KR101238047B1

KR101238047B1 - 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조방법

Info

Publication number: KR101238047B1
Application number: KR1020097017230A
Authority: KR
Inventors: 스스무 오히가시
Original assignee: 아사히 가세이 파마 가부시키가이샤
Priority date: 2007-03-23
Filing date: 2008-03-21
Publication date: 2013-02-27
Also published as: EP2138505A4; AU2008230465A1; ES2496596T3; EP2138505B1; CA2681294A1; JPWO2008117735A1; AU2008230465B2; NZ579873A; SG184699A1; CN101641368A; CA2681294C; US8952137B2; TW200906848A; JP5117486B2; EP2138505A1; US8258269B2; US20100145020A1; CN101641368B; US20130237693A1; WO2008117735A1

Abstract

본 발명의 과제는, 산성하에서 생성할 수 있는 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 함유하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 얻는 것이다. 본 발명에 의하면, 산성하에서 생성할 수 있는 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 포함하거나, 포함하는 것이 의심되는 가용성 트롬보모듈린 함유물로부터, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 제조하는 방법이며, 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하는 공정, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 분리할 수 있는 분리 조건으로 선형 또는 단계형, 또는 선형과 단계형을 조합한 염 농도로 구배시켜, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 미리 확인하거나 또는 용출 분획을 확인하면서 이를 인지하여 취득하는 공정으로 이루어진 상기 제조방법이 제공된다.

가용성 트롬보모듈린, 음이온 교환체, 히드록시아파타이트, 변성체

Description

고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조방법 {METHOD FOR PRODUCING SOLUBLE THROMBOMODULIN OF HIGH PURITY}

본 발명은 산성하에서 생성할 수 있는 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 함유하지 않는 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조방법에 관한 것이다.

트롬보모듈린은, 트롬빈과 특이적으로 결합하여 트롬빈의 혈액 응고 활성을 저해하는 동시에 트롬빈의 프로테인 C 활성화능을 현저하게 촉진하는 작용을 갖는 물질로 알려져 있고, 강력한 혈액 응고 저해 작용을 갖는 것이 알려져 있다. 트롬빈에 의해 응고 시간을 연장하는 것이나, 트롬빈에 의해 혈소판 응집을 억제하는 것이 알려져 있다. 프로테인 C는, 혈액 응고 선용계(線溶系)에서 중요한 역할을 하고 있는 비타민 K 의존성의 단백질이며, 트롬빈의 작용에 의해 활성화되어 활성화 프로테인 C가 된다. 이 활성화 프로테인 C는, 생체내에서 혈액 응고계 인자의 활성형 제V 인자 및 활성형 제VIII 인자를 실활시키고, 또 혈전 용해 작용을 갖는 플러스미노겐 액티베이터의 생성에 관여하고 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1). 따라서, 트롬보모듈린은, 이 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하여 항혈액 응고제 또는 혈전 용해제로서 유용하다고 여겨지고 있고, 응고 항진을 수반하는 질환의 치료, 예방에 유효하다는 동물 실험에 관한 보고도 있다(비특허문헌 2).

종래, 트롬보모듈린은 인간을 비롯한 여러 동물종의 혈관 내피 세포상에 발현하고 있는 당단백질로서 발견되어 취득된 후 클로닝에 성공했다. 즉, 유전자 공학적 수법을 이용하여 인간 폐 cDNA 라이브러리로부터 시그널 펩티드를 포함하는 인간 트롬보모듈린 전구체의 유전자를 클로닝하고, 그리고 트롬보모듈린의 전체 유전자 서열을 해석하여, 시그널 펩티드(통상은 18 아미노산 잔기가 예시됨)를 포함하는 575 잔기의 아미노산 서열이 밝혀져 있다(특허문헌 1). 시그널 펩티드가 절단된 성숙한 트롬보모듈린은, 그 성숙한 펩티드의 N 말단측보다 N 말단 영역(1-226번째 : 시그널 펩티드가 18 아미노산 잔기라고 생각한 경우의 위치 표시, 이하 동일), 6개의 EGF 유사 구조를 갖는 영역(227-462번째), O형 당쇄 부가 영역(463-498번째), 막관통 영역(499-521번째), 그리고 세포질내 영역(522-557번째)의 5개 영역으로 구성되어 있고, 그리고 전체 길이의 트롬보모듈린과 동일한 활성을 갖는 부분(즉 최소 활성 단위)으로는, 6개의 EGF 유사 구조를 갖는 영역 중, 주로 N 말단측에서 4, 5, 6번째의 EGF 유사 구조로 이루어진 부분인 것이 알려져 있다(비특허문헌 3).

전체 길이의 트롬보모듈린은 계면활성제의 존재하가 아니면 잘 용해되지 않아, 제제에는 계면활성제의 첨가가 필수인 데 비해, 계면활성제의 비존재하에서도 완전하게 용해될 수 있는 가용성 트롬보모듈린이 존재한다. 가용성 트롬보모듈린은, 적어도 막관통 영역의 일부 또는 전부를 함유시키지 않도록 조제하면 되고, 예를 들어, N 말단 영역과 6개의 EGF 유사 구조를 갖는 영역과 O형 당쇄 부가 영역의 3개의 영역만으로 이루어진(즉, 서열번호 1의 제19∼516위의 아미노산 서열로 이루 어진) 가용성 트롬보모듈린은, 재조합 기술의 응용에 의해 취득할 수 있는 것, 그리고 그 재조합체 가용성 트롬보모듈린은, 천연 트롬보모듈린의 활성을 갖고 있는 것이 확인되어 있다(특허문헌 1). 그 밖에 가용성 트롬보모듈린의 예로서 몇가지 보고가 있다(특허문헌 2∼9). 또는 천연형으로서 인간 뇨 유래의 가용성 트롬보모듈린 등도 예시된다(특허문헌 10, 11).

참고로, 유전자에 있어서는, 자연의 변이 또는 취득시의 변이에 의해 많은 케이스에서 보이는 바와 같이, 인간에 있어서도 다형성의 변이가 발견되고 있고, 상술한 575 잔기의 아미노산 서열로 이루어진 인간 트롬보모듈린 전구체의 제473위의 아미노산에서 Val인 것과 Ala인 것이 현재 확인되어 있다. 이 아미노산을 코드하는 염기 서열에서는, 제1418위에서 각각 T와 C와의 변이에 해당한다(비특허문헌 4). 그러나, 활성 및 물성에서는 전혀 차이가 없어 양자는 실질적으로 동일하다고 판단할 수 있다.

트롬보모듈린은 DIC의 치료에서 효과가 있다는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 5). 트롬보모듈린의 용도로는 상술한 것 외에, 예를 들어, 급성 관동맥 증후군(ACS), 혈전증, 말초 혈관 폐색증, 폐색성 동맥 경화증, 혈관염, 심장 수술에 속발하는 기능성 장해, 장기 이식의 합병증, 협심증, 일과성 뇌허혈 발작, 임신 중독증, 당뇨병, 간 VOD(Liver veno-occlusive disease; 극증(劇症) 간염이나 골수 이식후의 간정맥 폐색증), 심부정맥 혈전증(DVT; Deep venous thrombosis) 등이나, 나아가 성인 호흡 궁박 증후군(ARDS; Adult respiratory distress syndrome)의 질환의 치료 및 예방에 사용되는 것이 기대되고 있다.

트롬보모듈린의 변성체로는, 동결 건조 공정에서 생성되는 응집체 및 동결 건조 상태에서 장기간 보존중에 생성되는 응집체가 알려져 있다(특허문헌 12∼16).

의약품으로의 이용을 고려하여, 공업적 레벨로 가용성 트롬보모듈린을 제조하는 방법으로는, 예를 들어 정제 공정으로서 트롬보모듈린에 대한 항체를 담지시킨 어피니티(affinity) 크로마토그래피를 이용하는 방법, 또한 어피니티 크로마토그래피에 의해 얻어진 그 가용성 트롬보모듈린을, 비전도도 25∼34 ms/㎝, pH 3∼4의 조건하에서 양이온 교환체와 접촉시키는 공정에서, 통과 분획으로서 그 가용성 트롬보모듈린을 취득하는 것을 특징으로 하는 혈청 유래물 및 항체 유래물을 실질적으로 함유하지 않는 고순도 가용성 트롬보모듈린의 제조방법(특허문헌 17), 인간 뇨 트롬보모듈린 함유 시료를 트롬빈 결합 어피니티 크로마토그래피로 예비 정제하고, 이어서 히드록시아파타이트(hydroxyapatite)를 흡착제로 하는 흡착 크로마토그래피로 정제하는 것을 특징으로 하는 트롬보모듈린의 정제 방법(특허문헌 18)이 알려져 있다.

특허문헌 1 : 일본 특허 공개 소 64-6219호 공보

특허문헌 2 : 일본 특허 공개 평 2-255699호 공보

특허문헌 3 : 일본 특허 공개 평 3-133380호 공보

특허문헌 4 : 일본 특허 공개 평 3-259084호 공보

특허문헌 5 : 일본 특허 공개 평 4-210700호 공보

특허문헌 6 : 일본 특허 공개 평 5-213998호 공보

특허문헌 7 : WO92/00325호 공보

특허문헌 8 : WO92/03149호 공보

특허문헌 9 : WO93/15755호 공보

특허문헌 10 : 일본 특허 공개 평 3-86900호 공보

특허문헌 11 : 일본 특허 공개 평 3-218399호 공보

특허문헌 12 : 일본 특허 공개 평 6-321085호 공보

특허문헌 13 : 일본 특허 제 3007785호 공보

특허문헌 14 : 일본 특허 공개 평 11-171790호 공보

특허문헌 15 : WO95/16460호 공보

특허문헌 16 : 일본 특허 제 3822383호 공보

특허문헌 17 : 일본 특허 공개 평 11-341990호 공보

특허문헌 18 : 일본 특허 제 3745805호 공보

비특허문헌 1 : 스즈키 코지, 의학의 변천, 제125권, 901페이지(1983년)

비특허문헌 2 : K.Gomi 등 Blood 75.1396-1399(1990)

비특허문헌 3 : M.Zushi 등, J.Biol. Chem., 246, 10351-10353(1989)

비특허문헌 4 : D.Z.Wen 등, Biochemistry, 26, 4350-4357(1987)

비특허문헌 5 : S.M.Bates 등, Br.J.Pharmacol., 144, 1017-1028(2005)

본 발명의 과제는, 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 트롬보모듈린을 높은 생산성으로 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은, 공업적 레벨로 가용성 트롬보모듈린을 제조하는 과정에서, 또 산성하에서 바이러스를 불활화하는 공정을 포함하는 제조방법으로 가용성 트롬보모듈린을 제조하는 과정에서, 가용성 트롬보모듈린을 산성하에 둔 경우에 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체가 생성되며, 이것을 효율적으로 제거해야 하는 신규 과제를 발견했다. 본 발명자들은 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 제거하기 위해, 겔여과 크로마토그래피(GFC), 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC) 등의 이용을 검토했다. 그러나, 겔여과 크로마토그래피(GFC), 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)는, 처리 용량이 적어 일반적으로 컬럼 용적의 5% 이하이므로, 컬럼 용적을 크게 하거나 복수의 사이클을 필요로 하는 것을 발견했다. 또, 효율을 높이는 방법으로는, 크로마트 선속을 빠르게 하는 것을 생각할 수 있지만, 선속을 빠르게 하는 것은 분리 능력을 저하시키기 때문에 적당하지 않다고 생각된다. 또한, 다른 방법으로서 처리 단백질 농도를 높게 하는 것을 생각할 수 있지만, 단백질 농도를 높게 하는 농축 공정의 증가와, 높은 단백 농도에 의한 높은 점성으로 인해 분리 능력이 저하되는 등의 문제가 있다.

따라서 본 발명자는, 상기 신규 과제에 기초하여, 공업적 레벨로 가용성 트롬보모듈린을 제조하기 위해서는, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 상기 문제를 해결한 생산성 높은 방법으로 분리하는 것이 중요하다고 생각했다. 본 발명자는, 상기 신규 과제를 해결하기 위해, 여러가지 크로마토그래피 담체로 여러가지 조건을 예의 검토한 결과, 담체로서 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트를 사용하고, 각각의 담체에서 적절한 조건을 발견함으로써, 효율적이고 안정적으로 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 분리하는 방법을 발견하는 것에 성공했다.

즉 본 발명으로는 이하의 것을 들 수 있다.

[A1] 가용성 트롬보모듈린으로부터 산성하에서 생성할 수 있는 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 제조하는 방법이며, (1) 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 포함하거나, 포함하는 것이 의심되는 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하는 공정, 및 (2) 그 가용성 트롬보모듈린과 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 분리할 수 있는 분리 조건으로 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 분획을 취득하는 공정을 포함하는 그 제조방법.

[A2] 가용성 트롬보모듈린으로부터 산성하에서 생성할 수 있는 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 제조하는 방법이며, (0) 그 가용성 트롬보모듈린을 pH 5 이하의 산성하에 두는 공정, (1) 상기 (0)의 공정을 거쳐 얻어진, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 포함하거나, 포함하는 것이 의심되는 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하는 공정, 및 (2) 그 가용성 트롬보모듈린과 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 분리할 수 있는 분리 조건으로 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 분획을 취득하는 공정을 포함하는 상기 [A1]에 기재된 제조방법.

[A2-2] 가용성 트롬보모듈린으로부터 산성하에서 생성할 수 있는 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 제조하는 방법이며, (*) 가용성 트롬보모듈린을 정제하는 공정, (0) 그 가용성 트롬보모듈린을 pH 5 이하의 산성하에 두는 공정, (1) 상기 (0)의 공정을 거쳐 얻어진, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 포함하거나, 포함하는 것이 의심되는 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하는 공정, 및 (2) 그 가용성 트롬보모듈린과 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 분리할 수 있는 분리 조건으로 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 분획을 취득하는 공정을 포함하는 상기 [A1]에 기재된 제조방법.

[A2-3] 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하는 공정이, 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체에 제공하는 공정인 상기 [A1], [A2] 또는 [A2-2] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[A2-4] 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하는 공정이, 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 히드록시아파타이트에 제공하는 공정인 상기 [A1], [A2] 또는 [A2-2] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[A3] 가용성 트롬보모듈린이, 가용성 트롬보모듈린 함유물 중의 총단백에 대한 함유율이 80% 이상의 가용성 트롬보모듈린인 상기 [A1]∼[A2-4] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

상기 [A1]∼[A2-4]와 같이 인용하는 항번호가 범위로 표시되고, 그 범위내에 [A2-2] 등의 가지번호를 가지는 항이 배치되어 있는 경우에는, [A2-2] 등의 가지번호를 가지는 항도 인용되는 것을 의미한다. 이하에서도 동일하다.

[A3-2] 가용성 트롬보모듈린이, 가용성 트롬보모듈린 함유물 중의 총단백에 대한 함유율이 90% 이상의 가용성 트롬보모듈린인 상기 [A1]∼[A2-4] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[A3-3] 가용성 트롬보모듈린이, 가용성 트롬보모듈린 함유물 중의 총단백에 대한 함유율이 95% 이상의 가용성 트롬보모듈린인 상기 [A1]∼[A2-4] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[A3-4] 가용성 트롬보모듈린이, 가용성 트롬보모듈린 함유물 중의 총단백에 대한 함유율이 99% 이상의 가용성 트롬보모듈린인 상기 [A1]∼[A2-4] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[A4] (2)의 공정이, 선형 또는 단계형, 또는 선형과 단계형을 조합한 구배 용출을 행하여, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 취득하는 공정인 상기 [A1]∼[A3-4] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

상기 [A1]∼[A3-4]와 같이 인용하는 항번호가 범위로 표시되고, 그 범위내에 [A3-2] 등의 가지번호를 가지는 항이 배치되어 있는 경우에는, [A3-2] 등의 가지번호를 가지는 항도 인용되는 것을 의미한다. 이하에서도 동일하다.

[A5] (2)의 공정이, 통과 분획을 취득하는 공정이며, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 분획을 취득하는 공정인 상기 [A1]∼[A3-4] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[A6] (2)의 공정이, 등용매 용출을 행하여, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 취득하는 공정인 상기 [A1]∼[A3-4] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[A7] (1)의 공정이, pH가 4∼9인 완충액을 사용하여 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체에 제공하는 공정이며, (2)의 공정이, pH가 5∼9이고 염 농도가 0∼1 M인 완충액을 사용하여 선형 또는 단계형, 또는 선형과 단계형을 조합한 구배 용출을 행하고, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을, (a) 가용성 트롬보모듈린이 용출하는 분획의 위치를 미리 확인해 두고 취득하는 공정, 또는 (b) 용출 분획에 가용성 트롬보모듈린이 존재하는 것을 확인하면서 취득하는 공정인 상기 [A1]∼[A3-4] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[A7-2] (a) 또는 (b)의 공정이 (a)의 공정인 상기 [A7]에 기재된 제조방법.

[A7-3] (a) 또는 (b)의 공정이 (b)의 공정인 상기 [A7]에 기재된 제조방법.

[A8] (1)의 공정이, pH가 5∼8이고 염 농도가 0.1∼0.2 M인 완충액을 사용하여 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체에 제공하는 공정이며, (2)의 공정이, pH가 5∼8이고 염 농도가 0.1∼0.2 M인 완충액을 사용하여 통과 분획을 취득함으로써 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 분획을 취득하는 공정인 상기 [A1]∼[A3-4] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[A9] (1)의 공정이, pH가 6∼9이고 인산염 농도가 8 mM 이하인 완충액을 사용하여 가용성 트롬보모듈린 함유물을 히드록시아파타이트에 제공하는 공정이며, (2)의 공정이, pH가 6∼9이고 인산염 농도가 0∼0.5 M인 완충액을 사용하여 선형 또는 단계형, 또는 선형과 단계형을 조합한 구배 용출을 행하고, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을, (a) 가용성 트롬보모듈린이 용출하는 분획의 위치를 미리 확인해 두고 취득하는 공정, 또는 (b) 용출 분획에 가용성 트롬보모듈린이 존재하는 것을 확인하면서 취득하는 공정인 상기 [A1]∼[A3-4] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[A9-2] (a) 또는 (b)의 공정이 (a)의 공정인 상기 [A9]에 기재된 제조방법.

[A9-3] (a) 또는 (b)의 공정이 (b)의 공정인 상기 [A9]에 기재된 제조방법.

[A10] (1)의 공정이, pH가 6∼9이고 인산염 농도가 5∼20 mM인 완충액을 사용하여 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 히드록시아파타이트에 제공하는 공정이며, (2)의 공정이, pH가 6∼9이고 인산염 농도가 5∼20 mM인 완충액을 사용하여 통과 분획을 취득함으로써 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 분획을 취득하는 공정인 상기 [A1]∼[A3-4] 중 어느 하나에 기재의 제조방법.

[A11] 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 취득한 후에 그 분획의 pH를 4 이하로 하는 공정을 포함하지 않는 상기 [A1]∼[A10] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[A12] 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 취득한 후에 그 분획의 pH를 4 이하로 하지 않는 농축 공정 및/또는 탈염 공정을 포함하며, 그 가용성 트롬보모듈린을 의약 원료로 하기 위한 상기 [A1]∼[A11] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[A13] 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린에서의 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 함유율이 3% 이하인 상기 [A1]∼[A12] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[A14] 그 가용성 트롬보모듈린이, 서열번호 9 또는 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 숙주 세포에 트랜스펙트하여 조제된 형질 전환 세포에서 취득되는 트롬보모듈린인 상기 [A1]∼[A13] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[A15] 가용성 트롬보모듈린으로부터 산성하에서 생성할 수 있는 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않도록 가용성 트롬보모듈린을 정제하는 방법이며, (1) 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 포함하거나, 포함하는 것이 의심되는 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하는 공정, (2) 그 가용성 트롬보모듈린과 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 분리할 수 있는 분리 조건으로 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 취득하는 공정을 포함하는 그 정제 방법, 또는 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하는 공정에서, 그 가용성 트롬보모듈린 함유물의 완충액을 조제하고, 통과 분획으로서 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 취득하는 그 정제 방법.

[A15-2] 상기 [A1]∼[A14] 중 어느 하나에 기재된 특징을 갖는 상기 [A15]에 기재된 정제 방법.

[A16] 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 트롬보모듈린에서의 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 함유율이 3.0% 이하인 상기 [A1]∼[A15] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[B1] 가용성 트롬보모듈린으로부터 산성하에서 생성할 수 있는 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 포함하거나, 포함하는 것이 의심되는 그 가용성 트롬보모듈린 함유물로부터, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 트롬보모듈린을 제조하는 방법이며, (1) 그 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하는 공정, (2) 그 가용성 트롬보모듈린과 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 분리할 수 있는 분리 조건으로 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 취득하는 공정을 포함하는 그 제조방법.

[B2] 가용성 트롬보모듈린으로부터 산성하에서 생성할 수 있는 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 포함하거나, 포함하는 것이 의심되는 그 가용성 트롬보모듈린 함유물로부터, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 트롬보모듈린을 제조하는 방법이며, 그 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하는 공정에서, 그 트롬보모듈린 함유물의 완충액을 조제하여, 통과 분획으로서 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 취득하는 그 제조방법.

[B3] (1)의 공정이, 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체에 제공하고, 사용하는 완충액의 pH가 4∼9인 공정이며, (2)의 공정이, 사용하는 완충액의 pH가 5∼9이고, 0∼1 M의 염 농도에 의한 선형 또는 단계형, 또는 선형과 단계형을 조합한 구배 용출을 행하여, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 미리 확인하거나 또는 용출 분획을 확인하면서 이를 인지하여 취득하는 공정인 [B1]에 기재된 제조방법.

[B4] (1)의 공정이, 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체에 제공하고, 사용하는 완충액의 pH가 4∼5인 공정이며, (2)의 공정이, 사용하는 완충액의 pH가 5∼9이고, 0∼1 M의 염 농도에 의한 선형 또는 단계형, 또는 선형과 단계형을 조합한 구배 용출을 행하여, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 미리 확인하거나 또는 용출 분획을 확인하면서 이를 인지하여 취득하는 공정인 [B1]에 기재된 제조방법.

[B5] 완충액이 pH 5∼8로, 0.1∼0.2 M의 염 농도이며, 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체에 제공하고, 통과 분획으로서 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 취득하는 [B2]에 기재된 제조방법.

[B6] (1)의 공정이, 가용성 트롬보모듈린 함유물을 히드록시아파타이트에 제공하고, 사용하는 완충액의 pH가 6∼9이고, 그 완충액의 인산 농도가 8 mM 이하의 공정이며, 상기 (2)의 공정이, 사용하는 완충액의 pH가 6∼9이고, 0∼0.5 M의 인산염 농도에 의한 선형 또는 단계형, 또는 선형과 단계형을 조합한 구배 용출을 행하고, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 미리 확인하거나 또는 용출 분획을 확인하면서 이를 인지하여 취득하는 공정인 [B1]에 기재된 제조방법.

[B7] (1)의 공정이, 가용성 트롬보모듈린 함유물을 히드록시아파타이트에 제공하고, 사용하는 완충액의 pH가 6∼9이고, 그 완충액의 인산 농도가 1∼4 mM의 공정이며, 상기 (2)의 공정이, 사용하는 완충액의 pH가 6∼9이고, 1∼40 mM의 인산염 농도에 의한 선형 또는 단계형, 또는 선형과 단계형을 조합한 구배 용출을 행하고, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 미리 확인하거나 또는 용출 분획을 확인하면서 이를 인지하여 취득하는 공정인 [B1]에 기재된 제조방법.

[B8] 완충액이 pH 6∼9이고, 5∼20 mM 인산염 농도이며, 가용성 트롬보모듈린 함유물을 히드록시아파타이트에 제공하고, 통과 분획으로서 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 취득하는 [B2]에 기재된 제조방법.

[B9] 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 취득한 후에, 그 분획의 pH를 4 이하로 하지 않는 [B1]∼[B8] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[B10] 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 취득한 후에, 그 분획의 pH를 4 이하로 하지 않는 농축 공정 또는 탈염 공정에 의해 의약 원료로 하는 [B1]∼[B8] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[B11] 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린에서의 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 함유율이 3% 이하인 [B1]∼[B10] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[B12] 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린에서의 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 함유율이 1% 이하인 [B1]∼[B11] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[B13] 그 트롬보모듈린이, 서열번호 9 또는 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 숙주 세포에 트랜스펙트하여 조제된 형질 전환 세포에서 취득되는 펩티드인 [B1]∼[B12] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

본 발명의 제조방법을 이용함으로써, 처리 단백질 농도를 높이는 농축 공정을 필요로 하지 않고, 처리 용적에 제한되지 않으며, 생산성이 높고, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 분리 가능하게 하며, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 함유하지 않는 고순도 가용성 트롬보모듈린을 취득할 수 있다.

도 1은, 실시예 4에서의 음이온 교환체 선형 구배 용출에 의한 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 분리에서의 크로마토그램을 나타낸다.

도 2는, 실시예 5에서의 음이온 교환체 선형 구배 용출에 의한 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 분리에서의 크로마토그램을 나타낸다.

도 3은, 실시예 6에서의 음이온 교환체 선형 구배 용출에 의한 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 분리에서의 크로마토그램을 나타낸다.

도 4는, 실시예 3에서 취득한 고순도 정제품에 관해 가용성 트롬보모듈린의 변성체 함량을 측정한 결과를 나타낸다.

도 5는, 실시예 8에서의 음이온 교환체 단계형 구배 용출에 의한 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 제거에서의 크로마토그램을 나타낸다.

도 6은, 실시예 11에서의 히드록시아파타이트 단계형 구배 용출에 의한 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 제거에서의 크로마토그램을 나타낸다.

도 7은, 실시예 14에서의 강음이온 교환체에 의한 고순도화와 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 제거에서의 크로마토그램을 나타낸다.

본 발명에서의 트롬보모듈린은, (1) 트롬빈과 선택적으로 결합하여 (2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용을 갖는 것이 알려져 있다. 또, (3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용, 및/또는 (4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용을 통상 확인할 수 있는 것이 바람직하다. 이들 트롬보모듈린이 갖는 작용을 트롬보모듈린 활성이라고 부르는 경우가 있다.

트롬보모듈린 활성으로는, 상기 (1) 및 (2)의 작용을 가지며, 상기 (1)∼(4)의 작용을 모두 구비하는 것이 더욱 바람직하다.

트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용은, 예를 들어 일본 특허 공개 소 64-6219호 공보을 비롯한 각종 공지의 문헌에 명확하게 기재된 시험 방법으로 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용의 활성량이나 그 유무를 용이하게 확인할 수 있는 것이다. 또, 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용, 및/또는 트 롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용도 동일하게 용이하게 확인할 수 있다.

본 발명에 기재된 가용성 트롬보모듈린으로는, 계면활성제의 비존재하에서 물에 가용인 가용성 트롬보모듈린을 들 수 있다. 가용성 트롬보모듈린의 용해성의 바람직한 예시로는, 물, 예를 들어 주사용 증류수에 대하여(트리톤 X-100이나 폴리도카놀 등의 계면활성제의 비존재하, 통상은 중성 부근에서), 1 ㎎/㎖ 이상, 또는 10 ㎎/㎖ 이상을 들 수 있고, 바람직하게는 15 ㎎/㎖ 이상, 또는 17 ㎎/㎖ 이상을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 20 ㎎/㎖ 이상, 25 ㎎/㎖ 이상, 또는 30 ㎎/㎖ 이상이 예시되고, 특히 바람직하게는 60 ㎎/㎖ 이상을 들 수 있고, 경우에 따라서는 80 ㎎/㎖ 이상, 또는 100 ㎎/㎖ 이상을 각각 들 수 있다. 가용성 트롬보모듈린을 용해할 수 있는지의 여부를 판단함에 있어서는, 용해한 후에, 예를 들어 백색 광원의 바로 아래, 약 1000 룩스의 밝기의 위치에서 육안으로 관찰한 경우에, 징명(澄明)하여 명확하게 확인되는 정도의 불용성 물질을 포함하지 않는 것이 단적인 지표가 되는 것으로 이해된다. 또, 여과후 잔여물의 유무를 확인할 수도 있다.

본 발명에서의 가용성 트롬보모듈린으로는, 인간형 트롬보모듈린에서 트롬보모듈린 활성의 중심 부위로 알려져 있는 서열번호 1의 제19∼132위의 아미노산 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하고, 서열번호 1의 제19∼132위의 아미노산 서열을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않는다. 그 서열번호 1의 제19∼132위의 아미노산 서열은, 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용, 즉 트롬보모듈린 활성을 갖고 있다면 자연 또는 인공적으로 변이해도 되고, 즉 서열번호 1의 제19∼132위의 아미노산 서열의 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가되어 도 된다. 허용되는 변이의 정도는, 트롬보모듈린 활성을 갖는다면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 아미노산 서열로서 50% 이상의 상동성이 예시되고, 70% 이상의 상동성이 바람직하고, 80% 이상의 상동성이 보다 바람직하고, 90% 이상의 상동성이 더욱 바람직하고, 95% 이상의 상동성이 특히 바람직하고, 98% 이상의 상동성이 가장 바람직하다. 이와 같은 아미노산 서열을 상동(相同) 변이 서열이라 한다. 이들 변이에 관해서는 후술하는 바와 같이, 통상의 유전자 조작 기술을 이용하면 용이하게 취득할 수 있다.

서열번호 3의 서열은, 서열번호 1의 서열의 제125위의 아미노산인 Val이 Ala로 변이된 것이지만, 본 발명에서의 가용성 트롬보모듈린으로서, 서열번호 3의 제19∼132위의 아미노산 서열을 포함하고 있는 것도 바람직하다.

이와 같이 본 발명에서의 가용성 트롬보모듈린으로는, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 제19∼132위의 서열, 또는 이들의 상동 변이 서열을 적어도 가지며, 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드 서열을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않지만, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 각각에서의 제19∼132위 또는 제17∼132위의 서열로 이루어진 펩티드, 또는 상기 서열의 상동 변이 서열로 이루어지고 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드를 바람직한 예로 들 수 있고, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 제19∼132위의 서열로 이루어진 펩티드가 보다 바람직하다. 또, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 각각에서의 제19∼132위 또는 제17∼132위의 상동 변이 서열로 이루어지고 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드가 보다 바람직한 다른 형태도 있다.

또 본 발명에서의 가용성 트롬보모듈린의 다른 형태로서, 서열번호 5의 제19∼480위의 아미노산 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하고, 서열번호 5의 제19∼480위의 아미노산 서열을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않는다. 그 서열번호 5의 제19∼480위의 아미노산 서열은, 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용, 즉 트롬보모듈린 활성을 가지는 한 그 상동 변이 서열이어도 된다.

서열번호 7의 서열은, 서열번호 5의 서열의 제473위의 아미노산인 Val이 Ala로 변이된 것이지만, 본 발명에서의 가용성 트롬보모듈린으로서, 서열번호 7의 제19∼480위의 아미노산 서열을 포함하고 있는 것도 바람직하다.

이와 같이 본 발명에서의 가용성 트롬보모듈린으로는, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 제19∼480위의 서열, 또는 이들의 상동 변이 서열을 적어도 가지며, 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드 서열을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않지만, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 각각에서의 제19∼480위 또는 제17∼480위의 서열로 이루어진 펩티드, 또는 상기 서열의 상동 변이 서열로 이루어지고 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드를 바람직한 예로 들 수 있고, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 제19∼480위의 서열로 이루어진 펩티드가 보다 바람직하다. 또, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 각각에서의 제19∼480위 또는 제17∼480위의 상동 변이 서열로 이루어지고 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드가 보다 바람직한 다른 형태도 있다.

또, 본 발명에서의 가용성 트롬보모듈린의 다른 형태로서, 서열번호 9의 제19∼515위의 아미노산 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하고, 서열번호 9의 제19 ∼515위의 아미노산 서열을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않는다. 그 서열번호 9의 제19∼515위의 아미노산 서열은, 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용, 즉 트롬보모듈린 활성을 가지는 한 그 상동 변이 서열이어도 된다.

서열번호 11의 서열은, 서열번호 9의 서열의 제473위의 아미노산인 Val이 Ala로 변이된 것이지만, 본 발명에서의 트롬보모듈린으로서, 서열번호 11의 제19∼515위의 아미노산 서열을 포함하고 있는 것도 바람직하다.

이와 같이 본 발명에서의 가용성 트롬보모듈린으로는, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 제19∼515위의 서열, 또는 이들의 상동 변이 서열을 적어도 가지며, 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드 서열을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않지만, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 각각에서의 제19∼516위, 제19∼515위, 제17∼516위, 또는 제17∼515위의 서열로 이루어진 펩티드, 또는 상기 서열의 상동 변이 서열로 이루어지고 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드를 보다 바람직한 예로 들 수 있고, 서열번호 9에서의 제19∼516위, 제19∼515위, 제17∼516위, 또는 제17∼515위의 서열로 이루어진 펩티드가 특히 바람직하다. 이들의 혼합물도 바람직한 예로 들 수 있다. 또, 서열번호 11의 각각에서의 제19∼516위, 제19∼515위, 제17∼516위, 또는 제17∼515위의 서열로 이루어진 펩티드가 특히 바람직한 다른 형태도 있다. 이들의 혼합물도 바람직한 예로 들 수 있다. 또한 이들의 상동 변이 서열로 이루어지고, 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드도 바람직한 예로 들 수 있다.

상동 변이 서열을 갖는 펩티드는 상술한 바와 같지만, 대상으로 하는 펩티드 의 아미노산 서열 중 하나 이상, 즉 하나 또는 복수의 아미노산, 더욱 바람직하게는 여러개(예를 들어 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 내지 3개)의 아미노산이 치환, 결실, 부가되어 있어도 되는 펩티드도 의미한다. 허용되는 변이의 정도는, 트롬보모듈린 활성을 갖는다면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 아미노산 서열로서 50% 이상의 상동성이 예시되고, 70% 이상의 상동성이 바람직하고, 80% 이상의 상동성이 보다 바람직하고, 90% 이상의 상동성이 더욱 바람직하고, 95% 이상의 상동성이 특히 바람직하고, 98% 이상의 상동성이 가장 바람직하다.

또한, 본 발명에서의 가용성 트롬보모듈린으로는, 일본 특허 공개 소 64-6219에서의 서열번호 14의 서열(462 아미노산 잔기)로 이루어진 펩티드, 서열번호 8의 서열(272 아미노산 잔기)로 이루어진 펩티드, 또는 서열번호 6의 서열(236 아미노산 잔기)로 이루어진 펩티드도 바람직한 예로 들 수 있다.

본 발명에서의 가용성 트롬보모듈린으로는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 제19∼132위의 아미노산 서열을 적어도 갖고 있는 펩티드라면 특별히 한정되지 않지만, 그 중에서도 서열번호 5 또는 서열번호 7의 제19∼480위의 아미노산 서열을 적어도 갖고 있는 펩티드인 것이 바람직하고, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 제19∼515위의 아미노산 서열을 적어도 갖고 있는 펩티드인 것이 보다 바람직하다. 서열번호 9 또는 서열번호 11의 제19∼515위의 아미노산 서열을 적어도 갖고 있는 펩티드로는, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 각각에서의 제19∼516위, 제19∼515위, 제17∼516위, 또는 제17∼515위의 서열로 이루어진 펩티드를 보다 바람직한 예로 들 수 있다. 또, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 각각에서의 제19∼516위, 제19∼515위, 제17∼516위, 또는 제17∼515위의 서열로 이루어진 펩티드의, 서열번호 9 또는 서열번호 11 각각에 관한 혼합물도 보다 바람직한 예로 들 수 있다.

상기 혼합물의 경우, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 각각에서의 제17위로부터 시작되는 펩티드와 제19위로부터 시작되는 펩티드의 혼합 비율로는, (30:70)∼(50:50)이 예시되고, (35:65)∼(45:55)를 바람직한 예로 들 수 있다.

또, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 각각에서의 제515위에서 끝나는 펩티드와 제516위에서 끝나는 펩티드의 혼합 비율로는, (0:100)∼(90:10)이 예시되고, 경우에 따라서는 (70:30)∼(90:10), (0:100)∼(30:70)이 예시된다.

이들 펩티드의 혼합 비율은 통상의 방법으로 구할 수 있다.

서열번호 1의 제19∼132위의 서열은 서열번호 9의 제367∼480위의 서열에 해당하고, 서열번호 5의 제19∼480위의 서열은 서열번호 9의 제19∼480위의 서열에 해당한다.

또, 서열번호 3의 제19∼132위의 서열은 서열번호 11의 제367∼480위의 서열에 해당하고, 서열번호 7의 제19∼480위의 서열은 서열번호 11의 제19∼480위의 서열에 해당한다.

또한, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 및 11의 각각에서의 제1∼18위의 서열은 모두 동일한 서열이다.

이들 본 발명에서의 트롬보모듈린은 후술하는 바와 같이, 이들 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11 등의 펩티드를 코드하는 DNA(구체적으로는 각각 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 12 등의 염기 서열)을 벡터에 의해 숙주 세포에 트랜스펙트하여 조제된 형질 전환 세포에서 취득할 수 있다. 트롬보모듈린으로는, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 코드하는 DNA(구체적으로는 각각 서열번호 10 또는 서열번호 12)를 벡터에 의해 숙주 세포에 트랜스펙트하여 조제된 형질 전환 세포에서 취득되는 트롬보모듈린이 바람직하다.

또한, 이들의 펩티드는, 상기 아미노산 서열을 가지면 좋은 것이며, 당쇄가 부가되어 있어도 되고 부가되어 있지 않아도 되며, 이 점은 특별히 한정되는 것은 아니다. 또 유전자 조작에서는, 이용하는 숙주 세포의 종류에 따라 당쇄의 종류나 부가 위치, 부가의 정도는 상이하며, 어느 것이라도 사용할 수 있다. 당쇄의 결합 위치 및 종류에 관해서는, 일본 특허 공개 평 11-341990에 기재된 사실이 알려져 있고, 본 발명에서의 트롬보모듈린도 동일한 위치에 동일한 당쇄가 부가하는 경우가 있다. 후술하는 바와 같이, 유전자 조작에 의해 취득하는 것에 특정되는 것은 아니지만, 유전자 조작에 의해 취득하는 경우에는, 발현시에 이용할 수 있는 시그널 서열로는, 상술한 서열번호 9의 제1∼18위의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열, 서열번호 9의 제1∼16위의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열, 그 밖에 공지의 시그널 서열, 예를 들어 인간 조직형 플러스미노겐 액티베이터의 시그널 서열을 이용할 수 있다(국제공개 88/9811호 공보).

트롬보모듈린을 코드하는 DNA 서열을 숙주 세포에 도입하는 경우에는, 바람직하게는 트롬보모듈린을 코드하는 DNA 서열을, 벡터, 특히 바람직하게는, 동물 세 포에서 발현 가능한 발현 벡터에 조합하여 도입하는 방법을 들 수 있다. 발현 벡터란, 프로모터 서열, mRNA에 리보솜 결합 부위를 부여하는 서열, 발현하고자 하는 단백을 코드하는 DNA 서열, 스플라이싱 시그널, 전사 종결의 터미네이터 서열, 복제 기원 서열 등으로 구성되는 DNA 분자이고, 바람직한 동물 세포 발현 벡터의 예로는, R.C.Mulligan 등 [Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78.2072(1981)]이 보고하고 있는 pSV2-X나, P.M.Howley 등[Method in Emzymology, 101, 387, Academic Press(1983)]이 보고하고 있는 pBP69T(69-6) 등을 들 수 있다.

이러한 펩티드를 제조할 때 이용할 수 있는 숙주 세포로는, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, COS-1 세포, COS-7 세포, VERO(ATCC CCL-81) 세포, BHK 세포, 개 신장 유래 MDCK 세포, 햄스터 AV-12-664 세포 등을, 또 인간 유래 세포로서 HeLa 세포, WI38 세포, 인간 293 세포를 들 수 있다. CHO 세포가 매우 일반적이고 바람직하며, CHO 세포에서는 DHFR-CHO 세포가 더욱 바람직하다.

또, 유전자 조작의 과정이나 펩티드의 제조 과정에서 대장균 등의 미생물도 많이 이용되고, 각각에 적합한 숙주-벡터계를 이용하는 것이 바람직하고, 상술한 숙주 세포에서도 적절한 벡터계를 선택할 수 있다. 유전자 재조합 기술에 이용하는 트롬보모듈린의 유전자는 클로닝되어 있고, 그리고 트롬보모듈린의 유전자 재조합 기술을 이용한 제조예가 개시되어 있고, 나아가 그 정제품을 얻기 위한 정제 방법도 알려져 있다[일본 특허 공개 소 64-6219호 공보, 일본 특허 공개 평 2-255699호 공보, 일본 특허 공개 평 5-213998호 공보, 일본 특허 공개 평 5-310787호 공보, 일본 특허 공개 평 7-155176호 공보, J.Biol.Chem., 264:10351-10353(1989)]. 따라 서, 본 발명에서 이용하는 가용성 트롬보모듈린은, 상기 보고에 기재되어 있는 방법을 이용하는 것에 의해, 또는 이들에 기재된 방법에 준하는 것에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어 일본 특허 공개 소 64-6219호 공보에서는, 전체 길이의 트롬보모듈린을 코드하는 DNA를 포함하는 플러스미드 pSV2 트롬보모듈린 J2를 포함하는, Escherichia coli K-12 strain DH5(ATCC 기탁번호 67283호)가 개시되어 있다. 또, 이 균주를 생명연(현 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물 기탁센터)(일본 이바라키현 쯔쿠바시 히가시 1-1-3(우편번호 305))에, 1996년 6월 19일에 재기탁한 균주(Escherichia coli DH5/pSV2TMJ2)(FERM BP-5570)를 이용할 수도 있다. 이 전체 길이의 트롬보모듈린을 코드하는 DNA를 원료로 하여, 공지의 유전자 조작 기술에 의해 본 발명의 트롬보모듈린을 조제할 수 있다.

본 발명에 사용되는 가용성 트롬보모듈린은, 종래 공지의 방법 또는 그것에 준하여 조제하면 되지만, 예를 들어 상기 야마모토 등의 방법[일본 특허 공개 소 64-6219호 공보], 또는 일본 특허 공개 평 5-213998호 공보를 참고로 할 수 있다. 즉, 인간 유래의 트롬보모듈린 유전자를 유전자 조작 기술에 의해, 예를 들어 서열번호 9의 아미노산 서열을 코드하는 DNA로 하고, 또 필요에 따라 개변하는 것도 가능하다. 이 개변으로는, 예를 들어 서열번호 11의 아미노산 서열을 코드하는 DNA(구체적으로는, 서열번호 12의 염기 서열으로 이루어짐)로 하기 위해, 서열번호 9의 아미노산 서열의 제473위의 아미노산을 코드하는 코돈(특히 제1418위의 염기)에, 메소드 인 엔자이몰로지[Methods in Enzymology, 100:468(1983년), 아카데믹 프레스(Academic Press)]에 기재된 방법에 따라서, 부위 특이적 변이를 행한다. 예 를 들어, 서열번호 10의 제1418위의 염기 T는, 서열번호 13에 표시된 염기 서열을 갖는 변이용 합성 DNA를 이용하여 염기 C로 변환한 DNA로 할 수 있다.

이와 같이 하여 조제한 DNA를, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에 조합하여 형질 전환 세포로 하고, 적절하게 선택하여, 이 세포를 배양하여 얻은 배양액으로부터 공지의 방법으로 정제된 트롬보모듈린을 제조할 수 있다. 상술한 바와 같이 서열번호 9의 아미노산 서열을 코드하는 DNA(서열번호 10)를 상기 숙주 세포에 트랜스펙트하는 것이 바람직하다. 본 발명에 이용되는 트롬보모듈린의 생성 방법은 상기 방법에 한정되지 않고, 예를 들어 트롬보모듈린을 생성하는 조직 또는 이들 조직 배양액 등으로부터 추출 정제하는 것도, 또 필요에 따라 단백 분해 효소에 의해 절단 처리하는 것도 가능하다.

상기 세포 배양 방법에 의해 본 발명에서의 트롬보모듈린을 제조하는 경우, 단백질의 번역후 수식에 의해, N 말단 아미노산에 다양성이 보이는 경우가 있다. 예를 들어, 서열번호 9에서의 제17위, 18위, 19위 또는 22위의 아미노산이 N 말단이 되는 경우가 있다. 또, 예를 들어 제22위의 글루타민산이 피로글루타민산으로 변환되도록 N 말단 아미노산이 수식되는 경우도 있다. 제17위 또는 19위의 아미노산이 N 말단이 되는 것이 바람직하고, 제19위의 아미노산이 N 말단이 되는 것이 보다 바람직하다. 또, 제17위의 아미노산이 N 말단이 되는 것이 바람직한 다른 형태도 있다. 이상의 수식이나 다양성 등에 관해서는 서열번호 11도 동일한 예를 들 수 있다.

또한, 서열번호 10의 염기 서열을 갖는 DNA를 이용하여 트롬보모듈린을 제조 하는 경우, C 말단 아미노산의 다양성이 보이는 경우가 있고, 1 아미노산 잔기 짧은 펩티드가 제조되는 경우가 있다. 즉, 제515위의 아미노산이 C 말단이 되고, 또한 그 제515위가 아미드화된다고 한 바와 같이, C 말단 아미노산이 수식되는 경우가 있다. 따라서, N 말단 아미노산과 C 말단 아미노산이 다양성이 풍부한 펩티드, 또는 이들의 혼합물이 제조되는 경우가 있다. 제515위의 아미노산이 C 말단이 되는 것이 바람직하다. 또, 제516위의 아미노산이 C 말단이 되는 것이 바람직한 다른 형태도 있다. 이상의 수식이나 다양성 등에 관해서는 서열번호 12의 염기 서열을 갖는 DNA도 동일하다.

상기 방법으로 얻어지는 트롬보모듈린은, N 말단 및 C 말단에 다양성이 보이는 펩티드의 혼합물인 경우가 있다. 구체적으로는, 서열번호 9에서의 제19∼516위, 제19∼515위, 제17∼516위, 또는 제17∼515위의 서열로 이루어진 펩티드의 혼합물을 들 수 있다.

본 발명에 의해, 가용성 트롬보모듈린으로부터 산성하에서 생성할 수 있는 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 제조하는 방법이 제공된다. 그 제조방법은, (1) 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 포함하거나, 포함하는 것이 의심되는 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하는 공정, 및 (2) 그 가용성 트롬보모듈린과 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 분리할 수 있는 분리 조건으로 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 분획을 취득하는 공정을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않지만, (1)의 공정 이전에 (0) 그 가용성 트롬보모듈린을 pH 5 이하의 산성하에 두는 공정을 포함하는 것이 바람직하고, (1)의 공정 이전에 (0) 그 가용성 트롬보모듈린을 pH 5 이하의 산성하에 두는 공정을 포함하고 또한 (*) 가용성 트롬보모듈린을 정제하는 공정을 포함하는 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 제조방법에서 (*)의 공정의 위치는 특별히 한정되지 않지만, (1)의 공정 이전에 위치하는 것이 바람직하다.

본 발명의 가용성 트롬보모듈린으로부터 산성하에서 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 생성할 수 있는 산성하의 조건으로는, 예를 들어 pH 5 이하, 바람직하게는 pH 4 이하, 보다 바람직하게는 pH 3 이하가 예시되고, 이 pH 의 하한으로는, 예를 들어 pH 1 이상, 바람직하게는 pH 2 이상, 보다 바람직하게는 pH 3 이상이 예시된다. 또, 산성하에서의 시간으로는, 예를 들어 0.5 시간 이상, 바람직하게는 1 시간 이상, 보다 바람직하게는 2 시간 이상이 예시된다. 또, 산성하에서의 온도로는, 예를 들어 실온, 바람직하게는 15℃ 이하, 보다 바람직하게는 8℃ 이하가 예시되고, 이 온도의 하한으로는, 통상 0℃ 이상, 바람직하게는 2℃ 이상, 보다 바람직하게는 5℃ 이상이 예시된다. 상기 산성하의 조건에서, 가용성 트롬보모듈린과 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체와의 혼합물이 된다.

본 발명의 방법으로 제조되는 「가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 트롬보모듈린」에서의 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 함유율의 상한으로는, 3.0% 이하인 것이 바람직하고, 2.0% 이하인 것이 보다 바람직하고, 1.0% 이하인 것이 더욱 바람직하고, 0.5% 이하인 것이 특히 바람직하고, 하한으로는 0.01% 이상이 예시되지만, 검출 한계 이하인 것이 바람직하다. 가용성 트롬보모듈 린의 변성체의 함유율은, 크로마토그래피를 이용하여 분석할 수 있고, 예를 들어, TSKgelG3000SWXL(7.8 ㎜I.D.×30㎝; TOSOH사) 분석용 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하고, 황산나트륨을 포함하는 인산 완충액의 이동상으로 분석 샘플 150 ㎕을 사용하고, 유속 0.9 ㎖/분으로 280 ㎚에서의 흡광도를 측정함으로써 분석하여, 가용성 트롬보모듈린 및 가용성 트롬보모듈린의 피크 면적으로부터 구할 수 있다.

본 발명의 가용성 트롬보모듈린으로부터 산성하에서 생성할 수 있는 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체는, TSKgelG3000SWXL(7.8 ㎜I.D.×30㎝; TOSOH사) 분석용 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여, 황산나트륨을 포함하는 인산 완충액의 이동상으로 분석 샘플 150 ㎕을 사용하고, 유속 0.9 ㎖/분으로 분석하면, 가용성 트롬보모듈린의 유지 시간의 약 9할의 유지 시간(예를 들어, 가용성 트롬보모듈린의 유지 시간이 약 9 분인 경우, 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 유지 시간은 약 8 분)으로 검출되었다. 또, 본 발명의 가용성 트롬보모듈린으로부터 산성하에서 생성할 수 있는 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체는, 전기 영동의 Native-PAGE에서는, 이동하여 트롬보모듈린의 고분자측에 보이고, SDS-PAGE에서는 검출되지 않았다.

본 발명에 이용하는 산성하에서 생성할 수 있는 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 포함하거나, 포함하는 것이 의심되는 가용성 트롬보모듈린 함유물(이하, 변성체 함유물로 약칭하는 경우가 있음)로는, 가용성 트롬보모듈린 및 가용성 트롬보모듈린 변성체를 함유하는 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 가용성 트롬보모듈린을 생성할 수 있는 세포를, 혈청 성분을 함유하는 배지나 무혈청 배지를 사용하여 배양하여 조제된 배양 상청으로부터 얻어진 가용성 트롬보모듈린 액체가 예시되고, 바람직하게는, 가용성 트롬보모듈린을 생성할 수 있는 세포를, 혈청 성분을 함유하는 배지나 무혈청 배지를 사용하여 배양하여 조제된 배양 상청을 이용하여, 정제 공정을 거쳐 얻어진 그 가용성 트롬보모듈린 액체, 또는 산성하에 놓여진 그 가용성 트롬보모듈린 액체가 예시되고, 보다 바람직하게는, 가용성 트롬보모듈린을 생성할 수 있는 세포를, 혈청 성분을 함유하는 배지나 무혈청 배지를 사용하여 배양하여 조제된 배양 상청을 이용하여, 정제 공정을 거쳐 얻어진 그 가용성 트롬보모듈린 액체가 예시된다. 또, 산성하에 놓여진 그 가용성 트롬보모듈린 액체가 바람직한 다른 형태도 있다.

상기 정제 공정으로는, 적어도 가용성 트롬보모듈린 이외의 단백질을 제거할 수 있는 공정이라면 특별히 한정되지 않지만, 트롬보모듈린에 대한 항체를 담지시킨 어피니티 크로마토그래피를 이용하여, 산성하에서 그 가용성 트롬보모듈린을 용출 회수하는 공정, 또는 상기 어피니티 크로마토그래피에 의해 얻어진 그 가용성 트롬보모듈린을, 비전도도 25∼34 ms/㎝, pH 3∼4의 조건하에 양이온 교환체와 접촉시키는 공정에 있어서, 통과 분획으로서 그 가용성 트롬보모듈린을 회수하는 공정을 들 수 있다.

상기 가용성 트롬보모듈린 함유물(변성체 함유물)로는 가용성 트롬보모듈린 및 가용성 트롬보모듈린 변성체를 함유하는 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 가용성 트롬보모듈린 및 가용성 트롬보모듈린 변성체 이외의 단백을 실질적으로 포함하지 않는 것이 예시된다. 구체적으로는, 가용성 트롬보모듈린 함유물 중의 총단백에 대한 가용성 트롬보모듈린의 함유율이, 하한으로서 50% 이상인 것이 예시되고, 60% 이상인 것이 바람직하고, 70% 이상인 것이 보다 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 90% 이상인 것이 특히 바람직하고, 95% 이상인 것이 가장 바람직하고, 99% 이상인 것이 더없이 바람직하다. 또, 99.9% 이상이 바람직한 경우도 있다. 상기 가용성 트롬보모듈린의 함유율로는, 가용성 트롬보모듈린 자체의 함유율을 들 수 있지만, 가용성 트롬보모듈린 및 가용성 트롬보모듈린 변성체 양자를 합한 함유율을 의미하는 경우도 있다. 가용성 트롬보모듈린의 함유율이, 가용성 트롬보모듈린 및 가용성 트롬보모듈린 변성체 양자를 합한 함유율을 의미하는 경우에도, 가용성 트롬보모듈린 함유물 중의 총단백에 대한 가용성 트롬보모듈린의 함유율이, 하한으로서 50% 이상인 것이 예시되고, 60% 이상인 것이 바람직하고, 70% 이상인 것이 보다 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 90% 이상인 것이 특히 바람직하고, 95% 이상인 것이 가장 바람직하고, 99% 이상인 것이 더없이 바람직하다. 또, 99.9% 이상이 바람직한 경우도 있다.

상기 가용성 트롬보모듈린의 함유율은 크로마토그래피를 이용하여 측정할 수 있고, 예를 들어 Asahipak C4P-50(4.6 ㎜I.D.×15 ㎝; 쇼와덴꼬(주)) 분석용 역상 크로마토그래피를 이용하여, 0.1% 트리플루오로아세트산을 포함하는 증류수(A 액)와 0.1% 트리플루오로아세트산을 포함하는 아세토니트릴(B 액)의 이동상으로 분석 샘플 150 ㎕을 사용하여, 유속 0.8 ㎖/분으로 A 액과 B 액의 혼합비를 96:4에서 48 분후에 0:100이 되도록 직선적으로 변화시켜, 용출액의 280 ㎚에서의 흡광도를 측정함으로써 분석하여, 가용성 트롬보모듈린과 다른 단백질의 피크 면적으로부터 구할 수 있다. 또, 일본 특허 공개 평 11-341990호 공보에 기재된 ELISA 방법을 이용 하여, 가용성 트롬보모듈린 이외의 단백질을 측정함으로써, 가용성 트롬보모듈린의 함유율을 구할 수 있다.

본 발명에서는, 그 트롬보모듈린을 pH 5 이하의 산성하에 두는 공정을 거친 후에, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 포함하거나, 포함하는 것이 의심되는 그 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하는 것이 바람직하다. 산성하로서는, 상한으로서 pH 5 이하가 바람직하고, pH 4 이하가 보다 바람직하고, pH 3 이하가 더욱 바람직하고, 하한으로서 pH 1 이상이 바람직하고, pH 2 이상이 보다 바람직하고, pH 3 이상이 더욱 바람직하다.

또, 산성하에서의 시간으로는, 예를 들어 0.5 시간 이상, 바람직하게는 1 시간 이상, 보다 바람직하게는 2 시간 이상이 예시된다. 또, 산성하에서의 온도로는, 예를 들어 실온, 바람직하게는 15℃ 이하, 보다 바람직하게는 8℃ 이하가 예시되고, 이 온도의 하한으로는, 통상 0℃ 이상, 바람직하게는 2℃ 이상, 보다 바람직하게는 5℃ 이상이 예시된다.

본 발명에서 사용되는 염으로서 적합한 염은 염화물이며, 가장 적합한 염은 염화나트륨이다. 또, 히드록시아파타이트에서 적합한 인산염은, 인산나트륨, 인산칼륨이다.

가용성 트롬보모듈린과 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 분리할 수 있는 분리 조건으로는, 선형 또는 단계형, 또는 선형과 단계형을 조합한 구배 용출 조건, 통과 분획에 가용성 트롬보모듈린이 용출하는 조건, 또는 등용매(isograding) 용출 조건을 들 수 있고, 선형 또는 단계형, 또는 선형과 단계형을 조합한 구배 용출 조건, 또는 통과 분획에 가용성 트롬보모듈린이 용출하는 조건이 바람직하고, 선형 또는 단계형, 또는 선형과 단계형을 조합한 구배 용출 조건이 보다 바람직하다. 또, 통과 분획에 가용성 트롬보모듈린이 용출하는 조건이 바람직한 다른 형태도 있다. 또한, 등용매 용출 조건이 바람직한 경우도 있다.

통과 분획으로는, 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하여, 가용성 트롬보모듈린이 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 흡착되지 않는 분획을 들 수 있다. 통과 분획으로는 트롬보모듈린 변성체를 실질적으로 포함하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1∼20 컬럼 용적, 1∼50 컬럼 용적, 또는 1∼100 컬럼 용적을 들 수 있다.

구배 용출 조건으로는, 사용하는 컬럼에 따라 적절하게 설정하면 된다. 구체적인 조건으로는 후술하는 조건을 들 수 있다. 또, 통과 분획에 가용성 트롬보모듈린이 용출하는 조건으로는, 사용하는 완충액도 사용하는 컬럼에 따라 적절하게 설정하면 된다. 구체적인 조건으로는 후술하는 조건을 들 수 있다. 또한, 등용매 용출 조건으로는, 사용하는 컬럼에 따라 적절하게 설정하면 된다.

음이온 교환체는, 바람직하게는 강음이온 교환체인 제4급 암모늄기를 갖는 음이온 교환체, 예를 들어 SOURCEQ(GE 헬스케어 바이오사이언스사)를 이용하여, 변성체 함유물을 제공하기 전에, 수컬럼 용적의 pH 4∼9의 완충액(완충액의 종류는 한정되지 않지만, 예를 들어, 0.1 M 아세트산, pH 4 또는 0.02 M 인산, pH 7.3 또는 0.02 M 트리스, pH 8)을 이용하여 평형화될 수 있다. 평형후, 변성체 함유물을 제공하고, 그리고 가용성 트롬보모듈린의 용출전에, pH 4∼9의 완충액(완충액의 종 류는 한정되지 않지만, 예를 들어, 0.1 M 아세트산, pH 4 또는 0.02 M 인산, pH 7.3 또는 0.02 M 트리스, pH 8)을 이용하여 세정될 수 있다. 흡착시킨 변성체 함유물은 pH 5∼9, 바람직하게는 pH 7∼8의 완충액(완충액의 종류는 한정되지 않지만, 예를 들어, 0.02 M 인산, pH 7.3 또는 0.02 M 트리스, pH 8)을 이용하여, 0∼1 M의 염 농도에 의한 구배 용출에 의해, 가용성 트롬보모듈린과 가용성 트롬보모듈린의 변성체가 분리 용출된다. 분리 조건은 가용성 트롬보모듈린과 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 분리할 수 있는 분리 조건이라면 특별히 한정되지 않지만, 구배 용출 조건으로서 선형 또는 단계형, 또는 선형과 단계형을 조합한 조건을 들 수 있다. 바람직하게는 이 구배 용출은, 0∼0.3 M의 염 농도, 보다 바람직하게는 0.03∼0.26 M의 염 농도이다. 용출 완충액의 양은 2∼40 컬럼 용적, 바람직하게는 5∼20 컬럼 용적의 범위이다.

구배 용출 조건을 사용하는 경우, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 취득하는 공정으로는, 예를 들어 (a) 가용성 트롬보모듈린이 용출하는 분획의 위치를 미리 확인해 두고 취득하는 공정, 또는 (b) 용출 분획에 가용성 트롬보모듈린이 존재하는 것을 확인하면서 취득하는 공정을 들 수 있다.

(a)의 공정을 구체적으로 설명하면, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 용출 분획의 위치를, 가용성 트롬보모듈린 및 가용성 트롬보모듈린 변성체의 존재를 확인할 수 있는 분석 방법(예를 들어, 이하의 실시예 7에 기재된 사이즈 배제 크로마토그래피)으로 미리 확인해 두고, 그 위치의 용출 분 획을 회수하는 공정을 들 수 있다. 또, (b)의 공정을 구체적으로 설명하면, 용출 분획이 그 가용성 트롬보모듈린을 함유하고 또한 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 것을, 가용성 트롬보모듈린 및 가용성 트롬보모듈린 변성체의 존재를 확인할 수 있는 분석 방법(예를 들어, 이하의 실시예 7에 기재된 사이즈 배제 크로마토그래피)으로 확인하면서, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 그 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 취득하는 공정을 들 수 있다. (b)의 공정이 바람직하다. 또, 경우에 따라서는 (a)의 공정이 바람직한 경우도 있다.

또, 변성체 함유물을 제공하기 전에, 변성체 함유물을 적절한 완충액에 치환함으로써, 통과 분획으로서 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 취득할 수도 있다. 통과 분획으로는, 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체에 제공하고, 가용성 트롬보모듈린이 음이온 교환체에 흡착되지 않는 분획을 들 수 있다. 가용성 트롬보모듈린 및 가용성 트롬보모듈린의 변성체와의 사이의 컬럼에 대한 흡착력의 차이를 이용하는 경우, 음이온 교환체는, 바람직하게는 강음이온 교환체인 제4급 암모늄기를 갖는 음이온 교환체, 예를 들어 SOURCEQ, QSepharoseFF(GE 헬스케어 바이오사이언스사), 사르토바인드(sartorius사), 무스탕(PALL사)을 이용할 수 있다. 치환하는 적절한 완충액은, 바람직하게는 pH 5∼8, 0.1∼0.2 M의 염 농도의 완충액이며, 완충액의 종류는 한정되지 않지만, 예를 들어, 0.02 M 인산, 0.18 M 염화나트륨, pH 7.3을 이용할 수 있다. 통과 분획을 취득하는 방법으로는, 분획이 그 가용성 트롬보모듈린을 함유하고 또한 그 가용 성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 것을, 후술하는 실시예 7에 기재된 사이즈 배제 크로마토그래피 등의 분석 방법으로 확인하면서 그 분획을 적절하게 취득하면 된다.

또한, 등용매 용출 조건을 이용할 수도 있다. 이 경우도, 구배 용출 조건 및 통과 분획에 가용성 트롬보모듈린이 용출하는 조건을 참고로 적절하게 조건을 설정할 수 있다.

히드록시아파타이트는, 예를 들어 Macro-Prep(R) Ceramic Hydroxyapatite TYPE1(BIO-RAD사)을 이용하여, 변성체 함유물을 제공하기 전에, 수컬럼 용적의 pH 6∼9의 인산 농도가 8 mM 이하, 바람직하게는 5 mM 이하, 보다 바람직하게는 2 mM 이하인 완충액(완충액의 종류는 한정되지 않지만, 예를 들어 5 mM 인산, 0.2 M 염화나트륨, pH 7 또는 1 mM 인산, 25 mM TRIS, 0.2 M 염화나트륨, pH 7.7 또는 2 mM 인산, 20 mM HEPES, 0.17 M 염화나트륨, pH 7)을 이용하여 평형화될 수 있다. 제공하는 변성체 함유물의 완충액은, pH 6∼9의 인산 농도가 8 mM 이하, 바람직하게는 5 mM 이하, 보다 바람직하게는 2 mM 이하의 완충액을 이용하고, 평형후 변성체 함유물을 제공하고, 그리고 가용성 트롬보모듈린의 용출전에, pH 6∼9의 인산 농도가 8 mM 이하, 바람직하게는 5 mM 이하, 보다 바람직하게는 2 mM 이하인 완충액(완충액의 종류는 한정되지 않지만, 예를 들어 5 mM 인산, 0.2 M 염화나트륨, pH 7 또는 1 mM 인산, 25 mM TRIS, 0.2 M 염화나트륨, pH 7.7 또는 2 mM 인산, 20 mM HEPES, 0.17 M 염화나트륨, pH 7)을 이용하여 세정될 수 있다. 흡착시킨 변성체 함유물은 pH 6∼9, 바람직하게는 pH 7∼8의 완충액을 이용하고, 0∼0.5 M의 인산염 농도의 구배에 의해, 가용성 트롬보모듈린과 가용성 트롬보모듈린의 변성체가 분리 용출된다. 분리 조건은 가용성 트롬보모듈린과 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 분리할 수 있는 분리 조건이라면 특별히 한정되지 않지만, 구배 용출 조건으로서 선형 또는 단계형을 들 수 있다. 바람직하게는 이 구배는, 1∼40 mM의 인산염 농도이며, 보다 바람직하게는, 단계형으로 행하고, 8∼10 mM 인산염 농도로 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 얻을 수 있다. 인산염의 농도를 더욱 높임으로써 가용성 트롬보모듈린의 변성체가 용출된다.

구배 용출 조건을 사용하는 경우, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 취득하는 방법으로는, 가용성 트롬보모듈린 및 가용성 트롬보모듈린 변성체를 음이온 교환체로 분리하는 경우의 방법과 동일한 방법을 들 수 있다.

또, 변성체 함유물을 제공하기 전에, 변성체 함유물을 적절한 완충액에 치환함으로써, 통과 분획으로서 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 취득할 수도 있다. 통과 분획으로는, 가용성 트롬보모듈린 함유물을 히드록시아파타이트에 제공하고, 가용성 트롬보모듈린이 히드록시아파타이트에 흡착되지 않는 분획을 들 수 있다. 가용성 트롬보모듈린 및 가용성 트롬보모듈린의 변성체와의 사이의 컬럼에 대한 흡착력의 차이를 이용한다. 이 경우, 히드록시아파타이트는, 예를 들어 Macro-Prep(R) Ceramic Hydroxyapatite TYPE1(BIO-RAD 사)을 이용할 수 있다. 치환하는 적절한 완충액은, pH 6∼9, 5∼20 mM의 인산 염 농도, 바람직하게는 pH 6∼7, 5∼10 mM의 인산염 농도의 완충액이며, 완충액의 종류는 한정되지 않지만, 예를 들어, 10 mM 인산, 10 mM 염화나트륨, pH 7을 이용할 수 있다. 통과 분획을 취득하는 방법으로는, 분획이 그 가용성 트롬보모듈린을 함유하고 또한 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 것을, 후술하는 실시예 7에 기재된 사이즈 배제 크로마토그래피 등의 분석 방법으로 확인하면서 그 분획을 적절하게 취득하면 된다.

본 발명의 제조방법에서는, 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하고, 가용성 트롬보모듈린 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린의 용출 분획을 취득한 후에 그 분획을 pH 4 이하로 하는 공정을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 또, 그 가용성 트롬보모듈린을 의약 원료로 하기 위한 그 후의 농축 공정 및/또는 탈염 공정에서도 pH 4 이하로 하지 않는 것이 바람직하다.

가용성 트롬보모듈린을 생성할 수 있는 세포를, 혈청 성분을 함유하는 배지나 무혈청 배지를 사용하여 배양하여 조제된 배양 상청으로부터 가용성 트롬보모듈린을 정제하는 바람직한 방법을 예시하면, 트롬보모듈린 활성, 예를 들어 트롬빈에 의한 프로테인 C 활성화의 촉진 활성을 지표로 정제하는 방법을 들 수 있고, 예를 들어 이온 교환 컬럼의 Q-세파로스 FF로 배양 상청을 조정제하여 트롬보모듈린 활 성을 갖는 분획을 회수하고, 이어서 어피니티 컬럼의 마우스 항 트롬보모듈린 모노클로날 항체로 정제하여, 트롬보모듈린 활성이 강한 분획을 회수하고, 회수 분획을 양이온 교환 컬럼의 SP-세파로스 FF로 정제하고, 통과 분획을 농축하고, 겔여과하여 트롬보모듈린 활성 분획을 취득하는 정제 방법을 들 수 있다. 이 SP-세파로스 FF에 의한 정제후, 본 발명에 의한 음이온 교환체, 바람직하게는 강음이온 교환체인 제4급 암모늄기를 갖는 음이온 교환체, 예를 들어 SOURCEQ(GE 헬스케어 바이오사이언스사), 또는 본 발명에 의한 히드록시아파아타이트, 예를 들어 Macro-Prep(R) Ceramic Hydroxyapatite TYPE1(BIO-RAD 사)을 최적의 조건하에서 이용함으로써, 간편하게 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 함유하지 않는 고순도의 트롬보모듈린을 취득하는 것이 가능하다.

또, 마우스 항트롬보모듈린 모노클로날 항체로 정제한 후, 본 발명에 의한 음이온 교환체, 바람직하게는 강음이온 교환체인 제4급 암모늄기를 갖는 음이온 교환체, 예를 들어 SOURCEQ(GE 헬스케어 바이오사이언스사)를 최적의 조건하에서 이용함으로써, 가용성 트롬보모듈린의 변성체와 마우스 항체 유래물, 혈청 함유 배지를 사용한 경우는 혈청 유래물을 동시에 제거할 수 있어, 간편하게 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 함유하지 않는 고순도의 트롬보모듈린을 취득하는 것이 가능하다.

상기에 예시한 방법으로 얻어진 고순도의 트롬보모듈린을, pH를 4 이하로 하지 않는 농축 공정 및/또는 탈염 공정에 의해 완충액 교환한 고순도 정제품을 취득할 수 있다. 상기 방법으로 취득한 가용성 트롬보모듈린은 의약 원료로서 이용할 수 있다.

또, 본 발명에 의해 가용성 트롬보모듈린으로부터 산성하에서 생성할 수 있는 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않도록 가용성 트롬보모듈린을 정제하는 방법이 제공된다. 그 정제 방법은, (1) 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 포함하거나, 포함하는 것이 의심되는 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하는 공정, 및 (2) 그 가용성 트롬보모듈린과 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 분리할 수 있는 분리 조건으로 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 분획을 취득하는 공정을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않는다. 또, 그 정제 방법으로는, 상기 본 발명의 가용성 트롬보모듈린의 제조방법이 갖는 특징을 갖고 있는 정제 방법을 들 수 있다.

실시예

이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 전혀 한정되지 않는다.

(실시예 1) 강음이온 교환체 컬럼에 의한 조정제(粗精製)

일본 특허 공개 평 11-341990호 공보에 따라서, 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 유전자 조작 기술에 의해, 조제 개변하여 조합한 차이니즈 햄스터 난소 세포를 배양하여 배양액 상청을 취득했다. 취득한 배양액 상청 41 ℓ를, 0.2 ㎛의 멤브레인 필터(밀리포어사, 밀리팩 20)로 여과했다. 여과한 배양 상청을, 150 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.4)으로 평형화 한 Q-Sepharose(GE 헬스케어 바이오사이언스사) 컬럼(직경 44 ㎝, 높이 26.3 ㎝)에 제공했다. 다음으로 6 컬럼 용적의 180 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 아세트산 완충액으로 세정하고, 또한 8 컬럼 용적의 180 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.4)으로 세정하고, 300 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.4)으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 ㎚의 피크 상승부터의 0.5 컬럼 볼륨 용량의 용출액을 조(粗)정제품으로서 취득했다. 유속은 760 ㎖/분으로 실시했다.

(실시예 2) 모노클로날 항체에 의한 정제

일본 특허 공개 평 11-341990호 공보에 따라서, 인간 폐 유래 트롬보모듈린을 항원으로 한 항트롬보모듈린 모노클로날 항체를 제작하고, CNBr-activated Sepharose 4FastFlow(GE 헬스케어 바이오사이언스사)와 접촉 반응시키고, 항트롬보모듈린 모노클로날을 커플링하여, 항트롬보모듈린 모노클로날 결합 Sepharose 4FastFlow를 제작했다. 실시예 1에서 얻어진 용출 분획 중 16.5 ℓ를, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 모노클로날 항체 컬럼(직경 44 ㎝, 높이 10.5 ㎝)에 제공했다. 6 컬럼 용적의 1.0 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)을 흐르게 하고, 또한 3 컬럼 용적의 0.1 M 아세트산 완충액(pH 5.0)을 흐르게 하여 세정하고, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.0)으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 ㎚의 피크 상승에서 하강까지의 용출액을 얻고, 용출액에 1/10 용출액 용적 용량의 0.5 M 인산 완충액(pH 7.3)을 첨가하여 정제액으로서 취득했다. 유속은 760 ㎖/분으로 실시 했다.

(실시예 3) 강양이온 교환체 컬럼에 의한 정제

실시예 2에서 얻어진 정제액 중 193 ㎖를 1.0 M 글리신염산 완충액(pH 2.0)으로 pH 3.5로 조제한 액을, 0.3 M NaCl을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.5)으로 평형화한 SP-SepharoseFF(GE 헬스케어 바이오사이언스사) 컬럼(직경 16 ㎜, 높이 12㎝)에 제공했다. 300 mM NaCl을 포함하는 100 mM 글리신염산 완충액(pH 3.5)으로 세정을 시작하여, 흡광도 280 ㎚의 피크 상승부터 하강까지의 통과 분획을 얻고, 즉시 0.5 M 인산 완충액(pH 7.3)으로 pH 7로 중화하여, 고순도 정제품으로서 취득했다. 유속은 3.3 ㎖/분으로 실시했다. 그 고순도 정제품의 가용성 트롬보모듈린의 함유율은, 상기 Asahipak C4P-50을 사용한 크로마토그래피 또는 일본 특허 공개 평 11-341990호 공보에 기재된 ELISA법 등에 의해, 99% 이상인 것을 알 수 있다.

(실시예 4) 음이온 교환체 선형 구배 용출에 의한 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 분리 (1)

실시예 3에서 얻어진 고순도 정제품 중 10 ㎖를 정제수 30 ㎖로 희석했다. 희석한 용액 40 ㎖를 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 6)으로 평형화한 sourrceQ30(GE 헬스케어 바이오사이언스사) 컬럼(직경 0.5 ㎝, 높이 9.8 ㎝)에 제공했다. 3 컬럼 용적의 20 mM 인산 완충액(pH 6)으로 세정하고, 20 mM 인산 완충액(pH 6)의 0.1 M∼0.3 M 염화나트륨의 선형 구배, 용출 용적 20 컬럼 용적으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 ㎚의 피크 상승부터 1 컬럼 용적을 단 위로 분획했다. 샘플의 로드 및 세정시의 유속은 2.2 ㎖/분, 용출시의 유속은 0.3 ㎖/분으로 실시했다. 크로마토그램을 도 1에 나타냈다.

(실시예 5) 음이온 교환체 선형 구배 용출에 의한 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 분리 (2)

실시예 3에서 얻어진 고순도 정제품 중 10 ㎖를 정제수 30 ㎖로 희석했다. 희석한 용액 40 ㎖를, 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7)으로 평형화한 sourrceQ30(GE 헬스케어 바이오사이언스사) 컬럼(직경 0.5 ㎝, 높이 9.8 ㎝)에 제공했다. 3 컬럼 용적의 20 mM 인산 완충액(pH 7)으로 세정하고, 20 mM 인산 완충액(pH 7)의 0.1 M∼0.3 M 염화나트륨의 선형 구배, 용출 용적 20 컬럼 용적으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 ㎚의 피크 상승부터 1 컬럼 용적을 단위로 분획했다. 샘플의 로드 및 세정시의 유속은 2.2 ㎖/분, 용출시의 유속은 0.3 ㎖/분으로 실시했다. 크로마토그램을 도 2에 나타냈다.

(실시예 6) 음이온 교환체 선형 구배 용출에 의한 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 분리 (3)

실시예 3에서 얻어진 고순도 정제품 중 10 ㎖를 정제수 30 ㎖로 희석했다. 희석한 용액 40 ㎖를, 0.1 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스 완충액(pH 8)으로 평형화한 sourrceQ30(GE 헬스케어 바이오사이언스사) 컬럼(직경 0.5 ㎝, 높이 9.8 ㎝)에 제공했다. 3 컬럼 용적의 20 mM 트리스 완충액(pH 8)으로 세정하고, 20 mM 트리스 완충액(pH 8)의 0.1 M∼0.3 M 염화나트륨의 선형 구배, 용출 용적 20 컬럼 용적으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 ㎚의 피크 상승부터 1 컬럼 용 적을 단위로 분획했다. 샘플의 로드 및 세정시의 유속은 2.2 ㎖/분, 용출시의 유속은 0.3 ㎖/분으로 실시했다. 크로마토그램을 도 3에 나타냈다.

(실시예 7) 실시예 4∼6의 가용성 트롬보모듈린의 변성체 함량 평가

TSKgelG3000SWXL(7.8㎜I.D.×30㎝; TOSOH사) 분석용 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여, 각 분획의 가용성 트롬보모듈린의 변성체 함량을 평가했다. 컬럼은 이동상으로 평형화하고, 이동상은 0.1 M 황산나트륨을 포함하는 50 mM 인산염 완충액 pH 7.3을 사용하고, 유속 0.9 ㎖/분, 각 분획 150 ㎕을 제공하여 분석했다. 또, 각 분획의 회수는 280 ㎚에서의 흡광도를 측정함으로써 산출했다. 실시예 4에서 실시예 6까지의 결과를 하기 표 1에 나타냈다. 또, 실시예 3에서 취득한 고순도 정제품에 대해서도, 상기 방법으로 가용성 트롬보모듈린의 변성체 함량을 측정한 결과 7.0%였다(도 4). 실시예 4∼실시예 6의 조건 모두에서, 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 함유하지 않는 고순도 가용성 트롬보모듈린을 회수율 76%∼81%로 취득할 수 있었다.

[표 1]

(실시예 8) 음이온 교환체 단계형 구배 용출에 의한 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 분리

실시예 3에서 얻어진 고순도 정제품 중 70 ㎖를 정제수 210 ㎖로 희석했다. 희석한 용액을, 30 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 sourceQ30(GE 헬스케어 바이오사이언스사) 컬럼(직경 0.5 ㎝, 높이 20.5 ㎝)에 제공했다. 3 컬럼 용적의 30 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 세정하고, 0.18 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 ㎚의 피크 상승부터 6 컬럼 볼륨 용량까지의 용출액을 얻었다. TSKgelG3000SWXL(TOSOH사) 분석용 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여, 실시예 7의 조건으로 용출액의 가용성 트롬보모듈린의 변성체 함량을 평가한 결과, 가용성 트롬보모듈린의 변성체 함량 비율은 0.0%가 되고, 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 고순도 가용성 트롬보모듈린으로서 취득했다. 용출액의 회수율은 89%였다. 샘플의 로드 및 세정시의 유속은 0.8 ㎖/분, 용출시의 유속은 0.4 ㎖/분으로 실시했다. 크로마토그램을 도 5에 나타냈다.

(실시예 9) 인간 유래의 트롬보모듈린 유전자를 유전자 조작 기술에 의해, 조제 개변하여 조합한 차이니즈 햄스터 난소 세포의 무혈청 배양에 의한 가용성 트롬보모듈린 함유 배양 상청의 취득

가용성 트롬보모듈린 함유 배양 상청을 취득하기 위한 배양에서 사용한 동물 성분 불포함 무혈청 배지는, 시드용 배지와 관류 배양용 배지의 2 종류를 조제했다.

시드용 배지는 IS CHO-CD(액체 배지, 카타로그 번호 91119-1L, 메이커 Irvine Scientific) 1 L당, HT supplement(액체, 카타로그 번호 11067-030, 메이커 Invitrogen)를 5 ㎖, L-Glutamine 200 mM(액체, 카타로그 번호 25030-081, 메이커 Invitrogen)를 40 ㎖의 비율로 무균적으로 혼합하여 조제했다. 시드용 배지는, 보존시에는 냉장 보존(2∼8도)하고, 사용시에는 사용 직전에 36℃ 항온수욕조에서 가온하여 사용했다.

관류 배양용 배지는, 탈이온 한외 여과수 1 L당, IS CHO-CD-A3(분말 배지, 카타로그 번호 98688, 메이커 Irvine Scientific)을 20.8 g, 식염(특등급, 메이커 와코준야쿠)을 2.6 g, 중조 식염(특등급, 메이커 와코준야쿠)을 4.4 g의 비율로 첨가하여 용해한 후, 0.2 ㎛ 필터(PVDF제, 메이커 밀리포어)로 무균 여과하여 조제했다. 관류 배양용 배지는, 보존시, 사용시 모두 냉장 보존(2∼8도)으로 했다.

시드 배양 시작시에는, 동결 보존된 가용성 트롬보모듈린을 생성할 수 있는 세포(일본 특허 공개 평 11-341990호 공보)를 37도 항온수욕조에서 재빨리 융해하고, 시드용 배지에 현탁하고 원심 분리(2000 rpm, 2분, 코쿠산카가쿠)하여 원심 상청 제거후, 세포 팰릿을 시드용 배지 100 ㎖로 현탁하고, 225 ㎠ T 플라스크 배양 용기(메이커 BD Biosciences)에 나누어 넣어, 1단째의 시드 배양을 시작했다. 1단째 시드 배양은 36도 5% 탄산가스 인큐베이터내에서의 정치 배양으로 실시했다. 1단째 시드 배양의 부유 생세포 밀도가 약 8×10⁵ cells/㎖에 도달한 지점에서 2단째 시드 배양으로 계대했다.

2단째 시드 배양 이후에는 교반 배양으로 실시했다. 교반 배양에서의 시드 배양의 스케일 및 교반 배양 용기는, 2단째 시드 배양 : 400 ㎖(유리제 스피너 플라스크, 메이커 시바타카가쿠), 3단째 시드 배양 : 1.6 L(유리제 스피너 플라스크, 메이커 시바타카가쿠), 4단째 시드 배양 : 6 L(유리제 볼스피너 플라스크, 메이커 시바타카가쿠)로 순서대로 계대하여 배양액량을 확대했다. 시드 배양의 부유 생세포 밀도가 약 8×10⁵ cells/㎖에 도달한 지점에서 다음 단의 시드 배양으로 계대하였다. 계대에서는, 계대후의 배양 스케일에서 계대전의 배양 스케일을 뺀 값과 동일한 양의 시드 배양용 배지를 더하여 확대했다. 교반 배양은, 36도 5% 탄산가스 인큐베이터내에서, 마그네틱 스터러(메이커 시바타카가쿠)에 의해 교반수 60∼100 rpm의 조건으로 실시했다.

4단째 시드 배양의 부유 생세포 밀도가 약 8×10⁵ cells/㎖에 도달한 지점에서, 시드 배양액을 3대의 관류 배양조(2 L 관류 배양 장치, 메이커 마루비시바이오)에 각각 2 L씩 이송하여 관류 배양을 시작했다.

관류 배양에 있어서 관류 배양조에 공급하는 관류 배양용 배지의 정량 이송은, 페리스타틱 펌프(메이커 : 마스터플렉스)를 사용하여 2 L/일의 유량으로 행했다.

관류 배양에서의 세포 분리는, 관류 배양조내에 설치된 스핀 필터로 행했다. 3대의 관류 배양조의 스핀 필터는 각각 다른 것을 사용했다. 1대째는 스테인레스제 메쉬(FP-10, 구멍 직경 10 ㎛, 메이커 후지필터고교), 2대째는 스테인레스제 메쉬(FP-30, 구멍 직경 30 ㎛, 메이커 후지필터고교), 3대째는 폴리에스테르 PETP제 메쉬(구멍 직경 10 ㎛, 카타로그 번호 BB-8808571, 메이커 sartorius)의 스핀 필터를 사용했다.

관류 배양조내에 설치된 스핀 필터로 세포 분리된 배양 상청은, 관류 배양조내의 2 L 액면을 나타내는 레벨 센서의 동작에 의해, 배양액량이 2 L 이상이 된 경우, 배양조내 압력에 의해 간헐적으로 빼냈다. 간헐적으로 빼낸 배양 상청은, 냉장 보존된 용기내로 이송되어 2∼8도로 냉장 보존했다.

관류 배양 조건은, 조(槽)내 온도 35∼37℃, 용존 산소 농도 10%∼90%, pH 6.8∼7.6로 제어하여 배양했다.

관류 배양은 30일간 행하고, 그 동안의 평균 생세포 밀도는, 1대째 17×10⁶ cells/㎖, 2대째 10×10⁶ cells/㎖, 3대째 18×10⁶ cells/㎖였다.

3대의 관류 배양조에서 관류 배양 3일째부터 30일째까지 취득한 배양 상청을 혼합하여, 0.2 ㎛ 필터(PVDF제, 메이커 밀리포어)로 여과하고, 여과한 배양 상청으로서 냉장 보존(2∼8도)했다.

(실시예 10) 강음이온 교환체 컬럼에 의한 정제

실시예 9에 의해 취득한 배양액 상청 중 850 ㎖를, 30 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 아세트산나트륨, 120 mM 아세트산 완충액으로 평형화한 Q-SepharoseFF(GE 헬스케어 바이오사이언스사) 컬럼(직경 1.6 ㎝, 높이 29 ㎝)에 제공했다. 다음으로, 12 컬럼 용적의 30 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 아세트산나트륨, 120 mM 아세트산 완충액(pH 3.8)으로 세정하고, 140 mM 염화나트륨을 포함하 는 20 mM 아세트산나트륨, 40 mM 아세트산 완충액(pH 4.2)으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 ㎚의 메인피크 상승부터 2 컬럼 볼륨 용량의 용출액에 1/5 컬럼 볼륨 용량의 10 mM 인산칼륨을 포함하는 1 M HEPES 완충액(pH 8)을 첨가하여 정제품을 취득했다. 유속은 2 ㎖/분으로 실시했다.

(실시예 11) 히드록시아파타이트 단계형 구배 용출에 의한 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 분리

실시예 10에서 취득한 정제품 중 20 ㎖를, 0.17 M 염화나트륨, 2 mM 인산나트륨을 포함하는 20 mM HEPES 완충액(pH 7)으로 평형화한 Macro-Prep(R) Ceramic Hydroxyapatite TYPE1(BIO-RAD사) 컬럼(직경 0.5 ㎝, 높이 9.7 ㎝)에 제공했다. 6 컬럼 용적의 0.17 M 염화나트륨, 2 mM 인산나트륨을 포함하는 20 mM HEPES 완충액(pH 7)으로 세정하고, 10 mM 염화나트륨을 포함하는 8 mM 인산 완충액(pH 7), 용출 용적 4 컬럼 용적으로 용출하여, 용출액의 흡광도 280 ㎚의 피크 상승부터 하강까지의 용출액을 얻었다. 유속은 0.4 ㎖/분으로 실시했다. TSKgelG3000SWXL(TOSOH사) 분석용 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여, 실시예 7의 조건으로 용출액의 가용성 트롬보모듈린의 변성체 함량을 평가한 결과, 가용성 트롬보모듈린의 변성체 함량 비율은 0.8% 이하가 되었다. 컬럼은 0.5 M 인산 완충액(pH 7)으로 재생했다. 크로마토그램을 도 6에 나타냈다.

(실시예 12) 강음이온 교환체 컬럼에 의한 조(粗)정제 (2)

실시예 9에서 취득한 배양액 상청 5.2ℓ를, 150 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 평형화한 CaptoQ(GE 헬스케어 바이오사이언스 사) 컬럼(직경 1.6 ㎝, 높이 26 ㎝)에 제공했다. 다음으로, 15 컬럼 용적의 0.18 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 세정하고, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스염 완충액(pH 7.7)으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 ㎚의 피크 상승부터의 2 컬럼 볼륨 용량의 용출액을 조(粗)정제품으로서 취득했다. 유속은 10 ㎖/분으로 실시했다.

(실시예 13) 모노클로날 항체에 의한 정제 (2)

모노클로날 항체를 (특허문헌 2)에 따라 제작했다. 실시예 12에서 얻어진 용출 분획 중 72 ㎖를, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 모노클로날 항체 컬럼(직경5 ㎝, 높이 11㎝)에 제공했다. 6 컬럼 용적의 1.0 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)을 흐르게 하고, 또한 3 컬럼 용적의 0.1 M 아세트산 완충액(pH 5.0)을 흐르게 하여 세정하고, 20 mM 염화나트륨을 포함하는 0.1 M 글리신염산 완충액(pH 3.0)으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 ㎚의 피크 상승부터 하강까지의 용출액을 얻고, 용출액에 15% 용출액 용적 용량의 0.3 M 인산 완충액(pH 7.3)을 첨가하여 정제액으로서 취득했다. 유속은 9.8 ㎖/분으로 실시했다. 그 정제액의 가용성 트롬보모듈린의 함유율은, 상기 Asahipak C4P-50를 이용한 크로마토그래피 또는 일본 특허 공개 평 11-341990호 공보에 기재된 ELISA법 등에 의해, 99% 이상인 것을 알 수 있다.

(실시예 14) 강음이온 교환체에 의한 고순도화와 가용성 트롬보모듈린의 변성체의 제거

실시예 13에서 얻어진 정제액 중 75 ㎖를, 40 mM 염화나트륨을 포함하는 0.1 M 아세트산 완충액(pH 4)으로 평형화한 sourceQ30(GE 헬스케어 바이오사이언스사) 컬럼(직경 0.5 ㎝, 높이 20.5 ㎝)에 제공했다. 2 컬럼 용적의 40 mM 염화나트륨을 포함하는 0.1 M 아세트산 완충액(pH 4)을 흐르게 하고, 또한 4 컬럼 용적의 50 mM 염화나트륨을 포함하는 0.1 M 아세트산 완충액(pH 4)을 흐르게 하고, 그리고 3 컬럼 용적의 30 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 세정하고, 0.18 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 용출을 시작하여, 용출액의 흡광도 280 ㎚의 피크 상승부터 6 컬럼 용적까지의 용출액을 얻었다. 샘플을 로드할 때의 유속은 1 ㎖/분, 세정 및 용출시의 유속은 0.3 ㎖/분으로 실시했다. TSKgelG3000SWXL(TOSOH사) 분석용 사이즈 배제 크로마토그래피를 이용하여, 실시예 7의 조건으로 용출액의 가용성 트롬보모듈린의 변성체 함량을 평가한 결과, 가용성 트롬보모듈린의 변성체 함량 비율은 0.1%가 되어, 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 실질적으로 포함하지 않는 고순도 가용성 트롬보모듈린으로서 취득했다. 용출액의 회수율은 71%였다. 크로마토그램을 도 7에 나타냈다.

(실시예 15) 혼입 이종 단백질(마우스 항체 유래물 및 차이니즈 햄스터 난소 세포 세포 유래물)량의 평가

일본 특허 공개 평 11-341990호 공보에 기재된 ELISA 방법을 이용하여, 실시예 13∼14까지의 용출 분획에 관해 평가했다. 각 용출 분획의 280 ㎚에서의 흡광도를 측정하여, 1 흡광도당 혼입량으로 평가한 결과를 하기 표 2에 나타냈다. 각 성분의 혼입량을 동시에 줄일 수 있었다.

[표 2]

Claims

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가용성 트롬보모듈린으로부터 산성하에서 생성할 수 있는 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 3% 이하 함유하는 가용성 트롬보모듈린을 제조하는 방법으로서,

(0) 그 가용성 트롬보모듈린을 pH 5 이하의 산성하에 두는 공정,

(1) 상기 (0)의 공정을 거쳐 얻어진, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 포함하거나, 포함하는 것이 의심되는 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하는 공정, 및

(2) 그 가용성 트롬보모듈린과 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 분리할 수 있는 분리 조건으로 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 3% 이하 함유하는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 분획을 취득하는 공정을 포함하는 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 가용성 트롬보모듈린 함유물 중의 총단백에 대한 가용성 트롬보모듈린의 함유율이 80% 이상인 제조방법.
제2항에 있어서, (2)의 공정이, 선형 또는 단계형, 또는 선형과 단계형을 조합한 구배 용출을 행하여, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 3% 이하 함유하는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 취득하는 공정인 제조방법.
제2항에 있어서, (2)의 공정이, 통과 분획을 취득하는 공정으로, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 3% 이하 함유하는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 분획을 취득하는 공정인 제조방법.
제2항에 있어서, (2)의 공정이, 등용매 용출을 행하여, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 3% 이하 함유하는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 취득하는 공정인 제조방법.
제2항에 있어서, (1)의 공정이, pH가 4∼9의 완충액을 사용하여 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체에 제공하는 공정이며, (2)의 공정이, pH가 5∼9이고 염 농도가 0∼1 M인 완충액을 사용하여 선형 또는 단계형, 또는 선형과 단계형을 조합한 구배 용출을 행하고, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 3% 이하 함유하는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을, (a) 가용성 트롬보모듈린이 용출하는 분획의 위치를 미리 확인해 두고 취득하는 공정, 또는 (b) 용출 분획에 가용성 트롬보모듈린이 존재하는 것을 확인하면서 취득하는 공정인 제조방법.
제2항에 있어서, (1)의 공정이, pH가 5∼8이고 염 농도가 0.1∼0.2 M인 완충액을 사용하여 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체에 제공하는 공정이며, (2)의 공정이, pH가 5∼8이고 염 농도가 0.1∼0.2 M인 완충액을 사용하여 통과 분획을 취득함으로써 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 3% 이하 함유하는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 분획을 취득하는 공정인 제조방법.
제2항에 있어서, (1)의 공정이, pH가 6∼9이고 인산염 농도가 8 mM 이하인 완충액을 사용하여 가용성 트롬보모듈린 함유물을 히드록시아파타이트에 제공하는 공정이며, (2)의 공정이, pH가 6∼9이고 인산염 농도가 0∼0.5 M인 완충액을 사용하여 선형 또는 단계형, 또는 선형과 단계형을 조합한 구배 용출을 행하고, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 3% 이하 함유하는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을, (a) 가용성 트롬보모듈린이 용출하는 분획의 위치를 미리 확인해 두고 취득하는 공정, 또는 (b) 용출 분획에 가용성 트롬보모듈린이 존재하는 것을 확인하면서 취득하는 공정인 제조방법.
제2항에 있어서, (1)의 공정이, pH가 6∼9이고 인산염 농도가 5∼20 mM인 완충액을 사용하여 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 히드록시아파타이트에 제공하는 공정이며, (2)의 공정이, pH가 6∼9이고 인산염 농도가 5∼20 mM인 완충액을 사용하여 통과 분획을 취득함으로써 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 3% 이하 함유하는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 분획을 취득하는 공정인 제조방법.
제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 3% 이하 함유하는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 취득한 후에 그 분획의 pH를 4 초과로 유지하는 제조방법.
제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 3% 이하 함유하는 가용성 트롬보모듈린을 함유하는 용출 분획을 취득한 후에 그 분획의 pH를 4 초과로 유지하는 농축 공정, 탈염 공정, 또는 농축 공정 및 탈염 공정을 포함하며, 그 가용성 트롬보모듈린을 의약 원료로 하기 위한 제조방법.
제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 그 가용성 트롬보모듈린의 변성체를 1% 이하 함유하는 제조방법.
제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 그 가용성 트롬보모듈린이, 서열번호 9 또는 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 숙주 세포에 트랜스펙트하여 조제된 형질 전환 세포에서 취득되는 트롬보모듈린인 제조방법.
제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 그 가용성 트롬보모듈린이, 서열번호 9 또는 서열번호 11의 각각에서의 제19∼516위의 서열을 갖는 펩티드, 또는 상기 펩티드의 아미노산 서열 중 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드인 제조방법.
제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 트롬보모듈린 함유물 중의 총단백에 대한 가용성 트롬보모듈린의 함유율이 80% 이상인 제조방법.
제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 그 가용성 트롬보모듈린을 pH 5 이하의 산성하에 두는 공정이, 그 가용성 트롬보모듈린을 pH 4 이하의 산성하에 두는 공정인 제조방법.
제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하는 공정이, 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체에 제공하는 공정인 제조방법.
제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 음이온 교환체 또는 히드록시아파타이트에 제공하는 공정이, 그 가용성 트롬보모듈린 함유물을 히드록시아파타이트에 제공하는 공정인 제조방법.
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