JP3220174B2 - 組換ヒトトロンボモジュリン誘導体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、組換ヒトトロンボモジ
ュリン誘導体に関するものである。さらに詳しくは、コ
ンドロイチナーゼＡＢＣで切断されるグルコサミノグリ
カンによって修飾されないようにアミノ酸配列を変更す
ることにより血中半減期が延長された組換ヒトトロンボ
モジュリン誘導体、その発現ベクター及びその形質転換
細胞に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】トロンボモジュリンは血管内皮細胞の膜
上に存在する糖蛋白の一つであり、トロンビンと結合し
てトロンビンの持つフィブリン凝固活性、第Ｖ因子や第
VIII因子の活性化あるいは血小板活性化に対して阻害作
用を示し、またトロンビンによるプロテインＣの活性化
を促進する（実験医学 6,(14), 1396-1398 (1988); Pro
g.Hemost.Thromb., 9, 29-55 (1989))。これらのトロン
ボモジュリンの生理活性はトロンボモジュリンが抗凝固
薬として有用であることを示している。 ヒトトロンボモジュリンのｃＤＮＡは既に報告され(E
MBO J., 6, 1891-1897(1987); Biochemistry, 26, 4350
-4357 (1987)) 、また染色体上の遺伝子のＤＮＡについ
てもヒトトロンボモジュリン遺伝子はイントロンを持っ
ていないことが判明している(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
84, 6425-6429(1987); J.Biochem.,103,281〜285 (198
8))。Suzukiら（J.Biol.Chem.,264, 4872-4876 (1989))
はこのヒトトロンボモジュリンを遺伝子組換により動
物培養細胞で生産させているが、その構造に関しては詳
細な検討は行われていない。

【０００３】明らかにされたＤＮＡ配列によるとヒトト
ロンボモジュリンは 557個のアミノ酸から成立っている
と推定される。ヒトトロンボモジュリンは、機能的に
は、アミノ末端領域、ＥＧＦ様構造領域、Ｏ−グリコシ
ル化部位領域、細胞膜貫通領域および細胞質内領域の５
つの領域に分けられ、その内、ＥＧＦ様構造領域が、ト
ロンビンに作用してそのプロテインＣ活性化能を促進す
る領域であることが報告されている（J.Biol.Chem., 26
4, 4872-4876(1989)) 。また、アミノ末端領域、ＥＧＦ
様構造領域およびＯ−グリコシル化部位領域は細胞膜外
に存在する部分であり、これらの部分だけで構成される
ヒトトロンボモジュリンは細胞膜に結合できず、可溶化
された形で存在する（J.Biol.Chem., 264, 4872-4876
(1989) ；Blood, 75, 1396-1399 (1990) ）。

【０００４】本発明者らはこれら３つの領域（アミノ末
端領域、ＥＧＦ様構造領域およびＯ−グリコシル化部位
領域）に着目して、これら３つの領域のみから成る組換
ヒトトロンボモジュリンの生産を試みた。ヒトトロンボ
モジュリン遺伝子を改変し、発現ベクターを作成し、さ
らにこれを動物培養細胞（CHO-K1細胞）に導入した発現
細胞株を培養したところ、その培養液中に硫酸化グルコ
サミノグリカンを持った組換ヒトトロンボモジュリンを
見出すことができた（特願平1-269194，国際出願PCT/JP
90/01342) 。この硫酸化グルコサミノグリカン構造はコ
ンドロイチン−４−硫酸を主要構造とするものであり、
ヒトトロンボモジュリンでは従来知られていない構造の
ものであった。しかし、この硫酸化グルコサミノグリカ
ンを有する組換ヒトトロンボモジュリンの血中半減期を
ラットにおいて調べたところ、約２０分と短いものであ
った。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】医薬品を疾病の治療に
使用する際、投与された医薬品の血中濃度が有効濃度を
長時間にわたって維持することは極めて重要である。す
なわちその期待される薬効を発揮するためには医薬品の
血中半減期が十分な長さをもっていなければならない。
この点は組換医薬品においても同様であり、血中半減期
を長くするためにさまざまな考案がなされている。

【０００６】発明者らは、硫酸化グルコサミノグリカン
を有する組換ヒトトロンボモジュリンの血中半減期が短
い原因として、硫酸化グルコサミノグリカンの存在に着
目し、この組換ヒトトロンボモジュリンをコンドロイチ
ナーゼＡＢＣで処理したところ、ラットにおける血中半
減期は７．７時間まで延長していた。このことは、組換
ヒトトロンボモジュリンに付加している硫酸化グルコサ
ミノグリカンを除去すれば、血中半減期の長い組換ヒト
トロンボモジュリンが得られることを示している。

【０００７】そこで、発明者らは、前記出願で得られた
組換ヒトトロンボモジュリンの硫酸化グルコサミノグリ
カン付加部位を調べた。すなわち、組換ヒトトロンボモ
ジュリンを還元後遊離のＳＨ基をカルボキシアミドメチ
ル化し、これをトリプシンで完全消化した後、Dowex1×
2 によるイオン交換クロマトグラフィー及びアルコール
沈澱操作を行い、硫酸化グルコサミノグリカンを含むペ
プチド断片を分離した。得られたペプチド断片のＮ末端
アミノ酸配列を調べたところ、硫酸化グルコサミノグリ
カンの付加部位はVal・Asp・Gly・Gly・Asp・Ser・Gly・X・Gly・
Gln・Pro・Pro・Pro であった（Val:バリン、Asp:アスパラ
ギン酸、Gly:グリシン、Ser:セリン、Gln:グルタミン
酸、Pro:プロリン、X:特定できず）。この配列はヒトト
ロンボモジュリンの４６７番目のバリン以降の配列と一
致していた。

【０００８】一方、グルコサミノグリカンのペプチド鎖
への結合部位周辺のアミノ酸配列に関しては、Ser^*-Gly
-Xaa-Gly或いは、Gly-Ser^*-Glyとその近傍の酸性アミノ
酸の存在が重要であることが提唱されている（Xaa:任意
のアミノ酸、Ser^*: グルコサミノグリカンが結合するセ
リン）（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 84, 3194-3198 (198
7); J. Cell Biol., 108, 1547-1556 (1989)) 。またヒ
トトロンボモジュリンでは知られていないが、ウサギト
ロンボモジュリンの一部は、コンドロイチン硫酸様／デ
ルマタン硫酸様グルコサミノグリカンで修飾されてお
り、そのグルコサミノグリカン部分を介してアンチトロ
ンビンIII 依存性の抗トロンビン活性を示すことや、硫
酸化グルコサミノグリカンの結合位置はＯ−グリコシル
化部位領域にあるセリン・グリシン・セリン・グリシン
の配列部分であることが推定されている（J.Biol.Che
m., 263, 8044-8052 (1988); Thromb. Res., 54, 27-39
(1989) ) 。

【０００９】これらのことから、本発明者らは、組換ヒ
トトロンボモジュリンの硫酸化グルコサミノグリカン付
加部位を472 番目から476 番目のSer・Gly・Ser・Gly・Glu
を含む領域であると予想し、この部位のアミノ酸配列を
改変したところ、硫酸化グルコサミノグリカンで修飾さ
れていない組換ヒトトロンボモジュリン誘導体を作成す
ることができた。またその血中半減期は、ラットにおい
て７時間と延長されていた。本発明はこの知見に基づき
なされたものであり、血中半減期が長く、抗凝固薬とし
て有用な新規構造の組換ヒトトロンボモジュリンを提供
することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、硫酸化
グルコサミノグリカンの付加部位であると予想される部
位（Ｏ−グリコシル化部位領域中にある４７２番目から
４７６番目のセリン・グリシン・セリン・グリシン・グ
ルタミン酸周辺）のアミノ酸配列を、アミノ酸の除去・
付加或いは置換により変更した組換ヒトトロンボモジュ
リン誘導体により達成される。

【００１１】この組換ヒトトロンボモジュリン誘導体
は、ヒトトロンボモジュリン遺伝子のＤＮＡに部位特異
的変異の手法を用いて、アミノ酸４７２番目から４７６
番目のセリン・グリシン・セリン・グリシン・グルタミ
ン酸部分及びその周辺の連続したアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ配列を、除去・付加あるいは置換することに
より変更したヒトトロンボモジュリン誘導体遺伝子を作
成し、これを用いて製造することができる。

【００１２】ヒトトロンボモジュリンの遺伝子は、文献
（J.Biochem.,103,281〜285(1988))記載のＤＮＡ配列に
基づいて作成できるプローブを用いてヒト染色体遺伝子
より入手する。この遺伝子は完全長であってもよいし、
また実施例で述べるような、アミノ末端領域、ＥＧＦ様
構造領域およびＯ−グリコシル化部位領域の３つの領域
のペプチドをコードする部分長ＤＮＡでもよい。すなわ
ちヒトトロンボモジュリンの生理活性を損なわず、かつ
硫酸化グルコサミノグリカンで修飾される部位が存在す
る最小限の部分（おそらくはＥＧＦ様構造領域とＯ−グ
リコシル化部位領域の４７２番目から４７６番目のセリ
ン・グリシン・セリン・グリシン・グルタミン酸部分周
辺のアミノ酸配列が必要と思われる）をコードする範囲
の長さのＤＮＡであればよい。得られたヒトトロンボモ
ジュリン誘導体の遺伝子は適当なプロモータ、ターミネ
ータ、シグナル配列等、さらに必要に応じて適当なマー
カー遺伝子を付けて適当なベクターに組込まれる。ベク
ターは動物培養細胞で機能するものであればどのような
種類のものでもよい。たとえばSV40ベクター、 RSV（ラ
ウス肉腫ウイルス）ベクター、MMTV（マウス乳がんウイ
ルス）ベクターあるいは CMV（サイトメガロウイルス）
ベクターなどである。また宿主培養細胞として使用され
るものは、とくに限定されないが、CHO 細胞や COS細胞
はとくに適している。

【００１３】以上のヒトトロンボモジュリン遺伝子の入
手、発現ベクターの構築、細胞内発現等は全て慣用技術
で行なうことができる（参考「遺伝子操作マニュアル」
高木康敬編著，講談社(1982)；Maniatis et al, "Molec
ular Cloning: A Laboratory Mannal" Cold Spring Har
bor Laboratory, Cold spring Harbor, New York (198
2) ；Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laborat
ory Manual 2nd Ed." Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, New York (1989))。

【００１４】

【実施例１】ヒトトロンボモジュリン遺伝子の取得 a) プローブの作成 文献（J.Biolchem.103, 281〜285 (1988)) 記載のＤＮ
Ａ配列に基づいて合成したＤＮＡオリゴマーを用いてプ
ローブを作成した。即ち、Pr-TM-01: (5’)CAGGAGCCTGGCTCCGTCCAGGAGCCTGTGCCTCCTCACCCCCAG
C(3’) およびこれと部分的に相補鎖を形成するPr-TM-02: (5’)CAGCTGTAATGCCAGCTAAGGTGCTTTGGTAGCAAAGCTGGGGGT
GAG(3’) を合成した。これはヒトトロンボモジュリン遺伝子の終
止コドンの13塩基下流側に相当する部分である。これら
二本の合成DNA オリゴマーをアニールさせ部分的に二本
鎖を形成させた後、dNTPs 存在下T4 DNAポリメラーゼ処
理により完全二本鎖とした。この DNA断片をT4ポリヌク
レオチドキナーゼで5′末端をリン酸化したのち、HincI
Iで切断したpUC119（市販）とT4 DNAリガーゼで結合さ
せたところ前者が３個同方向に繰返し挿入されたプラス
ミドpUCprTM9を得た。このpUCprTM9をEcoRI およびHind
III で切断して合成オリゴマー由来の部分を分離し、ニ
ックトランスレーション法により ³²Pでラベルし、ヒト
トロンボモジュリン遺伝子取得用のプローブとして使用
した。

【００１５】b)ヒトトロンボモジュリン遺伝子のクロー
ニング ヒト染色体 DNAを AluＩおよび HaeIII で部分消化して
ヒト遺伝子ライブラリー（ベクターはCharon 4A)を作成
し、このライブラリーから、a)に述べた方法で作成した
プローブを用いてプラークハイブリダイゼーションを行
いヒトトロンボモジュリン遺伝子をスクリーニングした
（参考「遺伝子操作マニュアル」高木康敬編著 講談社
(1982))。その結果、ヒトトロンボモジュリン遺伝子の
全長を保持するファージクローン(phage No.7)の DNAを
得た。このDNA を SacＩで切断しヒトトロンボモジュリ
ン遺伝子を含む6.6kbpの DNA断片を分離した。この DNA
断片をpUC119の SacＩ部位に挿入し図１上段に示すプラ
スミドp7TM-SacＩを得た。図中、ＴＭがヒトトロンボモ
ジュリン遺伝子領域を示す。このp7TM-SacＩをXhoＩお
よびNcoＩで切断し、Klenowフラグメントを用いて平滑
末端としたのちヒトトロンボモジュリン遺伝子を含む2.
1kbpのDNA 断片を分離してpUC119のHincII部位に挿入す
ることにより、ヒトトロンボモジュリン遺伝子の5′側
がpUC119のHindIII 側にくる方向に挿入されたプラスミ
ドp7TMO1を得た（図１下段）。このプラスミドの一本鎖
DNA を調製し dideoxy法により DNA塩基配列を調べて文
献(J.Biolchem.,103, 281-285 (1989)) 記載のヒトトロ
ンボモジュリン遺伝子の DNA配列と一致することを確認
した。

【００１６】

【実施例２】発現ベクターの構築 図２に示すように、プラスミドp7TM01をＳphＩおよびＰ
vlIIで切断し、ヒトトロンボモジュリン遺伝子の開始コ
ドンＡＴＧを含む470bp の DNA断片を分離した。この断
片を BanＩで切断後Klenowフラグメントを用いて平滑末
端とし、更に BglIIで切断し、ATGコドンを含む 180bp
の DNA断片（断片Ａ）を分離した。一方、プラスミドp7
TMO1をＳphＩで切断後マングビーンヌクレアーゼを用い
て平滑末端化し、 BglIIで切断して、ベクター部分を含
む4.8kbpの DNA断片を分離した。この DNA断片と上記の
断片ＡをT4DNA リガーゼを用いて結合させ、プラスミド
p7TM17を作製した。これはp7TM01よりヒトトロンボモジ
ュリン遺伝子の5′非コード領域をほぼ取除いたもので
ある。なお5′側のHindIII 部位までの間に残っている
非コード領域は約30bpである。

【００１７】次にこの全長ヒトトロンボモジュリン遺伝
子にターミネータ配列を結合した。ターミネータ配列に
はプラスミドpSV2-gpt（市販）の SV2ターミネータを用
いた。図３に示すように、pSV2-gptを ApaＩおよびBamH
Ｉで切断した後Klenowフラグメントで平滑末端とし、SV2
転写終了領域を含む 850bpの DNA断片を分離した。この
断片を、 SalＩで切断後Klenowフラグメントで平滑末端
化したベクターpUC19 に挿入した。転写終了領域の5′
側がpUC19 のEcoRＩ側になっている方向に挿入されたプ
ラスミドをとり、pSVTO1とした。プラスミドpSVTO1をBa
mHＩおよびHindIII で切断後マングビーンヌクレアーゼ
で平滑末端とし、転写終了領域を含む 850bpの DNA断片
を分離した。BstXＩおよび XbaＩで切断後マングビーン
ヌクレアーゼで平滑末端化したp7TM17に上記転写終了領
域の断片を挿入した。ヒトトロンボモジュリン遺伝子と
転写終了領域が同方向になっているプラスミドをとりp7
TM19とした。

【００１８】次に部分長ヒトトロンボモジュリンＤＮＡ
のベクターを作成した。図４に示すように、プラスミド
p7TM19を NruＩで切断後Bal31S処理し、更に XbaＩを作
用させた後Klenowフラグメントで末端平滑化した。これ
をT4DNA リガーゼでセルフライゲーションさせることに
よりプラスミドpTMs07を得た。pTMs07の保持する遺伝子
によってコードされるヒトトロンボモジュリンは、１番
目のアラニンから 491番目のアラニンまでである（アミ
ノ酸の番号は文献 EMBO J., 6, 1891-1897 (1987) によ
る）。

【００１９】次にマーカー遺伝子のプロモータ領域を構
築した（図５〜７）。SV2 プロモータ及び SV2ターミネ
ータを有するプラスミドSV2-gpt をEcoRＩおよびPvuII
で切断後Klenowフラグメントで平滑末端とし、キサンチ
ン−グアニン・フォスフォリボシル・トランスフェラー
ゼ(GPT) 遺伝子を含む2.9kbpの DNA断片をとり、これを
pUC13のHincII部位に挿入した。 SV2プロモータがpUC1
3 のEcRＩ側に挿入されたプラスミドをとり pDAＩ-gpt
とし（図５）、HindIII 側に挿入されたものをpNAN-gpt
とした（図７）。プラスミドpSV2-gptをEcoRI およびPv
uII で切断後 gptを含む2.9kbpの DNA断片を分離し、Ec
oRＩおよびSmaIで切断したpUC13 と結合させた。得られ
たプラスミドをpTEN-gptとした（図６）。pDAI-gptをHi
ndIII で切断後Klenowフラグメントで平滑末端とした後
SV2プロモータを含む3.0kbpのDNA 断片（断片Ｂ）を分
離した。pDAI-gptをBglII およびBamHＩで切断後Klenow
フラグメントで平滑末端とした後 gpt領域を含むDNA 断
片(1.8kbp)を分離し、断片Ｂと結合させた。 gpt遺伝子
が発現される方向に結合したプラスミドをとりpD-gptB-
84とした（図５）。pD-gptB-84をXbaＩおよびEcoRＶで
切断し SV2プロモーターを含む0.8kbpの DNA断片を分離
し、 XbaＩおよびEcoRＶで切断して SV2プロモータを含
む部分を取除いたpTEN-gptに挿入した。得られたプラス
ミドをpT-gptB-23とした（図６）。このpT-gptB-23をHi
ndIII およびEcoRＶで切断し SV2プロモータを含む0.8k
bpの DNA断片を分離し、HindIII およびEcoRＶで切断し
て SV2プロモータ部分を取除いたpNAN-gptに挿入した。
得られたプラスミドをpN-gptB-16とした（図７）。

【００２０】マーカー遺伝子としてはネオマイシン耐性
遺伝子（neo^r）を用いた。図８に示すように、プラスミ
ドpSV2-neo（市販）を BglIIおよびBamHＩで切断しネオ
マイシン耐性遺伝子を含む2.3kbpの DNA断片（断片Ｃ）
を分離した。pN-gptB-16を BglIIおよびBamHＩで切断後
SV2プロモータおよびアンピシリン耐性遺伝子(Amp^r)を
含む DNA断片を分離して、断片Ｃと結合させプラスミド
pB-neoを得た。

【００２１】pB-neoを XbaＩとBamHＩおよびScaＩで切
断後マングビーンヌクレアーゼで平滑末端とした後、ネ
オマイシン耐性遺伝子を含む2.7kbpの DNA断片を分離し
た（図９）。この DNA断片を、BamHＩで切断後Klenowフ
ラグメントで平滑末端としたpTMs07と結合させ、ヒトト
ロンボモジュリン遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子が同
方向に挿入されたプラスミドpTMs07-neoを得た。一方、
pO-gal（文献 DNA, 8, 127〜133(1989))をHindIII で切
断し RSVプロモータを含む0.5kbpの DNAを分離し、この
0.5kbp断片をHindIII で切断したpTMs07-neoと結合させ
た。プロモータがヒトトロンボモジュリン遺伝子を発現
させられる方向に挿入されたプラスミドを選び、pRS7TM
-neoとした。このプラスミドpsR7TM-neoを有するE.coli
RS7TM-neoは工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている（受託番号：微工研条寄第2609号、FERM BP-26
09，寄託日：1989年 9月25日）。

【００２２】

【実施例３】発現細胞株の樹立 pRS7TM-neo 20 μg を水 440μl に加えた後2MCaCl₂ 溶
液60μl 添加して１液とした。×2 HBS 液(HEPES 2.5g,
NaCl 3.2g/200ml; pH7.1) 500μl に×100 リン酸溶液
(Na₂HPO₄ 1.253g, NaH₂PO₄ 0.546g/100ml) 10 μl 加え
たものを２液とした。２液に少量づつ１液を加えながら
攪拌し、室温に30分間放置した。一方、10%FBSを添加し
たダルベッコ変法イーグル培地「ニッスイ」（日水製
薬、以下DME培地という）で 1〜2 ×10⁵ 個のCHO-K1
細胞（大日本製薬 (株) カタログ番号:03-402,原ATCC N
o:CCL-61)を７５cm² のカルチャーボルト中で一晩培養
した。新鮮な同培地10mlと交換してから 4時間後上記プ
ラスミド懸濁液を加え、18時間培養した。1g/lのG418(G
IBCO社製）を含むDME培地16mlと交換し培養を継続し
た。3 〜4 日毎に培地を交換しながら10日間培養した
後、限界希釈法によって形質転換株を選出することによ
りヒトトロンボモジュリン生産株CHO-K1RS7TMneo No.2-
9b-29 （以下No.2-9b-29と略す）を得た。

【００２３】

【実施例４】活性型プロテインＣの活性測定によるヒト
トロンボモジュリンの定量(APC法） 33μl のゼラチン
バッファー（0.1%ゼラチン(SIGMA社製、カタログ番号G-
2500）、20mM Tris-HCl (SIGMA社製), 0.1M NaCl, 0.02
% NaN₃; pH7.5)と、50 mM CaCl₂ 6 μl、 3μM ヒトプロ
テインC(American Diagnostica Inc. ）製）10μl およ
び測定試料 1μl を混合して37℃で20分間静置した。こ
れに3.5U/ml のウシトロンビン（持田製薬製；5M MES,
0.1M NaCl, 0.02% NaN₃, pH6.0 に溶解）10μl 添加し
た後37℃で10分間静置後、20μl のアンチトロンビンII
I （ノイアート500 倍（ミドリ十字製）を20mlの生理食
塩水で溶解したもの）および20μl のヘパリン(SIGMA社
製、カタログ番号H-3125; 10,000n を25mlのゼラチンバ
ッファーで溶解したもの）を加える。充分に混合した後
10μl を別の容器に移し、90μl のS-2366（第一化学；
ゼラチンバッファーで溶解し0.11mMとしたもの）を加え
Vmax(Molecnlar Devices社製）を用いて、ここで生成し
た活性型プロテインＣによって起る単位時間当りの405n
m での吸光度の変化を測定することにより測定試料中の
ヒトトロンボモジュリンを定量する。

【００２４】

【実施例５】実施例３で得られたヒトトロンボモジュリ
ン生産CHO 細胞株No,2-9b-29を１本当り 2×10⁷ 個、G4
18(1g/l)およびアプロチニン(50U/ml)を含むGIT 培地
（日本製薬製） 200mlの入ったローラーボトルに接種
し、 0.3〜0.5rpmで培養を行った。２日目に上記培地で
培地交換を行った。４日目に上記培地よりG418を除いた
培地と交換した。以降毎日７日目まで培地を交換し、
５、６および７日目に回収した培養液を合せ生産物回収
の材料とした。

【００２５】

【実施例６】実施例５で得られた培養液(880ml) から遠
心分離(3000rpm、10分間）および濾過(0.8μm メブラン
フィルター使用）処理によって固形夾雑物を取除いた
後、1.0M Tris-HCl 緩衝液(pH7.5) を添加しpHを 7.5に
調整した。この液を、0.15M NaCl を含む20mM Tris-HCl
緩衝液(pH7.5) で予め平衡化したQ-セファロースファ
ーストフロー(Pharmacia社製）充填カラム（φ 2.5×12
cm）に流速200ml/時で通した。カラム流量 20ml/時の前
記緩衝液 300mlで洗った後流量100ml/時の20mMTris-HCl
緩衝液(pH7.5) 中で0.15M から1.20M の直線塩化ナトリ
ウム濃度勾配を用いて溶出した（総溶出緩衝液量は1000
ml）。溶出液を19mlづつ分画し各フラクションを APC法
により活性を調べた。その結果、フラクションNo.8〜15
と22〜32の二つの活性ピークが検出された（図１０参
照）。後者のピーク画分を集め画分Ａとした。また前者
の画分は画分Ｂとした。

【００２６】

【実施例７】さらに各画分Ａ，Ｂをアフィニティクロマ
トグラフィで精製した。予め 0.15M NaCl を含む20mM T
ris-HCl 緩衝液(pH7.5) 平衡化した抗ヒトトロンボモジ
ュリンIgG 結合セルロファイン（ホルミルセルロファイ
ン（チッソ社製）に抗ヒトトロンボモジュリンIgG を約
5mg/mlゲルの割合で結合させたもの）充填カラム（φ
1.5×6cm)に、２倍量の20mM Tris-HCl 緩衝液(pH7.5)
で希釈した画分Ａ（又はＢ）を流量 20ml/時で通した。
このカラムを流量30ml／時で0.35M NaClを含む20mM Tri
s-HCl 緩衝液(pH7.5) で洗浄した後流量30ml／時の3.0M
チオシアン酸カリウムを含む20mM Tris-HCl 緩衝液(pH
7.5)150mlで溶出した。この溶出液を集め限外濾過膜
（ダイアフローメンブレンYM30、φ76mm）を装着した限
外濾過装置で約 5mlに濃縮した。これに100ml の0.15M
のNaClを含む20mM Tris-HCl 緩衝液(pH7.5) を加えて再
度同様に約 5mlに濃縮した。この操作を更に二度繰返し
たのち、φ43mmのYM30を用いて最終的に1 mlに濃縮し
た。

【００２７】こうして得た画分Ａからの活性物質を TM-
β、画分Ｂからの活性物質を TM-αとした。各試料につ
いて逆相HPLCを行なった。溶出条件は以下の通りであ
る。 カラム：フェニル5PWRP ( φ 4.6×75 mm,東ソー社製） 溶媒Ａ： 0.1％TFA-H₂O （pH≒2.0 ） 溶媒Ｂ： 0.1％TFA-CH₃CN 濃度勾配：溶媒Ｂの比率を開始時10％から50分間で65％
に上げた。 流速：1 ml／分， 試料：20μｇ 検出：Ａ_280nm 結果を図１１に示す。 TM-αはシングルピークを示した
（図１１(A) ）が、 TM-βはこのような酸性の溶出条件
では溶出されなかった（図１１(B) ）。

【００２８】そこで溶出条件を下記のようなアルカリ条
件に変えてHPLC分析を行なった。 カラム：フェニル5PWRP (φ 4.6×75 mm,東ソー社製） 溶媒Ａ： 1mM NH₄OH （pH≒9.5 ） 溶媒Ｂ： CH₃CN 濃度勾配：溶媒Ｂの比率を開始時10％から50分間で65％
に上げた。 流速：1 ml／分， 試料：80μｇ 検出：Ａ_280nm 図１２に示すようにこの条件下では保持時間13.0分でシ
ングルピークとして溶出され、 TM-βを純化することが
できた。精製された TM-α及び TM-βは何れもSDS-ポリ
アクリルアミド電気泳動で単一バンドを示していた。

【００２９】TM-α及び TM-βについて、そのＮ末端側
のアミノ酸配列をペプチドシーケンサーApplied Biosys
tems 社製、470A型）を用いて５番目まで調べたとこ
ろ、いずれもAla・Pro・Ala・Glu・Pro であった。これは文
献(EMBO J.,6, 1891〜1897(1987)) 記載のヒトトロンボ
モジュリンの N末端アミノ酸配列と一致する。 TM-αと
TM-βのHPLCでの挙動の違いから、 TM-βは酸性糖鎖が
付加したものであると推測された。

【００３０】なお図１３は TM-βのイオン交換クロマト
の溶出パターンである。その溶出条件は下記の通りであ
る。 カラム：DEAE-NPR (φ 4.6×35 mm, 2.5μm,東ソー社
製） 溶媒Ａ： 20mM Tris-HCl(pH 7.5 ） 溶媒Ｂ： 1.2M NaCl - 20mM Tris-HCl(pH 7.5) 濃度勾配：５分間、溶媒Ｂを10％、その後50分間で10か
ら90％に上げた 流速：0.8 ml／分， 試料：60〜70μｇ 検出：Ａ_280nm

【００３１】

【実施例８】TM-βのコンドロイチナーゼABC 処理 ヒトトロンボモジュリンでは知られていないが、ウサギ
トロンボモジュリンの一部は、コンドロイチン硫酸様／
デルマタン硫酸様グルコサミノグリカンで修飾されてお
り、そのグルコサミノグリカン部分を介してアンチトロ
ンビンIII 依存性の抗トロンビン活性を示すことが報告
されており、硫酸化グルコサミノグリカンの重要性が示
されている(J.Biol.Chem., 263, 8044〜8052 (1988);Th
romb.Res.,54, 27〜39 (1989) ）。そこで酸性物質であ
る TM-βについて硫酸化グルコサミノグリカンの有無を
調べた。まずコンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸を特
異的に分解して硫酸化不飽和二糖を生成するコンドロイ
チナーゼABC で TM-βを処理した。コンドロイチナーゼ
ABC(プロテアーゼフリー、1U／バイアル；生化学工業
製）凍結乾燥粉末の入ったバイアルに620μl の0.1M Na
Cl を含む50mM Tris-HCl 緩衝液(pH8.0) と30μl の 1.
0M 酢酸ナトリウム水溶液を加え酵素を溶解した。これ
に、350 μl の TM-β溶液(3.4mg/ml, 0.1M NaCl−20mM
Tris-HCl 緩衝液(pH7.5))を加えよく攪拌した後37℃で
16時間反応させた。なお、 TM-βの定量は、TM-αの凍結
乾燥粉末を標準試料にして、ELISA(enzymelinked immun
osorbent assay法）により行なった。このときの重量換
算は、SDS-電気泳動の泳動度から、 TM-αの分子量を70
kD、 TM-βの分子量を85kDとして行なった。

【００３２】

【実施例９】HPLC装置(LC-6AD;島津製作所製）に装着し
たTSKgel Phenyl 5PW RP（φ 4.6×75mm；東ソー社製）
をあらかじめ流量1.0ml/分の条件下で 10%CH₃CN を含む
1mM NH₄OH 溶液で平衡化しておき、この条件下で連続的
に通液中のカラムに実施例８で得た反応液を注入した。
この操作により大部分の蛋白質はカラムに吸着される
が、反応生成物である不飽和二糖は吸着されないで通過
する。この通過画分を回収し凍結乾燥し、その凍結乾燥
粉末を1.0 mlの水に溶解しHPLCによる同定の試料とし
た。

【００３３】

【実施例１０】実施例９で得られた試料を下記の条件で
HPLCによる分析を行なった。 カラム：Shim-pack CLC-NH₂,φ 6.0×150 mm（島津製作
所製） 溶媒Ａ： 10mM NaH₂PO₄ ， 溶媒Ｂ： 500 mM NaH₂PO₄ 流 量：1.2 ml／分 溶出条件：試料注入後５分間は溶媒Ａのみで流し、その
後40分間で溶媒Ｂの比率を最終80％まで直線的に高め
た。 検 出：232nm におけるＵＶ吸収 この本条件下で試料中の主要ピークの保持時間は24.7分
であった（図１４）。 このピークを示す不飽和二糖を便宜上ΔDi-XS として図
面に示す。この保持時間は市販の標準2-acetamido-2-de
oxy-3-0-（β-D-gluco-4-enepyranosylnronic acid)-4-
0-sulfo-D-galactose （以下ΔDi-4S と略す；生化学工
業社製）の保持時間と一致した。さらに、本試料 (ΔDi
-XS)とΔDi-4S を混合して上記条件下で分析を行うと、
試料中の主要ピーク（保持時間24.7分）に相応の増加が
見られた（図１５）。ΔDi-4S はコンドロイチン-4- 硫
酸やデルマタン硫酸をコンドロイチナーゼABC で処理し
た場合の分解産物として知られているものであり、 TM-
βの主要修飾糖鎖はコンドロイチン-4- 硫酸又はデルマ
タン硫酸であると推測できた。なお図１４、１５におけ
る保持時間16.1分のピークは試料中に混在するSCN^-イオ
ン（実施例７の操作により混入）によるピークである。

【００３４】

【実施例１１】実施例９で得られた試料について実施例
１０とは異なる下記の条件でHPLCによる分析を行った。 カラム：Shim-pack CLC-NH₂,φ 6.0×150mm （島津製作
所製） 溶 媒Ａ：アセトニトリル：メタノール：0.5M蟻酸アン
モニウム緩衝液(pH4.8) 流 量：1.5ml/分 検 出：232nm のＵＶ吸収 この条件下でも試料中の主要ピークの保持時間（21.3
分）は予想分解産物ΔDi-4S の保持時間と一致していた
（図示せず）。

【００３５】

【実施例１２】次に TM-β修飾糖鎖がコンドロイチン-4
硫酸であるのかデルマタン硫酸であるのか明らかにす
るため、コンドロイチナーゼAC 1フラボ（コンドロイチ
ン-4- 硫酸を特異的に分解して硫酸化不飽和二糖を生成
するが、デルマタン硫酸は分解できない）でTM-βを処
理した。50μl の TM-β溶液（3.4mg/ml, 0.15M NaCl-
20mM Tris-HCl 緩衝液(pH7.5))に50μl の0.4M Tris-HC
l 緩衝液(pH7.5) と50μl の0.4M酢酸ナトリウム溶液と
50μl の0.1% BSA溶液および200 μl の水を加え、更に
これに予め0.1% BSA溶液に1U/ml の濃度で溶かした市販
コンドロイチナーゼAC 1フラボ(1.6U/バイアル：生化学
工業製）溶液100μl を添加した後よく攪拌し37℃で６
時間反応させた。得られた反応液から、実施例９と同様
にして不飽和二糖画分を集め、実施例１０，１１と同様
の条件でHPLCにかけたところ、いずれも実施例１０，１
１と同様に予想分解産物ΔDi-4S と同じ保持時間を持つ
ピークが観察された。図１６は実施例１０と同一条件下
でのHPLC溶出パターンである。従って TM-βの修飾糖鎖
はコンドロイチン−４−硫酸であると推測できた。

【００３６】

【実施例１３】さらに TM-βの修飾糖鎖はコンドロイチ
ン-4- 硫酸であることの確証を得るため、 TM-βの予想
分解産物ΔDi-4S に特異的に作用し脱硫酸するコンドロ
−４−スルファターゼでΔDi-XS を処理した。実施例９
で得られた試料50μl に10μl の0.4M Tris-HCl 緩衝液
(pH7.5) と10μl の 0.4M 酢酸ナトリウム溶液と10μl
の0.1%BSA 溶液および10μl の水を加え、これに 2μl
の市販コンドロ4- スルファターゼ(1U/ml 0.1%BSA：生
化学工業製）を添加しよく攪拌した後37℃で１時間反応
させた。 100℃２分間加熱して反応を停止させた後ただ
ちに実施例１０に述べた条件によりHPLCを用いた分析を
行った。その結果、保持時間24.7分のピークが減少し、
新たに保持時間15.6分のピークが観察された（図１７
(C) ）。この保持時間は市販の標準2-acetamido-2-deox
y-3-0-（β-D-glnco-4-enepyranosyluronic acid)-D-ga
lactosu （以下ΔDi-OS と略す）と一致した（図１７
(A) ）。さらに市販のΔDi-4S と2-acetamido-2-deoxy-
3-0-（β-D-gluco-4-enepyranosylnronic acid)-6-0-su
lfo-D-galactose （以下ΔDi-6S と略す；生化学工業
製）を各 2.5μg づつコンドロ-4- スルファターゼで処
理し同様の条件でHPLCによる分析を行なった。その結果
ΔDi-4S では保持時間がΔDi-OS と等しいピークを生じ
た（図１７(B) ）。しかしコンドロイチン-6- 硫酸の分
解産物として知られているΔDi-6S ではコンドロ-4- ス
ルファターゼ処理によるピークの移動は観察されなかっ
た（図１７(D) )）。以上の結果から本発明の組換ヒト
トロンボモジュリン（ TM-β）はコンドロイチン−４−
硫酸を基本とする硫酸化グルコサミノグリカンを有する
ことが判明した。なおΔDi-4S 生成量をHPLCでのピーク
面積から換算した結果、組換ヒトトロンボモジュリンか
らその１分子当り平均２０〜２５分子の上記ΔDi-4S が
コンドロイチナーゼ処理により生成するものと推測でき
た。

【００３７】

【実施例１４】TM-βの抗凝固活性の測定 54nMウシトロンビン（表１中ではＴと略す）の生理食塩
水溶液（持田製薬製） 100μl、ウシフィプリノーゲン
（タイプ2; 3mg/ml 20mM Tris-HCl, 0.15M NaCl、pH 7.5
；第一化学薬品製） 100μl および0.9% NaCl, 1mg/ml
BSA, 0.1% ルブロールPXに溶解した0、54、108あるいは1
62nM の TM-β 100μl を混合して反応を開始し、凝固
までの時間を測定した。測定は血液凝固自動測定器クロ
テックII（メテク社製）を使用して行った。その結果は
次の通りである。数値の単位は秒で示してある。

【００３８】

【表１】

【００３９】表に示すように硫酸化グルコサミノグリカ
ン鎖を有するヒトトロンボモジュリン、 TM-βはトロン
ビンの凝固活性を抑制していた。

【００４０】

【実施例１５】TM-βによるトロンビンのプロテインＣ
活性化の促進 １ml当り20, 15, 8, 6, 4, 2及び 1μｇの TM-β溶液を
作り、これを測定試料として実施例４の方法で活性化プ
ロテインＣを生成させた。生成した活性化プロテインＣ
によって起こる１分間当りの吸光度（OD₄₀₅)変化を図１
８に示す。図に示すように、硫酸化グルコサミノグリカ
ン鎖を有するヒトトロンボモジュリン、 TM-βはトロン
ビンによるプロテインＣ活性化を促進していた。

【００４１】

【実施例１６】コンドロイチナーゼABC 処理した TM-β
の血中濃度半減期 TM-βを実施例８と同様な方法でコンドロイチナーゼABC
処理し、実施例９と同様にHPLCカラムに注入し、カラ
ムをよく洗浄して反応生成物である不飽和二糖を除去し
た。次に、カラムに吸着保持されたコンドロイチナーゼ
ABC 処理 TM-βを1mM NH₄OH-アセトニトリル（5-55% の
直線濃度勾配）で溶出し、これを集めて凍結乾燥した。
この凍結乾燥標品を0.9% NaCl, 0.1% ルーブロールPX,
1mg/ml BSAに溶解して、以下の実験に用いた。

【００４２】ウイスター系雄性ラット（静岡実験動物）
11週令をペントバルビタール（商品名、ネンブタール；
大日本製薬製）麻酔下で、コンドロイチナーゼABC 処理
TM-βを0.2 mg/kg の用量で大腿静脈から投与した。投
与後、5、10、30、60、120、 300分にクエン酸加血（3,13％
クエン酸ナトリウム・２水塩：血液＝1:9 ）を採取し、
遠心操作（3,000 rpm, 10 分）により血漿を得た。この
血漿をPBS(0.02％ルブロールPX含有）で100 倍希釈し
て、ELISA で血中のコンドロイチナーゼABC 処理 TM-β
量を定量した。 TM-β量の換算は実施例８と同様 TM-α
凍結乾燥粉末を標準試料として行った。

【００４３】図１９に示すように、コンドロイチナーゼ
ABC 処理 TM-β（−●−）の血中濃度半減期は7.7 時間
であり、未処理 TM-βの場合（−○−）の血中濃度半減
期約20分に比べ、著しく延長していた。なお、コンドロ
イチナーゼABC 処理 TM-βは、トロンビンによるプロテ
インＣ活性化の促進作用を失うことはなかった。従っ
て、硫酸化グルコサミノグリカン鎖で修飾されないヒト
トロンボモジュリン誘導体を作ることができれば、 TM-
βよりも血中半減期の長い組換ヒトトロンボモジュリン
とすることが期待できる。

【００４４】

【実施例１７】ヒトトロンボモジュリン誘導体遺伝子の
作成とその発現ベクターの構築 部分長ヒトトンボモジュリン遺伝子を有するプラスミド
pTMs07を、BssHIIおよびNheIで切断後Klenowフラグメン
トで平滑末端とし、self-ligation させ、約1.3kbpのBs
sHII−NheI断片が除去されたプラスミドpTMDs07 を得た
（図２０上段）。別途ＤＮＡオリゴマーMnt-TMSG-2＝
(5′) GCTCGCCAGAGTCGCCACCG(3′) を合成し、Ｋｕｎｋ
ｅｌ法( 文献: Sambrook et al.:"Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2nd Ed." Vol.2, p15.74, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New
York (1989)）により部位特異的変異の手法を用いてpTM
Ds07 に変異を導入した。実験に当たっては部位特異的
変異実験キット 「Mutan_TM-K」（宝酒造製）を使用した。
即ち概略を述べると以下の通りである（図２０、２
１）。

【００４５】i)ｄＵを含むssＤＮＡの取得 pTMDs07 をE.coli MV1184 に保持させ、この菌を２×Ｙ
Ｔ培地（10μg/mlのテトラサイクリン、30μg/mlのスト
レプトマイシンを含む）で前培養した。この培養液30μ
l を２×ＹＴ培地（150 μg/mlのアンピシリンを含む）
3ml に接種し、ファージM13K07をm.o.i.＝２〜10で感染
させ、37℃30分静置後70μg/mlとなるようにカナマイシ
ンを加えて一夜37℃で振盪培養した。遠心分離で上清を
集め0.22μm のメンブランフィルターで濾過した後、こ
の上清20μl とE.coli BW313の培養液80μl を混合し37
℃10分間静置後適当量をＬＢ−プレート（150 μg/mlの
アンピシリンを含む）にひろげ37℃でコロニーを形成さ
せた。シングルコロニーを２×ＹＴ培地（150 μg/mlの
アンピシリンを含む）で前培養し、この培養液１mlを２
×ＹＴ培地（150 μg/mlのアンピシリンを含む）100ml
接種しファージM13K07をm.o.i.＝２〜10で感染させた。
37℃30分静置後70μg/mlとなるようにカナマイシンを加
えて一夜37℃で振盪培養した。遠心分離で上清を回収し
た。上清に20％PEG6000 ／2.5M NaCl 溶液25mlを加え攪
拌し、室温で10分放置後遠心分離で沈澱を集めた。ＴＥ
緩衝液５mlに溶かし等量の中和フェノールを加えて攪拌
後10分静置した。遠心分離で水層を回収し、等量の中和
フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（2
5：24：1 ）を加えて攪拌後10分静置した。遠心分離で
水層を回収し、等量のクロロホルム：イソアミルアルコ
ール（24：１）を加えて攪拌後10分静置した。遠心分離
後水層を回収し、３Ｍ酢酸アンモニウム、pH8.0 を500
μl 、イソプロピルアルコール５mlを加えて攪拌後、遠
心分離して沈澱を集めた。沈澱を70％エタノールで洗
い、減圧乾燥した後50μl のＴＥ緩衝液に溶解した。

【００４６】ii) 部位特異的変異の導入 10pmolの上記合成オリゴマーMnt-TMSG-2をＡＴＰ存在下
T4ポリヌクレオチドキナーゼによって5′末端をリン酸
化（反応溶液の最終用量は10μl ）した。この溶液１μ
l とi)で得たssＤＮＡ溶液（0.2pmol ／10μl アニール
緩衝液）１μl を混合し65℃15分、37℃静置することに
よりハイブリダイズさせた。これにdNTPs 存在下E.coli
DNAリガーゼ、T4 DNAポリメラーゼを加え（反応溶液27
μl ）25℃２時間静置後、３μl の0.2M EDTA,pH8.0 を
加え65℃５分静置し反応を停止させた。この反応液３μ
l をE.coli BMH71-18mutS コンピテントセルに混合し０
℃30分、42℃45秒、０℃１〜２分静置した後、ＳＯＣ培
地300 μl を加え、37℃１時間振盪培養した。これにM1
3K07ファージを感染させ37℃30分静置し、２×ＹＴ培地
（150 μg/mlのアンピシリン、70μg/mlのカナマイシン
を含む）１mlを加え37℃で一夜振盪培養した。遠心分離
で回収した上清２０μl をE.coli MV1184 培養液80μl
を混合し、37℃10分静置後ＬＢ−プレート（150 μg/ml
のアンピシリンを含む）にひろげ37℃でコロニーを生育
させた。これより部分特異変異の導入されたプラスミド
pM2TMD07を得た（図２０下段）。

【００４７】pM2TMD07をNheI及びSalIで切断後変異導入
部位を含む約260bp ＤＮＡ断片を分離した。この断片を
pRS7TM-neoをNheI及びSalIで切断後分離したプロモータ
ーを含むＤＮＡ断片と結合させ、欠損変異ヒトトロンボ
モジュリン遺伝子と発現させるためのベクターpRS7M2TM
-neoを作成した（図２１）。このプラスミド・ベクター
pRS7M2TM-neoを有するE.coli RS7M2TM-neoは工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されている（受託番号：微
工研条寄第３１７７号）。

【００４８】

【実施例１８】実施例３と同様の方法で、pRS7M2TM-neo
を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞を形質転換し、組換え欠損変
異ヒトトロンボモジュリン誘導体（以下MTM10 と称す
る）の発現細胞株CHO-K1RS7M2TMneo Neo No.14-50 （以
下No.14-50と略す）を得た。

【００４９】

【実施例１９】実施例５と同様の方法で、MTMI0 生産細
胞株No.14-50をローラ−ボトルで培養し、５、６及び７
日目に回収した培養液を合わせ生産物回収の材料とし
た。

【００５０】

【実施例２０】実施例１９で得られた培養液（4 L)から
遠心分離(3000rpm、10分）および濾過（0.45μm メンブ
ランフィルター使用）処理によって固形夾雑物を取り除
いた後、 1.0M Tris-HCl 緩衝液(pH7.5) を添加しpHを
7.5 に調整した。この液を0.15M NaClを含む20mM Tris-
HCl 緩衝液(pH7.5）で予め平衡化したＱセファロースフ
ァーストフロー（Pharmacia 社製）充填カラム（φ5 ×
10cm）に流速30ml／分で通した。カラム流量20ml／分の
前記緩衝液200ml で洗った後流量20ml／分の0.5M NaCl
を含む20mM Tris-HCl 緩衝液(pH7.5）600ml で溶出し
た。溶出画分中のMTM10 をELISA 法（二種類の坑ヒトト
ロンボモジュリン・モノクロナル抗体を用いたサンドイ
チ法）で定量したところ、回収率は99％であった。

【００５１】

【実施例２１】実施例２０の活性画分をアフィニティク
ロマトグラフィで精製した。予め0.15M NaCl を含む20
Tris-HCl 緩衝液（pH7.5 で平衡化した抗ヒトトロンボ
モジュリンＩｇＧ結合セルロファイン（ホルミルセルロ
ファイン（チッソ社製）に抗ヒトトロンボモジュリンＩ
ｇＧを約5mg/mlゲルの割合で結合させたもの）充填カラ
ム（φ2.5 ×9cm ）に活性画分を流量60ml／時で通し
た。このカラムを流量60ml／時で0.35M NaClを含む20mM
Tris-HCl 緩衝液(pH7.5) で洗浄した後60ml／時のチオ
シアン酸ナトリウムを含む20mM Tris-HCl 緩衝液(pH7.
5)400mlで溶出した。この溶出液を集め限外濾過膜（ダ
イアフローメンブレンYM30、φ76mm）を装着した限外濾
過装置で約５mlに濃縮した。これに100ml の0.15M NaCl
含有20mM Tris-HCl 緩衝液(pH7.5) を加えて再度同様
に約５mlに濃縮した。この操作を更に二度繰り返した
後、φ43mmの限外濾過膜YM30を用いて最終的に22mlに濃
縮した。

【００５２】

【実施例２２】実施例２１のようにして得られた合計５
ロット分のMTM10 画分を合わせて（合計用量約100ml ）
ゲル濾過クロマトグラフィーを行なった。予めＰＢＳ
（１ｌ中にKCL を200mg、KH₂PO₄を200mg 、NaClを8g、Na
₂PO₄・7H₂Oを2.16g 含有している）で平衡化したセファ
クリルS-300HR(Pharmacia 社製）充填カラム（φ5.0 ×
95cm) にMTM10 画分を流量5ml/分で通した。カラム流量
5ml/分のＰＢＳで溶出させ、溶出液を15mlづつ分画し
た。４１番目から４７番目までのフラクションを集め、
40mlに濃縮した。こうして得たMTM10 の精製物につい
て、実施例７と同様の方法で逆相ＨＰＬＣを行った。溶
出条件は以下の通りである。 カラム： フェニル５−ＰＷＲＰ（φ4.6 ×75mm、東ソ
ー社製） 溶媒Ａ： 0.1 ％ TFA-H₂O 溶媒Ｂ： 0.1 ％ TFA-CH₃CN 濃度勾配： 溶媒Ｂの比率を開始時20％から60分間で60
％に上げた。 流速： １ml／分、 試料： 20μg 検出： Ａ_280nm 結果は図２２に示ように、MTM10 シングルピークを示し
た。MTM10 について、そのＮ末端側のアミノ酸配列をペ
プチドシーケンサー（Applied Biosystems社製、470A
型）を用いて５番目まで調べたところ、主なものはAla・
Pro・Ala・Glu・Pro であった。これは文献（EMBO J., 6,
1891-1897 (1987)）記載のヒトトロンボモジュリンのＮ
末端アミノ酸配列と一致する。

【００５３】

【実施例２３】MTM10 のコンドロイチナーゼＡＢＣ処理
MTM10 がコンドロイチン硫酸を保持しているかどうかを
調べた。コンドロイチナーゼＡＢＣ（プロテアーゼフリ
ー、１Ｕ／バイアル；生化学工業製）凍結乾燥粉末の入
ったバイアルに620 μl の1.0M NaCl を含む50mM Tris
-HCl緩衝液（pH8.0 ）と３０μl の0.1M酢酸ナトリウム
水溶液を加え酵素を溶解した。これに、350 μl のMTM1
0 溶液（5.0mg/ml ，0.1M NaCl-20mM Tris-HCl 緩衝液
（pH7.5 ））を加えよく攪拌した後37℃で16時間反応さ
せた。反応生成物と未反応のMTM10 とを、実施例７と同
様の条件で逆相HPLCを行なったところ、両者の保持時間
は一致していた（図示せず）。このことはMTM10 は TM-
βと異なりコンドロイチナーゼＡＢＣで切断されるグル
コサミノグリカンで修飾かれていないことを示してい
る。

【００５４】

【実施例２４】MTM10 の血中半減期 ９−１０週令のウイスター系ラット（雄、250g前後）に
ペントバルビタールで麻酔後、MTM10 を投与量1mg/kgで
大腿静脈から投与した。経時時に採血し、実施例１６と
同様にＥＬＩＳＡ法で血中残存量を測定した。その結果
MTM10 の血中半減期は約７時間であった（図２３）。以
上のように、 TM-βを修飾しているコンドロイチン硫酸
が結合していると予想される部位のアミノ酸配列を変更
することにより作製した誘導体MTM10 は、コンドロイチ
ナーゼＡＢＣで切断されるような硫酸化グルコサミグリ
カンで修飾されていないため、血中半減期が長いものと
考えられる。

【００５５】

【実施例２５】MTM10 によるトロンビンのプロテインＣ
活性化促進能 40、20、15、10および5 nMのMTM10 溶液を作り、これを
測定試料とした。この測定試料６μl を、32μl の緩衝
液Ａ（20mM Tris-HCl(SIGMA 社製)、0.15M NaCl、 0.5 ％
BSA(SIGMA 社製、カタログ番号A-4378);pH7.4 ）、50mM
CaCl₂６μl 、３μＭヒトプロテインＣ（American Dia
gnostica Inc. 製）10μl に混合した。これに100nM ヒ
トトロンビン（SIGMA 社製、カタログ番号T-3010；緩衝
液Ａに溶解）６μl を添加後37℃で15分静置し、20μl
のアンチトロンビンIII （ノイアート500 倍（ミドリ十
字製）を20mlの生理食塩水で溶解後、更に緩衝液Ｂ(50m
M Tris-HCl（SIGMA 社製）、0.1M NaCl 、1mM CaCl₂ ；
pH8.0 ）2.5 倍希釈したもの）および20μl のヘパリン
溶液（SIGMA 社製、カタログ番号H-3125：400n/ml とな
るようゼラチンバッファー（0.1 ％ゼラチン（SIGMA 社
製、カタログ番号G-2500）、20mM Tris-HCl、 0.1M NaC
l、 0.02％NaN₃：pH7.5 ）で濃度を調整したもの）を加
えた。充分に混合した後100 μl のS-2366（第一化学：
ゼラチンバッファーで2.0mMに調整した後緩衝液Ｂで0.4
mM としたもの）を加えＶｍａｘ（Molecular Devices
社製）を用いて、ここで生成した活性型プロテインＣに
よって起こる単位時間当たりの405nm での吸光度の変化
を測定することにより測定試料中のMTM10 の補酵素活性
を調べた。生成した活性化プロテインＣによって起こる
１分間当たりの吸光度（ＯＤ₄₀₅ ）の変化を図２４に示
す。図に示すように、MTM10 はトロンビンによるプロテ
インＣ活性化を促進していた。

【００５６】

【実施例２６】MTM10 の抗凝固活性の測定 54nMウシトロンビン（表２中でＴと略す）の生理食塩水
溶液（持田製薬製）100 μl 、ウシフィブリノーゲン
（タイプ２：3mg/ml、20mM Tris-HCl、 0.15M NaCl 、pH
7.5 ；第一化学薬品製）100 μl および0.9 ％NaCl、１
mg/ml BSA、０．１％ルブロールＰＸに溶解した０、5
4、108 あるいは162nM のMTM10 溶液100 μl を混合し
て反応を開始し、凝固までの時間を測定した。測定は血
液凝固自動測定器クロテックII（メテク社製）を使用し
て行った。その結果は次の通りである。数値の単位は秒
で示してある。

【００５７】

【表２】

【００５８】表に示すように、MTM10 はトロンビンの凝
固活性を抑制していた。

【００５９】

【発明の効果】以上のように、本発明の組換ヒトトロン
ボモジュリン誘導体は、硫酸化グルコサミノグリカンが
付加しないようにアミノ酸配列を変更した新規構造の組
換ヒトトロンボモジュリン誘導体であり、ＤＮＡ配列を
改変しないで作られた従来の組換ヒトトロンボモジュリ
ンに比べ、血中半減期が長い。一方、従来の組換ヒトト
ロンボモジュリンと同様、トロンビンの凝固活性を抑制
する能力と、トロンビンによるプロテインＣ活性化に対
する促進能は失われていない。従って、本発明の組換ヒ
トトロンボモジュリン誘導体(TMT10) は、新たな抗凝固
薬として有用性が高い。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトトロンボモジュリン遺伝子を含んだプラス
ミドp7TMO1の構造図である。

【図２】5′非コード領域をほぼ取除いた全長ヒトトロ
ンボモジュリン遺伝子を有するプラスミドp7TM17の構築
図である。

【図３】全長ヒトトロンボモジュリン遺伝子にターミネ
ータ配列が結合されているプラスミドp7TM19の構築図で
ある。

【図４】プラスミドp7TM19より得た部分長ヒトトロンボ
モジュリン遺伝子を有するプラスミドp7TM07の構築図で
ある。

【図５】プラスミドpD-gptB-84の構築説明図である。

【図６】プラスミドpTEN-gptB-23の構築説明図である。

【図７】プラスミドpN-gptB-16の構築説明図である。

【図８】マーカー遺伝子であるneo^rを含むプラスミドpB
-neoの構築説明図である。

【図９】ヒトトロンボモジュリン発現ベクターpRS7TM-n
eoの構築説明図である。

【図１０】ヒトトロンボモジュリン生産細胞の培養液の
Ｑ−セファロース・カラムクロマトグラムの溶出パター
ン図である。

【図１１】組換ヒトトロンボモジュリンの活性物質 TM-
α、 TM-βの酸性条件下における逆相HPLCによる溶出パ
ターン図である。図中(A) は TM-αの、(B) は TM-β T
M-βの溶出パターン図を示す。

【図１２】TM-βの弱アルカリ条件下における逆相HPLC
による溶出パターン図である。

【図１３】TM-βのイオン交換クロマトグラムの溶出パ
ターン図である。

【図１４】TM-βをコンドロイチナーゼABC 処理して得
た不飽和二糖（ΔDi-XS)のHPLC溶出パターン図である。

【図１５】TM-βをコンドロイチナーゼABC 処理して得
た不飽和二糖（ΔDi-XS)に、ΔDi-4S を混合して行なっ
たHPLC溶出パターン図である。

【図１６】TM-βをコンドロイチナーゼAC Iフラボ処理
して得た不飽和二糖のHPLC溶出パターン図である。

【図１７】ΔDi-XS 及び標準試料などをコンドロ−４−
スルファターゼ処理したもののHPLC溶出パターン図であ
る。

【図１８】TM-βによるトロンピンのプロテインＣ活性
化促進効果を示す図である。

【図１９】コンドロイチナーゼABC 処理した TM-βおよ
び未処理 TM-βのラット血中濃度半減期を示す図であ
る。図中、−○−は未処理 TM-βの場合、−●−はコン
ドロイチナーゼABC 処理 TM-βの結果を示す。

【図２０】部分長ヒトトロンボモジュリン遺伝子部分に
部分的特異変異を導入したプラスミドpM2TMD07の構築説
明図である。

【図２１】ヒトトンボモジュリン誘導体の発現ベクター
pRS7M2TM-neoの構築説明図である。

【図２２】本発明による組換ヒトトロンボモジュリン誘
導体MTM10 の酸性条件下における逆相HPLCによる溶出パ
ターン図である。

【図２３】本発明による組換ヒトトロンボモジュリン誘
導体MTM10 のラット血中濃度半減期を示す図である。投
与３分後の血中濃度を100%とした時の相対的残余量で表
わしてある。

【図２４】本発明による組換ヒトトロンボモジュリン誘
導体MTM10 によるトロンビンのプロテインＣ活性化促進
効果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 名和 克彦 東京都江戸川区北葛西一丁目16番13号 第一製薬中央研究所内 (72)発明者 丸本 恭正 東京都江戸川区北葛西一丁目16番13号 第一製薬中央研究所内 (56)参考文献 国際公開88／9811（ＷＯ，Ａ１) 国際公開92／325（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/47 C12N 5/10 C12N 15/09 A61K 38/00 A61P 7/02 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトトロンボモジュリンを構成する領域
   の内、アミノ末端領域とＥＧＦ様領域およびＯ−グリコ
   シル化部位領域より成り、且つアミノ酸４７２番目から
   ４７６番目のセリン・グリシン・セリン・グリシン・グ
   ルタミン酸部分のアミノ酸配列が、アミノ酸を除去・付
   加或いは置換することにより変更され、コンドロイチナ
   ーゼABC で切断される硫酸化グルコサミノグリカンで修
   飾されなくされた組換ヒトトロンボモジュリン誘導体
2. 【請求項２】 ヒトトロンボモジュリンを構成する領域
   の内、Ｎ末端より１番目のアラニンより４９１番目のア
   ラニンまでを含み、且つアミノ酸４７２番目から４７６
   番目のセリン・グリシン・セリン・グリシン・グルタミ
   ン酸部分のアミノ酸配列が、アミノ酸を除去・付加或い
   は置換することにより変更され、コンドロイチナーゼAB
   C で切断される硫酸化グルコサミノグリカンで修飾され
   なくされた置換ヒトトロンボモジュリン誘導体
3. 【請求項３】 プラスミドｐＯ−ｇａｌ由来のＲＳＶプ
   ロモータの下流に以下のものを結合した発現ベクタープ
   ラスミドｐＲＳ７Ｍ２ＴＭ−ｎｅｏ： ヒトトロンボモジュリンのアミノ酸配列のＮ末端より１
   番目のアラニンより４９１番目のアラニンまでをコード
   するＤＮＡ配列であってアミノ酸４７２番目から４７６
   番目のセリン・グリシン・セリン・グリシン・グルタミ
   ン酸部分をコードするＤＮＡ配列部分が除去・付加或い
   は置換することにより変更されたＤＮＡ配列であり、こ
   のＤＮＡ配列でコードされたアミノ酸配列では前記セリ
   ン・グリシン・セリン・グリシン・グルタミン酸部分の
   アミノ酸配列が除去・付加或いは置換により変更されて
   いるＤＮＡ配列； プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏ由来のネオマイシン耐性遺
   伝子； プラスミドｐＳＶ２−ｇｐｔ由来のＳＶ２ターミネー
   タ。
4. 【請求項４】 請求項３のプラスミドｐＲＳ７Ｍ２ＴＭ
   −ｎｅｏを有するE.coli ＲＳ７Ｍ２ＴＭ−ｎｅｏ
5. 【請求項５】 請求項３のプラスミドｐＲＳ７Ｍ２ＴＭ
   −ｎｅｏで形質転換され、ヒトトロンボモジュリンを構
   成する領域の内、Ｎ末端より１番目のアラニンより４９
   １番目のアラニンまでを含み、且つアミノ酸４７２番目
   から４７６番目のセリン・グリシン・セリン・グリシン
   ・グルタミン酸部分のアミノ酸配列が、アミノ酸を除去
   ・付加或いは置換することにより変更され、コンドロイ
   チナーゼABC で切断される硫酸化グルコサミノグリカン
   で修飾されなくされた組換ヒトトロンボモジュリン誘導
   体を産生する動物培養細胞