JPH09110900A - トロンボモジュリンの精製方法 - Google Patents
トロンボモジュリンの精製方法Info
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- JPH09110900A JPH09110900A JP7300682A JP30068295A JPH09110900A JP H09110900 A JPH09110900 A JP H09110900A JP 7300682 A JP7300682 A JP 7300682A JP 30068295 A JP30068295 A JP 30068295A JP H09110900 A JPH09110900 A JP H09110900A
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- JP
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- thrombomodulin
- human urine
- hydroxyapatite
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- chromatography
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/7455—Thrombomodulin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
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- Inorganic Compounds Of Heavy Metals (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 人尿トロンボモジュリンの新しい精製法を提
供する。 【解決手段】 人尿トロンボモジュリンの精製にヒドロ
キシアパタイトを吸着剤とする吸着クロマトグラフィー
を用いることよりなる人尿トロンボモジュリンの精製方
法。 【効果】 簡単な操作で人尿トロンボモジュリンを精製
することができ、トロンボモジュリン含量の低い試料を
精製する場合でも含量の高い試料の場合に勝る精製倍率
で精製することができる。
供する。 【解決手段】 人尿トロンボモジュリンの精製にヒドロ
キシアパタイトを吸着剤とする吸着クロマトグラフィー
を用いることよりなる人尿トロンボモジュリンの精製方
法。 【効果】 簡単な操作で人尿トロンボモジュリンを精製
することができ、トロンボモジュリン含量の低い試料を
精製する場合でも含量の高い試料の場合に勝る精製倍率
で精製することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は人尿中のトロンボモジュ
リンを濃縮、精製する方法に関する。トロンボモジュリ
ンは抗血液凝固物質であり、血液凝固能異常に関わる疾
患の予防及び治療剤として期待されている。
リンを濃縮、精製する方法に関する。トロンボモジュリ
ンは抗血液凝固物質であり、血液凝固能異常に関わる疾
患の予防及び治療剤として期待されている。
【０００２】
【従来の技術】トロンボモジュリン（以下ＴＭと略称す
る）は血管内皮細胞上に存在する高親和性のトロンビン
受容体でプロテインＣの活性化を促進する蛋白としてエ
ヌ・エル・エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）らにより見
いだされた（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：８５９
−８６４，１９８２）。ＴＭはトロンビンと１：１で結
合し、Ｃａ2+の存在下でプロテインＣを活性化する一
方、ＴＭに結合したトロンビンはフィブリノゲン凝固作
用、血小板活性化などほとんどすべての凝固活性を失
う。またＴＭは内因性ヘパリン作用を示し、アンチトロ
ンビンIII によるトロンビン抑制を促進することも知ら
れており、新しいタイプの薬剤として臨床応用が期待さ
れている。
る）は血管内皮細胞上に存在する高親和性のトロンビン
受容体でプロテインＣの活性化を促進する蛋白としてエ
ヌ・エル・エスモン（Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）らにより見
いだされた（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：８５９
−８６４，１９８２）。ＴＭはトロンビンと１：１で結
合し、Ｃａ2+の存在下でプロテインＣを活性化する一
方、ＴＭに結合したトロンビンはフィブリノゲン凝固作
用、血小板活性化などほとんどすべての凝固活性を失
う。またＴＭは内因性ヘパリン作用を示し、アンチトロ
ンビンIII によるトロンビン抑制を促進することも知ら
れており、新しいタイプの薬剤として臨床応用が期待さ
れている。
【０００３】ヒトＴＭは当初エッチ・エッチ・サレム
（Ｈ．Ｈ．Ｓａｌｅｍ）らによって人胎盤から精製され
たが（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１２２４６−
１２２５１，１９８４）、大量にＴＭを得る際の材料と
しては不適切であった。またヒトＴＭの遺伝子構造も鈴
木らによって明らかにされたが（ＥＭＢＯ Ｊ．６：１
８９１−１８９７，１９８７）、ＴＭは多くの糖鎖を含
んでいるため遺伝子工学的手法により天然型と全く同じ
糖鎖を有するものを合成するのは難しい。その後、山本
ら（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：４３３−４４０，１
９９３）やディ・イ・ジャクソン（Ｄ．Ｅ．Ｊａｃｋｓ
ｏｎ）ら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２１：１０
７９−１０８７，１９９４) により人尿中ＴＭが精製さ
れ、天然型ＴＭの精製原料として人尿が適していること
が示された。尿からの精製法については山本らはＱＡＥ
セファデックス、抗ＴＭモノクロナール抗体カラム、ト
ロンビンをリガンドとしたアフィニティーカラム、セフ
ァデックスＧ−２００を用いて精製ＴＭを得ているが、
この方法にはモノクロナール抗体の調製が必要で、煩雑
である。また、ディ・イ・ジャクソン（Ｄ．Ｅ．Ｊａｃ
ｋｓｏｎ）らはＤＥＡＥセファロース、トロンビンをリ
ガンドとしたアフィニティーカラム、逆相ＨＰＬＣによ
って精製しているが、逆相ＨＰＬＣでの収率が極めて悪
い点、ＨＰＬＣを用いているので大量精製には不向きで
あるという問題点がある。さらに青木ら（特開６３−３
０４２３）や国広ら（特開０３−２１８３９９）は新鮮
尿からイオン交換クロマトグラフィー、トロンビン結合
アフィニティーカラム、ゲルろ過によりＴＭを精製した
と報告している。しかしながら本発明者らの経験では尿
中に含まれるＴＭ量は必ずしも一定しておらず、特に尿
中含量が低い場合にはこの方法では不十分であることが
多い。従ってこのような場合に簡便で且つ有効な精製手
段の開発が望まれる。
（Ｈ．Ｈ．Ｓａｌｅｍ）らによって人胎盤から精製され
たが（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１２２４６−
１２２５１，１９８４）、大量にＴＭを得る際の材料と
しては不適切であった。またヒトＴＭの遺伝子構造も鈴
木らによって明らかにされたが（ＥＭＢＯ Ｊ．６：１
８９１−１８９７，１９８７）、ＴＭは多くの糖鎖を含
んでいるため遺伝子工学的手法により天然型と全く同じ
糖鎖を有するものを合成するのは難しい。その後、山本
ら（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：４３３−４４０，１
９９３）やディ・イ・ジャクソン（Ｄ．Ｅ．Ｊａｃｋｓ
ｏｎ）ら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２１：１０
７９−１０８７，１９９４) により人尿中ＴＭが精製さ
れ、天然型ＴＭの精製原料として人尿が適していること
が示された。尿からの精製法については山本らはＱＡＥ
セファデックス、抗ＴＭモノクロナール抗体カラム、ト
ロンビンをリガンドとしたアフィニティーカラム、セフ
ァデックスＧ−２００を用いて精製ＴＭを得ているが、
この方法にはモノクロナール抗体の調製が必要で、煩雑
である。また、ディ・イ・ジャクソン（Ｄ．Ｅ．Ｊａｃ
ｋｓｏｎ）らはＤＥＡＥセファロース、トロンビンをリ
ガンドとしたアフィニティーカラム、逆相ＨＰＬＣによ
って精製しているが、逆相ＨＰＬＣでの収率が極めて悪
い点、ＨＰＬＣを用いているので大量精製には不向きで
あるという問題点がある。さらに青木ら（特開６３−３
０４２３）や国広ら（特開０３−２１８３９９）は新鮮
尿からイオン交換クロマトグラフィー、トロンビン結合
アフィニティーカラム、ゲルろ過によりＴＭを精製した
と報告している。しかしながら本発明者らの経験では尿
中に含まれるＴＭ量は必ずしも一定しておらず、特に尿
中含量が低い場合にはこの方法では不十分であることが
多い。従ってこのような場合に簡便で且つ有効な精製手
段の開発が望まれる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者らは
尿中のＴＭ含量に関わらず純度の高いＴＭを得るための
精製手段について検討することにした。
尿中のＴＭ含量に関わらず純度の高いＴＭを得るための
精製手段について検討することにした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこの課題を
解決するために研究を重ねた結果、ヒドロキシアパタイ
トを吸着剤とする吸着クロマトグラフィーがトロンボモ
ジュリンの精製に極めて有効であることを見いだし、本
発明を確立するに至った。
解決するために研究を重ねた結果、ヒドロキシアパタイ
トを吸着剤とする吸着クロマトグラフィーがトロンボモ
ジュリンの精製に極めて有効であることを見いだし、本
発明を確立するに至った。
【０００６】本発明は、人尿トロンボモジュリンの精製
にヒドロキシアパタイトを吸着剤とする吸着クロマトグ
ラフィーを用いることを特徴とする人尿トロンボモジュ
リンの精製方法である。本発明の方法の原料である人尿
トロンボモジュリン含有試料としては原尿または硫安分
画等により濃縮したものが用いられるが、種類としては
特に限定はされないが、できれば陰イオン交換クロマト
グラフィー、トロンビン結合アフィニティークロマトグ
ラフィーなどで予備精製したものが好ましい。
にヒドロキシアパタイトを吸着剤とする吸着クロマトグ
ラフィーを用いることを特徴とする人尿トロンボモジュ
リンの精製方法である。本発明の方法の原料である人尿
トロンボモジュリン含有試料としては原尿または硫安分
画等により濃縮したものが用いられるが、種類としては
特に限定はされないが、できれば陰イオン交換クロマト
グラフィー、トロンビン結合アフィニティークロマトグ
ラフィーなどで予備精製したものが好ましい。
【０００７】ヒドロキシアパタイトは、市販品（生化学
工業（株）製、和光純薬（株）製など）を用いることが
できる。
工業（株）製、和光純薬（株）製など）を用いることが
できる。
【０００８】また試料量が少ない場合には分取用あるい
は分析用ＨＰＬＣカラム、例えばＴＳＫｇｅｌ ＨＡ−
１０００（東ソー（株））、ＫＢＣ系カラム（高研）な
どが使用可能である。
は分析用ＨＰＬＣカラム、例えばＴＳＫｇｅｌ ＨＡ−
１０００（東ソー（株））、ＫＢＣ系カラム（高研）な
どが使用可能である。
【０００９】ヒドロキシアパタイトをカラムに詰めた
後、ｐＨ５−８好ましくはｐＨ６−７に調整した１−３
０ｍＭ好ましくは５−１０ｍＭのリン酸系緩衝液でカラ
ムを平衡化する。この時使用する平衡化液には塩化カル
シウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシ
ウムなどの塩類を添加した方が効果的である。特に好ま
しくは１ｍＭ以下の塩化カルシウムを用いるのがよい。
後、ｐＨ５−８好ましくはｐＨ６−７に調整した１−３
０ｍＭ好ましくは５−１０ｍＭのリン酸系緩衝液でカラ
ムを平衡化する。この時使用する平衡化液には塩化カル
シウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシ
ウムなどの塩類を添加した方が効果的である。特に好ま
しくは１ｍＭ以下の塩化カルシウムを用いるのがよい。
【００１０】次に同緩衝液に置換した試料をカラムにア
プライした後、同緩衝液で十分に洗浄する。２８０ｎｍ
における吸収が十分低下した後、リン酸の直線濃度勾配
で溶出する。ＴＭの精製には５から３００ｍＭ程度の濃
度勾配が適当であるが、ＴＭは一番最初に溶出され（リ
ン酸濃度が５０−１００ｍＭ程度）、引き続いて不純物
が溶出されてくる。なおオープンカラムを用いる場合に
はカラムの形状を細長くした方が良好な分離が得られ
る。本工程終了時でまだ不純物が検出される場合にはゲ
ルろ過などで最終精製を行うことができるが、本発明の
ヒドロキシアパタイトを用いる吸着クロマトグラフィー
では比活性の低い試料をかけた時も精製後には比活性の
高い試料をかけた時と同等の純度のものが得られるのが
特長である。
プライした後、同緩衝液で十分に洗浄する。２８０ｎｍ
における吸収が十分低下した後、リン酸の直線濃度勾配
で溶出する。ＴＭの精製には５から３００ｍＭ程度の濃
度勾配が適当であるが、ＴＭは一番最初に溶出され（リ
ン酸濃度が５０−１００ｍＭ程度）、引き続いて不純物
が溶出されてくる。なおオープンカラムを用いる場合に
はカラムの形状を細長くした方が良好な分離が得られ
る。本工程終了時でまだ不純物が検出される場合にはゲ
ルろ過などで最終精製を行うことができるが、本発明の
ヒドロキシアパタイトを用いる吸着クロマトグラフィー
では比活性の低い試料をかけた時も精製後には比活性の
高い試料をかけた時と同等の純度のものが得られるのが
特長である。
【００１１】本発明の方法はたとえば、イオン交換クロ
マトグラフィー、トロンビン結合アフィニティークロマ
トグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの他の
クロマトグラフィーと組み合わせて人尿トロンボモジュ
リンの精製に用いることができる。
マトグラフィー、トロンビン結合アフィニティークロマ
トグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの他の
クロマトグラフィーと組み合わせて人尿トロンボモジュ
リンの精製に用いることができる。
【００１２】なお、各精製工程におけるＴＭの活性測定
は以下の方法で行うことができる。緩衝液Ａ（０．１Ｍ
塩化ナトリウム、３．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））３０μｌ、ヒト
プロテインＣ溶液（緩衝液Ｂ（緩衝液Ａに０．１％ Ｂ
ＳＡを溶かした液）で１００μｇ／ｍｌに調製した液）
１０μｌ、試料及び標準試料１０μｌを混合後、ヒトト
ロンビン溶液（緩衝液Ｂで４Ｕ／ｍｌに調製した液）５
０μｌを添加し、３７℃で３０分間インキュベートす
る。その後、ヒトアンチトロンビンIII 溶液（緩衝液Ｃ
（０．１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化カルシウムを含
む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））で５０μ
ｇ／ｍｌに調製した液）１５０μｌ、ヘパリン溶液（緩
衝液Ｃで２Ｕ／ｍｌに調製した液）５０μｌを添加し、
３７℃で１５分間インキュベートする。基質溶液（テス
トチームＳ−２３６６（第一化学（株））２５ｍｇを２
３．１９ｍｌの緩衝液Ｃに溶解した液）６００μｌを添
加し、３７℃で２０分間インキュベート後、５０％酢酸
溶液１００μｌを加えて反応を停止させる。４０５ｎｍ
における吸収を測定し、標準試料の値から試料中のＴＭ
含量を算出する。（標準試料としてはウサギ肺由来ＴＭ
を緩衝液Ｂで２，５，１０，２０，４０ｍＵ／ｍｌに希
釈したものを使用。）
は以下の方法で行うことができる。緩衝液Ａ（０．１Ｍ
塩化ナトリウム、３．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））３０μｌ、ヒト
プロテインＣ溶液（緩衝液Ｂ（緩衝液Ａに０．１％ Ｂ
ＳＡを溶かした液）で１００μｇ／ｍｌに調製した液）
１０μｌ、試料及び標準試料１０μｌを混合後、ヒトト
ロンビン溶液（緩衝液Ｂで４Ｕ／ｍｌに調製した液）５
０μｌを添加し、３７℃で３０分間インキュベートす
る。その後、ヒトアンチトロンビンIII 溶液（緩衝液Ｃ
（０．１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化カルシウムを含
む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））で５０μ
ｇ／ｍｌに調製した液）１５０μｌ、ヘパリン溶液（緩
衝液Ｃで２Ｕ／ｍｌに調製した液）５０μｌを添加し、
３７℃で１５分間インキュベートする。基質溶液（テス
トチームＳ−２３６６（第一化学（株））２５ｍｇを２
３．１９ｍｌの緩衝液Ｃに溶解した液）６００μｌを添
加し、３７℃で２０分間インキュベート後、５０％酢酸
溶液１００μｌを加えて反応を停止させる。４０５ｎｍ
における吸収を測定し、標準試料の値から試料中のＴＭ
含量を算出する。（標準試料としてはウサギ肺由来ＴＭ
を緩衝液Ｂで２，５，１０，２０，４０ｍＵ／ｍｌに希
釈したものを使用。）
【００１３】
【実施例】次に本発明の方法について実施例により具体
的に示すが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。
的に示すが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。
【００１４】（実施例１）以下に異なる２ロットの人尿
各２０００Ｌから精製した結果について示した。新鮮な
人尿２０００ＬをｐＨ５．５とした後、吸着体としてキ
トサン０．５％（ｗ／ｖ）を加えて攪はんした。ｐＨを
５．５に３０分間保った後、ろ過し、水洗浄後５％硫酸
アンモニウム溶液（ｐＨ１０．５）に懸濁して室温で１
時間攪はんした。その後ろ過洗浄して吸着成分を溶出し
た後、６０％硫安分画を行い、沈澱部分を回収した。得
られた沈澱を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
に溶解後、同緩衝液に透析し、あらかじめ同緩衝液で平
衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（樹脂量
１．２Ｌ，１１．５×１１ｃｍ）（東ソー（株））にア
プライした。カラムを同緩衝液で洗浄後、０．３Ｍ塩化
ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。この溶出画分を
プールし、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で
３倍希釈後、最終濃度が５ｍＭとなるように塩化カルシ
ウムを添加した。次にあらかじめ０．１Ｍ塩化ナトリウ
ム、５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＩＰ−トロンビン結
合セファロースカラム（樹脂量４０ｍｌ，２．５×８ｃ
ｍ）にアプライし、同緩衝液で洗浄後、２Ｍ塩化ナトリ
ウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。溶出画分を０．４ｍＭ
塩化カルシウム、０．９％塩化ナトリウムを含む５ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に透析後、あら
かじめ同緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラ
ム（樹脂量２０ｍｌ，１．０ｃｍ×２５ｃｍ）（生化学
工業（株））にアプライした。同緩衝液で洗浄後、５か
ら３００ｍＭのリン酸ナトリウム直線濃度勾配で溶出し
たところ、図１（Ｌｏｔ．１）及び図２（Ｌｏｔ．２）
に示すようにＴＭ活性は最初に鋭いピークとして溶出さ
れ、それに続いて不純物が溶出されてきた。この活性画
分を濃縮後、あらかじめ０．９％塩化ナトリウムを含む
２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡
化したセファクリルＳ−３００カラム（樹脂量８０ｍ
ｌ，１．５ｃｍ×９０ｃｍ）（ファルマシア）にアプラ
イし、同緩衝液で溶出した。２回の精製結果を表１に示
したが、ヒドロキシアパタイトカラムにかける前の比活
性が低い試料でも精製後には十分高い比活性のものが得
られた。また最終精製試料の還元、非還元条件下のＳＤ
Ｓポリアクリルアミド電気泳動の結果を図３に示した
が、いずれのロットにおいてもＴＭに特徴的な近接する
２本のバンド（還元条件下で分子量７万付近）が認めら
れた。
各２０００Ｌから精製した結果について示した。新鮮な
人尿２０００ＬをｐＨ５．５とした後、吸着体としてキ
トサン０．５％（ｗ／ｖ）を加えて攪はんした。ｐＨを
５．５に３０分間保った後、ろ過し、水洗浄後５％硫酸
アンモニウム溶液（ｐＨ１０．５）に懸濁して室温で１
時間攪はんした。その後ろ過洗浄して吸着成分を溶出し
た後、６０％硫安分画を行い、沈澱部分を回収した。得
られた沈澱を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
に溶解後、同緩衝液に透析し、あらかじめ同緩衝液で平
衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（樹脂量
１．２Ｌ，１１．５×１１ｃｍ）（東ソー（株））にア
プライした。カラムを同緩衝液で洗浄後、０．３Ｍ塩化
ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。この溶出画分を
プールし、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で
３倍希釈後、最終濃度が５ｍＭとなるように塩化カルシ
ウムを添加した。次にあらかじめ０．１Ｍ塩化ナトリウ
ム、５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＩＰ−トロンビン結
合セファロースカラム（樹脂量４０ｍｌ，２．５×８ｃ
ｍ）にアプライし、同緩衝液で洗浄後、２Ｍ塩化ナトリ
ウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。溶出画分を０．４ｍＭ
塩化カルシウム、０．９％塩化ナトリウムを含む５ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に透析後、あら
かじめ同緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラ
ム（樹脂量２０ｍｌ，１．０ｃｍ×２５ｃｍ）（生化学
工業（株））にアプライした。同緩衝液で洗浄後、５か
ら３００ｍＭのリン酸ナトリウム直線濃度勾配で溶出し
たところ、図１（Ｌｏｔ．１）及び図２（Ｌｏｔ．２）
に示すようにＴＭ活性は最初に鋭いピークとして溶出さ
れ、それに続いて不純物が溶出されてきた。この活性画
分を濃縮後、あらかじめ０．９％塩化ナトリウムを含む
２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡
化したセファクリルＳ−３００カラム（樹脂量８０ｍ
ｌ，１．５ｃｍ×９０ｃｍ）（ファルマシア）にアプラ
イし、同緩衝液で溶出した。２回の精製結果を表１に示
したが、ヒドロキシアパタイトカラムにかける前の比活
性が低い試料でも精製後には十分高い比活性のものが得
られた。また最終精製試料の還元、非還元条件下のＳＤ
Ｓポリアクリルアミド電気泳動の結果を図３に示した
が、いずれのロットにおいてもＴＭに特徴的な近接する
２本のバンド（還元条件下で分子量７万付近）が認めら
れた。
【００１５】
【表１】 ─────────────────────────────────── 総活性 収率 比活性 精製倍率 （Ｕ） （％） （Ｕ／ｍｇ） （倍） ─────────────────────────────────── ヒドロキシアパタイト ５５５６ １００ ４４６．３ １．０ クロマト前（Ｌｏｔ．１） ヒドロキシアパタイト ４４８３ ８１ １３０６．９ ２．９ クロマト後（Ｌｏｔ．１） ─────────────────────────────────── ヒドロキシアパタイト ３０７１ １００ ２８．７ １．０ クロマト前（Ｌｏｔ．２） ヒドロキシアパタイト ２５６５ ８４ ６７４．６ ２３．５ クロマト後（Ｌｏｔ．２） ───────────────────────────────────
【００１６】（実施例２）次に精製された試料が確かに
ＴＭであることを確認するためにアミノ酸組成及びＮ末
端アミノ酸配列について調べた。なおアミノ酸組成は６
Ｎ塩酸加水分解後、アミノ酸分析装置（ベックマン社
製）により分析し、Ｎ末端アミノ酸配列はプロテインシ
ークエンサー４７３Ａ（アプライドバイオシステム社
製）にて分析した。アミノ酸分析の結果を表２に、Ｎ末
端アミノ酸配列を下に示したが、いずれも既報の結果と
良く一致し、精製品が確かにヒトＴＭであることが確認
された。 Ｎ末端アミノ酸配列：Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｎ−
ＴＭであることを確認するためにアミノ酸組成及びＮ末
端アミノ酸配列について調べた。なおアミノ酸組成は６
Ｎ塩酸加水分解後、アミノ酸分析装置（ベックマン社
製）により分析し、Ｎ末端アミノ酸配列はプロテインシ
ークエンサー４７３Ａ（アプライドバイオシステム社
製）にて分析した。アミノ酸分析の結果を表２に、Ｎ末
端アミノ酸配列を下に示したが、いずれも既報の結果と
良く一致し、精製品が確かにヒトＴＭであることが確認
された。 Ｎ末端アミノ酸配列：Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｎ−
【００１７】
【表２】 Ｎ．Ｄ．：検出されず Ｒｅｆ．：ＴＭのＡｌａ １−Ａｓｐ ４６８部分のア
ミノ酸配列から計算した値 （Ａｓｘ：Ａｓｐ＋Ａｓｎ，Ｇｌｘ：Ｇｌｕ＋Ｇｌｎ）
ミノ酸配列から計算した値 （Ａｓｘ：Ａｓｐ＋Ａｓｎ，Ｇｌｘ：Ｇｌｕ＋Ｇｌｎ）
【００１８】
【発明の効果】本発明によれば、操作容易な吸着クロマ
トグラフィーによって人尿トロンボモジュリンを高倍率
で濃縮精製することができるばかりでなく、トロンボモ
ジュリン比活性の低い試料でも比活性の高い試料を用い
る場合に勝る精製倍率で精製することができる。
トグラフィーによって人尿トロンボモジュリンを高倍率
で濃縮精製することができるばかりでなく、トロンボモ
ジュリン比活性の低い試料でも比活性の高い試料を用い
る場合に勝る精製倍率で精製することができる。
【図１】実施例１において、ヒドロキシアパタイトカラ
ムに人尿トロンボモジュリン含有試料（Ｌｏｔ．１）を
吸着後リン酸ナトリウム直線濃度勾配で溶出したときの
トロンボモジュリンの溶出パターンを示す。
ムに人尿トロンボモジュリン含有試料（Ｌｏｔ．１）を
吸着後リン酸ナトリウム直線濃度勾配で溶出したときの
トロンボモジュリンの溶出パターンを示す。
【図２】実施例１において、図１の場合と同様に試料
（Ｌｏｔ．２）について行ったトロンボモジュリンの溶
出パターンを示す。
（Ｌｏｔ．２）について行ったトロンボモジュリンの溶
出パターンを示す。
【図３】実施例１において、得られた人尿トロンボモジ
ュリン精製物の還元および非還元条件下のＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動の結果を示す写真である。
ュリン精製物の還元および非還元条件下のＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動の結果を示す写真である。
Claims (5)
- 【請求項１】 人尿トロンボモジュリンの精製にヒドロ
キシアパタイトを吸着剤とする吸着クロマトグラフィー
を用いることを特徴とする人尿トロンボモジュリンの精
製方法。 - 【請求項２】 人尿トロンボモジュリン含有試料の溶液
をヒドロキシアパタイトを充填したカラムにかけてトロ
ンボモジュリンを吸着させ、次いでヒドロキシアパタイ
トからトロンボモジュリンを脱着することを特徴とする
トロンボモジュリンの精製方法。 - 【請求項３】 トロンボモジュリン含有試料が人尿の原
液もしくはその硫安分画による濃縮物、または陰イオン
交換クロマトグラフィーもしくはトロンビン結合アフィ
ニティークロマトグラフィーで予備精製したものである
請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 吸着をｐＨ５−８で行い、脱着をリン酸
の濃度勾配で行う請求項２記載の方法。 - 【請求項５】 イオン交換クロマトグラフィー、トロン
ビン結合アフィニティークロマトグラフィー、およびゲ
ルろ過クロマトグラフィーの一つ以上と組み合わせて行
う請求項１または２記載の方法。
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- 1996-10-24 DE DE69620539T patent/DE69620539T2/de not_active Expired - Fee Related
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