JP3122127B2 - 抗凝血タンパク質 - Google Patents

抗凝血タンパク質

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はEPI活性を有する新規タンパク質、該タンパ
ク質の製造方法および該タンパク質を含む治療製剤に関
する。
発明の背景 血液凝固は多くの活性化および不活化凝血因子が関係
する複雑な過程である。抗凝血タンパク質は凝血過程の
調節に重要であるとして知られており（ビイ．レームル
（B.Lmmle）およびジェイ．グリィフィン（J.Griffi
n）Clinics in Haematology 14（1985）,281−34
2）、したがって抗凝血剤は様々な疾患たとえば血栓
病、心筋梗塞、播種性血管内凝固等の治療に重要であ
る。
したがって、ヘパリンはアンチトロンビンIIIおよび
ヘパリンコファクターIIの活性を増加するために臨床的
に使用される。アンチトロンビンIIIはX a因子およびト
ロンビンの阻害に対し使用される。ヒルジンはトロンビ
ンの阻害のために使用されそしてプロテインＣはＶ因子
とVIII因子の阻害のために使用される。
抗凝血タンパク質はまたガンの治療にも使用される。
すなわち、アンチスタチン（antistatin）は抗転移性を
有することがわかっている（ジェイ．エイチ．ハン（J.
H.Han）ら、Gene 75（1989）,45−57）。またヘパリン
およびワルファリンも抗転移性を有することがわかって
いる（ジイ．ジェイ．ガシック（G.J.Gasic）ら、Int.R
ev.Exp.Pathol.,29（1985）,173−209）。
凝血は組織因子（TF）を循環血液へ暴露することによ
り外因性経路を介して開始される（ワイ．ネマーソン
（Y.Nemerson）,Blood 71（1988）,1−８）。組織因子
は因子VII/VII aに対するタンパク質コファクターであ
り組織因子の結合はその基質因子IXおよび因子Ｘに対す
るVII a因子（F VII a）の酵素活性を強化する。胎盤抗
凝血タンパク質はまた組織因子活性を阻害することがで
き、これはたぶんTF/F VII a−リン脂質相互反応を妨害
することによる（エス．コンドウ（S.Kondo）ら、Throm
b.Res.48（1987）,449−459）。
最近、新規抗凝血タンパク質である外因性経路阻害剤
（EPI）が単離された（ブロゼ（Broze）ら、Proc.Natl.
Acad.Sci.84（1987）,1886−1890）。
モル規模でEPIはTF/F VII a誘因凝血の強力な阻害剤
であることがわかった（アール．エー．グラムツインス
キー（R.A.Gramzinski）ら、Blood 73（1989）,983−9
89）。EPIはX a因子（F X a）と結合し阻害し、そしてE
PIとF X aとの複合体がTF/F VII aを阻害する（ラパポ
ート（Rapaport）,Blood 73（1989）,359−365）。多
くの腫瘍細胞がTF活性を表わす（ティ．サカイ（T.Saka
i）ら、J.Biol.Chem.264（1989）,9980−9988）での抗
凝血／抗転移剤として非常に興味があり、そしてこれは
EPIがアンチスタティンのような抗X a活性を示すためで
ある。
EPIはブロゼら（前出）によりHepG2肝ガン細胞から回
収され（ブロゼ、ヨーロッパ特許第300988号）、そして
タンパク質についての遺伝子をクローンした（ブロゼ、
ヨーロッパ特許第318451号）。EPIの二番目の構造につ
いての図式を第１図に示し、EPIのアミノ酸配列を第２
図に示し、図中Ｎ末端アミノ酸Aspを１番とする。タン
パク質は276個のアミノ酸残基からなり、そして３つの
クニッツ型（Kunitz type）の阻害ドメインに加えて、
Asn117,Asn167およびAsn229に３つの強力なグリコシル
化部位を有する。分子量はこれらの部位のいくつかがグ
リコシル化されていることを示す。さらに、二番目のク
ニッツドメインがF X aと結合し一方一番目のクニッツ
ドメインがF VII a/TFと結合していることがわかってい
る（ギラルド（Girard）ら、Nature 338（1989）,518
−520）。EPIはまたHeLa細胞からも単離され（PCT/DK90
/00016）、HeLa EPIはヘパリンと結合することが示さ
れた。
ヘパリン結合は注射用物質の薬学動態について重要な
ファクターである。血小板因子４（エム．プロスドミ
（M.Prosdomi）ら、Thromb.Res.39（1985）,541−547）
および１つのグニッツドメインを有するアプロチニン
（アルツナイミッテルフォルシュング（Arzneimittelfo
rschung）,33（４）479−94,1983）はたぶんヘパリン結
合特性のために短かい半減期を有する。したがって、抗
凝血剤のヘパリン結合能力の低下は有利なように思われ
る。さらに、医療用途にEPIより小さい分子を使用する
ことは有利であろう。
本発明によれば、驚くべきことにある主のEPI類似物
質が分子の一部を欠失しているとはいえEPI活性ならび
に抗X a活性を保持することが見出された。さらに、こ
れらの類似物質は十分な長さのEPIよりヘパリンに対し
より低い親和性を示し、これにより天然分子より治療薬
として一層有用になる。EPI類似物質はさらに天然EPIと
比較してより長い半減期を有し、これにより医療用途に
対する有効成分の量が一層低下するであろう。
発明の概要 最初の見地において、本発明は天然EPIのアミノ酸残
基１つ以上を欠失した新規EPI類似物質に関する。
第二の見地において、本発明は生理学的条件（pH、イ
オン濃度）下でEPI活性を有するがしかしヘパリン結合
能力がないかまたは低いEPI類似物質の新規一群に関す
る。
本明細書において用語“低ヘパリン結合能力”とは、
生理学的pHおよびイオン濃度で天然EPIの結合能力の約5
0％、さらに好ましくは約25％、最も好ましくは約10％
未満の結合能力を意味するものである。
新規EPI類似物質の好ましい一群は、天然EPIのヘパリ
ン結合ドメインが欠失しているかまたは前記ドメインに
おけるアミノ酸残基１つ以上を欠失しその結果ヘパリン
結合能力を失なうかまたはほとんど低下させることによ
り非官能性ヘパリン結合ドメインを有することを特徴と
するものである。ヘパリン結合ドメインにおけるアミノ
酸残基１つ以上を別のアミノ酸残基で置換することによ
っても同様な効果が得られる。
本発明の詳細な記載 EPI活性を保持するために本発明による類似物質は、
少なくとも一番目と二番目のクニッツドメインを含むＮ
末端配列を有するべきである。すなわち、本発明による
EPI類似物質は少なくとも天然EPIのアミノ酸番号25〜ア
ミノ酸番号148のアミノ酸配列を含むべきである（第１
図および第２図参照）。
本発明者らによれば、アミノ酸残基番号162〜アミノ
酸残基番号275の配列をEPI分子から欠失させるとヘパリ
ン結合能力が失なわれることが示されている。それゆえ
ヘパリン結合ドメインはEPI分子のこの部分に位置する
ものと結論される。ヘパリン結合ドメインは陽性に帯電
したアミノ酸残基に豊富であるEPI分子のＣ末端付近のA
rg246〜Lys265の領域から少なくともなると考えられ
る。
本発明による好ましいEPI類似物質は天然アミノ酸に
おいてアミノ酸残基148〜Ｃ末端Met276を欠失させたも
のである。
さらに特に、Arg246〜Lys275の配列における１つ以上
のアミノ酸残基を欠失させる。
本発明によるEPI類似物質の例は次のようである： （Asp1−Thr255）−EPI （Asp1−Ile253）−EPI （Asp1−Lys249）−EPI （Asp1−Ser248）−EPI （Asp1−Lys240）−EPI （Asp1−Glu234）−EPI （Asp1−Trp188）−EPI （Asp1−Asn164）−EPI （Asp1−Thr161）−EPI （Asp1−Asp149）−EPI （Asp1−Glu148）−EPI Ser−（Asp1−Thr255）−EPI Ser−（Asp1−Ile253）−EPI Ser−（Asp1−Lys249）−EPI Ser−（Asp1−Ser248）−EPI Ser−（Asp1−Lys240）−EPI Ser−（Asp1−Glu234）−EPI Ser−（Asp1−Trp188）−EPI Ser−（Asp1−Asn164）−EPI Ser−（Asp1−Thr161）−EPI Ser−（Asp1−Asp149）−EPI Ser−（Asp1−Glu148）−EPI （Glu15−Thr255）−EPI （Glu15−Ile253）−EPI （Glu15−Lys249）−EPI （Glu15−Ser248）−EPI （Glu15−Lys240）−EPI （Glu15−Glu234）−EPI （Glu15−Trp188）−EPI （Glu15−Asn164）−EPI （Glu15−Thr161）−EPI （Glu15−Asp149）−EPI （Glu15−Glu148）−EPI Ser−（Glu15−Thr255）−EPI Ser−（Glu15−Ile253）−EPI Ser−（Glu15−Lys249）−EPI Ser−（Glu15−Ser248）−EPI Ser−（Glu15−Lys240）−EPI Ser−（Glu15−Glu234）−EPI Ser−（Glu15−Trp188）−EPI Ser−（Glu15−Asn164）−EPI Ser−（Glu15−Thr161）−EPI Ser−（Glu15−Asp149）−EPI Ser−（Glu15−Glu148）−EPI （Ser24−Thr255）−EPI （Ser24−Ile253）−EPI （Ser24−Lys249）−EPI （Ser24−Ser248）−EPI （Ser24−Lys240）−EPI （Ser24−Glu234）−EPI （Ser24−Trp188）−EPI （Ser24−Asn164）−EPI （Ser24−Thr161）−EPI （Ser24−Asp149）−EPI （Ser24−Glu148）−EPI （Asp1−Thr255）−（Ile266−Met276）−EPI （Asp1−Ile253）−（Ile266−Met276）−EPI （Asp1−Ser248）−（Ile266−Met276）−EPI （Asp1−Gln245）−（Ile266−Met276）−EPI （Asp1−Thr255）−（Val264−Met276）−EPI （Asp1−Ile253）−（Val264−Met276）−EPI （Asp1−Ser248）−（Val264−Met276）−EPI （Asp1−Glu245）−（Val264−Met276）−EPI （Asp1−Thr255）−（Glu262−Met276）−EPI （Asp1−Ile253）−（Glu262−Met276）−EPI （Asp1−Ser248）−（Glu262−Met276）−EPI （Asp1−Glu245）−（Glu262−Met276）−EPI Ser−（Asp1−Thr255）−（Ile266−Met276）−EPI Ser−（Asp1−Ile253）−（Ile266−Met276）−EPI Ser−（Asp1−Ser248）−（Ile266−Met276）−EPI Ser−（Asp1−Gln245）−（Ile266−Met276）−EPI Ser−（Asp1−Thr255）−（Val264−Met276）−EPI Ser−（Asp1−Ile253）−（Val264−Met276）−EPI Ser−（Asp1−Ser248）−（Val264−Met276）−EPI Ser−（Asp1−Glu245）−（Val264−Met276）−EPI Ser−（Asp1−Thr255）−（Glu262−Met276）−EPI Ser−（Asp1−Ile253）−（Glu262−Met276）−EPI Ser−（Asp1−Ser248）−（Glu262−Met276）−EPI Ser−（Asp1−Glu245）−（Glu262−Met276）−EPI EPI分子において記載した欠失に加えて、天然EPIの特
定アミノ酸残基を別の天然産生アミノ酸残基で置換して
もよい。EPI類似物質はまたＮ末端残基としてSer残基を
有利に含む。シグナル配列を使用する場合開裂のための
認識部位として成熟タンパク質におけるＮ末端Serを要
求することが必要である。すなわち、EPI分子における
Ｎ末端をSerで置き換えるかまたは追加のSerを本来のＮ
末端残基に隣接して挿入してもよい。またAsn167および
Asn238における潜在的グリコシル化部位を別のアミノ酸
残基で置換してグリコシル化を避けるようにしてもよ
い。
グリコシル化部位がEPI活性にとって必ずしも必要な
ものではないということは今までわかっていなかった。
EPIタンパク質の大きなフラグメントはEPI活性にとっ
て、すなわちTF/F VII aのF X a依存性阻害にとって必
ずしも必要なものではないということも知られていなか
った。EPIにおける１個のアミノ酸を別のアミノ酸残基
（Arg199−＞Leu199）（ジラルドら、Nature 338（198
9）,518−520）により活性に影響を与えることなく置換
することができるということはこれまで知られていた。
しかしながら、このような変化はタンパク質の構造を著
しくは変化させない。これと対照的に本発明による欠失
は、ヘパリンに対する変化した親和性により説明される
ように、天然分子とは別の特性を有する新規分子を生じ
る。
本発明EPI−類似物質はよく知られた組換えDNA技術に
より作られる。
天然EPIに対する遺伝子はクローン化され配列化され
る（ウォンら、J.Biol.Chem.263（1988）,6001−600
4）。所望EPI−類似物質をコードするDNA配列はよく知
られた方法にしたがって同種組換えのための所望のアミ
ノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを用いた
特定部位の突然変異誘発によりEPI cDNAを変えること
により構築される。
本発明によるEPI類似物質をコードするDNA配列はまた
確立された標準的方法、たとえばエス．エル．ビューケ
ージ（S.L.Beaucage）およびエム．エイチ．カルーサー
ズ（M.H.Caruthers）,Tetrahedron Letters 22,1981,
p.1859−1869により記載されたホスホアミダイト法、ま
たはマッセス（Matthes）ら、EMBO Journal 3,1984,
p.801−805により記載された方法により合成されうる。
ホスホアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドはた
とえば自動DNA合成機で合成され、精製、アニール、連
結されそして適当なベクター中でクローン化される。
別の見地において、本発明は、本発明EPI類似物質を
コードするDNA配列からなる組換え体発現ベクターに関
する。発現ベクターは組換えDNA技術を受けるのに都合
の良いベクターであればいずれでもよく、そしてベクタ
ーの選択はしばしばこれが導入されるべき宿主細胞によ
るであろう。すなわち、ベクターは自律的に複製するベ
クター、すなわち染色体外存在物として存在するベクタ
ーであり、その複製は染色体複製物すなわちプラスミド
によるものである。これに代わり、ベクターは、宿主細
胞へ導入されたとき宿主細胞ゲノムへ組込まれこれが組
込まれている染色体と一緒に複製するものでもよい。
ベクターにおいて、本発明のEPI類似物質をコードす
るDNA配列は適当なプロモーター配列と操作可能に接続
されるべきである。プロモーターは選択する宿主細胞に
おける転写活性を示しそして宿主細胞と相同かまたは非
相同のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から由
来するいずれかのDNA配列である。哺乳動物細胞におけ
る本発明EPI類似物質をコードするDNAの転写を指向する
ための適当なプロモーターの例は、SV40プロモーター
（スブラマニ（Subramani）ら、Mol.Cell.Biol.1,1981,
p.854−864）、MT−１（メタロチオネイン遺伝子）プロ
モーター（パルミター（Palmiter）ら、Science 222,1
983,p.809−814）、アデノウィルス２主要後期プロモー
ターまたはCMV（サイトメガロウィルスIE1）プロモータ
ー（ヘニンハウゼン Henninghausen）ら、EMBO J.5
（1986）,1367−71）である。酵母宿主細胞中で使用さ
れる適当なプロモーターには、酵母解糖遺伝子（ヒッツ
ェマン（Hitzeman）ら、J.Biol.Chem.288,1980,p.12073
−12080;アルバー（Alber）およびカワサキ（Kawasak
i）、J.Mol.Appl.Gen.1,1982,p.419−434）またはアル
コールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ヤング（Young）ら、G
enetic Engineering of Microorganisms for Chem
icals（ホーレンダー Hollaenderら著）、プレナムプ
レス ニューヨーク、1982）、またはPTI1（米国特許第
4,599,311号）またはADH2−4c（ラッセルら、Nature 3
04,1983,p.652−654）プロモーターである。糸状菌宿主
細胞に使用される適当なプロモーターは、たとえばADH3
プロモーター（マックナイト（McKnight）ら、The EMB
O J.4,1985,p.2093−2099）またはtipAプロモーターで
ある。
分泌を確実にするために、EPI類似物質をコードするD
NA配列の５′に適当なシグナル配列を挿入する。適当な
シグナル配列はｔ−PAシグナル配列である（フリズナー
（Friezner）ら、J.Biol.Chem.261（1986）,6972−8
5）。
本発明のEPI類似物質をコードするDNA配列はまた適当
なターミネーターたとえばヒト成長ホルモンターミネー
ター（パルミター（Palmiter）ら、前出）または（真菌
宿主に対し）TPI1（アルバーおよびカワサキ、前出）ま
たはADH3（マックナイトら、前出）プロモーターと操作
可能に接続すべきである。ベクターはたとえばポリアデ
ニル化シグナル（たとえばSV40またはアデノウィルス5E
lb領域）、転写エンハンサー配列（たとえばSV40エンハ
ンサー）および翻訳エンハンサー配列（たとえばアデノ
ウィルスVA RNAをコードするもの）のようなものをさ
らに含んでもよい。
本発明の組換え体発現ベクターはさらに当該宿主細胞
においてベクターを複製しうるようにするDNA配列を含
んでいてよい。このような配列（宿主細胞が哺乳動物細
胞である場合）の例は複製のSV40オリジンである。ベク
ターはまた選択可能なマーカーたとえばその生成物が宿
主細胞における欠点を補う遺伝子、たとえばジヒドロフ
ォレートレダクターゼ（DHFR）をコードする遺伝子また
はたとえばネオマイシン、ヒグロマイシンまたはメソト
レキサートのような薬品に対する耐性を与えるものを含
んでもよい。
本発明のEPI類似物質をコードするDNA配列、プロモー
ターおよびターミネーターをそれぞれ連結するために使
用される手法およびこれらを複製に必要な情報を含む適
当なベクターへ挿入する手段は当業者によく知られてい
る（たとえば、サムブルック（Sambrook）ら、前出）。
別の見地において、本発明は上述の組換体発現ベクタ
ーを含む細胞に関する。宿主細胞はEPI類似物質を産生
しうるいずれかの細胞であり、好ましくは白血球細胞特
に哺乳動物細胞である。適当な哺乳動物細胞列の例は、
COS（ATCC CRL 1650および1651）,BHK（ATCC CRL 1
632,ATCC CCL10）またはCHO（ATCC CCL 61）細胞列
である。哺乳動物細胞のトランスフェクションおよび細
胞中で起こされるDNA配列の発現はたとえばカウフマン
（Kaufman）およびシャープ（Sharp）、J.Mol.Biol.15
9,1982,p.601−621;サウザン（Southern）およびベルグ
（Berg）、J.Mol.Appl.Genet.1,1982,p.237−341;ロイ
ター（Loyter）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79,1982,
p.422−426;ウィグラー（Wigler）ら、Cell 14,1978,
p.725;コルサロ（Corsaro）およびパーソン（Pearso
n）、Somatic Cell Genetics 7,1981,p.603;グラハ
ム（Graham）およびファンデルエブ（van der Eb）、
Virology 52,1973,p.456;およびノイマン（Neuman）
ら、EMBO J.1,1982,p.841−845に記載されている。
これに代わって、真菌細胞（酵母細胞を含む）は本発
明の宿主細胞として使用されうる。適当な酵母細胞の例
としては、サッカロミセス（Saccharomyces）属または
シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属の細
胞、特に枯草菌（Saccharomyces cerevisiae）の菌株
である。他の真菌細胞の例は、糸状菌たとえばアスペル
ギルス（Aspergillus）属またはノイロスポラ（neurosp
ora）属、特にアスペルギルス オリザエ（Aspergillus
oryzae）またはアスペルギルス ニガー（Aspergillu
s niger）の菌株である。タンパク質の発現に対するア
スペルギルス属の使用は、たとえばヨーロッパ特許第27
2,277号に記載されている。
さらに別の見地において、本発明は本発明によるEPI
類似物質を製造する方法に関し、該方法はEPI類似物質
の発現を導びく条件下で適当な普通培地上で上述のよう
に細胞を培養し、培地からポリペプチドを解消すること
からなる方法である。細胞の培養に使用する培地は、哺
乳動物細胞の増殖に適する通常の培地たとえば適当な補
足物を含む血清含有または血清不含有培地である。適当
な培地は商業的供給者から入手可能であるかまたは公表
された作り方にしたがって調製されうる（たとえば、ア
メリカンタイプカルチュアコレクションのカタログ）。
EPI類似物質は好ましくは増殖培地へ分泌されそして
常法によりたとえば宿主細胞を培地から遠心分離または
濾過により分泌し、上澄液のタンパク質豊富成分を沈で
んさせるかもしくは塩たとえば硫酸アンモニウムを用い
て濾過し、続いて様々なクロマトグラフィ法たとえばイ
オン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラ
フィ等により精製することにより培地から回収される。
新規EPI類似物質は抗凝血疾患またはガンを患らって
いる患者の治療に使用される。
したがって本発明はまた、適当な量のEPI類似物質と
適当な助剤および添加剤とを一緒に含む抗凝血疾患また
はガンを患らう患者の治療用薬剤製剤に関する。
薬剤製剤は適当な安定剤および保存剤と一緒の緩衝化
水溶液である。溶液は加熱処理されるかまたは注射ペン
用のアンプルまたはカープル（carpoul）に含まれても
よい。これに代わって、安定した溶液をフリーズドライ
してアンプルに含ませるか、または１つのチャンバーに
フリーズドライ物質そして他のチャンバーに溶媒を入れ
た２つのチャンバーの注射システムとしてもよい。
図面の簡単な説明 本発明をさらに図面を参照しながら記載するが、図中 第１図は、EPIのアミノ酸配列および二次元構造を示
し、 第２図は、天然EPIのアミノ酸配列を示し、 第３図は、ｔ−PAシグナル、ヒトサイトメガロウィルス
IE1遺伝子プロモーターおよびヒト成長ホモン遺伝子ポ
リアデニル化シグナルを含むプラスミドpJR77を示し、 第４図は、EPI遺伝子を含むpCMVEPIhGHを示し、 第５図は、Ser−（Thr88−Thr161）−EPIをコードするD
NA配列を含むプラスミドpEP1b1を示し、 第６図は、Ser−（Glu15−Thr161）−EPIをコードするD
NA配列を含むプラスミドPEP1abを示し、 第７図は、ｔ−PAシグナル配列により先行されたSer−
（ThR88−Thr161）−EPIに対するDNA配列を示し、 第８図は、ｔ−PAシグナル配列により先行されたSer（G
lu15−Thr161）−EPIに対するDNA配列を示し、 第９図は、（Asp1−Thr161）−EPIをコードするDNA配列
を含むプラスミドPEPIab2を示し、 第10図は、EPIシグナルにより先行された（Asp1−Thr16
1）−EPIに対するDNA配列を示す。
本発明をさらに以下の実施例に記載するが、これによ
り何ら請求の範囲に記載した本発明の範囲または精神を
制限するものではない。
実験部 EPI活性の分析：サンドセット（Sandset）ら（Thromb.R
es.47（1989）,389−400）の方法の後で変更されたクロ
モゲンミクロプレート分析においてEPIを測定した。熱
処理した血漿プールを標準物として使用した。この標準
物をEPI活性1U/mlを含むようにセットした。標準物とサ
ンプルを緩衝液Ａ（0.05Mトリス/0.1M NaCl/0.1M Na
−クエン酸/0.02％Ｍ NaH3/pH8.0）であって２μg/ml
ポリブレンおよび0.2％ウシ血清アルブミンを含むもの
で希釈した。F VII a/TF/F X/CaCl2組合せ剤試薬は、緩
衝液Ａにおいて調製され、そして1.6ng/ml F VII a
（ノボ−ノルディスクa/s）、60倍に希釈したヒト組織
ファクター（ハヨルト（Hjort）、Scand.J.Clin.Lab.In
vest.9（1957）、50ng/ml F X（シグマ）および18mM
CaCl2を含有する。分析は37℃にてミクロプレートスト
リップ中で行なった。サンプルおよび標準物の50μｌを
ピペットでストリップへ入れ組合せ剤試薬100μｌを各
凹所へ添加した。インキュベーション10分後、F X（3.2
μg/ml）25μｌを各凹所へ加え、さらに10分間後F X a
についてのクロモゲン基質（S2222）25μｌを基質添加
後10分してから添加した。1.0Mクエン酸pH3.0 50μｌ
を加えることにより反応を停止した。405nmでミクロプ
レートを読んだ。
抗X a活性に対する分析：ヘパリンセファロース上で精
製されたHeLa EPI（PCT/DK90/00016）を標準物として
使用した。この標準物にはEPI分析において測定されたE
PI単位の量に相当するX a阻害単位の量が割当てられ
た。サンプルおよび標準物を50mMトリス/0.2％ウシ血清
アルブミンpH7.3中で希釈した。希釈したサンプルおよ
び標準物100μｌを100μｌ F X a（スタゴ（Stago）、
14ng/ml）とともに37℃で30分間インキュベートした。S
2222（2mg/ml）25μｌを37℃でさらに２時間後添加し
た。分析をEPI分析のように停止しそして読み取った。
アプライドバイオシステムDNA合成機を用いてホスホ
ロアミダイト法により合成オリゴヌクレオチドを合成し
た。
プライマーを標識化するためのM13配列化プライマー
およびγ−〔32P〕−ATP（5000Ci/ミリモル、10mCi/m
l）がアマーシャム（Amersham）から得られた。
制限エンドヌクレアーゼおよびT4 DNAリガーゼをニ
ューイングランドラボズから得られた。修飾したT7 DN
A−ポリマーゼ（セクエナーゼ（Sequenase））がユナイ
テッド ステーツ バイオケミカルズ（United States
Biochemicals）から得られた。pBS＋（ストラタジー
ン（Stratagene））を合成DNAフラグメントに対するク
ローニングベクターとして得た。
ヒトサイトメガロウィルスIE1遺伝子プロモーターお
よびヒト成長ホルモン遺伝子ポリアデニル化シグナルを
含むpJR77を意味する哺乳動物発現ベクター（第３図）
はCOS−７細胞における様々なEPI関連タンパク質の発現
のために使用された。
XL−１ブルー（ストラクタジーン）大腸菌K12の誘導
体を、プラスミド形質転換のための細菌性受容器として
およびプラスミドDNAの増殖および調製用の宿主として
使用された。
ミドリザル腎細胞系COS−７（ATCC ＃ CRL 1651）
は、ダルベッコ変性イーグル培地（DMEM）（ジブコ041
−1965）＋50μg/mlゲンタマイシイン＋110μg/mlピル
ベート＋10％胎児仔牛血清（FCS）またはDMEM＋50μg/m
lゲンタマイシン＋110μg/mlピルベート＋１％ ITS
+（インシュリン、トランスフェリン、血清アルブミ
ン）において増殖した。
制限エンドヌクレアーゼおよび他の酵素は、製造上の
忠告にしたがって使用された。標準組換え体DNA技術を
記載のように実施した（マニィアティスら、Molecular
cloning、コールドスプリング ハーバー ラボラト
リィ、1982）。
DNA配列を、鋳型として二本鎖プラスミドDNAおよび32
P−標識化プライマーおよびセクエナーゼを用いてチェ
インターミネーター法（サンガー（Sanger）ら、Proc.N
atl.Acad.Sci.74（1977）,5463−67）によりDNA配列を
測定した。
プラスミドDNAをリン酸カルシウム共沈化によりCOS−
７細胞へ導入した（グラハムおよびファンデルエブ、Vi
rology 52（1973）,456−457）。
７×105細胞を5ml DMEM＋FCS中20cm2皿に播種した。
次の日に各皿へ0.5沈でん物中プラスミドDNA 20μｇお
よび10mM二リン酸クロロキニン50μｌを加えた。細胞を
沈でん物とともに一晩インキュベーションした。次の日
新しい培地DMEM＋ITS+を加えた。インキュベーションし
てから２日後培地を採取しそしてEPI−活性および抗X a
活性に対し分析した。
例 １ EPIおよびEPI類似物質をコードするDNA−フラグメント
の調製およびCOS−７細胞における一時的発現 EPI cDNA配列はウォン（Wun）らにより記載されてい
る（J.Biol.Chem.263（1988）,6001〜6004）。公知配列
に基づいて、EPIおよびEPI類似物質をコードする合成DN
A配列を、適当な位置に制限エンドヌクレアーゼ認識部
位をサイレント突然変異導入することにより構築した。
tPAシグナル配列を用いたEPIフラグメントをコードす
る発現カセット（第７図および第８図）および全EPIタ
ンパク質をコードする発現カセットをアニールした相補
的合成オリゴヌクレオチドのクローニングベクターpBS
＋へ逐次挿入することによりアッセンブリーした。DNA
フラグメントのアッセンブリーに続いて記載したように
DNA配列化により配列を変えた。
最後に発現カセットを発現ベクターpJR77へ移すと次
の発現プラスミドが得られた： tPAシグナルをコードするpEPIb1−EPI類似物質Ser−（T
hr88−Thr161）−EPI tPAシグナルをコードするPEPIab−EPI類似物質Ser（Glu
15−Thr161）−EPI 全EPIタンパク質をコードするpCMVEPIhGH COS−７細
胞を表１に示すようにトランスフェクションした。DMEM
＋ITS+とともにインキュベーション２日後に培地を採取
した。表１にEPI活性および抗−X a活性についての分析
結果を示す。
表１における結果は、二番目のクニッツドメインだけ
を含むEPI−フラグメントSer−（Thr88−Thr161）−EPI
が何らの活性も有さず、一方一番目と二番目のクニッツ
ドメインを含むEPI−フラグメントSer−（Glu15−Thr16
1）−EPIはEPI活性を保持していることを示す。
例 ２ EPIプラスミドを用いたCOSトランスフェクションを例
１に記載のように行ない、培地を48時間後に採取した。
それぞれヘパリンセファロース300μｌを有する５本の
カラムをパックした。カラムを20mMトリス/10％グリセ
ロール、pH7.5（緩衝液Ｂ）で平衡化した。培養液1.3ml
を各カラムへ施こした。次いでカラムを緩衝液Ｂ 1.5m
lで洗浄し、各カラムを、NaClの量を増やしながら緩衝
液Ｂ 1.5mlを用いて溶出した。比較のためにHeLaおよ
びHepG2細胞からのEPIをヘパリンセファロース上で分別
する別の実験からのデータを与える。この実験では別の
NaCl濃度が溶出のために使用された。表２によればSer
−（Glu15−Thr161）−EPIは生理学的pHおよびイオン濃
度にてヘパリンと縮合しないことがわかる。
例 ３ （Asp1−Thr161）−EPIの調製 発現プラスミドの構築、形質転換およびCOS−７細胞
における発現を、例１に記載した材料および方法を用い
て行なった。
ｔ−PAシグナルおよびSer−（Glu15−Thr161）−EPI
をコードする発現プラスミドpEPIabのSal I−BamH I間
の配列（第６図）を、真正なEPIシグナルおよび（Asp1
−Thr161）−EPIをコードする合成DNA−配列で置き換え
た。
得られたプラスミドpEPIab2を第９図に示し、そしてp
EPIab2の発現カセットを第10図に示す。
pEPIab2でトランスフェクションしたCOS細胞からの培
地を、例２に記載のようにヘパリン−セファロースへ施
こした。EPI 31.2U/mlを含む培養液3.8mlをヘパリンカ
ラム0.5mlへ施こした。フロースルーは施こされたEPI活
性の77％を有しＢ洗浄液は16％を含有した。それぞれ0.
25、0.75および1.5M NaClでの溶出液中にEPIは検出さ
れなかった。
（Asp−Thr161）−EPIは１つの強力なＮ−結合グリコ
シル化部位（Asn117）を有し活性に対するこのグリコシ
ル化の重要性が観察された。
（Asp1−Thr161）−EPIはF X a−セファロースのアフ
ィニティクロマトグラフィによりCOS培地から精製し
た。SDS−PAGEにおいて精製されたタンパク質は27kDa付
近のグリコシル化バンドとして22kDa付近の非グリコシ
ル化バンドとして表われた。グリコシル化および非グリ
コシル化形は非還元SDS−PAGEにおいて分離されそして
ゲルから抽出された。両方の形ともEPI分析において活
性でありそしてSDS−ゲルにおける汚染強度から判断す
るように同じ特異的活性を示した。Asn117におけるグリ
コシル化はしたがってEPI活性について明らかに必須と
いうわけではなく活性（Asp1−Thr161）−EPIは有効な
発現システムにおいて得られ、ここでは哺乳動物のＮ−
連結グリコシル化がたとえば原核細胞中で、または酵母
における末分泌タンパク質として得られない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/64 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/47 C12N 15/12 C12P 21/02 A61K 38/55 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】天然外因性経路阻害剤EPI分子のフラグメ
    ントであるEPI類似物質であって、Ｎ末端延長部として
    アミノ酸セリンを任意に有し、下記に示すアミノ酸配列
    のうち少なくともアミノ酸番号25〜アミノ酸番号148の
    アミノ酸配列を含んで成り、ここで当該類似物質はEPI
    活性及び抗F X a活性を保持し、そして生理学的条件下
    で固定化ヘパリンに対し、天然EPI分子と比べ50％未満
    にまで低下したヘパリン結合能力を有するEPI類似物
    質： 【化１】
  2. 【請求項２】天然EPI分子のアミノ酸番号162〜アミノ酸
    番号275のアミノ酸配列が欠失している、請求項１に記
    載のEPI類似物質。
  3. 【請求項３】前記天然EPI分子のAsp1〜Thr161のアミノ
    酸配列から成る、請求項１に記載のEPI類似物質。
  4. 【請求項４】前記天然EPI分子のGlu15〜Thr161のアミノ
    酸配列から成る、請求項１に記載のEPI類似物質。
  5. 【請求項５】Ｎ末端アミノ酸残基としてさらにSerを有
    する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のEPI類似物
    質。
  6. 【請求項６】請求項１〜５のいずれか１項に記載のEPI
    類似物質をコードするDNA。
  7. 【請求項７】請求項６に記載のDNAを含む発現ベクタ
    ー。
  8. 【請求項８】請求項７に記載のベクターを含んで成る形
    質転換されたまたはトランスフェクションされた微生物
    または細胞系。
  9. 【請求項９】請求項８に記載の微生物または細胞系を適
    当な培養基中で培養し、しかる後EPI類似物質を単離す
    る、請求項１〜５のいずれか１項に記載のEPI類似物質
    の調製方法。
  10. 【請求項１０】請求項１〜５のいずれか１項に記載のEP
    I類似物質および適当な助剤ならびに添加剤を含有する
    凝血疾患の処置のための医薬製剤。
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