃에서 약 2 시간 정치한다. 250 ㎕의 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 각 웰을 5 회 세정한 후, 아비딘-퍼옥시다아제 용액을 100 ㎕씩 첨가하여, 25℃에서 약 2 시간 정치한다. 250 ㎕의 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 각 웰을 5 회 세정한 후, 효소 기질 용액을 100 ㎕씩 첨가하여, 실온 암소에 정치한다. 적당히 발색되면, 25% 황산을 50 ㎕씩 첨가하여 반응을 정지시키고, 96 웰 플레이트용 흡광도계(일본, 테칸재팬)로 492 nm의 흡광도를 측정한다. 표준 용액에 의한 검량선으로부터, 시료 1 ㎖ 중의 소혈청 단백질 함량을 구한다. 본 측정법의 정량 한계의 일례는 1.25 ng/㎖이다. 필요에 따라서 다음 식에 따라서 트롬보모듈린 10,000 U 당의 소혈청 단백질 함량을 산출한다.
트롬보모듈린 10,000 U 당의 소혈청 단백질 함량 (ng/10,000 U)
=a/b×10,000
a : 시료 1 ㎖ 당의 소혈청 단백질 함량 (ng/㎖)
b : 시료 1 ㎖ 당의 트롬보모듈린의 APC 활성 (U/㎖)
또한, 시약은 이하와 같다.
<탄산나트륨 완충액>
무수탄산나트륨 0.16 g 및 탄산수소나트륨 0.29 g에 물을 첨가하고 용해하여 100 ㎖로 한다.
<아비딘-퍼옥시다아제 용액>
아비딘 D를 결합한 서양 와사비 퍼옥시다아제 원액(미국, 벡터레보러토리즈)을, 0.05% 폴리솔베이트 80을 포함하는 PBS로 약 30,000배로 희석한다.
<효소 기질 용액>
오르토-페닐렌디아민이염산염 10 ㎎을 시트르산ㆍ인산염 완충액(시트르산-수화물 2.56 g 및 인산수소이나트륨 12 수화물 9.12 g을 물에 용해하여 500 ㎖로 함) 20 ㎖에 첨가하여 용해하고, 사용하기 직전에 과산화수소수 10 ㎕를 첨가한다.
(비교예 1) 가용성 트롬보모듈린의 제조 1
일본 특허공개 평11-341990호 공보의 실시예 1에 따라서, 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 유전자 조작 기술에 의해 삽입한 유전자 재조합 CHO 세포를 제작한 후, 150 ㎎/L의 L-프롤린(일본, 아지노모토), 60 ㎎/L의 카나마이신황산염(일본, 메이지 제과), 1 ㎎/L의 주석산타일로신(일본, 메르샨) 및 10% 소혈청(미국, 하이크론)을 포함하는 DMEM 배지(미국, 인비트로젠)에 파종하여, CO2 인큐베이터 내, 37℃에서 배양했다. 배양액을 원심 분리하여 얻어진 세포를 150 ㎎/L의 L-프롤린(일본, 아지노모토), 60 ㎎/L의 카나마이신황산염(일본, 메이지 제과), 1 ㎎/L의 주석산타일로신(일본, 메르샨), 10% 디메틸술폭시드(독일, 메르크) 및 10% 소혈청(미국, 하이크론)을 포함하는 DMEM 배지(미국, 인비트로젠)에 현탁한 후, 바이알에 분주하여(4×107 cells/개), 액체 질소 중에 동결 보존했다.
일본 특허공개 평11-341990호 공보의 성분표 2에 표시된 배지의 NaHCO3 농도를 5,700 ㎎/L로, NaCl 농도를 2,410 ㎎/L로 개변한 것을 기본 배지로 하여 세포 배양을 행했다. 증식 배지는 기본 배지에 60 ㎎/L의 카나마이신황산염(미국, 인비트로젠), 1 ㎎/L의 주석산타일로신(미국, 시그마알드리치) 및 8% 소혈청(미국, 하이크론)을 첨가하여 이용했다. 또, 생산 배지는 증식 배지의 혈청 농도를 3%로 했다.
세포의 바이알 1개를 융해하여, 그 세포를 100 ㎖의 증식 배지에 파종하고, CO2 인큐베이터 내, 스피너 플라스크를 이용하여 37℃에서 5 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 전량을 0.9 L의 증식 배지에 계대하고, CO2 인큐베이터 내, 스피너 플라스크를 이용하여 37℃에서 5 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 전량을 9 L의 증식 배지에 계대하고, 배양조를 이용하여 37℃, pH 7.2, 용존 산소 50%로 5 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 전량을 120 L의 증식 배지에 계대하고, 관류 배양조를 이용하여 37℃, pH 7.2, 용존 산소 50%로 7 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 생산 배지의 첨가와 배양 상청액의 회수를 연속적으로 행하는 관류 배양을 시작했다. 배양 조건은, 37℃, pH 7.2, 용존 산소 50%, 배지 교환 130～200 L/day, 상면 가압 0～0.2 MPa로 했다. 생세포 밀도가 7.5×106 cells/㎖에 도달하고 나서 36 일간 배양을 계속하여, 배양 상청액을 생산액으로서 회수했다. 회수한 생산액은 여과 필터의 수프라디스크 II(미국, 폴) 및 스포어 EBV(미국, 폴)를 이용하여 징명화하여, 여과후 생산액으로서 2～10℃에서 보존했다.
약 700 L의 여과후 생산액을, 150 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 평형화한 Q-Sepharose Fast Flow(미국, GE 헬스케어) 컬럼(직경 63 cm, 높이 25 cm)에 이용했다. 다음으로 6 컬럼 볼륨(CV)의 180 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 아세트산 완충액(pH 5.5)으로 세정하고, 다시 280 nm의 흡수가 베이스라인으로 되돌아갈 때까지 180 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 세정을 행하고, 300 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터의 0.5 컬럼 볼륨 용량의 용출액을 조정제액으로서 취득했다. 동일한 조작을 6 회 반복 실시하여, 6 로트의 조정제액을 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 109 L/h로 실시했다.
일본 특허공개 평11-341990호 공보의 실시예 10에 따라서, 인간 폐 유래 트롬보모듈린을 항원으로 한 항트롬보모듈린 모노클로날 항체를 제작하고, CNBr-activated Sepharose 4Fast Flow(미국, GE 헬스케어)와 접촉 반응시켜, 항트롬보모듈린 모노클로날 항체를 커플링하고, 항트롬보모듈린 모노클로날 항체 결합 Sepharose 4Fast Flow를 제작하고, 컬럼에 충전하여 모노클로날 항체 컬럼으로 했다. 약 40 L의 조정제액을, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 모노클로날 항체 컬럼(직경 44 cm, 높이 13 cm)에 이용했다. 6 CV의 1.0 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)을 흘리고, 다시 3 CV의 0.1 M 아세트산 완충액(pH 5.0)을 흘려 세정하고, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.0)으로 용출을 시작했다. 용출액의 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터 하강까지의 용출액을 얻고, 용출액에 1/10 용량의 0.5 M 인산 완충액(pH 7.3)을 첨가하여 정제액 1로서 취득했다. 동일한 조작을 6 회 반복 실시하여, 6 로트의 정제액 1을 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 46 L/h로 실시했다.
6 로트분의 정제액 1 약 170 L를 1.0 M 글리신염산 완충액(pH 2.0)으로 pH 3.5로 조제하여, 0.3 M NaCl을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.5)으로 평형화한 SP-SepharoseFF(미국 GE 헬스케어바이오사이언스) 컬럼(직경 45 cm, 높이 10 cm)에 이용했다. 0.3 M NaCl을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.5)으로 세정을 시작하여, 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터 하강까지의 통과 획분을 얻고, 즉시 0.5 M 인산 완충액(pH 7.3)으로 pH 7로 중화하여, 정제액 2로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 160 L/h로 실시했다.
약 200 L의 정제액 2를 한외여과막인 마이크로자 UF 모듈 SIP-2013(일본, 아사히카세이케미컬)으로 약 10 L까지 농축한 후에, 50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 Sephacryl S-300 HR(미국 GE 헬스케어바이오사이언스) 컬럼(직경 63 cm, 높이 94 cm)에 이용했다. 280 nm에서의 흡수가 가장 큰 용출 피크를 분취한 후, 한외여과막인 마이크로자 UF 모듈 SIP-1013(일본, 아사히카세이케미컬)으로 약 12 L까지 농축하여, 정제액 3으로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 6.2 L/h로 실시했다.
실온하에서, 정제액 3을 50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 바이러스 제거막의 PLANOVA 15N(일본, 아사히카세이메디컬, 막면적 1 ㎡)에 압력 0.1 MPa 이하로 통액후, 다시 0.22 ㎛의 PVDF제 여과막(미국, 밀리포어)에 통액하여 전량을 회수했다. 이것을 가용성 트롬보모듈린 정제품으로 했다.
동일한 조작에 의해 3 로트(A1, A2, A3)의 정제품을 취득했다.
A1, A2, A3의 트롬보모듈린의 APC 활성은, 각각 69000 U/㎖, 68000 U/㎖, 72000 U/㎖였다.
A1, A2, A3의 용액에서의 가용성 트롬보모듈린 농도는, 각각 10.5 ㎎/㎖, 10.2 ㎎/㎖, 10.3 ㎎/㎖였다.
(비교예 2) 가용성 트롬보모듈린의 제조 2
일본 특허공개 평11-341990호 공보의 성분표 2에 표시된 배지를 기본 배지로서 사용했다. 증식 배지는 기본 배지에 60 ㎎/L의 카나마이신황산염(미국, 인비트로젠), 1 ㎎/L의 주석산타일로신(일본, 시오노기 제약) 및 8% 소혈청(미국, 하이크론)을 첨가하여 이용했다. 또, 생산 배지는 증식 배지의 혈청 농도를 4%로 했다.
비교예 1에서 제작한 세포의 바이알 1개를 융해하여, 그 세포를 100 ㎖의 증식 배지에 파종하고, CO2 인큐베이터 내, 스피너 플라스크를 이용하여 37℃에서 3 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 5.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 전량을 400 ㎖의 증식 배지에 계대하고, CO2 인큐베이터 내, 스피너 플라스크를 이용하여 37℃에서 3 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 5.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 전량을 2 L의 증식 배지에 계대하고, CO2 인큐베이터 내, 구형 보틀을 이용하여 37℃에서 3 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 5.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 전량을 7.5 L의 증식 배지에 계대하고, CO2 인큐베이터 내, 구형 보틀을 이용하여 37℃에서 4 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 5.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 생산 배지의 첨가와 배양 상청액의 회수를 연속적으로 행하는 관류 배양을 시작했다. 배양 조건은, 37℃, pH 7.2, 용존 산소 50%, 배지 교환 10 L/day, 상면 가압 0～0.2 MPa로 했다. 생세포 밀도가 7.5×106 cells/㎖에 도달하고 나서 40 일간 배양을 계속하여, 배양 상청액을 생산액으로서 회수했다.
회수한 생산액은, 구멍 직경 0.7 ㎛ 및 0.22 ㎛의 여과 필터(미국, 폴)를 이용하여 징명화하여, 여과후 생산액으로서 2～10℃에서 보존했다.
약 400 L의 여과후 생산액을, 150 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.4)으로 평형화한 Q-Sepharose Fast Flow(미국, GE 헬스케어) 컬럼(직경 44 cm, 높이 26 cm)에 이용했다. 다음으로 6 CV의 180 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 아세트산 완충액(pH 5.5)으로 세정하고, 다시 280 nm의 흡수가 베이스라인으로 되돌아갈 때까지 180 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.4)으로 세정을 행하고, 300 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.4)으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터의 0.5 컬럼 볼륨 용량의 용출액을 조정제액으로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 45 L/h로 실시했다.
약 20 L의 조정제액을, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 모노클로날 항체 컬럼(직경 44 cm, 높이 12 cm)에 이용했다. 6 CV의 1.0 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)을 흘리고, 다시 3 CV의 0.1 M 아세트산 완충액(pH 5.0)을 흘려 세정하고, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.0)으로 용출을 시작했다. 용출액의 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터 하강까지의 용출액을 얻고, 용출액에 1/10 용량의 0.5 M 인산 완충액(pH 7.3)을 첨가하여 정제액 1로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 45 L/h로 실시했다.
약 12 L의 정제액 1을 1.0 M 글리신염산 완충액(pH 2.0)으로 pH 3.5로 조제하여, 0.3 M NaCl을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.5)으로 평형화한 SP-SepharoseFF(미국 GE 헬스케어바이오사이언스) 컬럼(직경 14 cm, 높이 13 cm)에 이용했다. 0.3 M NaCl을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.5)으로 세정을 시작하여, 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터 하강까지의 통과 획분을 얻고, 즉시 0.5 M 인산 완충액(pH 7.3)으로 pH 7로 중화하여, 정제액 2로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 15 L/h로 실시했다.
약 16 L의 정제액 2를 한외여과막인 마이크로자 UF 모듈 SIP-1013(일본, 아사히카세이케미컬)으로 약 1.2 L까지 농축한 후에 50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 Sephacryl S-300 HR(미국 GE 헬스케어바이오사이언스) 컬럼(직경 25 cm, 높이 85 cm)에 이용했다. 280 nm에서의 흡수가 가장 큰 용출 피크를 분취한 후, 한외여과막인 마이크로자 UF 모듈 SIP-1013(일본, 아사히카세이케미컬)으로 약 0.8 L까지 농축하여, 정제액 3으로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 1 L/h로 실시했다.
실온하에서, 정제액 3을 50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 바이러스 제거막의 PLANOVA 15N(일본, 아사히카세이메디컬, 막면적 0.3 ㎡)에 압력 0.1 MPa 이하로 통액후, 다시 0.22 ㎛의 PVDF제 여과막(미국, 밀리포어)에 통액하여 전량을 회수했다. 이것을 가용성 트롬보모듈린 정제품으로 했다(로트 : B1).
B1의 트롬보모듈린의 APC 활성은 79000 U/㎖였다.
B1의 용액에서의 가용성 트롬보모듈린 농도는 12.6 ㎎/㎖였다.
(비교예 3) 가용성 트롬보모듈린의 제조 3
DMEM 배지(미국, 인비트로젠)를 기본 배지로서 사용했다. 증식 배지는 기본 배지에 150 ㎎/L의 L-프롤린(일본, 아지노모토), 60 ㎎/L의 카나마이신황산염(일본, 메이지 제과), 1 ㎎/L의 주석산타일로신(일본, 메르샨) 및 10% 소혈청(미국, 하이크론)을 첨가하여 이용했다. 또, 생산 배지는 증식 배지의 혈청 농도를 1～3%로 했다.
비교예 1에서 제작한 세포의 바이알 1개를 융해하여, 그 세포를 100 ㎖의 증식 배지에 파종하고, CO2 인큐베이터 내, 스피너 플라스크를 이용하여 37℃에서 5 일간 교반 배양했다. 배양액 전량을 400 ㎖의 증식 배지에 계대하고, CO2 인큐베이터 내, 스피너 플라스크를 이용하여 37℃에서 5 일간 교반 배양했다. 배양액 전량을 1.6 L의 증식 배지에 계대하고, 에어와 CO2를 불어 넣으면서 구형 보틀을 이용하여 37℃에서 5 일간 교반 배양했다. 배양액 전량을 6 L의 증식 배지에 계대하고, 에어, CO2 및 산소를 불어 넣으면서 구형 보틀을 이용하여 37℃에서 5 일간 교반 배양했다. 배양액 전량을 56 L의 증식 배지에 계대하고, 에어, CO2 및 산소를 불어 넣으면서 구형 보틀을 이용하여 37℃에서 4 일간 교반 배양했다. 전량 배지 교환을 행한 후에 3 일간 배양하고, 다시 전량 배지 교환한 후, 생세포 밀도가 1×106 cells/㎖에 도달하고 나서 생산 배지로 전환했다. CC-100 연속 원심 분리기(스웨덴, 알파라발)를 이용하여 매일 생산액을 회수하고, 신선 배지로 교환했다. 생산 배양은 100 일간 실시했다. 회수한 생산액은, 구멍 직경 0.7 ㎛ 및 0.22 ㎛의 여과 필터(미국, 폴)를 이용하여 징명화하여, 여과후 생산액으로서 2～10℃에서 보존했다.
약 2400 L의 여과후 생산액을, 150 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.4)으로 평형화한 Q-Sepharose Fast Flow(미국, GE 헬스케어) 컬럼(직경 44 cm, 높이 25 cm)에 이용했다. 다음으로 6 CV의 180 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 아세트산 완충액(pH 5.5)으로 세정하고, 다시 2 CV의 180 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.4)으로 세정을 행하고, 300 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.4)으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터 약 15 L의 용출액을 조정제액 1로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 45 L/h로 실시했다.
상기 조정제액 1을, 0.3 M NaCl을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 Butyl-SepharoseFF(미국 GE 헬스케어바이오사이언스) 컬럼(직경 25 cm, 높이 10cm)에 이용했다. 0.3 M NaCl을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 세정을 시작하여, 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터 하강까지의 통과 획분을 조정제액 2로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 13 L/h로 실시했다.
약 20 L의 조정제액을, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 모노클로날 항체 컬럼(직경 44 cm, 높이 18cm)에 이용했다. 6 CV의 1.0 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)을 흘리고, 다시 3 CV의 0.1 M 아세트산 완충액(pH 5.0)을 흘려 세정하고, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.0)으로 용출을 시작했다. 용출액의 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터 하강까지의 용출액을 얻고, 용출액에 1/10 용량의 1 M 글리신-수산화나트륨 완충액(pH 9.0)과 1/25 용량의 0.5 M 인산 완충액(pH 7.3)을 첨가하여 정제액 1로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 50 L/h로 실시했다.
약 15 L의 정제액 1을 한외여과막인 마이크로자 UF 모듈 SIP-1013(일본, 아사히카세이케미컬)으로 약 1 L까지 농축한 후에 150 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 Sephacryl S-300 HR(미국 GE 헬스케어바이오사이언스) 컬럼(직경 25 cm, 높이 80cm)에 이용했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 1 L/h로 실시했다. 280 nm에서의 흡수가 가장 큰 용출 피크를 분취한 후, 0.22 ㎛의 PVDF제 여과막(미국, 밀리포어)에 통액하여 약 3 L를 회수했다. 이것을 가용성 트롬보모듈린 정제품으로 했다(로트 : B2).
B2의 트롬보모듈린의 APC 활성은 28000 U/㎖였다.
B2의 용액에서의 가용성 트롬보모듈린 농도는 3.8 ㎎/㎖였다.
(비교예 4) 가용성 트롬보모듈린의 제조 4
비교예 1에서 동결 보존된 세포의 바이알을 1개 융해하고, 8 mM의 L-글루타민(미국, 인비트로젠), 50 μM의 하이포크산틴(미국, 인비트로젠) 및 8 μM의 티미딘(미국, 인비트로젠)을 포함하는 무혈청 배지 IS CHO-CD(미국, 어바인 사이언티픽)에 파종하여, CO2 인큐베이터 내, 37℃에서 배양했다. 배양액을 원심 분리하여 얻어진 세포를 8 mM의 L-글루타민(미국, 인비트로젠), 50 μM의 하이포크산틴(미국, 인비트로젠), 8 μM의 티미딘(미국, 인비트로젠) 및 10% 디메틸술폭시드(미국, 시그마알드리치)를 포함하는 무혈청 배지 IS CHO-CD(미국, 어바인 사이언티픽)에 현탁한 후 바이알에 분주하여(2×107 cells/개), 액체 질소 중에 동결 보존했다.
증식 배지는 1 L의 물에 대하여, 20.78 g의 IS CHO-CD-A3(미국, 어바인 사이언티픽), 4.06 g의 염화나트륨(일본, 토미타 제약) 및 2.20 g의 탄산수소나트륨(일본, 와코쥰야쿠 공업)을 용해하여 제작했다. 또, 생산 배지는 1 L의 물에 대하여, 20.78 g의 IS CHO-CD-A3(미국, 어바인 사이언티픽), 2.63 g의 염화나트륨(일본, 토미타 제약) 및 4.40 g의 탄산수소나트륨(일본, 와코쥰야쿠 공업)을 용해하여 제작했다.
세포의 바이알 1개를 융해하여, 그 세포를 100 ㎖의 증식 배지에 파종하고, CO2 인큐베이터 내, T-플라스크를 이용하여 36℃에서 5 일간 정치 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 40 ㎖를 360 ㎖의 증식 배지에 계대하고, CO2 인큐베이터 내, 스피너 플라스크를 이용하여 36℃에서 7 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 80 ㎖를 720 ㎖의 증식 배지에 계대하고, CO2 인큐베이터 내, 스피너 플라스크를 이용하여 36℃에서 6 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 전량을 9.2 L의 증식 배지에 계대하고, 관류 배양조를 이용하여 36℃, pH 7.1, 용존 산소 50%로 8 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 생산 배지의 첨가와 배양 상청액의 회수를 연속적으로 행하는 관류 배양을 시작했다. 배양 조건은, 36℃, pH 7.1, 용존 산소 50%, 배지 교환 10 L/day, 상면 가압 0～0.2 MPa로 했다. 생세포 밀도가 7.5×106 cells/㎖에 도달하고 나서 26 일간 배양을 계속하여, 배양 상청액을 생산액으로서 회수했다.
회수한 생산액은 여과 필터의 수프라캡(미국, 폴) 및 스포어 EBV(미국, 폴)를 이용하여 징명화하여, 여과후 생산액으로서 2～10℃에서 보존했다.
약 250 L의 여과후 생산액을, 150 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 평형화한 Q-Sepharose Fast Flow(미국, GE 헬스케어) 컬럼(직경 25 cm, 높이 25 cm)에 이용했다. 다음으로 6 CV의 180 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 아세트산 완충액(pH 5.6)으로 세정하고, 다시 4 CV의 180 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 세정을 행하고, 290 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터의 0.5 컬럼 볼륨 용량의 용출액을 조정제액으로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 18 L/h로 실시했다.
약 6 L의 상기 조정제액을, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 모노클로날 항체 컬럼(직경 44 cm, 높이 8cm)에 이용했다. 6 CV의 1.0 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)을 흘리고, 다시 3 CV의 0.1 M 아세트산 완충액(pH 5.0)을 흘려 세정하고, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.0)으로 용출을 시작했다. 용출액의 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터 하강까지의 용출액을 얻고, 용출액에 1/10 용량의 0.5 M 인산 완충액(pH 7.3)을 첨가하여 정제액 1로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 46 L/h로 실시했다.
약 14 L의 정제액 1을 1.0 M 글리신염산 완충액(pH 2.0)으로 pH 3.5로 조제하여, 0.3 M NaCl을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.5)으로 평형화한 SP-SepharoseFF(미국 GE 헬스케어바이오사이언스) 컬럼(직경 14 cm, 높이 13 cm)에 이용했다. 0.3 M NaCl을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.5)으로 세정을 시작하여, 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터 하강까지의 통과 획분을 얻고, 즉시 0.5 M 인산 완충액(pH 7.3)으로 pH 7로 중화하여, 정제액 2로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 15 L/h로 실시했다.
약 20 L의 정제액 2를 한외여과막인 마이크로자 UF 모듈 SIP-1013(일본, 아사히카세이케미컬)으로 약 1 L까지 농축한 후에 50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 Sephacryl S-300 HR(미국 GE 헬스케어바이오사이언스) 컬럼(직경 25 cm, 높이 79 cm)에 이용했다. 280 nm에서의 흡수가 가장 큰 용출 피크를 분취한 후, 한외여과막인 마이크로자 UF 모듈 SIP-1013(일본, 아사히카세이케미컬)으로 약 0.7 L까지 농축하여, 정제액 3으로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 1 L/h로 실시했다.
실온하에서, 정제액 3 전량을 50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 바이러스 제거막의 PLANOVA 15N(일본, 아사히카세이메디컬, 막면적 0.12 ㎡)에 압력 0.1 MPa 이하로 통액후, 다시 0.22 ㎛의 PVDF제 여과막(미국, 밀리포어)에 통액하여 전량을 회수했다. 이것을 가용성 트롬보모듈린 정제품으로 했다(로트 : B3).
(실시예 1) 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조 1
일본 특허공개 평11-341990호 공보의 성분표 2에 표시된 배지의 NaHCO3 농도를 5,700 ㎎/L로, NaCl 농도를 2,410 ㎎/L로 개변한 것을 기본 배지로 하여 세포 배양을 행했다. 증식 배지는 기본 배지에 60 ㎎/L의 카나마이신황산염(미국, 인비트로젠), 1 ㎎/L의 주석산타일로신(미국, 시그마알드리치) 및 8% 소혈청(미국, 하이크론)을 첨가하여 이용했다. 또, 생산 배지는 증식 배지의 혈청 농도를 3%로 했다.
비교예 1에서 제작한 세포의 바이알 1개를 융해하여, 그 세포를 100 ㎖의 증식 배지에 파종하고, CO2 인큐베이터 내, 스피너 플라스크를 이용하여 37℃에서 5 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 전량을 0.9 L의 증식 배지에 계대하고, CO2 인큐베이터 내, 스피너 플라스크를 이용하여 37℃에서 5 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 전량을 9 L의 증식 배지에 계대하고, 배양조를 이용하여 37℃, pH 7.2, 용존 산소 50%로 5 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 전량을 120 L의 증식 배지에 계대하고, 관류 배양조를 이용하여 37℃, pH 7.2, 용존 산소 50%로 7 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 생산 배지의 첨가와 배양 상청액의 회수를 연속적으로 행하는 관류 배양을 시작했다. 배양 조건은, 37℃, pH 7.2, 용존 산소 50%, 배지 교환 130～200 L/day, 상면 가압 0～0.2 MPa로 했다. 생세포 밀도가 7.5×106 cells/㎖에 도달하고 나서 40 일간 배양을 계속하여, 배양 상청액을 생산액으로서 회수했다. 회수한 생산액은 여과 필터의 수프라디스크 II(미국, 폴) 및 스포어 EBV(미국, 폴)를 이용하여 징명화하여, 여과후 생산액으로서 2～10℃에서 보존했다.
약 700 L의 여과후 생산액을, 150 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 평형화한 Q-Sepharose Fast Flow(미국, GE 헬스케어) 컬럼(직경 63 cm, 높이 25 cm)에 이용했다. 다음으로 6 CV의 180 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 아세트산 완충액(pH 5.5)으로 세정하고, 다시 280 nm의 흡수가 베이스라인으로 되돌아갈 때까지 180 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 세정을 행하고, 300 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터의 0.5 컬럼 볼륨 용량의 용출액을 조정제액으로서 취득했다. 동일한 조작을 3회 반복 실시하여, 3 로트의 조정제액을 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 109 L/h로 실시했다.
약 20 L의 조정제액을, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 모노클로날 항체 컬럼(직경 44 cm, 높이 13 cm)에 이용했다. 6 CV의 1.0 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)을 흘리고, 다시 3 CV의 0.1 M 아세트산 완충액(pH 5.0)을 흘려 세정하고, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.0)으로 용출을 시작했다. 용출액의 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터 하강까지의 용출액을 얻고, 용출액에 1/10 용량의 0.5 M 인산 완충액(pH 7.3)을 첨가하여 정제액 1로서 취득했다. 동일한 조작을 6 회 반복 실시하여, 6 로트의 정제액 1을 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 46 L/h로 실시했다.
6 로트분의 정제액 1 약 130 L를 나일론제 여과막(독일, 싸토리우스사, SARTOLON Maxi Caps 5101307H3, 구멍 직경 0.4 ㎛+0.2 ㎛, 막면적 1.8 ㎡)에 5 L/분의 유속으로 통액한 후(HCP 1 ㎎에 대하여 약 0.07 ㎡ 막면적을 사용), 1.0 M 글리신염산 완충액(pH 2.0)으로 pH 3.5로 조제하여, 0.3 M NaCl을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.5)으로 평형화한 SP-SepharoseFF(미국 GE 헬스케어바이오사이언스) 컬럼(직경 45 cm, 높이 10cm)에 이용했다. 0.3 M NaCl을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.5)으로 세정을 시작하여, 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터 하강까지의 통과 획분을 얻고, 즉시 0.5 M 인산 완충액(pH 7.3)으로 pH 7로 중화하여, 정제액 2로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 160 L/h로 실시했다.
약 160 L의 정제액 2를 한외여과막인 마이크로자 UF 모듈 SIP-2013(일본, 아사히카세이케미컬)으로 약 10 L까지 농축한 후에, 50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 Sephacryl S-300 HR(미국 GE 헬스케어바이오사이언스) 컬럼(직경 63 cm, 높이 94 cm)에 이용했다. 280 nm에서의 흡수가 가장 큰 용출 피크를 분취한 후, 한외여과막인 마이크로자 UF 모듈 SIP-1013(일본, 아사히카세이케미컬)으로 약 6 L까지 농축하여, 정제액 3으로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 6.2 L/h로 실시했다.
실온하에서, 정제액 3을 50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 바이러스 제거막의 PLANOVA 15N(일본, 아사히카세이메디컬, 막면적 1 ㎡)에 압력 0.1 MPa 이하로 통액후, 다시 0.22 ㎛의 PVDF제 여과막(미국, 밀리포어)에 통액하여 전량을 회수했다. 이것을 고순도 가용성 트롬보모듈린 정제품(로트 : A4)으로 했다.
A4의 트롬보모듈린의 APC 활성은 60000 U/㎖였다.
A4의 용액에서의 가용성 트롬보모듈린 농도는 9.3 ㎎/㎖였다.
(실시예 2) 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조 2
실시예 1에서 취득한 약 2,000 L의 여과후 생산액을, 150 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 평형화한 Q-Sepharose Fast Flow(미국, GE 헬스케어) 컬럼(직경 63 cm, 높이 25 cm)에 이용했다. 다음으로 6 CV의 170 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 아세트산 완충액(pH 5.45)으로 세정하고, 다시 4 CV의 170 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 세정을 행하고, 300 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터의 0.5 컬럼 볼륨 용량의 용출액을 조정제액으로서 취득했다. 동일한 조작을 2 회 반복 실시하여, 2 로트의 조정제액을 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 109 L/h로 실시했다.
약 10 L의 조정제액을, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 모노클로날 항체 컬럼(직경 44 cm, 높이 13 cm)에 이용했다. 6 CV의 1.0 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)을 흘리고, 다시 3 CV의 0.1 M 아세트산 완충액(pH 5.0)을 흘려 세정하고, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.0)으로 용출을 시작했다. 용출액의 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터 하강까지의 용출액을 얻고, 용출액에 1/10 용량의 0.5 M 인산 완충액(pH 7.3)을 첨가하여 정제액 1로서 취득했다. 동일한 조작을 8회 반복 실시하여, 8 로트의 정제액 1을 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 46 L/h로 실시했다.
6 로트분의 정제액 1 약 180 L를 나일론제 여과막(독일, 싸토리우스사, SARTOLON Maxi Caps 5101307H3, 구멍 직경 0.4 ㎛+0.2 ㎛, 막면적 1.8 ㎡)에 5 L/분의 유속으로 통액한 후(HCP 1 ㎎에 대하여 약 0.05 ㎡ 막면적을 사용), 1.0 M 글리신염산 완충액(pH 2.0)으로 pH 3.5로 조제하여, 0.3 M NaCl을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.5)으로 평형화한 SP-SepharoseFF(미국 GE 헬스케어바이오사이언스) 컬럼(직경 45 cm, 높이 10cm)에 이용했다. 0.3 M NaCl을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.5)으로 세정을 시작하여, 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터 하강까지의 통과 획분을 얻고, 즉시 0.5 M 인산 완충액(pH 7.3)으로 pH 7로 중화하여, 정제액 2로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 160 L/h로 실시했다.
약 220 L의 정제액 2를 한외여과막인 마이크로자 UF 모듈 SIP-2013(일본, 아사히카세이케미컬)으로 약 5 L까지 농축한 후에, 50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 Sephacryl S-300 HR(미국 GE 헬스케어바이오사이언스) 컬럼(직경 63 cm, 높이 94 cm)에 이용했다. 280 nm에서의 흡수가 가장 큰 용출 피크를 분취한 후, 한외여과막인 마이크로자 UF 모듈 SIP-1013(일본, 아사히카세이케미컬)으로 약 10 L까지 농축하여, 정제액 3으로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 6.2 L/h로 실시했다.
실온하에서, 정제액 3을 50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 바이러스 제거막의 PLANOVA 15N(일본, 아사히카세이메디컬, 막면적 1 ㎡)에 압력 0.1 MPa 이하로 통액후, 다시 0.22 ㎛의 PVDF제 여과막(미국, 밀리포어)에 통액하여 전량을 회수했다. 이것을 고순도 가용성 트롬보모듈린 정제품(로트 : A5)으로 했다.
A5의 트롬보모듈린의 APC 활성은 69000 U/㎖였다.
A5의 용액에서의 가용성 트롬보모듈린 농도는 10.9 ㎎/㎖였다.
(실시예 3) 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조 3
일본 특허공개 평11-341990호 공보의 성분표 2에 표시된 배지의 NaHCO3 농도를 5,700 ㎎/L로, NaCl 농도를 2,410 ㎎/L로 개변한 것을 기본 배지로 하여 세포 배양을 행했다. 증식 배지는 기본 배지에 60 ㎎/L의 카나마이신황산염(미국, 인비트로젠), 1 ㎎/L의 주석산타일로신(미국, 시그마알드리치) 및 8% 소혈청(미국, 하이크론)을 첨가하여 이용했다. 또, 생산 배지는 증식 배지의 혈청 농도를 3%로 했다.
비교예 1에서 제작한 세포의 바이알 1개를 융해하여, 그 세포를 100 ㎖의 증식 배지에 파종하고, CO2 인큐베이터 내, 스피너 플라스크를 이용하여 37℃에서 5 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 전량을 0.9 L의 증식 배지에 계대하고, CO2 인큐베이터 내, 스피너 플라스크를 이용하여 37℃에서 5 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 전량을 9 L의 증식 배지에 계대하고, 배양조를 이용하여 37℃, pH 7.2, 용존 산소 50%로 5 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 전량을 120 L의 증식 배지에 계대하고, 관류 배양조를 이용하여 37℃, pH 7.2, 용존 산소 50%로 7 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 생산 배지의 첨가와 배양 상청액의 회수를 연속적으로 행하는 관류 배양을 시작했다. 배양 조건은, 37℃, pH 7.2, 용존 산소 50%, 배지 교환 130～200 L/day, 상면 가압 0～0.2 MPa로 했다. 생세포 밀도가 7.5×106 cells/㎖에 도달하고 나서 36 일간 배양을 계속하여, 배양 상청액을 생산액으로서 회수했다. 회수한 생산액은 여과 필터의 수프라디스크 II(미국, 폴) 및 스포어 EBV(미국, 폴)를 이용하여 징명화하여, 여과후 생산액으로서 2～10℃에서 보존했다.
약 700 L의 여과후 생산액을, 150 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 평형화한 Q-Sepharose Fast Flow(미국, GE 헬스케어) 컬럼(직경 63 cm, 높이 25 cm)에 이용했다. 다음으로 6 CV의 180 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 아세트산 완충액(pH 5.5)으로 세정하고, 다시 280 nm의 흡수가 베이스라인으로 되돌아갈 때까지 180 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 세정을 행하고, 300 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터의 0.5 컬럼 볼륨 용량의 용출액을 조정제액으로서 취득했다. 동일한 조작을 6 회 반복 실시하여, 6 로트의 조정제액을 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 109 L/h로 실시했다.
약 20 L의 조정제액을, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 모노클로날 항체 컬럼(직경 44 cm, 높이 13 cm)에 이용했다. 6 CV의 1.0 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)을 흘리고, 다시 3 CV의 0.1 M 아세트산 완충액(pH 5.0)을 흘려 세정하고, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.0)으로 용출을 시작했다. 용출액의 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터 하강까지의 용출액을 얻고, 용출액에 1/10 용량의 0.5 M 인산 완충액(pH 7.3)을 첨가하여 정제액 1로서 취득했다. 동일한 조작을 12 회 반복 실시하여, 12 로트의 정제액 1을 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 46 L/h로 실시했다.
12 로트분의 정제액 1 약 270 L를 나일론제 여과막(독일, 싸토리우스사, SARTOLON Maxi Caps 5101307H3, 구멍 직경 0.4 ㎛+0.2 ㎛, 막면적 1.8 ㎡)에 5 L/분의 유속으로 통액한 후(HCP 1 ㎎에 대하여 약 0.05 ㎡ 막면적을 사용), 1.0 M 글리신염산 완충액(pH 2.0)으로 pH 3.5로 조제하여, 0.3 M NaCl을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.5)으로 평형화한 SP-SepharoseFF(미국 GE 헬스케어바이오사이언스) 컬럼(직경 45 cm, 높이 10cm)에 이용했다. 0.3 M NaCl을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.5)으로 세정을 시작하여, 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터 하강까지의 통과 획분을 얻고, 즉시 0.5 M 인산 완충액(pH 7.3)으로 pH 7로 중화하여, 정제액 2로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 160 L/h로 실시했다.
약 300 L의 정제액 2를 한외여과막인 마이크로자 UF 모듈 SIP-2013(일본, 아사히카세이케미컬)으로 약 11 L까지 농축한 후에, 50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 Sephacryl S-300 HR(미국 GE 헬스케어바이오사이언스) 컬럼(직경 63 cm, 높이 94 cm)에 이용했다. 280 nm에서의 흡수가 가장 큰 용출 피크를 분취한 후, 한외여과막인 마이크로자 UF 모듈 SIP-1013(일본, 아사히카세이케미컬)으로 약 13 L까지 농축하여, 정제액 3으로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 6.2 L/h로 실시했다.
실온하에서, 정제액 3을 50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 바이러스 제거막의 PLANOVA 15N(일본, 아사히카세이메디컬, 막면적 1 ㎡)에 압력 0.1 MPa 이하로 통액후, 다시 0.22 ㎛의 PVDF제 여과막(미국, 밀리포어)에 통액하여 전량을 회수했다. 이것을 고순도 가용성 트롬보모듈린 정제품(로트 : A6)으로 했다.
A6의 트롬보모듈린의 APC 활성은 81000 U/㎖였다.
A6의 용액에서의 가용성 트롬보모듈린 농도는 11.9 ㎎/㎖였다.
(실시예 4) 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조 4
증식 배지는 20.78 g의 IS CHO-CD-A3(미국, 어바인 사이언티픽), 4.06 g의 염화나트륨(일본, 토미타 제약) 및 2.20 g의 탄산수소나트륨(일본, 와코쥰야쿠 공업)을 1 L의 물에 용해하여 제작했다. 또, 생산 배지는 1 L의 물에 대하여, 20.78 g의 IS CHO-CD-A3(미국, 어바인 사이언티픽), 2.63 g의 염화나트륨(일본, 토미타 제약) 및 4.40 g의 탄산수소나트륨(일본, 와코쥰야쿠 공업)을 용해하여 제작했다.
비교예 4에서 제작한 세포의 바이알 1개를 융해하여, 그 세포를 100 ㎖의 증식 배지에 파종하고, CO2 인큐베이터 내, T-플라스크를 이용하여 36℃에서 5 일간 정치 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 전량을 0.9 L의 증식 배지에 계대하고, CO2 인큐베이터 내, 스피너 플라스크를 이용하여 36℃에서 5 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 전량을 9 L의 증식 배지에 계대하고, 배양조를 이용하여 36℃, pH 7.1, 용존 산소 50%로 5 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 배양액 전량을 120 L의 증식 배지에 계대하고, 관류 배양조를 이용하여 36℃, pH 7.1, 용존 산소 50%로 7 일간 교반 배양했다. 생세포 밀도가 7.0×105 cells/㎖ 이상이 된 시점에서, 생산 배지의 첨가와 배양 상청액의 회수를 연속적으로 행하는 관류 배양을 시작했다. 배양 조건은, 36℃, pH 7.1, 용존 산소 50%, 배지 교환 130 L/day, 상면 가압 0～0.2 MPa로 했다. 생세포 밀도가 7.5×106 cells/㎖에 도달하고 나서 20 일간 배양을 계속하여, 배양 상청액을 생산액으로서 회수했다.
회수한 생산액은 여과 필터의 수프라디스크 II(미국, 폴) 및 스포어 EBV(미국, 폴)를 이용하여 징명화하여, 여과후 생산액으로서 2～10℃에서 보존했다.
약 1,400 L의 여과후 생산액을, 150 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 평형화한 Q-Sepharose Fast Flow(미국, GE 헬스케어) 컬럼(직경 63 cm, 높이 25 cm)에 이용했다. 다음으로 6 CV의 180 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 아세트산 완충액(pH 5.6)으로 세정하고, 다시 4 CV의 180 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 세정을 행하고, 290 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터의 0.5 컬럼 볼륨 용량의 용출액을 조정제액으로서 취득했다. 약 900 L의 여과후 생산액에 관해서도 동일한 조작을 행하여, 2 로트의 조정제액을 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 109 L/h로 실시했다.
약 13 L의 조정제액을, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 모노클로날 항체 컬럼(직경 44 cm, 높이 13 cm)에 이용했다. 6 CV의 1.0 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)을 흘리고, 다시 3 CV의 0.1 M 아세트산 완충액(pH 5.0)을 흘려 세정하고, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.0)으로 용출을 시작했다. 용출액의 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터 하강까지의 용출액을 얻고, 용출액에 1/10 용량의 0.5 M 인산 완충액(pH 7.3)을 첨가하여 정제액 1로서 취득했다. 동일한 조작을 5 회 반복 실시하여, 5 로트의 정제액 1을 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 46 L/h로 실시했다.
5 로트분의 정제액 1 약 110 L를 나일론제 여과막(독일, 싸토리우스사, SARTOLON Maxi Caps 5101307H3, 구멍 직경 0.4 ㎛+0.2 ㎛, 막면적 1.8 ㎡)에 5 L/분의 유속으로 통액한 후(HCP 1 ㎎에 대하여 약 0.03 ㎡ 막면적을 사용), 1.0 M 글리신염산 완충액(pH 2.0)으로 pH 3.5로 조제하여, 0.3 M NaCl을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.5)으로 평형화한 SP-SepharoseFF(미국 GE 헬스케어바이오사이언스) 컬럼(직경 45 cm, 높이 10cm)에 이용했다. 0.3 M NaCl을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.5)으로 세정을 시작하여, 흡광도 280 nm의 피크 상승으로부터 하강까지의 통과 획분을 얻고, 즉시 0.5 M 인산 완충액(pH 7.3)으로 pH 7로 중화하여, 정제액 2로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 160 L/h로 실시했다.
약 120 L의 정제액 2를 한외여과막인 마이크로자 UF 모듈 SIP-2013(일본, 아사히카세이케미컬)으로 약 5 L까지 농축한 후에 50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 Sephacryl S-300 HR(미국 GE 헬스케어바이오사이언스) 컬럼(직경 63 cm, 높이 94 cm)에 이용했다. 280 nm에서의 흡수가 가장 큰 용출 피크를 분취한 후, 한외여과막인 마이크로자 UF 모듈 SIP-1013(일본, 아사히카세이케미컬)으로 약 5 L까지 농축하여, 정제액 3으로서 취득했다. 또한, 온도는 2～10℃, 크로마토 유속은 6.2 L/h로 실시했다.
실온하에서, 정제액 3 전량을 50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 바이러스 제거막의 PLANOVA 15N(일본, 아사히카세이메디컬, 막면적 1 ㎡)에 압력 0.1 MPa 이하로 통액후, 다시 0.22 ㎛의 PVDF제 여과막(미국, 밀리포어)에 통액하여 전량을 회수했다. 이것을 고순도 가용성 트롬보모듈린 정제품(로트 : A7)으로 했다.
A7의 트롬보모듈린의 APC 활성은 69000 U/㎖였다.
A7의 용액에서의 가용성 트롬보모듈린 농도는 10.4 ㎎/㎖였다.
(시험예 1) 각종 여과막에 의한 HCP 제거 평가
비교예 1에서 얻어진 정제액 1(HCP 농도 : 462 ng/㎖)을 상이한 재질의 여과막에 통액한 후의 HCP 농도를 비교했다. 즉, (1) PVDF(폴리불화비닐리덴)제 (미국, 밀리포어, Millex GV), (2) CA(셀룰로오스아세테이트)제 (독일, 싸토리우스, Minisart), (3) PES(폴리에테르술폰)제 (독일, 싸토리우스, Minisart High-Flow), (4) 나일론제(미국, 서모피셔사이언티픽, NALGENE Syringe Filter), (5) CA+GF(셀룰로오스아세테이트+유리 섬유)제 (싸토리우스, Minisart Plus)의 각 여과막에 5 ㎖의 정제액 1을 1 ㎖/분의 유속으로 통액하여 전량을 여과액으로서 회수했다.
여과 전후의 액에 관해, 단백질 농도와 HCP 농도의 측정을 행했다. 단백질 농도는 280 nm의 흡광도로부터 구하고, HCP 농도는 참고예 2에 나타낸 방법에 따라서 측정했다. 그 결과, 모든 여과막에 대하여 여과 전후에서의 단백질 농도의 변화는 거의 보이지 않았지만, 나일론제 여과막 및 PES제 여과막에는 높은 HCP 제거 효과가 보여, 각각 HCP 농도를 28% 및 36%로 감소시키는 것을 알 수 있다(표 1). 또, 동일한 구멍 직경임에도 불구하고, HCP 농도의 저하가 막재질에 따라 크게 상이하기 때문에, 응집하여 불용화한 HCP가 제거된 것은 아니고, HCP의 막에 의한 흡착 제거라고 생각되었다. 또한, 평가한 각 여과막의 직경은 25 ㎜ 또는 26 ㎜이고, 각 메이커의 데이터시트에 기재된 여과막의 유효 막면적으로부터 HCP 1 ㎎에 대한 막면적은 0.17 ㎡ 또는 0.23 ㎡였다.
Figure pct00003
(시험예 2) 나일론제 및 PES제 여과막에 의한 HCP 제거능 비교
시험예 1에 있어서, 나일론제 여과막과 PES제 여과막은 높은 HCP 제거능을 갖는 것이 판명되었기 때문에, 이들 여과막에 관해 통액량에 의한 HCP 제거능의 변화를 평가했다. 또한, 여과막은 각 재질에 관해 2 종류의 메이커의 상품을 준비하고, 통액하는 정제액 1에 관해서는, 시험예 2에서 사용한 로트와는 상이한 로트를 이용했다(HCP 농도 : 303 ng/㎖). 여과막은, 컨트롤로서 PVDF제(미국, 밀리포어, Millex GV : 구멍 직경 0.22 ㎛, 막직경 25 ㎜, 유효 막면적 3.9 ㎠)를 사용하고, 나일론제로서 (1) 미국, 폴사의 Acrodisc AP-4436T, : 구멍 직경 0.2 ㎛, 막직경 25 ㎜, 유효 막면적 3.9 ㎠ 및 (2) 독일, 싸토리우스사의 Minisart NY25 : 구멍 직경 0.2 ㎛, 막직경 25 ㎜, 유효 막면적 4.8 ㎠를, PES제로서 (3) 미국 폴사의 Acrodisc PN4612 : 구멍 직경 0.2 ㎛, 막직경 25 ㎜, 유효 막면적 2.8 ㎠ 및 (4) 싸토리우스사의 Minisart High-Flow : 구멍 직경 0.2 ㎛, 막직경 26 ㎜, 유효 막면적 5.3 ㎠를 이용했다. 여과막당의 정제액 1의 통액량은 10 ㎖/분의 유속으로 100 ㎖로 하고, 20 ㎖ 통액마다 여과액을 샘플링하여 참고예 2에 나타낸 방법에 따라서 HCP 농도를, 280 nm의 흡수로부터 단백질 농도를 측정했다.
그 결과, 모든 샘플에 있어서 단백질 농도의 변화는 보이지 않았지만, 나일론제 및 PES제 여과막 모두 HCP 제거 효과가 보였다(표 2). HCP 제거 효과는 특히 나일론제 여과막이 높아, HCP 농도를 최대 25%로 저하시켰다. 여과막에 대한 통액량이 적을수록, 즉 HCP 1 ㎎에 대한 여과막 면적이 클수록 HCP 제거 효과가 높다는 것을 알 수 있다.
Figure pct00004
(시험예 3) 상이한 액조성에서의 나일론제 여과막의 HCP 제거능 평가
완충액 조성 및 가용성 트롬보모듈린 농도의 차이가 나일론제 여과막의 HCP 제거능에 미치는 영향을 평가했다. 비교예 4에서 얻어진 정제액 1, 정제액 2, 정제액 2 농축후, 정제액 3 및 정제품에 관해 각 5 ㎖를 막직경 25 ㎜, 유효 막면적 4.8 ㎠, 구멍 직경 0.2 ㎛의 나일론제 여과막(독일, 싸토리우스사, Minisart NY25)에 1 ㎖/분의 유속으로 통액하여 전량을 여과액으로서 회수했다. 각 샘플에 포함되는 HCP 1 ㎎에 대한 여과막 면적은, 정제액 1 : 0.77 ㎡, 정제액 2 : 1.7 ㎡, 정제액 2 농축후 : 0.43 ㎡, 정제액 3 : 0.72 ㎡, 정제품 : 0.81 ㎡였다. 얻어진 여과액에 관해, 참고예 2에 나타낸 방법에 따라서 HCP 농도를 측정하고, 단백질 농도를 280 nm의 흡수로부터 구했다. 그 결과, 나일론제 막은 모든 샘플에 대하여 높은 HCP 제거 효과가 보이고, 단백질 농도 회수율은 90% 이상의 높은 값을 얻을 수 있었다(표 3).
Figure pct00005
(시험예 4) 각종 제조 방법에 의해 취득한 가용성 트롬보모듈린 정제품으로부터의 HCP 제거 평가
상이한 제조 방법에 의해 취득한 가용성 트롬보모듈린을, 다시 나일론제 여과막에 통액함으로써 HCP가 제거되는지의 여부를 검토했다. 비교예 1～3에서 취득한 가용성 트롬보모듈린 정제품(각각, A1, B1 및 B2)에 관해 각 5 ㎖를 막직경 25 ㎜, 유효 막면적 4.8 ㎠, 구멍 직경 0.2 ㎛의 나일론제 여과막(독일, 싸토리우스사, Minisart NY25)에 1 ㎖/분의 유속으로 통액하여 전량을 여과액으로서 회수했다. 각 가용성 트롬보모듈린 정제품에 포함되는 HCP 1 ㎎에 대한 여과막 면적은 각 가용성 트롬보모듈린 정제품에 포함되는 HCP 1 ㎎에 대한 여과막 면적은, A1 : 0.34 ㎡, B1 : 0.46 ㎡, B2 : 1.7 ㎡였다. 여과 전후의 액에 관해, 참고예 2～4에 나타낸 방법에 따라서 HCP 함량, 마우스 IgG 함량 및 소혈청 단백질 함량을 측정했다. 모든 정제품에 있어서 나일론제 여과막은 HCP에 대해서만 강한 제거 효과가 보였다(표 4). 이러한 점에서 나일론제 여과막은 단백질을 비특이적으로 흡착하는 것이 아니라, HCP를 특이적으로 흡착하는 작용을 갖는다고 생각되었다.
Figure pct00006
(시험예 5) 나일론제 여과막의 사용의 유무에 의한 트롬보모듈린 정제품의 순도의 비교
나일론제 여과막 미사용의 공업화 레벨 제조(비교예 1) 및 나일론제 여과막을 사용한 공업화 레벨 제조(실시예 1～4)에서 얻어진 트롬보모듈린 정제품에 관해, 참고예 2～4에 나타낸 방법에 따라서 HCP 함량, 마우스 IgG 함량 및 소혈청 단백질 함량을 측정했다.
나일론제 여과막을 통액하지 않은 비교예 1의 3 로트(A1, A2 및 A3)는 10 ng/10,000 U 이상의 높은 HCP 함량을 갖고 있었지만, 나일론제 여과막을 통액한 실시예 1～4의 4 로트(A4, A5, A6 및 A7)의 HCP 함량은 정량 한계 미만이었다. 그 밖의 불순물의 마우스 IgG 함량 및 소혈청 단백질 함량에 관해서는 나일론제 여과막의 사용의 유무로 그 함량에 차이가 보이지 않았다(표 5). 이와 같이 공업화 레벨에서의 제조에 있어서도 나일론제 여과막은, HCP에 특이적인 제거능을 가지며, HCP 함량이 10 ng/10,000 U 미만이라는 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조를 가능하게 했다.
실시예 1～4에서 얻어진 고순도 가용성 트롬보모듈린의 총단백질 중 순도를 겔 여과 액체 크로마토그래피 및 이온 교환 액체 크로마토그래피로 측정했다. 겔 여과 액체 크로마토그래피에 관해서는, TOSOH TSKgel G3000SWXL(일본, 도소)를 이용하여, 0.1 M 황산나트륨을 포함하는 50 mM 인산염 완충액(pH 7.3), 온도 40℃, 유속 0.9 ㎖/분이라는 조건하에서 측정을 행한 결과, 모든 정제품(A4, A5, A6 및 A7)의 순도는 99% 이상이었다. 또, 이온 교환 액체 크로마토그래피에 관해서는, TOSOH DEAE 5PW(일본, 도소)를 이용하여, 50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 피페라진염산 완충액(pH 5.6)으로부터 350 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 피페라진염산 완충액(pH 5.6)으로의 30 분간 직선 그래디언트 용출, 온도 40℃, 유속 0.9 ㎖/분이라는 조건하에서 측정을 행한 결과, 모든 정제품(A4, A5, A6 및 A7)의 순도는 99% 이상이었다.
또, 비교예 1에 준하여 제조하여, MALDI-TOF-MS법으로 분자량이 64,000인 것이 확인되어 있는 가용성 트롬보모듈린 정제품과, 실시예 1～4에서 얻어진 고순도 가용성 트롬보모듈린 정제품의 분자량을 SDS-PAGE로 비교한 바, 동일한 위치에 밴드가 검출되었다. 이러한 점에서 고순도 가용성 트롬보모듈린의 분자량은 64,000이라고 생각되었다.
또한, 일본약국방 일반시험법의 엔도톡신 시험법 <4.01>의 겔화법에 따라서 시험을 실시한 결과, 엔도톡신 함량이 0.004～0.03 EU/10,000 U로서, 매우 낮은 레벨이었다(표 6).
Figure pct00007
Figure pct00008
(시험예 6) 나일론제 여과막으로 제거된 HCP의 해석
실시예 3과 동일한 방법에 의해 고순도 가용성 트롬보모듈린을 제조한 후, 제조에서 사용한 나일론제 여과막(독일, 싸토리우스, SARTOLON Maxi Caps 5101307H3, 구멍 직경 0.4 ㎛+0.2 ㎛, 막면적 1.8 ㎡)을 하우징으로부터 꺼내어, 막을 약 3 g의 단편이 되도록 절단했다. 5 장의 단편을 50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 충분히 세정한 후, 40 ㎖의 0.5% CHAPS, 200 mM 염화나트륨을 포함하는 50 mM 트리스염산 완충액(pH 8.0)이 들어간 시험관에 단편을 1 장씩 넣었다. 실온에서 하룻밤 진탕함으로써, 막에 흡착한 단백질을 완충액 중에 추출했다. 추출액 전량을 한외여과막의 Vivaspin20(독일, 싸토리우스)과 AmiconUltra-0.5 ㎖(미국, 밀리포어)를 이용하여, 15 ㎕가 될 때까지 농축했다. 이 농축액 중 약 1/5 량을 SDS-PAGE(일본, 아토, e-PAGEL5/20)에 이용하여, CBB 염색(일본, 와코쥰야쿠 공업, Quick-CBB)했다. 분자량 10,000 부근에 보인 밴드를 절취하여, 그 겔 단편을 디티오트레이톨로 환원후, 요오드아세트아미드에 의해 카르바미드메틸화하고, 트립신에 의한 효소 소화를 철야로 실시했다. 효소 소화물을 LC/MS/MS에 이용하고, 얻어진 매스 스펙트럼 데이터로부터, NCBI의 데이터베이스를 이용하여 Mascot 검색을 행하여, 효소 소화물의 아미노산 서열을 해석했다.
LC/MS/MS의 측정 조건
LC/MS/MS(측정 장치) :
DiNa-2A 다차원 오토인젝터 시스템(일본, KYAtechnologies)
MS 측정 범위 :
MS1(m/z400-1500)MS2(m/z50-1500)×3(data dependent 스캔 모드)
이온화 모드 : nanoESI+
컬럼 :
PicoFrit Column BataBasic C18(미국, New Objective)
이동상 :
이동상 A : 0.1% 포름산/2% 아세토니트릴
이동상 B : 0.1% 포름산/80% 아세토니트릴
그래디언트 : 0→ 30 분 이동상 B 5→ 40%
30→ 40 분 이동상 B 40→ 100%
40→ 60 분 이동상 B 100%
유량 : 300 nL/분
매스 스펙트럼 데이터로부터 예상되는 각 프래그먼트의 아미노산 서열은 이하의 (1)～(7)에 나타낸 바와 같고, 이하에 나타내는 히스톤 H2B(Biochimie, 61(1), 61-69(1979))의 부분 서열과 일치했다. 이러한 점에서, 나일론 필터로 제거되는 HCP의 하나는, 히스톤 H2B인 것을 알 수 있다.
(1) KESYSVYVYK
(2) VLKQVHPDTGISSK
(3) STITSREIQTAVR
(4) EIQTAVR
(5) EIQTAVRLLLPGELAK
(6) LLLPGELAK
(7) LLLPGELAKHAVSEGTK
[표 7]
Figure pct00009

(□로 둘러싼 서열은, 히스톤 H2B 아미노산 서열 중, 매스 스펙트럼 데이터로부터 예상되는 상기 (1)～(7)의 아미노산 서열과 일치하는 아미노산 서열 범위를 나타낸다.)
SEQUENCE LISTING <110> Asahi Kasei Pharma Corporation <120> Highly purified soluble thrombomodulin and method for manufacturing thereof. <130> 111151M <140> 2010-04-30 <141> JP 2010-105421 <160> 21 <210> 1 <211> 132 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 Phe Pro Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro 20 25 30 Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro 35 40 45 Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala 50 55 60 Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu 85 90 95 Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly 100 105 110 Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile 115 120 125 Gly Thr Asp Cys 130 <210> 2 <211> 396 <212> DNA <213> human <400> 2 atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgacccg 60 tgcttcagag ccaactgcga gtaccagtgc cagcccctga accaaactag ctacctctgc 120 gtctgcgccg agggcttcgc gcccattccc cacgagccgc acaggtgcca gatgttttgc 180 aaccagactg cctgtccagc cgactgcgac cccaacaccc aggctagctg tgagtgccct 240 gaaggctaca tcctggacga cggtttcatc tgcacggaca tcgacgagtg cgaaaacggc 300 ggcttctgct ccggggtgtg ccacaacctc cccggtacct tcgagtgcat ctgcgggccc 360 gactcggccc ttgtccgcca cattggcacc gactgt 396 <210> 3 <211> 132 <212> PRT <213> human <400> 3 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 Phe Pro Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro ?????? 20 25 30 Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro 35 40 45 Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala 50 55 60 Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu 85 90 95 Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly 100 105 110 Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile 115 120 125 Gly Thr Asp Cys 130 <210> 4 <211> 396 <212> DNA <213> human <400> 4 atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgacccg 60 tgcttcagag ccaactgcga gtaccagtgc cagcccctga accaaactag ctacctctgc 120 gtctgcgccg agggcttcgc gcccattccc cacgagccgc acaggtgcca gatgttttgc 180 aaccagactg cctgtccagc cgactgcgac cccaacaccc aggctagctg tgagtgccct 240 gaaggctaca tcctggacga cggtttcatc tgcacggaca tcgacgagtg cgaaaacggc 300 ggcttctgct ccggggtgtg ccacaacctc cccggtacct tcgagtgcat ctgcgggccc 360 gactcggccc ttgcccgcca cattggcacc gactgt 396 <210> 5 <211> 480 <212> PRT <213> human <400> 5 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu 20 25 30 His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala 35 40 45 Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser 50 55 60 Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly 65 70 75 80 Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys 85 90 95 Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr 100 105 110 Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn 115 120 125 Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu 130 135 140 Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val 145 150 155 160 Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg 165 170 175 Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr 180 185 190 Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro 195 200 205 Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys 210 215 220 Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro 225 230 235 240 Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys 245 250 255 Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala 260 265 270 Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys 275 280 285 Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly 290 295 300 Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln 305 310 315 320 His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys 325 330 335 Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr 340 345 350 Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro 355 360 365 Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr 370 375 380 Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu 385 390 395 400 Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp 405 410 415 Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile 420 425 430 Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly 435 440 445 Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 450 455 460 Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 465 470 475 480 <210> 6 <211> 1440 <212> DNA <213> human <400> 6 atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgcaccc 60 gcagagccgc agccgggtgg cagccagtgc gtcgagcacg actgcttcgc gctctacccg 120 ggccccgcga ccttcctcaa tgccagtcag atctgcgacg gactgcgggg ccacctaatg 180 acagtgcgct cctcggtggc tgccgatgtc atttccttgc tactgaacgg cgacggcggc 240 gttggccgcc ggcgcctctg gatcggcctg cagctgccac ccggctgcgg cgaccccaag 300 cgcctcgggc ccctgcgcgg cttccagtgg gttacgggag acaacaacac cagctatagc 360 aggtgggcac ggctcgacct caatggggct cccctctgcg gcccgttgtg cgtcgctgtc 420 tccgctgctg aggccactgt gcccagcgag ccgatctggg aggagcagca gtgcgaagtg 480 aaggccgatg gcttcctctg cgagttccac ttcccagcca cctgcaggcc actggctgtg 540 gagcccggcg ccgcggctgc cgccgtctcg atcacctacg gcaccccgtt cgcggcccgc 600 ggagcggact tccaggcgct gccggtgggc agctccgccg cggtggctcc cctcggctta 660 cagctaatgt gcaccgcgcc gcccggagcg gtccaggggc actgggccag ggaggcgccg 720 ggcgcttggg actgcagcgt ggagaacggc ggctgcgagc acgcgtgcaa tgcgatccct 780 ggggctcccc gctgccagtg cccagccggc gccgccctgc aggcagacgg gcgctcctgc 840 accgcatccg cgacgcagtc ctgcaacgac ctctgcgagc acttctgcgt tcccaacccc 900 gaccagccgg gctcctactc gtgcatgtgc gagaccggct accggctggc ggccgaccaa 960 caccggtgcg aggacgtgga tgactgcata ctggagccca gtccgtgtcc gcagcgctgt 1020 gtcaacacac agggtggctt cgagtgccac tgctacccta actacgacct ggtggacggc 1080 gagtgtgtgg agcccgtgga cccgtgcttc agagccaact gcgagtacca gtgccagccc 1140 ctgaaccaaa ctagctacct ctgcgtctgc gccgagggct tcgcgcccat tccccacgag 1200 ccgcacaggt gccagatgtt ttgcaaccag actgcctgtc cagccgactg cgaccccaac 1260 acccaggcta gctgtgagtg ccctgaaggc tacatcctgg acgacggttt catctgcacg 1320 gacatcgacg agtgcgaaaa cggcggcttc tgctccgggg tgtgccacaa cctccccggt 1380 accttcgagt gcatctgcgg gcccgactcg gcccttgtcc gccacattgg caccgactgt 1440 <210> 7 <211> 480 <212> PRT <213> human <400> 7 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu 20 25 30 His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala 35 40 45 Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser 50 55 60 Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly 65 70 75 80 Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys 85 90 95 Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr 100 105 110 Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn 115 120 125 Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu 130 135 140 Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val 145 150 155 160 Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg 165 170 175 Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr 180 185 190 Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro 195 200 205 Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys 210 215 220 Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro 225 230 235 240 Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys 245 250 255 Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala 260 265 270 Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys 275 280 285 Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly 290 295 300 Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln 305 310 315 320 His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys 325 330 335 Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr 340 345 350 Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro 355 360 365 Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr 370 375 380 Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu 385 390 395 400 Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp 405 410 415 Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile 420 425 430 Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly 435 440 445 Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 450 455 460 Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 465 470 475 480 <210> 8 <211> 1440 <212> DNA <213> human <400> 8 atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgcaccc 60 gcagagccgc agccgggtgg cagccagtgc gtcgagcacg actgcttcgc gctctacccg 120 ggccccgcga ccttcctcaa tgccagtcag atctgcgacg gactgcgggg ccacctaatg 180 acagtgcgct cctcggtggc tgccgatgtc atttccttgc tactgaacgg cgacggcggc 240 gttggccgcc ggcgcctctg gatcggcctg cagctgccac ccggctgcgg cgaccccaag 300 cgcctcgggc ccctgcgcgg cttccagtgg gttacgggag acaacaacac cagctatagc 360 aggtgggcac ggctcgacct caatggggct cccctctgcg gcccgttgtg cgtcgctgtc 420 tccgctgctg aggccactgt gcccagcgag ccgatctggg aggagcagca gtgcgaagtg 480 aaggccgatg gcttcctctg cgagttccac ttcccagcca cctgcaggcc actggctgtg 540 gagcccggcg ccgcggctgc cgccgtctcg atcacctacg gcaccccgtt cgcggcccgc 600 ggagcggact tccaggcgct gccggtgggc agctccgccg cggtggctcc cctcggctta 660 cagctaatgt gcaccgcgcc gcccggagcg gtccaggggc actgggccag ggaggcgccg 720 ggcgcttggg actgcagcgt ggagaacggc ggctgcgagc acgcgtgcaa tgcgatccct 780 ggggctcccc gctgccagtg cccagccggc gccgccctgc aggcagacgg gcgctcctgc 840 accgcatccg cgacgcagtc ctgcaacgac ctctgcgagc acttctgcgt tcccaacccc 900 gaccagccgg gctcctactc gtgcatgtgc gagaccggct accggctggc ggccgaccaa 960 caccggtgcg aggacgtgga tgactgcata ctggagccca gtccgtgtcc gcagcgctgt 1020 gtcaacacac agggtggctt cgagtgccac tgctacccta actacgacct ggtggacggc 1080 gagtgtgtgg agcccgtgga cccgtgcttc agagccaact gcgagtacca gtgccagccc 1140 ctgaaccaaa ctagctacct ctgcgtctgc gccgagggct tcgcgcccat tccccacgag 1200 ccgcacaggt gccagatgtt ttgcaaccag actgcctgtc cagccgactg cgaccccaac 1260 acccaggcta gctgtgagtg ccctgaaggc tacatcctgg acgacggttt catctgcacg 1320 gacatcgacg agtgcgaaaa cggcggcttc tgctccgggg tgtgccacaa cctccccggt 1380 accttcgagt gcatctgcgg gcccgactcg gcccttgccc gccacattgg caccgactgt 1440 <210> 9 <211> 516 <212> PRT <213> human <400> 9 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu 20 25 30 His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala 35 40 45 Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser 50 55 60 Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly 65 70 75 80 Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys 85 90 95 Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr 100 105 110 Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn 115 120 125 Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu 130 135 140 Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val 145 150 155 160 Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg 165 170 175 Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr 180 185 190 Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro 195 200 205 Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys 210 215 220 Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro 225 230 235 240 Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys 245 250 255 Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala 260 265 270 Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys 275 280 285 Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly 290 295 300 Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln 305 310 315 320 His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys 325 330 335 Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr 340 345 350 Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro 355 360 365 Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr 370 375 380 Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu 385 390 395 400 Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp 405 410 415 Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile 420 425 430 Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly 435 440 445 Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 450 455 460 Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 465 470 475 480 Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro 485 490 495 Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu 500 505 510 Val His Ser Gly 515 <210> 10 <211> 1548 <212> DNA <213> human <400> 10 atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgcaccc 60 gcagagccgc agccgggtgg cagccagtgc gtcgagcacg actgcttcgc gctctacccg 120 ggccccgcga ccttcctcaa tgccagtcag atctgcgacg gactgcgggg ccacctaatg 180 acagtgcgct cctcggtggc tgccgatgtc atttccttgc tactgaacgg cgacggcggc 240 gttggccgcc ggcgcctctg gatcggcctg cagctgccac ccggctgcgg cgaccccaag 300 cgcctcgggc ccctgcgcgg cttccagtgg gttacgggag acaacaacac cagctatagc 360 aggtgggcac ggctcgacct caatggggct cccctctgcg gcccgttgtg cgtcgctgtc 420 tccgctgctg aggccactgt gcccagcgag ccgatctggg aggagcagca gtgcgaagtg 480 aaggccgatg gcttcctctg cgagttccac ttcccagcca cctgcaggcc actggctgtg 540 gagcccggcg ccgcggctgc cgccgtctcg atcacctacg gcaccccgtt cgcggcccgc 600 ggagcggact tccaggcgct gccggtgggc agctccgccg cggtggctcc cctcggctta 660 cagctaatgt gcaccgcgcc gcccggagcg gtccaggggc actgggccag ggaggcgccg 720 ggcgcttggg actgcagcgt ggagaacggc ggctgcgagc acgcgtgcaa tgcgatccct 780 ggggctcccc gctgccagtg cccagccggc gccgccctgc aggcagacgg gcgctcctgc 840 accgcatccg cgacgcagtc ctgcaacgac ctctgcgagc acttctgcgt tcccaacccc 900 gaccagccgg gctcctactc gtgcatgtgc gagaccggct accggctggc ggccgaccaa 960 caccggtgcg aggacgtgga tgactgcata ctggagccca gtccgtgtcc gcagcgctgt 1020 gtcaacacac agggtggctt cgagtgccac tgctacccta actacgacct ggtggacggc 1080 gagtgtgtgg agcccgtgga cccgtgcttc agagccaact gcgagtacca gtgccagccc 1140 ctgaaccaaa ctagctacct ctgcgtctgc gccgagggct tcgcgcccat tccccacgag 1200 ccgcacaggt gccagatgtt ttgcaaccag actgcctgtc cagccgactg cgaccccaac 1260 acccaggcta gctgtgagtg ccctgaaggc tacatcctgg acgacggttt catctgcacg 1320 gacatcgacg agtgcgaaaa cggcggcttc tgctccgggg tgtgccacaa cctccccggt 1380 accttcgagt gcatctgcgg gcccgactcg gcccttgtcc gccacattgg caccgactgt 1440 gactccggca aggtggacgg tggcgacagc ggctctggcg agcccccgcc cagcccgacg 1500 cccggctcca ccttgactcc tccggccgtg gggctcgtgc attcgggc 1548 <210> 11 <211> 516 <212> PRT <213> human <400> 11 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu 20 25 30 His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala 35 40 45 Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser 50 55 60 Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly 65 70 75 80 Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys 85 90 95 Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr 100 105 110 Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn 115 120 125 Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu 130 135 140 Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val 145 150 155 160 Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg 165 170 175 Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr 180 185 190 Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro 195 200 205 Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys 210 215 220 Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro 225 230 235 240 Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys 245 250 255 Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala 260 265 270 Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys 275 280 285 Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly 290 295 300 Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln 305 310 315 320 His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys 325 330 335 Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr 340 345 350 Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro 355 360 365 Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr 370 375 380 Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu 385 390 395 400 Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp 405 410 415 Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile 420 425 430 Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly 435 440 445 Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 450 455 460 Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 465 470 475 480 Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro 485 490 495 Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu 500 505 510 Val His Ser Gly 515 <210> 12 <211> 1548 <212> DNA <213> human <400> 12 atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgcaccc 60 gcagagccgc agccgggtgg cagccagtgc gtcgagcacg actgcttcgc gctctacccg 120 ggccccgcga ccttcctcaa tgccagtcag atctgcgacg gactgcgggg ccacctaatg 180 acagtgcgct cctcggtggc tgccgatgtc atttccttgc tactgaacgg cgacggcggc 240 gttggccgcc ggcgcctctg gatcggcctg cagctgccac ccggctgcgg cgaccccaag 300 cgcctcgggc ccctgcgcgg cttccagtgg gttacgggag acaacaacac cagctatagc 360 aggtgggcac ggctcgacct caatggggct cccctctgcg gcccgttgtg cgtcgctgtc 420 tccgctgctg aggccactgt gcccagcgag ccgatctggg aggagcagca gtgcgaagtg 480 aaggccgatg gcttcctctg cgagttccac ttcccagcca cctgcaggcc actggctgtg 540 gagcccggcg ccgcggctgc cgccgtctcg atcacctacg gcaccccgtt cgcggcccgc 600 ggagcggact tccaggcgct gccggtgggc agctccgccg cggtggctcc cctcggctta 660 cagctaatgt gcaccgcgcc gcccggagcg gtccaggggc actgggccag ggaggcgccg 720 ggcgcttggg actgcagcgt ggagaacggc ggctgcgagc acgcgtgcaa tgcgatccct 780 ggggctcccc gctgccagtg cccagccggc gccgccctgc aggcagacgg gcgctcctgc 840 accgcatccg cgacgcagtc ctgcaacgac ctctgcgagc acttctgcgt tcccaacccc 900 gaccagccgg gctcctactc gtgcatgtgc gagaccggct accggctggc ggccgaccaa 960 caccggtgcg aggacgtgga tgactgcata ctggagccca gtccgtgtcc gcagcgctgt 1020 gtcaacacac agggtggctt cgagtgccac tgctacccta actacgacct ggtggacggc 1080 gagtgtgtgg agcccgtgga cccgtgcttc agagccaact gcgagtacca gtgccagccc 1140 ctgaaccaaa ctagctacct ctgcgtctgc gccgagggct tcgcgcccat tccccacgag 1200 ccgcacaggt gccagatgtt ttgcaaccag actgcctgtc cagccgactg cgaccccaac 1260 acccaggcta gctgtgagtg ccctgaaggc tacatcctgg acgacggttt catctgcacg 1320 gacatcgacg agtgcgaaaa cggcggcttc tgctccgggg tgtgccacaa cctccccggt 1380 accttcgagt gcatctgcgg gcccgactcg gcccttgccc gccacattgg caccgactgt 1440 gactccggca aggtggacgg tggcgacagc ggctctggcg agcccccgcc cagcccgacg 1500 cccggctcca ccttgactcc tccggccgtg gggctcgtgc attcgggc 1548 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 13 aatgtggcgg gcaagggccg a 21 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> human <400> 14 Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys 1 5 10 <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> human <400> 15 Val Leu Lys Gln Val His Pro Asp Thr Gly Ile Ser Ser Lys 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> human <400> 16 Ser Thr Ile Thr Ser Arg Glu Ile Gln Thr Ala Val Arg 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> human <400> 17 Glu Ile Gln Thr Ala Val Arg 1 5 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> human <400> 18 Glu Ile Gln Thr Ala Val Arg Leu Leu Leu Pro Gly Glu Leu Ala Lys 1 5 10 15 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> human <400> 19 Leu Leu Leu Pro Gly Glu Leu Ala Lys 1 5 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> human <400> 20 Leu Leu Leu Pro Gly Glu Leu Ala Lys His Ala Val Ser Glu Gly Thr 1 5 10 15 Lys <210> 21 <211> 125 <212> PRT <213> human <400> 21 Pro Glu Pro Ala Lys Ser Ala Pro Ala Pro Lys Lys Gly Ser Lys Lys 1 5 10 15 Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser 20 25 30 Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln Val 35 40 45 His Pro Asp Thr Gly Ile Ser Ser Lys Ala Met Gly Ile Met Asn Ser 50 55 60 Phe Val Asn Asp Ile Phe Glx Arg Ile Ala Gly Glu Ala Ser Arg Leu 65 70 75 80 Ala His Tyr Asn Lys Arg Ser Thr Ile Thr Ser Arg Glu Ile Gln Thr 85 90 95 Ala Val Arg Leu Leu Leu Pro Gly Glu Leu Ala Lys His Ala Val Ser 100 105 110 Glu Gly Thr Lys Ala Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ser Lys 115 120 125

Claims (22)

  1. 가용성 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 숙주 세포로 트랜스펙트하여 얻어진 형질 전환 세포에 의해 생성되는 가용성 트롬보모듈린으로서, 숙주 세포 유래 단백질의 함유율이 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율인 고순도 가용성 트롬보모듈린.
  2. 제1항에 있어서, 가용성 트롬보모듈린이 상기 형질 전환 세포를 무혈청 배양함으로써 생성되는 가용성 트롬보모듈린인 고순도 가용성 트롬보모듈린.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 숙주 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포인 고순도 가용성 트롬보모듈린.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 트롬보모듈린이, 하기의 (1)～(5)의 성질을 갖는 가용성 트롬보모듈린인 고순도 가용성 트롬보모듈린:
    (1) 트롬빈과 선택적으로 결합하는 작용,
    (2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용,
    (3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용,
    (4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용, 및
    (5) 항염증 작용.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 트롬보모듈린의 분자량이 50,000～80,000의 범위인 고순도 가용성 트롬보모듈린.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고순도 가용성 트롬보모듈린이 이하의 공정을 포함하는 방법에 의해 제조되는 고순도 가용성 트롬보모듈린:
    (a) 가용성 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 숙주 세포로 트랜스펙트하여 형질 전환 세포를 취득하는 공정,
    (b) 상기 형질 전환 세포를 배양하여 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 취득하는 공정, 및
    (c) 상기 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시켜, 숙주 세포 유래 단백질의 함유율이 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율인 고순도 가용성 트롬보모듈린을 얻는 공정.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 트롬보모듈린이,
    (i) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제367～480위의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 하기 (ii-1) 또는 (ii-2) 중의 어느 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로서, 상기 펩티드가 하기의 (1)～(5)의 성질을 갖는 가용성 트롬보모듈린인 고순도 가용성 트롬보모듈린:
    (ii-1) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제19～244위의 아미노산 서열, 또는
    (ii-2) 상기 (ii-1)의 아미노산 서열의 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열,
    (1) 트롬빈과 선택적으로 결합하는 작용,
    (2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용,
    (3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용,
    (4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용, 및
    (5) 항염증 작용.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 트롬보모듈린이,
    (i-1) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제19～516위의 아미노산 서열, 또는
    (i-2) 상기 (i-1)의 아미노산 서열의 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열
    중의 어느 아미노산 서열을 갖는 펩티드로서, 상기 펩티드가 하기의 (1)～(5)의 성질을 갖는 가용성 트롬보모듈린인 고순도 가용성 트롬보모듈린:
    (1) 트롬빈과 선택적으로 결합하는 작용,
    (2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용,
    (3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용,
    (4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용, 및
    (5) 항염증 작용.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA가, 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 DNA인 고순도 가용성 트롬보모듈린.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 고순도 가용성 트롬보모듈린 및 약학상 허용되는 담체를 함유하는 의약 조성물.
  11. 숙주 세포 유래 단백질의 함유율이 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율인 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조 방법으로서, 가용성 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 숙주 세포로 트랜스펙트하여 얻어진 형질 전환 세포가 생성되는 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 나일론 및/또는 폴리에테르술폰에 접촉시키는 공정을 포함하는 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 형질 전환 세포를 무혈청 배양하여 가용성 트롬보모듈린을 생성하는 제조 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 가용성 트롬보모듈린이, 하기의 (1)～(5)의 성질을 갖는 가용성 트롬보모듈린인 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조 방법:
    (1) 트롬빈과 선택적으로 결합하는 작용,
    (2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용,
    (3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용,
    (4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용, 및
    (5) 항염증 작용.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포인 제조 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 트롬보모듈린의 분자량이 50,000～80,000인 제조 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 트롬보모듈린이,
    (i) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제367～480위의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 하기 (ii-1) 또는 (ii-2) 중의 어느 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로서, 상기 펩티드가 하기의 (1)～(5)의 성질을 갖는 가용성 트롬보모듈린인 제조 방법:
    (ii-1) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제19～244위의 아미노산 서열, 또는
    (ii-2) 상기 (ii-1)의 아미노산 서열의 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열,
    (1) 트롬빈과 선택적으로 결합하는 작용,
    (2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용,
    (3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용,
    (4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용, 및
    (5) 항염증 작용.
  17. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 트롬보모듈린이,
    (i-1) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중의 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제19～516위의 아미노산 서열, 또는
    (i-2) 상기 (i-1)의 아미노산 서열의 1개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열
    중의 어느 아미노산 서열을 갖는 펩티드로서, 상기 펩티드가 하기의 (1)～(5)의 성질을 갖는 가용성 트롬보모듈린인 제조 방법:
    (1) 트롬빈과 선택적으로 결합하는 작용,
    (2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용,
    (3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용,
    (4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용, 및
    (5) 항염증 작용.
  18. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 트롬보모듈린을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA가, 서열번호 9 또는 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 DNA인 제조 방법.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 나일론 및/또는 폴리에테르술폰의 형태가 여과막의 형태인 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 여과막의 막면적이 숙주 세포 유래 단백질 1 ㎎에 대하여 0.01～0.5 ㎡인 제조 방법.
  21. 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 나일론 및/또는 폴리에테르술폰이 나일론인 제조 방법.
  22. 제11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포 유래 단백질의 함유율이 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율인 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조 방법으로서,
    (a) 서열번호 9 또는 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 숙주 세포로 트랜스펙트하여 형질 전환 세포를 취득하는 공정,
    (b) 상기 형질 전환 세포를 배양하여 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 취득하는 공정,
    (c) 상기 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 총단백질 중 트롬보모듈린 순도 99% 이상으로 정제하는 공정, 및
    (d) 상기 가용성 트롬보모듈린을 포함하는 용액을 나일론에 접촉시켜, 숙주 세포 유래 단백질의 함유율이 가용성 트롬보모듈린 10,000 U에 대하여 10 ng 미만의 비율인 고순도 가용성 트롬보모듈린을 단리하는 공정
    을 포함하는 제조 방법으로서, 상기 숙주 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포인 제조 방법.
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Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3856335T2 (de) 1987-01-08 2000-01-27 Asahi Chemical Ind Peptid zur beschleunigung der wirkung des proteins-c mit thrombin
JP2738428B2 (ja) 1987-01-08 1998-04-08 旭化成工業株式会社 トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進する作用を有するペプチド
DK299087D0 (da) 1987-06-12 1987-06-12 Novo Industri As Proteins and derivatives thereof
EP0356395A3 (de) 1988-08-26 1991-09-04 Ciba-Geigy Ag Flankierende Peptide und Verfahren zu ihrer Herstellung
JPH0720997B2 (ja) 1988-08-29 1995-03-08 興和株式会社 新規なトロンビン結合性物質及びその製法
US5202421A (en) 1988-12-27 1993-04-13 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Anticoagulant substance obtained from urine and process for the preparation thereof
JPH0798840B2 (ja) 1988-12-27 1995-10-25 持田製薬株式会社 尿由来の抗血液疑固物質、その製法およびそれを含有する医薬組成物
JPH02255699A (ja) 1989-03-28 1990-10-16 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規血液抗凝固物質及びその製法
US5466668A (en) 1989-04-28 1995-11-14 Schering Aktiengesellschaft Superior thrombomodulin analogs for pharmaceutical use
US6063763A (en) 1989-04-28 2000-05-16 Schering Aktiengesellschaft Protease-resistant thrombomodulin analogs
CA2022713A1 (en) 1989-08-11 1991-02-12 Nils U. Bang Human thrombomodulin derivatives
AU6528790A (en) 1989-10-18 1991-05-16 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Recombinant human thrombomodulin
JPH03259084A (ja) 1990-03-06 1991-11-19 Kowa Co トロンビン結合性物質の製造法
AU643306B2 (en) 1990-06-27 1993-11-11 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Anticoagulant polypeptides
KR930008093B1 (ko) 1990-08-03 1993-08-25 아사히가세이고오교 가부시끼가이샤 신규 폴리펩티드 및 이를 유효성분으로 하는 의약조성물
JPH05213998A (ja) 1990-08-03 1993-08-24 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規なポリペプチド及びこれを有効成分とする 医薬組成物
AU8723391A (en) 1990-08-15 1992-03-17 Schering Aktiengesellschaft Superior thrombomodulin analogs for pharmaceutical use
JP3220174B2 (ja) 1990-12-12 2001-10-22 第一製薬株式会社 組換ヒトトロンボモジュリン誘導体
ATE264913T1 (de) 1992-02-05 2004-05-15 Paion Gmbh Protease-resistente analoge des thrombomodulin
JPH05310787A (ja) 1992-05-01 1993-11-22 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規なポリペプチド
JPH0646219A (ja) 1992-07-23 1994-02-18 Ricoh Co Ltd 画像情報読取装置
US5378816A (en) 1992-12-16 1995-01-03 Berlex Laboratories, Inc. Methods for high purity chromatographic separation of proteins having EGF-like binding domains
JP3439503B2 (ja) 1993-06-28 2003-08-25 旭化成株式会社 蛋白質分離精製方法
WO1995016460A1 (fr) 1993-12-17 1995-06-22 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Dispositif a semi-conducteur
JP2824392B2 (ja) 1994-05-31 1998-11-11 旭化成工業株式会社 トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進する作用を有するペプチドを含有する培養上澄液
JPH08280384A (ja) 1995-04-18 1996-10-29 Toyobo Co Ltd 有核細胞を含む試料から核酸または蛋白質を回収する方法
JP3745805B2 (ja) 1995-10-24 2006-02-15 日本ケミカルリサーチ株式会社 トロンボモジュリンの精製方法
JP4157644B2 (ja) 1998-03-30 2008-10-01 旭化成ファーマ株式会社 高純度可溶性トロンボモジュリンの製造方法
FR2810667B1 (fr) 2000-06-23 2004-09-03 Warner Lambert Co Procede d'isolement et de purification d'une proteine, et proteine obtenue
GB0100513D0 (en) 2001-01-09 2001-02-21 Smithkline Beecham Plc Process
EP1475098B1 (en) 2002-01-18 2015-08-05 Asahi Kasei Pharma Corporation High-concentration preparation of soluble thrombomodulin
JP2007016016A (ja) 2005-06-09 2007-01-25 Toray Ind Inc 分画方法および分画装置
WO2007035283A1 (en) 2005-09-15 2007-03-29 Wyeth Protein floculation using salts
US8258269B2 (en) 2007-03-23 2012-09-04 Asahi Kasei Pharma Corporation Method for producing high-purity soluble thrombomodulin
FR2920429B1 (fr) 2007-08-30 2012-10-05 Lfb Biotechnologies Procede de purification du facteur viii et du facteur von willebrand
JP2010051927A (ja) 2008-08-29 2010-03-11 Asahi Kasei Corp 限外濾過膜を用いた生体成分の分離方法およびモジュール、装置

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Publication number Publication date
US20150322133A1 (en) 2015-11-12
CN102858978A (zh) 2013-01-02
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JP5722314B2 (ja) 2015-05-20
JPWO2011136313A1 (ja) 2013-07-22
WO2011136313A1 (ja) 2011-11-03
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