JP2003518513A - 血漿プロテアーゼからのフィブリノゲンの分離 - Google Patents
血漿プロテアーゼからのフィブリノゲンの分離Info
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/75—Fibrinogen
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Abstract
(57)【要約】
フィブリノゲンを精製する方法であって、フィブリノゲンが抽出バッファーに可溶化されるように、画分Ｉ沈降物を抽出バッファーと混合することにより画分Ｉ沈降物からフィブリノゲンを抽出することを含み、ここで、前記抽出バッファーが少なくとも０．１Ｍの濃度で塩を含み、かつ、少なくとも１０ＩＵ／ｍｌの濃度でヘパリンを含む方法を提供する。また特に、イオン交換クロマトグラフィーを用いたフィブリノゲンの精製にも関する。
Description
【０００１】
本発明は、フィブリノゲンの精製方法に関する。ある態様では、本発明は、血
漿画分Ｉ沈降物(plasma fraction I precipitate)からのフィブリノゲンの分離
方法に関する。別の態様では、本発明は、イオン交換クロマトグラフィーを用い
たフィブリノゲンの精製に関する。
漿画分Ｉ沈降物(plasma fraction I precipitate)からのフィブリノゲンの分離
方法に関する。別の態様では、本発明は、イオン交換クロマトグラフィーを用い
たフィブリノゲンの精製に関する。
【０００２】
ヒトフィブリノゲンの単離は、古典的な血漿分画方法によって行われてきた。
フィブリノゲンは、エタノール（BlombackとBlomback, 1956）、硫酸アンモニウ
ム（Takeda, 1996）、βアラニン／グリシン（JakobsenとKieruif, 1976）、ポ
リマー（ポリエチレングリコール）、および低イオン強度溶液（Holm,1985）を
用いて、比較的高収量かつ均質に、血漿から沈降されている。
フィブリノゲンは、エタノール（BlombackとBlomback, 1956）、硫酸アンモニウ
ム（Takeda, 1996）、βアラニン／グリシン（JakobsenとKieruif, 1976）、ポ
リマー（ポリエチレングリコール）、および低イオン強度溶液（Holm,1985）を
用いて、比較的高収量かつ均質に、血漿から沈降されている。
【０００３】
フィブリノゲン沈降物のさらなる精製は、イオン交換クロマトグラフィー条件
（Stathakisら,1978）およびアフィニティークロマトグラフィー（Kuyasら,1990
）により行うことができる。特定の不純物、例えば、フィブロネクチンは固定さ
れたゼラチンで、プラスミノゲンは固定されたリシンで吸着排除することができ
る（Vuentoら,1979）。
（Stathakisら,1978）およびアフィニティークロマトグラフィー（Kuyasら,1990
）により行うことができる。特定の不純物、例えば、フィブロネクチンは固定さ
れたゼラチンで、プラスミノゲンは固定されたリシンで吸着排除することができ
る（Vuentoら,1979）。
【０００４】
沈降方法は、商用フィブリノゲンの製造に広く用いられている。クロマトグラ
フィー方法は、現在、代替法として、また、フィブリノゲン濃縮物の純度改善の
ために研究されている。
フィー方法は、現在、代替法として、また、フィブリノゲン濃縮物の純度改善の
ために研究されている。
【０００５】
WO99/37680は、ヒト血液血漿中の別の血液タンパクからフィブリノゲンを大規
模に分離する方法を記載している。この方法は、フィブリノゲン精製の出発物質
としてヘパリン沈降ペーストの使用を含む。ヘパリン沈降ペーストは、第VIII因
子（抗血友病因子、ＡＨＦ）の製造方法の副生成物である。
模に分離する方法を記載している。この方法は、フィブリノゲン精製の出発物質
としてヘパリン沈降ペーストの使用を含む。ヘパリン沈降ペーストは、第VIII因
子（抗血友病因子、ＡＨＦ）の製造方法の副生成物である。
【０００６】
プラスミノゲンを含まないフィブリノゲンを製造する試み、または、プラスミ
ノゲンそのものを精製する試みが、刊行物に広く公表されている。最も一般的な
方法は、リシンが、プラスミノゲン分子の二つの“クリングル”の一方に結合す
るという能力を利用するものである。アフィニティークロマトグラフィー工程の
利用は、1970年にDeutschとMertzにより公表された論文に最初に開示された。Ba
xter International Inc.は、この技術を利用している。この技術は、不安定化
レベルのプラスミノゲン産物を含まないフィブリノゲン濃縮物の大規模製造に関
する特許WO95/25748に開示されているように、フィブリノゲンからプラスミノゲ
ンを除去する工程にリシン−セファロース物質を使用することを含む。科学文献
に公表された他の技術は、リシンまたはε-アミノカプロン酸の結合を利用する
。しかしながら、これらは、プラスミノゲン分子の可溶性を変更するために用い
られる。希釈フィブリノゲン溶液にリシンを添加した後に、得られた溶液を７％
エタノールの存在下で沈降させる。プラスミノゲンの除去は、この工程を繰り返
して、９０％より高く、不純物の全体的除去をもたらす（Mosesson, 1962）。沈
降方法は、商用フィブリノゲンの製造に広く用いられているが、Mosesson(1962)
により公表された研究は、製造規模での実施にとって実際的なプロセスとは言え
ない、フィブリノゲンの希釈溶液を利用する。
ノゲンそのものを精製する試みが、刊行物に広く公表されている。最も一般的な
方法は、リシンが、プラスミノゲン分子の二つの“クリングル”の一方に結合す
るという能力を利用するものである。アフィニティークロマトグラフィー工程の
利用は、1970年にDeutschとMertzにより公表された論文に最初に開示された。Ba
xter International Inc.は、この技術を利用している。この技術は、不安定化
レベルのプラスミノゲン産物を含まないフィブリノゲン濃縮物の大規模製造に関
する特許WO95/25748に開示されているように、フィブリノゲンからプラスミノゲ
ンを除去する工程にリシン−セファロース物質を使用することを含む。科学文献
に公表された他の技術は、リシンまたはε-アミノカプロン酸の結合を利用する
。しかしながら、これらは、プラスミノゲン分子の可溶性を変更するために用い
られる。希釈フィブリノゲン溶液にリシンを添加した後に、得られた溶液を７％
エタノールの存在下で沈降させる。プラスミノゲンの除去は、この工程を繰り返
して、９０％より高く、不純物の全体的除去をもたらす（Mosesson, 1962）。沈
降方法は、商用フィブリノゲンの製造に広く用いられているが、Mosesson(1962)
により公表された研究は、製造規模での実施にとって実際的なプロセスとは言え
ない、フィブリノゲンの希釈溶液を利用する。
【０００７】
イオン交換クロマトグラフィーとε-アミノカプロン酸を使用してｐＨまたは
イオン強度に関わりなくプラスミノゲンを結合および溶出することは、クリング
ル含有タンパクの精製について記載したNovo Nordisk A/Sにより1994年に出願さ
れた特許（WO94/00483）に開示されている。この方法は、樹脂の選択としてＳ-
セファロースを選択する。また、ゲル濾過とイオン交換クロマトグラフィーとの
組合せも、プラスミノゲンを精製するために利用されている（Robbinsら,1965）
。
イオン強度に関わりなくプラスミノゲンを結合および溶出することは、クリング
ル含有タンパクの精製について記載したNovo Nordisk A/Sにより1994年に出願さ
れた特許（WO94/00483）に開示されている。この方法は、樹脂の選択としてＳ-
セファロースを選択する。また、ゲル濾過とイオン交換クロマトグラフィーとの
組合せも、プラスミノゲンを精製するために利用されている（Robbinsら,1965）
。
【０００８】
本願発明者らは、フィブリノゲンが、画分Ｉペースト(Fraction I paste)から
なる出発物質から精製された形態で回収されうることを見出した。この方法で回
収されたフィブリノゲンは、不安定化レベルのプラスミノゲンおよびその他のプ
ロテアーゼを含んでいない。また、この方法で回収されたフィブリノゲンは、フ
ィブリングルー(glue)の形成におけるフィブリンポリマーの架橋を増強するため
に必要とされる第XIII因子も含む。さらに、この方法で得られたフィブリノゲン
の収量は、ヘパリン沈降ペーストのような他の出発物質を用いる方法で得られる
量よりも予想外に高い。
なる出発物質から精製された形態で回収されうることを見出した。この方法で回
収されたフィブリノゲンは、不安定化レベルのプラスミノゲンおよびその他のプ
ロテアーゼを含んでいない。また、この方法で回収されたフィブリノゲンは、フ
ィブリングルー(glue)の形成におけるフィブリンポリマーの架橋を増強するため
に必要とされる第XIII因子も含む。さらに、この方法で得られたフィブリノゲン
の収量は、ヘパリン沈降ペーストのような他の出発物質を用いる方法で得られる
量よりも予想外に高い。
【０００９】
また本発明者等は、イオン交換カラムからフィブリノゲンを回収するための改
善された方法を開発した。これは、少なくとも一つのω-アミノ酸を、カラムに
添加されたフィブリノゲン含有物質に、あるいは、フィブリノゲンを溶出する前
にカラムを洗浄するために用いる溶液に、添加することを含む。
善された方法を開発した。これは、少なくとも一つのω-アミノ酸を、カラムに
添加されたフィブリノゲン含有物質に、あるいは、フィブリノゲンを溶出する前
にカラムを洗浄するために用いる溶液に、添加することを含む。
【００１０】
ここで、用語「画分Ｉ沈降物(Fraction I precipitate)」とは、解凍されてお
り、かつ、寒冷沈降物が遠心により除かれた凍結血漿を指す。次いで、得られた
寒冷上清(cryosupernatant)をエタノールと混合して、画分Ｉを沈降させる。
り、かつ、寒冷沈降物が遠心により除かれた凍結血漿を指す。次いで、得られた
寒冷上清(cryosupernatant)をエタノールと混合して、画分Ｉを沈降させる。
【００１１】
従って、第一の態様では、本発明は、フィブリノゲンを精製する方法を提供し
、この方法は、フィブリノゲンが抽出バッファーに可溶化されるように、画分Ｉ
沈降物と抽出バッファーとを混合することにより、画分Ｉ沈降物からフィブリノ
ゲンを抽出することを含む。ここで前記抽出バッファーは、少なくとも０．１Ｍ
の濃度で塩を、そして少なくとも１０ＩＵ／ｍｌの濃度でヘパリンを含む。
、この方法は、フィブリノゲンが抽出バッファーに可溶化されるように、画分Ｉ
沈降物と抽出バッファーとを混合することにより、画分Ｉ沈降物からフィブリノ
ゲンを抽出することを含む。ここで前記抽出バッファーは、少なくとも０．１Ｍ
の濃度で塩を、そして少なくとも１０ＩＵ／ｍｌの濃度でヘパリンを含む。
【００１２】
第一の態様の好ましい実施態様では、塩の濃度が、少なくとも０．２Ｍ、より
好ましくは少なくとも０．４Ｍ、さらに好ましくは約０．８Ｍである。
好ましくは少なくとも０．４Ｍ、さらに好ましくは約０．８Ｍである。
【００１３】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出バッファーは、塩化物、リン
酸塩および酢酸塩からなる群から選択される少なくとも一つの塩を含み、より好
ましくはＮａＣｌを含む。
酸塩および酢酸塩からなる群から選択される少なくとも一つの塩を含み、より好
ましくはＮａＣｌを含む。
【００１４】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出バッファーが、約２０ｍＭの
濃度でクエン酸三ナトリウム(Tri-sodium citrate)も含む。
濃度でクエン酸三ナトリウム(Tri-sodium citrate)も含む。
【００１５】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出バッファーが、少なくとも一
つのω-アミノ酸をさらに含む。好ましくは、少なくとも一つのω-アミノ酸が、
少なくとも５ｍＭの濃度で抽出バッファーに存在する。
つのω-アミノ酸をさらに含む。好ましくは、少なくとも一つのω-アミノ酸が、
少なくとも５ｍＭの濃度で抽出バッファーに存在する。
【００１６】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出バッファーが、少なくとも約
１ＩＵ／ｍｌの濃度でアンチトロンビンIII（ＡＴIII）を含む。
１ＩＵ／ｍｌの濃度でアンチトロンビンIII（ＡＴIII）を含む。
【００１７】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出バッファーが、約２０ｍＭの
濃度でクエン酸三ナトリウム、約０．８Ｍの濃度でＮａＣｌ、約６０ＩＵ／ｍｌ
の濃度でヘパリン、そして、約５ｍＭの濃度で少なくとも一つのω-アミノ酸を
含む。好ましくは、抽出バッファーは、約７．３のｐＨを有する。
濃度でクエン酸三ナトリウム、約０．８Ｍの濃度でＮａＣｌ、約６０ＩＵ／ｍｌ
の濃度でヘパリン、そして、約５ｍＭの濃度で少なくとも一つのω-アミノ酸を
含む。好ましくは、抽出バッファーは、約７．３のｐＨを有する。
【００１８】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、フィブリノゲンの抽出は約３７℃
で行われる。好ましくは、抽出は、少なくとも６０分間、さらに好ましくは少な
くとも９０分間行われる。
で行われる。好ましくは、抽出は、少なくとも６０分間、さらに好ましくは少な
くとも９０分間行われる。
【００１９】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出されたフィブリノゲン溶液を
水酸化アルミニウムとインキュベートし、遠心して沈降物を取り除く工程をさら
に含む。
水酸化アルミニウムとインキュベートし、遠心して沈降物を取り除く工程をさら
に含む。
【００２０】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、グリシン塩水（Ｇｌｙ／ＮａＣｌ
）バッファーの添加により、抽出されたフィブリノゲン溶液からフィブリノゲン
を沈降させる工程をさらに含む。好ましくは、Ｇｌｙ／ＮａＣｌバッファーは、
約２．１Ｍの濃度でグリシン、約２０ｍＭの濃度でクエン酸Ｎａ、約３．６Ｍの
濃度で塩化ナトリウム、および約２．４ｍＭの濃度でＣａＣｌ2を含む。
）バッファーの添加により、抽出されたフィブリノゲン溶液からフィブリノゲン
を沈降させる工程をさらに含む。好ましくは、Ｇｌｙ／ＮａＣｌバッファーは、
約２．１Ｍの濃度でグリシン、約２０ｍＭの濃度でクエン酸Ｎａ、約３．６Ｍの
濃度で塩化ナトリウム、および約２．４ｍＭの濃度でＣａＣｌ2を含む。
【００２１】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、約１００ｍＭの濃度のＮａＣｌ、
約１．１Ｍの濃度のＣａＣｌ2、約１０ｍＭの濃度のクエン酸Ｎａ、約１０ｍＭ
の濃度のトリス、および約４５ｍＭの濃度のスクロースを含み、好ましくは約６
．９のｐＨのバッファーに、フィブリノゲン沈降物を可溶化する工程をさらに含
む。
約１．１Ｍの濃度のＣａＣｌ2、約１０ｍＭの濃度のクエン酸Ｎａ、約１０ｍＭ
の濃度のトリス、および約４５ｍＭの濃度のスクロースを含み、好ましくは約６
．９のｐＨのバッファーに、フィブリノゲン沈降物を可溶化する工程をさらに含
む。
【００２２】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、以下の工程：
−イオン交換マトリックスに、抽出したフィブリノゲン溶液を、フィブリノゲン
がイオン交換マトリックスに結合するような条件下で添加する工程、 −マトリックスからフィブリノゲンを溶出する工程；および −任意に溶出物からフィブリノゲンを回収する工程 をさらに含む。
がイオン交換マトリックスに結合するような条件下で添加する工程、 −マトリックスからフィブリノゲンを溶出する工程；および −任意に溶出物からフィブリノゲンを回収する工程 をさらに含む。
【００２３】
第一の態様のさらに好ましい実施態様では、マトリックスからフィブリノゲン
を溶出する前に、少なくとも一つのω-アミノ酸を含むバッファーでイオン交換
マトリックスを洗浄することをさらに含む。好ましくは、洗浄バッファーは、少
なくとも５ｍＭの濃度で少なくとも一つのω-アミノ酸を含む。
を溶出する前に、少なくとも一つのω-アミノ酸を含むバッファーでイオン交換
マトリックスを洗浄することをさらに含む。好ましくは、洗浄バッファーは、少
なくとも５ｍＭの濃度で少なくとも一つのω-アミノ酸を含む。
【００２４】
さらに好ましい実施態様では、洗浄バッファーは、（i）約５０ｍＭの濃度の
トリス、(ii)約２０ｍＭの濃度の少なくとも一つのω-アミノ酸、および約９０
ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。好ましくは、バッファーは、約８．０のｐＨを有
する。好ましくは、バッファーは、約１１．１ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する。
トリス、(ii)約２０ｍＭの濃度の少なくとも一つのω-アミノ酸、および約９０
ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。好ましくは、バッファーは、約８．０のｐＨを有
する。好ましくは、バッファーは、約１１．１ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する。
【００２５】
第二の態様では、本発明は、以下の工程
（ａ）フィブリノゲンが、少なくとも０．１Ｍの濃度の塩を含む抽出バッファー
に可溶化されるように、画分Ｉ沈降物を抽出バッファーと混合して、画分Ｉ沈降
物からフィブリノゲンを抽出する工程； （ｂ）フィブリノゲンを沈降させる工程；および （ｃ）少なくとも１００ｍＭの濃度で少なくとも一つのω-アミノ酸を含む溶液
にフィブリノゲンを可溶化させる工程 を含む、フィブリノゲンを精製する方法を提供する。
に可溶化されるように、画分Ｉ沈降物を抽出バッファーと混合して、画分Ｉ沈降
物からフィブリノゲンを抽出する工程； （ｂ）フィブリノゲンを沈降させる工程；および （ｃ）少なくとも１００ｍＭの濃度で少なくとも一つのω-アミノ酸を含む溶液
にフィブリノゲンを可溶化させる工程 を含む、フィブリノゲンを精製する方法を提供する。
【００２６】
第二の態様の好ましい態様では、抽出バッファーの塩の濃度は、少なくとも０
．２Ｍ、さらに好ましくは少なくとも０．４Ｍ、さらに好ましくは０．８Ｍであ
る。
．２Ｍ、さらに好ましくは少なくとも０．４Ｍ、さらに好ましくは０．８Ｍであ
る。
【００２７】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出バッファーは、塩化物、リン
酸塩および酢酸塩からなる群から選択される少なくとも一つの塩を含み、より好
ましくはＮａＣｌを含む。
酸塩および酢酸塩からなる群から選択される少なくとも一つの塩を含み、より好
ましくはＮａＣｌを含む。
【００２８】
好ましくは、抽出バッファーは、約２０ｍＭの濃度でクエン酸三ナトリウムも
含む。
含む。
【００２９】
第二の態様の好ましい実施態様では、抽出バッファーは、さらに少なくとも１
０ＩＵ／ｍｌ、さらに好ましくは約６０ＩＵ／ｍｌの濃度でヘパリンをさらに含
む。
０ＩＵ／ｍｌ、さらに好ましくは約６０ＩＵ／ｍｌの濃度でヘパリンをさらに含
む。
【００３０】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出バッファーは、少なくとも一
つのω-アミノ酸をさらに含む。好ましくは、少なくとも一つのω-アミノ酸は、
少なくとも５ｍＭの濃度で抽出バッファーに存在する。
つのω-アミノ酸をさらに含む。好ましくは、少なくとも一つのω-アミノ酸は、
少なくとも５ｍＭの濃度で抽出バッファーに存在する。
【００３１】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、抽出バッファーは、約２０ｍＭの
濃度のクエン酸Ｎａ、約０．８Ｍの濃度のＮａＣｌ、および約６０ＩＵ／ｍｌの
濃度のヘパリンを含む。好ましくは、抽出バッファーは、約７．３のｐＨを有す
る。
濃度のクエン酸Ｎａ、約０．８Ｍの濃度のＮａＣｌ、および約６０ＩＵ／ｍｌの
濃度のヘパリンを含む。好ましくは、抽出バッファーは、約７．３のｐＨを有す
る。
【００３２】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、フィブリノゲンを、グリシン塩水
（Ｇｌｙ／ＮａＣｌ）バッファーの添加により、工程（ｂ）で沈降させる。好ま
しくは、Ｇｌｙ／ＮａＣｌバッファーは、約２．１Ｍの濃度でグリシン、約２０
ｍＭの濃度でクエン酸Ｎａ、約３．６Ｍの濃度で塩化ナトリウム、および約２．
４ｍＭの濃度でＣａＣｌ2を含む。
（Ｇｌｙ／ＮａＣｌ）バッファーの添加により、工程（ｂ）で沈降させる。好ま
しくは、Ｇｌｙ／ＮａＣｌバッファーは、約２．１Ｍの濃度でグリシン、約２０
ｍＭの濃度でクエン酸Ｎａ、約３．６Ｍの濃度で塩化ナトリウム、および約２．
４ｍＭの濃度でＣａＣｌ2を含む。
【００３３】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、フィブリノゲン沈降物を、約１０
０ｍＭの濃度のＮａＣｌ、約１．１Ｍの濃度のＣａＣｌ2、約１０ｍＭの濃度の
クエン酸Ｎａ、約１０ｍＭの濃度のトリス、および約４５ｍＭの濃度のスクロー
スを含むバッファーを用いて、工程（ｃ）で可溶化させる。好ましくは、このバ
ッファーは、約６．９のｐＨを有する。
０ｍＭの濃度のＮａＣｌ、約１．１Ｍの濃度のＣａＣｌ2、約１０ｍＭの濃度の
クエン酸Ｎａ、約１０ｍＭの濃度のトリス、および約４５ｍＭの濃度のスクロー
スを含むバッファーを用いて、工程（ｃ）で可溶化させる。好ましくは、このバ
ッファーは、約６．９のｐＨを有する。
【００３４】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、以下の工程：
（ｄ）イオン交換マトリックスに、工程（ｃ）のフィブリノゲン溶液を、フィブ
リノゲンが前記マトリックスに結合するような条件下で添加する工程、 （ｅ）マトリックスからフィブリノゲンを溶出する工程；および （ｆ）任意に溶出物からフィブリノゲンを回収する工程 をさらに含む。
リノゲンが前記マトリックスに結合するような条件下で添加する工程、 （ｅ）マトリックスからフィブリノゲンを溶出する工程；および （ｆ）任意に溶出物からフィブリノゲンを回収する工程 をさらに含む。
【００３５】
第二の態様の好ましい実施態様では、マトリックスからフィブリノゲンを溶出
する前に、少なくとも一つのω-アミノ酸を含むバッファーでイオン交換マトリ
ックスを洗浄することをさらに含む。好ましくは、洗浄バッファーは、少なくと
も５ｍＭの濃度で少なくとも一つのω-アミノ酸を含む。
する前に、少なくとも一つのω-アミノ酸を含むバッファーでイオン交換マトリ
ックスを洗浄することをさらに含む。好ましくは、洗浄バッファーは、少なくと
も５ｍＭの濃度で少なくとも一つのω-アミノ酸を含む。
【００３６】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、洗浄バッファーは、（i）約５０
ｍＭの濃度のトリス、(ii)約２０ｍＭの濃度の少なくとも一つのω-アミノ酸、
および約９０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。好ましくは、バッファーは、約８．
０のｐＨを有する。好ましくは、バッファーは、約１１．１ｍＳ／ｃｍの伝導度
を有する。
ｍＭの濃度のトリス、(ii)約２０ｍＭの濃度の少なくとも一つのω-アミノ酸、
および約９０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。好ましくは、バッファーは、約８．
０のｐＨを有する。好ましくは、バッファーは、約１１．１ｍＳ／ｃｍの伝導度
を有する。
【００３７】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、フィブリノゲン含有溶液（好まし
くはω-アミノ酸を含む）は、イオン交換マトリックスに添加される前に、伝導
度が１０．５ｍＳ／ｃｍ以下となるように希釈する。
くはω-アミノ酸を含む）は、イオン交換マトリックスに添加される前に、伝導
度が１０．５ｍＳ／ｃｍ以下となるように希釈する。
【００３８】
第二の態様のさらに好ましい実施態様では、フィブリノゲンを、約１０ｍＭの
トリス、１０ｍＭのクエン酸塩、４５ｍＭのスクロース；および２００ｍＭから
１．０Ｍ、好ましくは約４００ｍＭの濃度のＮａＣｌを含むバッファーに、マト
リックスから溶出する。好ましくはバッファーは、約７．０のｐＨを有する。
トリス、１０ｍＭのクエン酸塩、４５ｍＭのスクロース；および２００ｍＭから
１．０Ｍ、好ましくは約４００ｍＭの濃度のＮａＣｌを含むバッファーに、マト
リックスから溶出する。好ましくはバッファーは、約７．０のｐＨを有する。
【００３９】
第三の態様では、本発明は、以下の工程
（ａ）少なくとも５ｍＭの濃度の少なくとも一つのω-アミノ酸を含む抽出バッ
ファーにフィブリノゲンが溶解されるように、フィブリノゲン含有物質を抽出バ
ッファーと混合することにより前記物質からフィブリノゲンを抽出する工程； （ｂ）イオン交換マトリックスに、工程（ａ）で得られた抽出バッファーを、フ
ィブリノゲンが前記マトリックスに結合するような条件下で添加する工程； （ｃ）前記マトリックスからフィブリノゲンを溶出する工程；および （ｄ）任意にフィブリノゲンを溶出物から回収する工程 を含む、フィブリノゲンを精製する方法を提供する。
ファーにフィブリノゲンが溶解されるように、フィブリノゲン含有物質を抽出バ
ッファーと混合することにより前記物質からフィブリノゲンを抽出する工程； （ｂ）イオン交換マトリックスに、工程（ａ）で得られた抽出バッファーを、フ
ィブリノゲンが前記マトリックスに結合するような条件下で添加する工程； （ｃ）前記マトリックスからフィブリノゲンを溶出する工程；および （ｄ）任意にフィブリノゲンを溶出物から回収する工程 を含む、フィブリノゲンを精製する方法を提供する。
【００４０】
第三の態様の好ましい実施態様では、工程（ｂ）の後に、少なくとも一つのω
-アミノ酸を含む溶液で、イオン交換マトリックスを洗浄することをさらに含む
。
-アミノ酸を含む溶液で、イオン交換マトリックスを洗浄することをさらに含む
。
【００４１】
第四の態様では、本発明は、フィブリノゲン含有溶液からフィブリノゲンを精
製する方法を提供するものであって、この方法は、以下の工程： （ａ）前記溶液をイオン交換マトリックスに、フィブリノゲンがマトリックスに
結合するような条件下で適用する工程； （ｂ）イオン交換マトリックスを、少なくとも一つのω-アミノ酸を含む溶液で
洗浄する工程； （ｃ）マトリックスからフィブリノゲンを溶出する工程；および （ｄ）任意に溶出物からフィブリノゲンを回収する工程 を含む。
製する方法を提供するものであって、この方法は、以下の工程： （ａ）前記溶液をイオン交換マトリックスに、フィブリノゲンがマトリックスに
結合するような条件下で適用する工程； （ｂ）イオン交換マトリックスを、少なくとも一つのω-アミノ酸を含む溶液で
洗浄する工程； （ｃ）マトリックスからフィブリノゲンを溶出する工程；および （ｄ）任意に溶出物からフィブリノゲンを回収する工程 を含む。
【００４２】
第四の態様の好ましい実施態様では、イオン交換マトリックスに添加する前に
、溶液に少なくとも一つのω-アミノ酸を添加することをさらに含む。
、溶液に少なくとも一つのω-アミノ酸を添加することをさらに含む。
【００４３】
本発明の第三および第四の態様では、フィブリノゲン含有物質は、フィブリノ
ゲンを含む血漿から誘導されたあらゆる物質とすることができる。かかる溶液の
例は、これらに限定されるわけではないが、血漿（抗凝固化血漿を含む）、また
は血漿画分を含む。好ましい実施態様では、ヘパリン沈降ペーストであり、これ
は第VIII因子の製造方法の副生成物である。ヘパリン沈降ペーストを塩溶液で可
溶化して、高い比活性のフィブリノゲン調製物を得てもよい。ヘパリンを用いて
寒冷沈降物抽出物からフィブリノゲンを沈降させる方法は、Winkelmanら,1989に
記載されており、この全内容を参照としてここに含める。また、フィブリノゲン
含有物質は、好ましくは本発明の第一または第二の態様の方法に従って、画分１
沈降物から抽出される。
ゲンを含む血漿から誘導されたあらゆる物質とすることができる。かかる溶液の
例は、これらに限定されるわけではないが、血漿（抗凝固化血漿を含む）、また
は血漿画分を含む。好ましい実施態様では、ヘパリン沈降ペーストであり、これ
は第VIII因子の製造方法の副生成物である。ヘパリン沈降ペーストを塩溶液で可
溶化して、高い比活性のフィブリノゲン調製物を得てもよい。ヘパリンを用いて
寒冷沈降物抽出物からフィブリノゲンを沈降させる方法は、Winkelmanら,1989に
記載されており、この全内容を参照としてここに含める。また、フィブリノゲン
含有物質は、好ましくは本発明の第一または第二の態様の方法に従って、画分１
沈降物から抽出される。
【００４４】
第三または第四の態様のさらに好ましい実施態様では、ω-アミノ酸は、５−
５００ｍＭ、好ましくは５０−５００ｍＭ、さらに好ましくは約１００ｍＭの濃
度で抽出バッファー中に存在する。
５００ｍＭ、好ましくは５０−５００ｍＭ、さらに好ましくは約１００ｍＭの濃
度で抽出バッファー中に存在する。
【００４５】
第三または第四の態様のさらに好ましい実施態様では、フィブリノゲン含有溶
液（好ましくはω-アミノ酸を含む）は、イオン交換マトリックスに適用する前
に、伝導度が１０．５ｍＳ／ｃｍ以下となるように希釈される。
液（好ましくはω-アミノ酸を含む）は、イオン交換マトリックスに適用する前
に、伝導度が１０．５ｍＳ／ｃｍ以下となるように希釈される。
【００４６】
第三または第四の態様のさらに好ましい実施態様では、イオン交換マトリック
スを洗浄するために用いられるバッファーは、（i）約５０ｍＭの濃度のトリス
、（ii）約２０ｍＭの濃度のω-アミノ酸、および約９０ｍＭの濃度のＮａＣｌ
を含む。好ましくはバッファーは、約８．０のｐＨを有する。好ましくは、バッ
ファーは、約１１．１ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する。
スを洗浄するために用いられるバッファーは、（i）約５０ｍＭの濃度のトリス
、（ii）約２０ｍＭの濃度のω-アミノ酸、および約９０ｍＭの濃度のＮａＣｌ
を含む。好ましくはバッファーは、約８．０のｐＨを有する。好ましくは、バッ
ファーは、約１１．１ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する。
【００４７】
第三または第四の態様のさらに好ましい実施態様では、フィブリノゲンを、約
１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのクエン酸塩、４５ｍＭのスクロース；および２０
０ｍＭから１．０Ｍ、好ましくは約４００−５００ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む
バッファーにマトリックスから溶出させる。好ましくは、バッファーは約７．０
のｐＨを有する。
１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのクエン酸塩、４５ｍＭのスクロース；および２０
０ｍＭから１．０Ｍ、好ましくは約４００−５００ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む
バッファーにマトリックスから溶出させる。好ましくは、バッファーは約７．０
のｐＨを有する。
【００４８】
本発明の第一、第二、第三または第四の態様の好ましい実施態様では、ω-ア
ミノ酸は、カルボン酸とω-アミノ基との間の炭素鎖に少なくとも４つの炭素原
子を含む。適切な直鎖ω-アミノ酸の例は、４-アミノ酪酸、５-アミノペントイ
ン酸、６-アミノヘキサン酸（ε-アミノカプロン酸(ＥＡＣＡ)）、７-アミノヘ
プタン酸、８-アミノオクタン酸、およびアルギニンである。環状ω-アミノ酸の
例は、トランス-４-アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸（トラネザミン酸）
およびパラ-アミノメチル安息香酸である。特に好ましい実施態様では、ω-アミ
ノ酸は、ＥＡＣＡである。
ミノ酸は、カルボン酸とω-アミノ基との間の炭素鎖に少なくとも４つの炭素原
子を含む。適切な直鎖ω-アミノ酸の例は、４-アミノ酪酸、５-アミノペントイ
ン酸、６-アミノヘキサン酸（ε-アミノカプロン酸(ＥＡＣＡ)）、７-アミノヘ
プタン酸、８-アミノオクタン酸、およびアルギニンである。環状ω-アミノ酸の
例は、トランス-４-アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸（トラネザミン酸）
およびパラ-アミノメチル安息香酸である。特に好ましい実施態様では、ω-アミ
ノ酸は、ＥＡＣＡである。
【００４９】
イオン交換マトリックスは、当該技術分野で公知であり、あらゆる適切なマト
リックスを本発明において用いることができる。好ましいマトリックスは、Macr
oPrep HQ樹脂（BioRad, カタログ番号１５６−００４１）である。さらに好まし
い実施態様では、イオン交換マトリックスはカラムに充填される。
リックスを本発明において用いることができる。好ましいマトリックスは、Macr
oPrep HQ樹脂（BioRad, カタログ番号１５６−００４１）である。さらに好まし
い実施態様では、イオン交換マトリックスはカラムに充填される。
【００５０】
当業者であれば、第三および第四の態様の方法は、不安定化レベルのプラスミ
ノゲンとその他のプロテアーゼを含まないフィブリノゲンの大規模な製造のため
のアフィニティークロマトグラフィーに代わる方法を提供する可能性を有するこ
とを理解できるであろう。かかる態様の方法は、高い回収量（約７５％）で、生
物学的流体から、不安定化レベルのプラスミノゲンおよびその他のプロテアーゼ
を含まないフィブリノゲンを単離するための、イオン交換クロマトグラフィーを
用いる唯一の処理工程のみを必要とする。血液タンパクからフィブリノゲンを精
製するこの新規方法の使用は、純度と安定性の両方に優れた産物をもたらす、よ
り簡単な製造方法を実現する可能性を有する。
ノゲンとその他のプロテアーゼを含まないフィブリノゲンの大規模な製造のため
のアフィニティークロマトグラフィーに代わる方法を提供する可能性を有するこ
とを理解できるであろう。かかる態様の方法は、高い回収量（約７５％）で、生
物学的流体から、不安定化レベルのプラスミノゲンおよびその他のプロテアーゼ
を含まないフィブリノゲンを単離するための、イオン交換クロマトグラフィーを
用いる唯一の処理工程のみを必要とする。血液タンパクからフィブリノゲンを精
製するこの新規方法の使用は、純度と安定性の両方に優れた産物をもたらす、よ
り簡単な製造方法を実現する可能性を有する。
【００５１】
本発明の技術は、フィブリノゲンの製造と、フィブリンシーラント製品におけ
るフィブリノゲンの使用の両方に関して、多くの利点を与える。フィブリノゲン
成分からプラスミノゲンを除去することは、フィブリノゲン成分とフィブリング
ルーの所望の安定性を得るために、ヒト、動物、または合成由来の阻害剤を添加
する必要がないという自由度を製造者に与える。阻害剤の添加は、別の問題を生
じることがあり、これは、最終的産物からプラスミノゲンを除去することによっ
て妨げられる。
るフィブリノゲンの使用の両方に関して、多くの利点を与える。フィブリノゲン
成分からプラスミノゲンを除去することは、フィブリノゲン成分とフィブリング
ルーの所望の安定性を得るために、ヒト、動物、または合成由来の阻害剤を添加
する必要がないという自由度を製造者に与える。阻害剤の添加は、別の問題を生
じることがあり、これは、最終的産物からプラスミノゲンを除去することによっ
て妨げられる。
【００５２】
最後に、イオン交換樹脂の製造コストは、アフィニティークロマトグラフィー
法で用いられるリシン-セファロースまたは固定化リシン樹脂のコストよりもは
るかに経済的である。
法で用いられるリシン-セファロースまたは固定化リシン樹脂のコストよりもは
るかに経済的である。
【００５３】
本明細書を通して、用語“含む”、またはその変形は、記載された要素(eleme
nt)、全体(integer)または工程(step)、あるいは要素、全体または工程の群を含
むが、他の要素、全体または工程、あるいは要素、全体または工程の群を排除し
ないことを意味するものと解する。
nt)、全体(integer)または工程(step)、あるいは要素、全体または工程の群を含
むが、他の要素、全体または工程、あるいは要素、全体または工程の群を排除し
ないことを意味するものと解する。
【００５４】
ここで使用する略号：
ＴＰ 全タンパク
ＣＰ 凝固可能タンパク
ＦＸIII 第ＸIII因子
ＦII 第II因子
Plasm. プラスミノゲン
ＦＮ フィブロネクチン
ＡＴIII アンチトロンビンIII
Ｆ１Ｐ 画分１ペースト
ＳＦＰ 可溶化画分１ペースト
ＡＳＦＰ アルヒドロゲル(Alhydrogel)吸収可溶化画分１ペースト
ＧＡＳＦＰ 溶解Ｇｌｙ／ＮａＣｌ沈降可溶化画分１ペースト
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動 Ｇｌｙ／ＮａＣｌ グリシン／塩 ＳＤ 溶媒／界面活性剤 εＡＣＡ エプシロンアミノカプロン酸 ＴＮＢＰ トリ-Ｎ-ブチルホスファート Ａｌ（ＯＨ）3 水酸化アルミニウム ＲＴ 室温 ＰＥＴ 血漿処理技術 ＩＥＸ イオン交換 ＳＨＰ 可溶化ヘパリンペースト上清
動 Ｇｌｙ／ＮａＣｌ グリシン／塩 ＳＤ 溶媒／界面活性剤 εＡＣＡ エプシロンアミノカプロン酸 ＴＮＢＰ トリ-Ｎ-ブチルホスファート Ａｌ（ＯＨ）3 水酸化アルミニウム ＲＴ 室温 ＰＥＴ 血漿処理技術 ＩＥＸ イオン交換 ＳＨＰ 可溶化ヘパリンペースト上清
【００５５】
実施例１：画分Ｉ沈降物からのフィブリノゲンの抽出
1.1 物質と方法
1.1.1 ヘパリンペースト抽出方法
画分Ｉペーストを、特に言及しない限り、１ｇ：８．３３ｇのヘパリンペース
ト抽出バッファーの比率で抽出した。この抽出は、室温で２時間行った。 1.1.2 ヘパリンペースト抽出バッファー ０．４Ｍ ＮａＣｌ ５ｍＭ εＡＣＡ ２０ｍＭ クエン酸Ｎａ ｐＨ７．３
ト抽出バッファーの比率で抽出した。この抽出は、室温で２時間行った。 1.1.2 ヘパリンペースト抽出バッファー ０．４Ｍ ＮａＣｌ ５ｍＭ εＡＣＡ ２０ｍＭ クエン酸Ｎａ ｐＨ７．３
【００５６】
1.1.3 アルヒドロゲル(Alhydrogel)吸着
アルヒドロゲルとしても知られる、２％水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）3溶
液を、１０．８％の濃度で、可溶化したヘパリンペースト上清（ＳＨＰ）に加え
た。この混合物を、室温で１５分間攪拌しながらインキュベートし、１０分間遠
心し、ペレットを捨てた。 1.1.4 Gly／NaCl沈降 アルヒドロゲル上清（ＡＳＦＰ）およびGly／NaClバッファーを３０℃±３℃
まで熱した。次いで、この上清を、４．５分間にわたって、１：２．０５の比率
でGly／NaClバッファーに加えた。次いで、上清を攪拌しながら２０分間３０℃
でインキュベートした後に、１０分間５０１０ｇで遠心した。この上清を捨て、
沈降物を、画分Ｉペーストからのフィブリノゲンの抽出後に得られた上清の量の
１／３に相当する量のバッファーＤを用いて可溶化した。この沈降物を、可溶化
の間、室温で攪拌してもよい。
液を、１０．８％の濃度で、可溶化したヘパリンペースト上清（ＳＨＰ）に加え
た。この混合物を、室温で１５分間攪拌しながらインキュベートし、１０分間遠
心し、ペレットを捨てた。 1.1.4 Gly／NaCl沈降 アルヒドロゲル上清（ＡＳＦＰ）およびGly／NaClバッファーを３０℃±３℃
まで熱した。次いで、この上清を、４．５分間にわたって、１：２．０５の比率
でGly／NaClバッファーに加えた。次いで、上清を攪拌しながら２０分間３０℃
でインキュベートした後に、１０分間５０１０ｇで遠心した。この上清を捨て、
沈降物を、画分Ｉペーストからのフィブリノゲンの抽出後に得られた上清の量の
１／３に相当する量のバッファーＤを用いて可溶化した。この沈降物を、可溶化
の間、室温で攪拌してもよい。
【００５７】
1.1.5 Gly／NaClバッファー
２．１Ｍ グリシン
２０ｍＭ クエン酸Ｎａ
３．６Ｍ ＮａＣｌ
２．４ｍＭ ＣａＣｌ2
【００５８】
1.1.6 バッファーＤ
１００ｍＭ ＮａＣｌ
１．１ｍＭ ＣａＣｌ2
１０ｍＭ クエン酸Ｎａ
１０ｍＭ トリス
４５ｍＭ スクロース
ｐＨ６．９
【００５９】
1.1.7 溶媒界面活性剤処理
溶媒界面活性剤処理を、可溶化したGly／NaCl沈降物（ＧＡＳＦＰ）に、１％
のポリソルバート８０および０．３％のＴＮＢＰを加えることによって実施した
。 1.1.8 湿熱処理 溶媒界面活性剤処理したフィブリノゲンを、濃縮スクロース／グリシンバッフ
ァーを用いて１／１５に希釈して、約１ｍｇ／ｍＬのタンパク、６０％スクロー
ス、および１Ｍグリシンの終濃度とした。得られた産物を６０℃まで熱し、１０
時間９インキュベートした。 1.1.9 イオン交換クロマトグラフィー 湿熱処理したフィブリノゲンを、平衡化したアニオン交換樹脂に添加した。樹
脂を洗浄した後に、産物を、塩含有バッファーを用いて溶出した。 1.1.10 ３７℃での安定性 処理過程において、サンプルをウォーターバスにて３７℃でインキュベートし
、サンプルを取り出し、規則的な時間間隔で凍結した。サンプルの安定性を、還
元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。安定性は、フィブリノゲンのα
サブユニットの分解をゲル上に肉眼で観察できない最後の時点として定量的に評
価した。
のポリソルバート８０および０．３％のＴＮＢＰを加えることによって実施した
。 1.1.8 湿熱処理 溶媒界面活性剤処理したフィブリノゲンを、濃縮スクロース／グリシンバッフ
ァーを用いて１／１５に希釈して、約１ｍｇ／ｍＬのタンパク、６０％スクロー
ス、および１Ｍグリシンの終濃度とした。得られた産物を６０℃まで熱し、１０
時間９インキュベートした。 1.1.9 イオン交換クロマトグラフィー 湿熱処理したフィブリノゲンを、平衡化したアニオン交換樹脂に添加した。樹
脂を洗浄した後に、産物を、塩含有バッファーを用いて溶出した。 1.1.10 ３７℃での安定性 処理過程において、サンプルをウォーターバスにて３７℃でインキュベートし
、サンプルを取り出し、規則的な時間間隔で凍結した。サンプルの安定性を、還
元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。安定性は、フィブリノゲンのα
サブユニットの分解をゲル上に肉眼で観察できない最後の時点として定量的に評
価した。
【００６０】
1.1.11 抽出１工程
画分１ペーストを、産物から新たに得た。６ｇを、ヘパリンペースト抽出バッ
ファーを用いて直ちに抽出した。可溶化した画分１ペーストを分注し、アッセイ
まで−８０℃で凍結貯蔵した。 1.1.12 抽出２工程 画分１ペーストを、産物から新たに得た。１２ｇを、ヘパリンペースト抽出バ
ッファーを用いて直ちに抽出した。このペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly
／NaClバッファーを用いて沈降させた。沈降物を、バッファーＤに可溶化した。
サンプルを各段階で得て、アッセイまで−８０℃で凍結した。残りの画分１ペー
ストを、−８０℃で貯蔵した。 1.1.13 抽出３（凍結ペースト）工程 画分１ペースト（３０ｇ）を３７℃で解凍し、ヘパリンペースト抽出バッファ
ーを用いて抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／Na
Clバッファーを用いて沈降させた。このGly／NaCl沈降物をバッファーＤを用い
て可溶化した。εＡＣＡを、０ｍＭ、２０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭおよび
５００ｍＭの濃度で、可溶化したGly／NaCl沈降物のサンプルに添加した。この
サンプルを３７℃で安定性について評価した。 可溶化したGly／NaCl沈降物を、ＳＤで処理し、MacroPrep HQイオン交換カラ
ムに添加した。画分を回収し、３７℃で安定性について評価した。
ファーを用いて直ちに抽出した。可溶化した画分１ペーストを分注し、アッセイ
まで−８０℃で凍結貯蔵した。 1.1.12 抽出２工程 画分１ペーストを、産物から新たに得た。１２ｇを、ヘパリンペースト抽出バ
ッファーを用いて直ちに抽出した。このペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly
／NaClバッファーを用いて沈降させた。沈降物を、バッファーＤに可溶化した。
サンプルを各段階で得て、アッセイまで−８０℃で凍結した。残りの画分１ペー
ストを、−８０℃で貯蔵した。 1.1.13 抽出３（凍結ペースト）工程 画分１ペースト（３０ｇ）を３７℃で解凍し、ヘパリンペースト抽出バッファ
ーを用いて抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／Na
Clバッファーを用いて沈降させた。このGly／NaCl沈降物をバッファーＤを用い
て可溶化した。εＡＣＡを、０ｍＭ、２０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭおよび
５００ｍＭの濃度で、可溶化したGly／NaCl沈降物のサンプルに添加した。この
サンプルを３７℃で安定性について評価した。 可溶化したGly／NaCl沈降物を、ＳＤで処理し、MacroPrep HQイオン交換カラ
ムに添加した。画分を回収し、３７℃で安定性について評価した。
【００６１】
1.1.14 抽出４工程
画分１ペーストを、産物から新たに得た。４０ｇを、ヘパリンペースト抽出バ
ッファーを用いて直ちに抽出した。抽出から２時間後に、画分１ペーストは完全
には可溶化されなかった。この物質を遠心*し、この上清（可溶化した画分１ペ
ースト＃１）をＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させ
た。このGly／NaCl沈降物を、バッファーＤを用いて可溶化した。εＡＣＡを、
０ｍＭ、２０ｍＭ、１２５ｍＭ、２５０ｍＭおよび５００ｍＭの濃度で、可溶化
したGly／NaCl沈降物の２セットのサンプルに添加した。一方のグループのサン
プルは、３７℃で直ちにインキュベートし、経時的に安定性についてアッセイし
た。他方のグループのサンプルを、−８０℃で６０時間凍結貯蔵し、解凍し、次
いで、安定性に関して３７℃でインキュベートした。残りの可溶化したGly／NaC
l沈降物をＳＤ処理し、イオン交換カラムに添加した。 ＊非可溶化画分１物質（１４．１３ｇ）を、０．８ＭのNaClを含有するヘパリ
ンペースト抽出バッファーに再抽出した。可溶化画分１物質（＃２）を分注し、
−８０℃で凍結貯蔵した。
ッファーを用いて直ちに抽出した。抽出から２時間後に、画分１ペーストは完全
には可溶化されなかった。この物質を遠心*し、この上清（可溶化した画分１ペ
ースト＃１）をＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させ
た。このGly／NaCl沈降物を、バッファーＤを用いて可溶化した。εＡＣＡを、
０ｍＭ、２０ｍＭ、１２５ｍＭ、２５０ｍＭおよび５００ｍＭの濃度で、可溶化
したGly／NaCl沈降物の２セットのサンプルに添加した。一方のグループのサン
プルは、３７℃で直ちにインキュベートし、経時的に安定性についてアッセイし
た。他方のグループのサンプルを、−８０℃で６０時間凍結貯蔵し、解凍し、次
いで、安定性に関して３７℃でインキュベートした。残りの可溶化したGly／NaC
l沈降物をＳＤ処理し、イオン交換カラムに添加した。 ＊非可溶化画分１物質（１４．１３ｇ）を、０．８ＭのNaClを含有するヘパリ
ンペースト抽出バッファーに再抽出した。可溶化画分１物質（＃２）を分注し、
−８０℃で凍結貯蔵した。
【００６２】
1.1.15 抽出バッファーに対するATIIIの添加
画分１ペーストを、産物から得て、半分を４℃で、そして他方の半分を−８０
℃で、４．５日間貯蔵した。この実験では、抽出を、１ＩＵ／ｍＬのATIIIを含
むまたは含まないバッファーに、４℃（新鮮ペースト）および−８０℃（凍結ペ
ースト）を用いて行った。標準抽出バッファーに対するさらなる変化は、０．８
Ｍへの塩濃度の増加であった。 画分１ペースト（６ｇ）を、以下の各条件の下に抽出した： （１）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３に抽出。 （２）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８
Ｍ ＮａＣｌ、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、ｐＨ７．３に抽出。 （３）凍結ペーストを３７℃で解凍し、次いで、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５
ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３に抽出。 （４）凍結ペーストを３７℃で解凍し、次いで、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５
ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、ｐＨ７．３に抽出。 可溶化した画分１ペーストを、アルヒドロゲル吸着させ、Gly／NaClバッファ
ーを用いて沈降させた。沈降物を半分に分けた。半分の沈降物を−８０℃に貯蔵
し、他の半分をバッファーＤを用いて可溶化した。可溶化沈降物を再び半分に分
け、０ εＡＣＡまたは２５０ｍＭのεＡＣＡを添加した。このサンプルを３７
℃で安定性について評価した。 凍結Gly／NaCl pptを、３７℃で解凍し、バッファーＤ＋１００ｍＭ εＡＣＡ
を用いて可溶化した（３０℃まで温めた）。可溶化を３０℃で行った。サンプル
を３７℃で、安定性について評価した。
℃で、４．５日間貯蔵した。この実験では、抽出を、１ＩＵ／ｍＬのATIIIを含
むまたは含まないバッファーに、４℃（新鮮ペースト）および−８０℃（凍結ペ
ースト）を用いて行った。標準抽出バッファーに対するさらなる変化は、０．８
Ｍへの塩濃度の増加であった。 画分１ペースト（６ｇ）を、以下の各条件の下に抽出した： （１）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３に抽出。 （２）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８
Ｍ ＮａＣｌ、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、ｐＨ７．３に抽出。 （３）凍結ペーストを３７℃で解凍し、次いで、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５
ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３に抽出。 （４）凍結ペーストを３７℃で解凍し、次いで、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５
ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、ｐＨ７．３に抽出。 可溶化した画分１ペーストを、アルヒドロゲル吸着させ、Gly／NaClバッファ
ーを用いて沈降させた。沈降物を半分に分けた。半分の沈降物を−８０℃に貯蔵
し、他の半分をバッファーＤを用いて可溶化した。可溶化沈降物を再び半分に分
け、０ εＡＣＡまたは２５０ｍＭのεＡＣＡを添加した。このサンプルを３７
℃で安定性について評価した。 凍結Gly／NaCl pptを、３７℃で解凍し、バッファーＤ＋１００ｍＭ εＡＣＡ
を用いて可溶化した（３０℃まで温めた）。可溶化を３０℃で行った。サンプル
を３７℃で、安定性について評価した。
【００６３】
1.1.16 抽出バッファーへのヘパリンの添加
画分１ペーストを、４℃で３日間貯蔵した後に産物から得た。この実験では、
４つの抽出を、２０ＩＵ／ｍＬまたは６０ＩＵ／ｍＬのヘパリンの存在下で１Ｉ
Ｕ／ｍＬのATIIIを含むおよび含まないバッファーを用いて実施した。 画分１ペースト（６ｇ）を、以下の各条件下で抽出した。 （１）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．４
Ｍ ＮａＣｌ、２０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、ｐＨ７．３に抽出。 （２）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．４
Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、ｐＨ７．３に抽出。 （３）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．４
Ｍ ＮａＣｌ、２０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、ｐＨ７．３に抽
出。 （４）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８
Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、ｐＨ７．３に抽
出。 可溶化画分１ペーストを、Ａｌ（ＯＨ）3を用いて処理し、Gly／NaClバッファ
ーを用いて沈降させた。沈降物を半分に分けた。半分の沈降物を−８０℃に貯蔵
し、他の半分をバッファーＤを用いて可溶化した。可溶化沈降物を再び半分に分
け、０ εＡＣＡまたは２５０ｍＭのεＡＣＡを添加した。このサンプルを３７
℃で安定性について評価した。 凍結ペレットの可溶化を、凍結Gly／NaCl沈降物中に、バッファーＤ＋１００
ｍＭ εＡＣＡ（３０℃に温めた）を添加することによって実施した。可溶化を
３０℃で行った。サンプルを、３７℃で安定性について評価した。
４つの抽出を、２０ＩＵ／ｍＬまたは６０ＩＵ／ｍＬのヘパリンの存在下で１Ｉ
Ｕ／ｍＬのATIIIを含むおよび含まないバッファーを用いて実施した。 画分１ペースト（６ｇ）を、以下の各条件下で抽出した。 （１）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．４
Ｍ ＮａＣｌ、２０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、ｐＨ７．３に抽出。 （２）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．４
Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、ｐＨ７．３に抽出。 （３）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．４
Ｍ ＮａＣｌ、２０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、ｐＨ７．３に抽
出。 （４）新鮮なペーストを、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８
Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、ｐＨ７．３に抽
出。 可溶化画分１ペーストを、Ａｌ（ＯＨ）3を用いて処理し、Gly／NaClバッファ
ーを用いて沈降させた。沈降物を半分に分けた。半分の沈降物を−８０℃に貯蔵
し、他の半分をバッファーＤを用いて可溶化した。可溶化沈降物を再び半分に分
け、０ εＡＣＡまたは２５０ｍＭのεＡＣＡを添加した。このサンプルを３７
℃で安定性について評価した。 凍結ペレットの可溶化を、凍結Gly／NaCl沈降物中に、バッファーＤ＋１００
ｍＭ εＡＣＡ（３０℃に温めた）を添加することによって実施した。可溶化を
３０℃で行った。サンプルを、３７℃で安定性について評価した。
【００６４】
1.1.17 ペースト：バッファー比調査
調査I：
画分１ペーストを産物から新たに得た。１．５ｇ、３ｇ、４．５ｇ、６ｇ、７
．５ｇ、および９ｇを、０．８ＭのNaClを含む５０ｇの抽出バッファーに可溶化
した。サンプルを、全タンパクおよび凝固可能なタンパク用に取りわけた。残り
の物質を捨てた。 調査II： 画分１ペースト（Batch #3715001253）を、産物から新たに得た。４．５ｇ、
９ｇ、１３．５ｇ、１８ｇ、２２．５ｇおよび２７ｇを、０．８Ｍ NaCl、６０
ＩＵ／ｍＬのヘパリンを含有する１５０ｍＬの抽出バッファーに、３７℃で９０
分間可溶化した。サンプルを、全タンパクおよび凝固可能なタンパク用に取りわ
けた。
．５ｇ、および９ｇを、０．８ＭのNaClを含む５０ｇの抽出バッファーに可溶化
した。サンプルを、全タンパクおよび凝固可能なタンパク用に取りわけた。残り
の物質を捨てた。 調査II： 画分１ペースト（Batch #3715001253）を、産物から新たに得た。４．５ｇ、
９ｇ、１３．５ｇ、１８ｇ、２２．５ｇおよび２７ｇを、０．８Ｍ NaCl、６０
ＩＵ／ｍＬのヘパリンを含有する１５０ｍＬの抽出バッファーに、３７℃で９０
分間可溶化した。サンプルを、全タンパクおよび凝固可能なタンパク用に取りわ
けた。
【００６５】
1.1.18 抽出温度調査
画分１ペーストを、産物から新たに得た。１８ｇを、室温で２時間、１５０ｍ
Ｌの２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．
３に抽出した。別の１８ｇを、３７℃で２時間、１５０ｍＬの２０ｍＭ クエン
酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３に抽出した。サンプ
ルを、全タンパクおよび凝固可能なタンパクの抽出の間、３０分、６０分、９０
分、および１２０分の時点で採取した。可溶化されたペーストを遠心し、別のサ
ンプルを取り分けた。
Ｌの２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．
３に抽出した。別の１８ｇを、３７℃で２時間、１５０ｍＬの２０ｍＭ クエン
酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３に抽出した。サンプ
ルを、全タンパクおよび凝固可能なタンパクの抽出の間、３０分、６０分、９０
分、および１２０分の時点で採取した。可溶化されたペーストを遠心し、別のサ
ンプルを取り分けた。
【００６６】
1.1.19 製造規模抽出の調査
製造規模抽出Ｉ：
画分１ペーストを、産物から新たに得た。２０．０ｋｇを１ｇペースト：８．
３３ｇバッファーの比率で、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８
Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬヘパリン、ｐＨ７．３に、ＰＥＴグループにより
抽出した。抽出を、３７℃で９０分間実施した。 可溶化画分１ペーストを、アルヒドロゲル吸着処理し、Gly／NaCl沈降を実施
した。沈降物を二つに分け、半分の沈降物を、１００ｍＭ εＡＣＡを含有する
バッファーＤに可溶化し、他の半分を−８０℃で凍結させた。可溶化したGly／N
aCl沈降物をＳＤで処理し、湿熱処理し、イオン交換カラムに添加した。溶出物
を回収し、サンプル化し、−８０℃で凍結させた。 凍結ペレットの可溶化を、凍結させたGly／NaCl沈降物にバッファーＤ＋１０
０ｍＭ εＡＣＡ（３０℃に温めた）を添加することにより実施した。可溶化を
３０℃で行った。このサンプルを、３７℃での安定性について評価した。 製造規模抽出II： 画分１ペーストを、産物から新たに得た。３０．０ｋｇを１ｇペースト：８．
３３ｇバッファーの比率で、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８
Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬヘパリン、ｐＨ７．３に、ＰＥＴグループにより
抽出した。抽出を、３７℃で９０分間実施した。サンプルを、全タンパクおよび
凝固可能なタンパクのために取り分けた。
３３ｇバッファーの比率で、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８
Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬヘパリン、ｐＨ７．３に、ＰＥＴグループにより
抽出した。抽出を、３７℃で９０分間実施した。 可溶化画分１ペーストを、アルヒドロゲル吸着処理し、Gly／NaCl沈降を実施
した。沈降物を二つに分け、半分の沈降物を、１００ｍＭ εＡＣＡを含有する
バッファーＤに可溶化し、他の半分を−８０℃で凍結させた。可溶化したGly／N
aCl沈降物をＳＤで処理し、湿熱処理し、イオン交換カラムに添加した。溶出物
を回収し、サンプル化し、−８０℃で凍結させた。 凍結ペレットの可溶化を、凍結させたGly／NaCl沈降物にバッファーＤ＋１０
０ｍＭ εＡＣＡ（３０℃に温めた）を添加することにより実施した。可溶化を
３０℃で行った。このサンプルを、３７℃での安定性について評価した。 製造規模抽出II： 画分１ペーストを、産物から新たに得た。３０．０ｋｇを１ｇペースト：８．
３３ｇバッファーの比率で、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８
Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬヘパリン、ｐＨ７．３に、ＰＥＴグループにより
抽出した。抽出を、３７℃で９０分間実施した。サンプルを、全タンパクおよび
凝固可能なタンパクのために取り分けた。
【００６７】
１．２ 結果
1.2.1 抽出１工程
画分１ペースト（６ｇ）を５０ｍＬの抽出バッファーに可溶化した。遠心後、
５２．４７ｇの上清を回収し、ペレットを捨てた。 タンパクの特徴決定 可溶化画分１ペーストを、全タンパク、凝固可能なタンパク、第XIII因子、プ
ラスミノゲンおよびフィブロネクチンについて、表１に記載したようにアッセイ
した。血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を表２に算出した。サイ
ズ排除分析を、スーパーローズ６(Superose 6)を用いて実施し、その結果を表３
に記載した。
５２．４７ｇの上清を回収し、ペレットを捨てた。 タンパクの特徴決定 可溶化画分１ペーストを、全タンパク、凝固可能なタンパク、第XIII因子、プ
ラスミノゲンおよびフィブロネクチンについて、表１に記載したようにアッセイ
した。血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を表２に算出した。サイ
ズ排除分析を、スーパーローズ６(Superose 6)を用いて実施し、その結果を表３
に記載した。
【００６８】
表１
可溶化画分１ペーストのタンパクの特徴決定
【表１】
【００６９】
可溶化画分１ペーストの特徴決定は、その約６５％が凝固可能なタンパクまた
はフィブリノゲンである高レベルのタンパクが抽出されたことを示している。ま
た、可溶化画分１ペーストは、高レベルの第XIII因子とプラスミノゲンを含有す
るが、低レベルのフィブロネクチンを含有していた。
はフィブリノゲンである高レベルのタンパクが抽出されたことを示している。ま
た、可溶化画分１ペーストは、高レベルの第XIII因子とプラスミノゲンを含有す
るが、低レベルのフィブロネクチンを含有していた。
【００７０】
表２
可溶化画分１ペーストからのフィブリノゲンの収量
【表２】
【００７１】
可溶化画分１ペーストからのフィブリノゲンの収量は、可溶化ヘパリンペース
トと比較して高く、血漿のキログラム当たり１．２２ｇのフィブリノゲンが抽出
された。
トと比較して高く、血漿のキログラム当たり１．２２ｇのフィブリノゲンが抽出
された。
【００７２】
表３
可溶化画分１ペーストのスーパーローズ６解析
【表３】
【００７３】
可溶化画分１ペーストのスーパーローズ６解析は、低レベルの凝集を含むが、
低分子量タンパクが存在する約６５％のフィブリノゲンモノマーを示した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果は、非還元条件下で高分子量タンパクの存在を示
し、かつ、還元条件下で約４０−６０ｋＤａの間の三つの主なバンドを示した。
このプロフィールは、フィブリノゲンに富んだ物質に特有である。 ３７℃における安定性 可溶化画分１ペーストの安定性は、約２４時間であった。可溶化画分１ペース
トサンプルは、３７℃で２４時間から３２時間の間のインキュベーションで凝固
した。
低分子量タンパクが存在する約６５％のフィブリノゲンモノマーを示した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果は、非還元条件下で高分子量タンパクの存在を示
し、かつ、還元条件下で約４０−６０ｋＤａの間の三つの主なバンドを示した。
このプロフィールは、フィブリノゲンに富んだ物質に特有である。 ３７℃における安定性 可溶化画分１ペーストの安定性は、約２４時間であった。可溶化画分１ペース
トサンプルは、３７℃で２４時間から３２時間の間のインキュベーションで凝固
した。
【００７４】
1.2.2 抽出２工程
画分１ペースト（１２．０６ｇ）を、１００．５ｍＬの抽出バッファーに抽出
し、遠心し、Ａｌ（ＯＨ）3吸着し、Gly／NaClで沈降させた。 タンパクの特徴決定 全てのサンプルを、全タンパク、凝固可能なタンパク、第XIII因子、第II因子
、プラスミノゲンおよびフィブロネクチンについてアッセイし、血漿のキログラ
ム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表４）。サイズ排除解析を、スー
パーローズ６を用いて実施し、この結果を表５に記載した。
し、遠心し、Ａｌ（ＯＨ）3吸着し、Gly／NaClで沈降させた。 タンパクの特徴決定 全てのサンプルを、全タンパク、凝固可能なタンパク、第XIII因子、第II因子
、プラスミノゲンおよびフィブロネクチンについてアッセイし、血漿のキログラ
ム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表４）。サイズ排除解析を、スー
パーローズ６を用いて実施し、この結果を表５に記載した。
【００７５】
表４
特徴決定一覧
【表４】
【００７６】
可溶化画分１ペーストの特徴決定は、その約７３％が凝固可能タンパクである
高レベルのタンパクの抽出を示した。この結果は、抽出Ｉから得られたものと一
致する。また、高レベルの第XIII因子とプラスミノゲン、並びに低レベルのフィ
ブロネクチンも抽出された。血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量も
、１．８３ｇ／ｋｇと高かった。 Ａｌ（ＯＨ）3吸着後には、可溶化画分１ペースト中に０．５３ＩＵ／ｍＬで
あることが観察された第II因子が検出されなかった。凝固可能タンパクは、７７
％であることが観察され、FXIII、ブラスミノゲンおよびフィブロネクチンの濃
度は比較的変化しなかった。血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量は
、約２２％低減したが、これは、この段階で予想された結果である。 Gly／NaCl沈降は、フィブリノゲンの純度を９２％の凝固可能物まで増加させ
、かつフィブロネクチンを無視できるレベルまで除いた。
高レベルのタンパクの抽出を示した。この結果は、抽出Ｉから得られたものと一
致する。また、高レベルの第XIII因子とプラスミノゲン、並びに低レベルのフィ
ブロネクチンも抽出された。血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量も
、１．８３ｇ／ｋｇと高かった。 Ａｌ（ＯＨ）3吸着後には、可溶化画分１ペースト中に０．５３ＩＵ／ｍＬで
あることが観察された第II因子が検出されなかった。凝固可能タンパクは、７７
％であることが観察され、FXIII、ブラスミノゲンおよびフィブロネクチンの濃
度は比較的変化しなかった。血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量は
、約２２％低減したが、これは、この段階で予想された結果である。 Gly／NaCl沈降は、フィブリノゲンの純度を９２％の凝固可能物まで増加させ
、かつフィブロネクチンを無視できるレベルまで除いた。
【００７７】
表５
スーパーローズ６解析
【表５】
【００７８】
サンプル処理におけるスーパーローズ解析は、Gly／NaCl沈降工程で、全領域
の５９％から７４％へとフィブリノゲンピークの増大を伴うフィブリノゲンの精
製を示した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析 可溶化画分１ペーストのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、抽出１で生成されたものと
非常に類似したタンパク組成を示した。また、処理サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
解析も、Gly／NaCl工程でフィブリノゲンの精製を示した。可溶化Gly／NaCl沈降
サンプルは、還元条件下で分析した場合に、より少ない高分子量タンパクバンド
を含み、非還元条件下で分析した場合に、２００ｋＤａ、１５０ｋＤａおよび５
５ｋＤａのバンドの欠失を示した。
の５９％から７４％へとフィブリノゲンピークの増大を伴うフィブリノゲンの精
製を示した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析 可溶化画分１ペーストのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、抽出１で生成されたものと
非常に類似したタンパク組成を示した。また、処理サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
解析も、Gly／NaCl工程でフィブリノゲンの精製を示した。可溶化Gly／NaCl沈降
サンプルは、還元条件下で分析した場合に、より少ない高分子量タンパクバンド
を含み、非還元条件下で分析した場合に、２００ｋＤａ、１５０ｋＤａおよび５
５ｋＤａのバンドの欠失を示した。
【００７９】
1.2.3 抽出３（凍結ペースト）工程
画分１ペースト（２１．１３ｇ）を１７６ｍＬの抽出バッファーで抽出し、遠
心し、Ａｌ（ＯＨ）3吸着し、かつGly／NaCl沈降させた。Gly／NaClバッファー
に産物を加えた際に、一部の産物が凝固した。可溶化Gly／NaCl沈降物をＳＤ処
理し、イオン交換カラムに添加し、フィブリノゲンを塩含有バッファーに溶出し
た。 タンパク特徴決定 全てのサンプルを、全タンパク、凝固可能なタンパク、第XIII因子、第II因子
、についてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出
した（表６）。サイズ排除解析を、スーパーローズ６を用いて実施し、この結果
を表７に記載した。
心し、Ａｌ（ＯＨ）3吸着し、かつGly／NaCl沈降させた。Gly／NaClバッファー
に産物を加えた際に、一部の産物が凝固した。可溶化Gly／NaCl沈降物をＳＤ処
理し、イオン交換カラムに添加し、フィブリノゲンを塩含有バッファーに溶出し
た。 タンパク特徴決定 全てのサンプルを、全タンパク、凝固可能なタンパク、第XIII因子、第II因子
、についてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出
した（表６）。サイズ排除解析を、スーパーローズ６を用いて実施し、この結果
を表７に記載した。
【００８０】
表６
特徴決定一覧
【表６】
【００８１】
可溶化画分１ペーストの特徴決定は、サンプルが解凍時に凝固したので実施し
なかった。可溶化Gly／NaCl沈降物の一つのサンプルも解凍時に凝固し、結果と
して、この段階で第XIII因子レベルについて全くデータを入手できなかった。 分析されたサンプルは、先の抽出実験と類似のプロフィールを示した。凝固可
能タンパクは、Ａｌ（ＯＨ）3吸着後約６０％であり、Gly／NaCl沈降後、８０％
よりも高く増大した。第XIII因子は、Ａｌ（ＯＨ）3吸着後７ＩＵ／ｍＬで存在
し、第II因子は、検出不可能であった。血漿のキログラム当たりのフィブリノゲ
ンの収量は、Gly／NaCl沈降後、僅かに０．４ｇ／ｋｇと検出される低いもので
あった。ＧＡＳＦＰイオン交換カラムに添加して、プラスミノゲンからフィブリ
ノゲンを精製した。
なかった。可溶化Gly／NaCl沈降物の一つのサンプルも解凍時に凝固し、結果と
して、この段階で第XIII因子レベルについて全くデータを入手できなかった。 分析されたサンプルは、先の抽出実験と類似のプロフィールを示した。凝固可
能タンパクは、Ａｌ（ＯＨ）3吸着後約６０％であり、Gly／NaCl沈降後、８０％
よりも高く増大した。第XIII因子は、Ａｌ（ＯＨ）3吸着後７ＩＵ／ｍＬで存在
し、第II因子は、検出不可能であった。血漿のキログラム当たりのフィブリノゲ
ンの収量は、Gly／NaCl沈降後、僅かに０．４ｇ／ｋｇと検出される低いもので
あった。ＧＡＳＦＰイオン交換カラムに添加して、プラスミノゲンからフィブリ
ノゲンを精製した。
【００８２】
表７
スーパーローズ６解析
【表７】
【００８３】
スーパーローズ６解析は、Ａｌ（ＯＨ）3段階で非常に高レベルの低分子量タ
ンパクを示した。ここでも、Gly／NaCl沈降後に、全エリアの４０％から６０％
へとフィブリノゲン含量の増大を伴ってフィブリノゲンの精製が見られた。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析 可溶化画分１ペーストの第一サンプルは、サンプルが解凍時に凝固したのでＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで解析しなかった。還元および非還元条件下における、Ａｌ（Ｏ
Ｈ）3およびGly／NaCl段階後のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、フィブリノ
ゲンの精製を示す。イオン交換カラム溶出の分析は、主なタンパク成分がフィブ
リノゲンであることを示した。
ンパクを示した。ここでも、Gly／NaCl沈降後に、全エリアの４０％から６０％
へとフィブリノゲン含量の増大を伴ってフィブリノゲンの精製が見られた。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析 可溶化画分１ペーストの第一サンプルは、サンプルが解凍時に凝固したのでＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで解析しなかった。還元および非還元条件下における、Ａｌ（Ｏ
Ｈ）3およびGly／NaCl段階後のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、フィブリノ
ゲンの精製を示す。イオン交換カラム溶出の分析は、主なタンパク成分がフィブ
リノゲンであることを示した。
【００８４】
３７℃での安定性
可溶化画分１ペーストの第一のサンプル（２４時間）は、サンプルが解凍時に
凝固したのでＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析しなかった。可溶化画分１ペースト安定性
サンプルの残りは、３７℃で放置後２４時間から３２時間の間のいずれかで凝固
した。Ａｌ（ＯＨ）3サンプルの解析は、２４時間の時点でフィブリノゲン分解
の証拠を示した。 Gly／NaCl沈降後、フィブリノゲンは４４時間の時点で安定であったが、分解
は１４４時間の時点で明らかだった（７２時間サンプルは見られなかった）。２
００または５００ｍＭのεＡＣＡを、可溶化Gly／NaCl沈降物に添加したときに
、フィブリノゲンは２４０時間よりも安定であった。 イオン交換カラムからの溶出後、フィブリノゲンは、εＡＣＡを全く添加せず
に、少なくとも２０８時間（試験した最終時点）安定であった。
凝固したのでＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析しなかった。可溶化画分１ペースト安定性
サンプルの残りは、３７℃で放置後２４時間から３２時間の間のいずれかで凝固
した。Ａｌ（ＯＨ）3サンプルの解析は、２４時間の時点でフィブリノゲン分解
の証拠を示した。 Gly／NaCl沈降後、フィブリノゲンは４４時間の時点で安定であったが、分解
は１４４時間の時点で明らかだった（７２時間サンプルは見られなかった）。２
００または５００ｍＭのεＡＣＡを、可溶化Gly／NaCl沈降物に添加したときに
、フィブリノゲンは２４０時間よりも安定であった。 イオン交換カラムからの溶出後、フィブリノゲンは、εＡＣＡを全く添加せず
に、少なくとも２０８時間（試験した最終時点）安定であった。
【００８５】
1.2.4 抽出４工程
新鮮な画分１ペースト（４０．０ｇ）を、３３３ｍＬの抽出バッファーで抽出
し、遠心し、Ａｌ（ＯＨ）3吸着し、かつGly／NaCl沈降させた。εＡＣＡを、０
ｍＭ、２０ｍＭ、１２５ｍＭ、２５０ｍＭおよび５００ｍＭの濃度で可溶化Gly
／NaCl沈降物の２セットのサンプルに添加した。一方のグループのサンプルを、
３７℃で直ちにインキュベートし、経時的に安定性を評価した。他方のグループ
のサンプルを−８０℃で６０時間凍結貯蔵し、解凍し、安定性について３７℃で
インキュベートした。可溶化Gly／NaCl沈降物をＳＤ処理し、イオン交換カラム
に添加し、フィブリノゲンを塩含有バッファーに溶出した。 タンパク特徴決定 全てのサンプルを、全タンパク、凝固可能なタンパク、第XIII因子、第II因子
、およびフィブロネクチンについてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィ
ブリノゲンの収量を表８に算出した。第一の抽出後に残ったペレットを、０．８
ＭのＮａＣｌを含有するバッファーで再抽出した。このサンプルのタンパク特徴
決定および血漿ｋｇ当たりの収量を、表９に記載した。スーパーローズ６解析は
行わなかった。
し、遠心し、Ａｌ（ＯＨ）3吸着し、かつGly／NaCl沈降させた。εＡＣＡを、０
ｍＭ、２０ｍＭ、１２５ｍＭ、２５０ｍＭおよび５００ｍＭの濃度で可溶化Gly
／NaCl沈降物の２セットのサンプルに添加した。一方のグループのサンプルを、
３７℃で直ちにインキュベートし、経時的に安定性を評価した。他方のグループ
のサンプルを−８０℃で６０時間凍結貯蔵し、解凍し、安定性について３７℃で
インキュベートした。可溶化Gly／NaCl沈降物をＳＤ処理し、イオン交換カラム
に添加し、フィブリノゲンを塩含有バッファーに溶出した。 タンパク特徴決定 全てのサンプルを、全タンパク、凝固可能なタンパク、第XIII因子、第II因子
、およびフィブロネクチンについてアッセイし、血漿のキログラム当たりのフィ
ブリノゲンの収量を表８に算出した。第一の抽出後に残ったペレットを、０．８
ＭのＮａＣｌを含有するバッファーで再抽出した。このサンプルのタンパク特徴
決定および血漿ｋｇ当たりの収量を、表９に記載した。スーパーローズ６解析は
行わなかった。
【００８６】
表８
特徴決定一覧
【表８】
【００８７】
処理サンプルの特徴決定は、新鮮な画分１ペーストの先の抽出と一致する結果
を示した。約６８％の凝固可能なタンパクを、画分１ペーストから抽出した。Ａ
ｌ（ＯＨ）3処理は、第II因子を検出できないレベルまで低減し、Gly／NaCl沈降
は凝固可能なタンパクを８９％まで増大させ、フィブロネクチンを無視できるレ
ベルまで低減させた。可溶化画分１ペースト段階での血漿のｋｇ当たりのフィブ
リノゲンの収量は１．８５であったが、Ａｌ（ＯＨ）3処理およびGly／NaCl沈降
後には１．３５に落ち、これはこれらの工程で予想されるものであった。イオン
交換クロマトグラフィー工程での回収量は約７６％であった。 凍結ＧＡＳＦＰを解凍し、イオン交換カラムに添加した。溶出は凝固可能タン
パクが高レベルであることを示し、低レベルのプラスミノゲンを含んでいた。Ｇ
ＡＳＦＰのプラスミノゲンのレベルは、試験しなかった。それゆえイオン交換段
階でのプラスミノゲンの回収量は算出できなかった。しかしながら、溶出物中の
８ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲンと＜０．２μｇ／ｍＬのプラスミノゲンは、６０
ｍｇ／ｍＬの濃縮産物中において１．６μｇ／ｍＬ未満に匹敵する。この結果は
、イオン交換カラムが産物からプラスミノゲンを除くのに効率的に作用している
ことを示唆する。 １４．１３ｇの画分１ペースト（抽出＃１後に残ったもの）を、１１７．７ｍ
Ｌのフィブリノゲン抽出バッファー（０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）に可溶
化した。
を示した。約６８％の凝固可能なタンパクを、画分１ペーストから抽出した。Ａ
ｌ（ＯＨ）3処理は、第II因子を検出できないレベルまで低減し、Gly／NaCl沈降
は凝固可能なタンパクを８９％まで増大させ、フィブロネクチンを無視できるレ
ベルまで低減させた。可溶化画分１ペースト段階での血漿のｋｇ当たりのフィブ
リノゲンの収量は１．８５であったが、Ａｌ（ＯＨ）3処理およびGly／NaCl沈降
後には１．３５に落ち、これはこれらの工程で予想されるものであった。イオン
交換クロマトグラフィー工程での回収量は約７６％であった。 凍結ＧＡＳＦＰを解凍し、イオン交換カラムに添加した。溶出は凝固可能タン
パクが高レベルであることを示し、低レベルのプラスミノゲンを含んでいた。Ｇ
ＡＳＦＰのプラスミノゲンのレベルは、試験しなかった。それゆえイオン交換段
階でのプラスミノゲンの回収量は算出できなかった。しかしながら、溶出物中の
８ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲンと＜０．２μｇ／ｍＬのプラスミノゲンは、６０
ｍｇ／ｍＬの濃縮産物中において１．６μｇ／ｍＬ未満に匹敵する。この結果は
、イオン交換カラムが産物からプラスミノゲンを除くのに効率的に作用している
ことを示唆する。 １４．１３ｇの画分１ペースト（抽出＃１後に残ったもの）を、１１７．７ｍ
Ｌのフィブリノゲン抽出バッファー（０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）に可溶
化した。
【００８８】
表９
可溶化画分１ペースト＃２の特徴決定一覧
【表９】
【００８９】
それゆえ、血漿ｋｇ当たりのフィブリノゲンの全収量は、可溶化画分１ペース
ト段階における血漿ｋｇ当たり１．８５＋０．７ｇ＝２．５ｇのフィブリノゲン
として算出できた。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、全ての画分にフィブリノゲンの存在を示した。Gly
／NaCl処理後には、いくつかのタンパクのバンドが、還元条件下で観察され、タ
ンパクの特徴決定により見られたフィブリノゲン分子の精製を示している。
ト段階における血漿ｋｇ当たり１．８５＋０．７ｇ＝２．５ｇのフィブリノゲン
として算出できた。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、全ての画分にフィブリノゲンの存在を示した。Gly
／NaCl処理後には、いくつかのタンパクのバンドが、還元条件下で観察され、タ
ンパクの特徴決定により見られたフィブリノゲン分子の精製を示している。
【００９０】
３７℃での安定性
可溶化Gly／NaCl沈降物は、ゼロおよび２０ｍＭのεＡＣＡをサンプルに添加
した場合に６４時間安定であった。６４時間後、サンプルは凝固した。１２５ｍ
ＭのεＡＣＡの添加により、サンプルは７２時間安定であったが、分子の分解は
１００時間の時点で明らかであった。 ２５０ｍＭおよび５００ｍＭのεＡＣＡの添加は、可溶化Gly／NaCl沈降物の
安定性を１２４時間より増大させ、最終的なサンプルをとった。 ゼロまたは２０ｍＭのεＡＣＡを添加し、安定化試験を開始する前に−８０℃
で６０時間凍結させた可溶化Gly／NaClサンプルは、可溶化非凍結沈降物よりも
安定性が低いことが観察された。ゼロまたは２０ｍＭのεＡＣＡを添加すると、
非凍結サンプルの６４時間と比べて、サンプルは２４時間安定であったが、その
後、凝固した。しかしながら、１２５ｍＭ、２５０ｍＭ、および５００ｍＭのε
ＡＣＡの添加は、＞９６時間、最終時点までフィブリノゲンの安定性を増大させ
、非凍結サンプルで見られた１２４時間から顕著に異なるものではなかった。か
くして、フィブリノゲンは、少なくとも１２５ｍＭのεＡＣＡの添加だけで−８
０℃で安定であった。 イオン交換溶出の安定性の解析は、εＡＣＡを添加することなく＞１７０時間
であることを示した。
した場合に６４時間安定であった。６４時間後、サンプルは凝固した。１２５ｍ
ＭのεＡＣＡの添加により、サンプルは７２時間安定であったが、分子の分解は
１００時間の時点で明らかであった。 ２５０ｍＭおよび５００ｍＭのεＡＣＡの添加は、可溶化Gly／NaCl沈降物の
安定性を１２４時間より増大させ、最終的なサンプルをとった。 ゼロまたは２０ｍＭのεＡＣＡを添加し、安定化試験を開始する前に−８０℃
で６０時間凍結させた可溶化Gly／NaClサンプルは、可溶化非凍結沈降物よりも
安定性が低いことが観察された。ゼロまたは２０ｍＭのεＡＣＡを添加すると、
非凍結サンプルの６４時間と比べて、サンプルは２４時間安定であったが、その
後、凝固した。しかしながら、１２５ｍＭ、２５０ｍＭ、および５００ｍＭのε
ＡＣＡの添加は、＞９６時間、最終時点までフィブリノゲンの安定性を増大させ
、非凍結サンプルで見られた１２４時間から顕著に異なるものではなかった。か
くして、フィブリノゲンは、少なくとも１２５ｍＭのεＡＣＡの添加だけで−８
０℃で安定であった。 イオン交換溶出の安定性の解析は、εＡＣＡを添加することなく＞１７０時間
であることを示した。
【００９１】
1.2.5 抽出バッファーへのATIIIの添加
新鮮かつ凍結された画分１ペースト（６ｇ）を、５０ｍＬの抽出バッファー（
±１ＩＵ／ｍＬ ATIII）で抽出し、遠心し、Ａｌ（ＯＨ）3吸着させ、Gly／NaCl
沈降させた。この沈降物を半分に分けた。半分の沈降物を−８０℃に貯蔵し、他
の半分をバッファーＤを用いて可溶化した。可溶化沈降物を再び半分に分け、０ εＡＣＡまたは２５０ｍＭ εＡＣＡを加えた。このサンプルを、３７℃で安定
性について評価した。
±１ＩＵ／ｍＬ ATIII）で抽出し、遠心し、Ａｌ（ＯＨ）3吸着させ、Gly／NaCl
沈降させた。この沈降物を半分に分けた。半分の沈降物を−８０℃に貯蔵し、他
の半分をバッファーＤを用いて可溶化した。可溶化沈降物を再び半分に分け、０ εＡＣＡまたは２５０ｍＭ εＡＣＡを加えた。このサンプルを、３７℃で安定
性について評価した。
【００９２】
タンパク特徴決定
抽出１
新鮮な画分１ペースト（６．０４ｇ）を、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ ε
ＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３を含む５０．３４ｇのバッファーに抽
出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファー
を用いて沈降させた。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１０）。
ＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３を含む５０．３４ｇのバッファーに抽
出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファー
を用いて沈降させた。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１０）。
【００９３】
表１０
特徴決定一覧
【表１０】
【００９４】
全タンパクおよび凝固可能タンパクに関する処理サンプルの特徴決定は、先の
結果と一致した。約６０％の凝固可能なタンパクが画分１ペーストから抽出され
、これはGly／NaCl沈降段階後に８５％の凝固可能タンパクとなるまでに増大し
た。収量は、先の抽出よりも低く、血漿のキログラム当たりに０．８５ｇのフィ
ブリノゲンが抽出された。
結果と一致した。約６０％の凝固可能なタンパクが画分１ペーストから抽出され
、これはGly／NaCl沈降段階後に８５％の凝固可能タンパクとなるまでに増大し
た。収量は、先の抽出よりも低く、血漿のキログラム当たりに０．８５ｇのフィ
ブリノゲンが抽出された。
【００９５】
抽出２
新鮮な画分１ペースト（５．９８ｇ）を、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ ε
ＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１ＩＵ／ｍｌ ATIII、ｐＨ７．３を含む４９．８
４ｇのバッファーに抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し
、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１１）。
ＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１ＩＵ／ｍｌ ATIII、ｐＨ７．３を含む４９．８
４ｇのバッファーに抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し
、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１１）。
【００９６】
表１１
可溶化画分１ペーストの特徴決定一覧
【表１１】
【００９７】
１ＩＵ／ｍＬ ATIIIを含有する抽出バッファーを用いて生成した処理サンプル
の特徴決定は、ATIIIを含まない抽出バッファーと非常に類似していた。約６５
％の凝固可能なタンパクが画分１ペーストから抽出され、これはGly／NaCl沈降
段階後に８５％の凝固可能タンパクとなるまでに増大した。収量は、先の抽出よ
りも低く、血漿のキログラム当たり０．７４ｇのフィブリノゲンが抽出された。
の特徴決定は、ATIIIを含まない抽出バッファーと非常に類似していた。約６５
％の凝固可能なタンパクが画分１ペーストから抽出され、これはGly／NaCl沈降
段階後に８５％の凝固可能タンパクとなるまでに増大した。収量は、先の抽出よ
りも低く、血漿のキログラム当たり０．７４ｇのフィブリノゲンが抽出された。
【００９８】
抽出３
凍結画分１ペースト（６．０６ｇ）を、解凍し、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５
ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３を含む５０．５ｇのバッファー
に抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッフ
ァーを用いて沈降させた。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１２）。
ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３を含む５０．５ｇのバッファー
に抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッフ
ァーを用いて沈降させた。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１２）。
【００９９】
表１２
可溶化画分１ペーストの特徴決定一覧
【表１２】
【０１００】
凍結画分１ペーストの抽出後に生成された処理サンプルの特徴決定は、６７％
の凝固可能なタンパクの抽出を示し、これは、Gly／NaCl沈降後に８４％にまで
増大した。これらの凝固可能なタンパクの結果は、新鮮な、および凍結した、ペ
ースト出発物質の間で一致していた。血漿のキログラム当たりの収量は、新鮮な
ペーストから抽出されるものよりも低く、血漿のキログラム当たりに０．６ｇ未
満のフィブリノゲンが抽出された。
の凝固可能なタンパクの抽出を示し、これは、Gly／NaCl沈降後に８４％にまで
増大した。これらの凝固可能なタンパクの結果は、新鮮な、および凍結した、ペ
ースト出発物質の間で一致していた。血漿のキログラム当たりの収量は、新鮮な
ペーストから抽出されるものよりも低く、血漿のキログラム当たりに０．６ｇ未
満のフィブリノゲンが抽出された。
【０１０１】
抽出４
凍結画分１ペースト（６．０７ｇ）を、解凍し、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５
ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、ｐＨ７．３を含む５
０．５９ｇのバッファーに抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で
処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１３）。
ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、ｐＨ７．３を含む５
０．５９ｇのバッファーに抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で
処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１３）。
【０１０２】
表１３
可溶化画分１ペーストの特徴決定一覧
【表１３】
【０１０３】
１ＩＵ／ｍＬ ATIIIを含有するバッファー中の凍結画分１ペーストの抽出後に
生成された処理サンプルの特徴決定は、先の抽出物±ATIIIから得られた結果と
、凝固可能タンパクおよび収量に関して非常に類似した結果を示した。 ３７℃での安定性 各抽出実験からの処理安定性サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を実施した。 新鮮（４℃）および凍結（−８０℃）ペーストからの、ATIIIを含む（＋）お
よび含まない（−）バッファーに抽出した、可溶化画分１ペースト、Ａｌ（ＯＨ
）3吸着、およびGly／NaCl沈降サンプルの安定性（時間）を以下の表１４に記載
した。
生成された処理サンプルの特徴決定は、先の抽出物±ATIIIから得られた結果と
、凝固可能タンパクおよび収量に関して非常に類似した結果を示した。 ３７℃での安定性 各抽出実験からの処理安定性サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を実施した。 新鮮（４℃）および凍結（−８０℃）ペーストからの、ATIIIを含む（＋）お
よび含まない（−）バッファーに抽出した、可溶化画分１ペースト、Ａｌ（ＯＨ
）3吸着、およびGly／NaCl沈降サンプルの安定性（時間）を以下の表１４に記載
した。
【０１０４】
表１４
フィブリノゲンの安定性（時間）
【表１４】
【０１０５】
凍結／解凍／可溶化ＧＡＳＦＰの分析
凍結Gly／NaCl沈降物を３７℃で解凍し、３０℃でバッファーＤ＋１００ｍＭ
εＡＣＡを用いて可溶化した。この沈降物を、３０分以内に可溶化した。次いで
、サンプルを、以下の表１５において全タンパクおよび凝固可能なタンパクにつ
いてアッセイし、および３７℃での安定性についてアッセイした。
εＡＣＡを用いて可溶化した。この沈降物を、３０分以内に可溶化した。次いで
、サンプルを、以下の表１５において全タンパクおよび凝固可能なタンパクにつ
いてアッセイし、および３７℃での安定性についてアッセイした。
【０１０６】
表１５
解凍および可溶化Gly／NaCl沈降物
【表１５】
【０１０７】
タンパク特徴決定は、沈降物の凍結が、可溶化Gly／NaCl沈降物におけるフィ
ブリノゲン／ｋｇ血漿の収量または凝固可能なタンパクのレベルに影響しないこ
とを示した。 解凍した可溶化Gly／NaCl沈降物の安定性分析は、全ての抽出条件からのフィ
ブリノゲンが１２０時間安定であることを示した。この結果は、非凍結Gly／NaC
l沈降物安定性の結果と一致する。
ブリノゲン／ｋｇ血漿の収量または凝固可能なタンパクのレベルに影響しないこ
とを示した。 解凍した可溶化Gly／NaCl沈降物の安定性分析は、全ての抽出条件からのフィ
ブリノゲンが１２０時間安定であることを示した。この結果は、非凍結Gly／NaC
l沈降物安定性の結果と一致する。
【０１０８】
1.2.6 抽出バッファーへのヘパリンの添加
新鮮な画分１ペースト（６ｇ）を５０ｇの適切な抽出バッファーに抽出し、Ａ
ｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。この沈降物を
半分に分けた。半分の沈降物を−８０℃に貯蔵し、他の半分をバッファーＤを用
いて可溶化した。可溶化沈降物を再び半分に分け、２５０ｍＭ εＡＣＡを一方
の半分に加え、もう一方の半分にはεＡＣＡを全く加えなかった。このサンプル
を、３７℃で安定性について評価した。 タンパク特徴決定 抽出１ 新鮮な画分１ペースト（６．０ｇ）を、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡ
ＣＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、ｐＨ７．３を含む５０．
０ｇの抽出バッファーに抽出した。可溶化画分１ペーストを、Ａｌ（ＯＨ）3で
処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１６）。
ｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。この沈降物を
半分に分けた。半分の沈降物を−８０℃に貯蔵し、他の半分をバッファーＤを用
いて可溶化した。可溶化沈降物を再び半分に分け、２５０ｍＭ εＡＣＡを一方
の半分に加え、もう一方の半分にはεＡＣＡを全く加えなかった。このサンプル
を、３７℃で安定性について評価した。 タンパク特徴決定 抽出１ 新鮮な画分１ペースト（６．０ｇ）を、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡ
ＣＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、ｐＨ７．３を含む５０．
０ｇの抽出バッファーに抽出した。可溶化画分１ペーストを、Ａｌ（ＯＨ）3で
処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１６）。
【０１０９】
表１６
特徴決定一覧
【表１６】
【０１１０】
２０ＩＵ／ｍＬのヘパリンを含有するバッファーを用いた抽出から得られた処
理サンプルの特徴決定は、元の抽出バッファーを用いて得られたものと非常に類
似していた。凝固可能なタンパクは抽出後６７％であり、Gly／NaCl沈降後は８
８％までに増加した。収量は高く、１．６７ｇのフィブリノゲンが血漿のキログ
ラム当たりに抽出された。
理サンプルの特徴決定は、元の抽出バッファーを用いて得られたものと非常に類
似していた。凝固可能なタンパクは抽出後６７％であり、Gly／NaCl沈降後は８
８％までに増加した。収量は高く、１．６７ｇのフィブリノゲンが血漿のキログ
ラム当たりに抽出された。
【０１１１】
抽出２
新鮮な画分１ペースト（６．０２ｇ）を、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ ε
ＡＣＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、ｐＨ７．３を含む５０
．１７ｇのバッファーに抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処
理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１７）。
ＡＣＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、ｐＨ７．３を含む５０
．１７ｇのバッファーに抽出した。可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処
理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１７）。
【０１１２】
表１７
特徴決定一覧
【表１７】
【０１１３】
６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリンを含有するバッファーを用いて抽出した画分１ペー
ストからの処理サンプルの特徴決定は、全タンパクおよび凝固可能タンパク、並
びにフィブリノゲン収量に関して、元の抽出バッファーと非常に類似した結果を
示した。
ストからの処理サンプルの特徴決定は、全タンパクおよび凝固可能タンパク、並
びにフィブリノゲン収量に関して、元の抽出バッファーと非常に類似した結果を
示した。
【０１１４】
抽出３
新鮮な画分１ペースト（６．０３ｇ）を、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ ε
ＡＣＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、
ｐＨ７．３を含む５０．２５ｇのバッファーに抽出した。可溶化画分１ペースト
をＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１８）。
ＡＣＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、
ｐＨ７．３を含む５０．２５ｇのバッファーに抽出した。可溶化画分１ペースト
をＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１８）。
【０１１５】
表１８
特徴決定一覧
【表１８】
【０１１６】
２０ＩＵ／ｍＬ ヘパリンおよびATIIIを含有するバッファーに抽出した画分１
ペーストからの処理サンプルの特徴決定は、元の抽出バッファーを用いて得られ
たものと非常に類似した結果を示した。収量は低く、血漿のキログラム当たり１
ｇのフィブリノゲンが抽出された。
ペーストからの処理サンプルの特徴決定は、元の抽出バッファーを用いて得られ
たものと非常に類似した結果を示した。収量は低く、血漿のキログラム当たり１
ｇのフィブリノゲンが抽出された。
【０１１７】
抽出４
新鮮な画分１ペースト（６．０１ｇ）を、２０ｍＭ クエン酸Ｎａ、５ｍＭ ε
ＡＣＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、
ｐＨ７．３を含む５０．０９ｇのバッファーに抽出した。可溶化画分１ペースト
をＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１９）。
ＡＣＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリン、１ＩＵ／ｍＬ ATIII、
ｐＨ７．３を含む５０．０９ｇのバッファーに抽出した。可溶化画分１ペースト
をＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaClバッファーを用いて沈降させた。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表１９）。
【０１１８】
表１９
特徴決定一覧
【表１９】
【０１１９】
再び、可溶化画分１ペーストからGly／NaCl沈降物までの全タンパクおよび凝
固可能タンパクの特徴決定の結果は一致した。Gly／NaCl沈降段階での顕著な損
失に注目すべきである。しかしながら、先の結果に基づけば、ヘパリンとATIII
の存在は、この工程での損失に寄与しないと考えられる。
固可能タンパクの特徴決定の結果は一致した。Gly／NaCl沈降段階での顕著な損
失に注目すべきである。しかしながら、先の結果に基づけば、ヘパリンとATIII
の存在は、この工程での損失に寄与しないと考えられる。
【０１２０】
３７℃での安定性
新鮮ペーストからの、２０ＩＵ／ｍＬまたは６０ＩＵ／ｍＬのヘパリンを含み
、かつATIIIを含む（＋）および含まない（−）バッファーに抽出した、可溶化
画分１ペースト、Ａｌ（ＯＨ）3吸着、およびGly／NaCl沈降サンプルの安定性を
以下の表２０に記載した。
、かつATIIIを含む（＋）および含まない（−）バッファーに抽出した、可溶化
画分１ペースト、Ａｌ（ＯＨ）3吸着、およびGly／NaCl沈降サンプルの安定性を
以下の表２０に記載した。
【０１２１】
表２０
フィブリノゲンの安定性
【表２０】
【０１２２】
抽出バッファーにおけるATIIIの存在は、３７℃において、サンプルの安定性
を増大するように見えた。６０ＩＵ／ｍＬのヘパリンの存在は、この安定性を、
２５０ｍＭのεＡＣＡを添加した後に得られるレベルにまでさらに増大させるよ
うに見えた。
を増大するように見えた。６０ＩＵ／ｍＬのヘパリンの存在は、この安定性を、
２５０ｍＭのεＡＣＡを添加した後に得られるレベルにまでさらに増大させるよ
うに見えた。
【０１２３】
凍結／解凍／可溶化ＧＡＳＦＰの分析
凍結Gly／NaCl沈降物を３７℃で解凍し、３０℃でバッファーＤ＋１００ｍＭ
εＡＣＡを用いて可溶化した。この沈降物を、３０分以内に可溶化した。次いで
、サンプルを、以下の表２１において全タンパクおよび凝固可能なタンパクにつ
いてアッセイし、および３７℃での安定性についてアッセイした。
εＡＣＡを用いて可溶化した。この沈降物を、３０分以内に可溶化した。次いで
、サンプルを、以下の表２１において全タンパクおよび凝固可能なタンパクにつ
いてアッセイし、および３７℃での安定性についてアッセイした。
【０１２４】
表２１
解凍および可溶化Gly／NaCl沈降物
【表２１】
【０１２５】
タンパク特徴決定は、沈降物の凍結が、可溶化Gly／NaCl沈降物における収量
または凝固可能なタンパクのレベルに影響しないことを示した。抽出４のGly／N
aCl沈降からの収量は低いが、これは、非凍結ＧＡＳＦＰに観察された低い収量
と関連するものであった。 解凍した可溶化Gly／NaCl沈降物の安定性分析は、抽出１からのフィブリノゲ
ンが少なくとも３６時間（最終時点）安定であり、抽出２が少なくとも７２時間
（最終時点）安定であり、抽出３が少なくとも７２時間（最終時点）安定であり
、そして抽出４が９６時間安定であることを示した。この結果は、非凍結Gly／N
aCl沈降物安定性の結果と一致する。
または凝固可能なタンパクのレベルに影響しないことを示した。抽出４のGly／N
aCl沈降からの収量は低いが、これは、非凍結ＧＡＳＦＰに観察された低い収量
と関連するものであった。 解凍した可溶化Gly／NaCl沈降物の安定性分析は、抽出１からのフィブリノゲ
ンが少なくとも３６時間（最終時点）安定であり、抽出２が少なくとも７２時間
（最終時点）安定であり、抽出３が少なくとも７２時間（最終時点）安定であり
、そして抽出４が９６時間安定であることを示した。この結果は、非凍結Gly／N
aCl沈降物安定性の結果と一致する。
【０１２６】
1.2.7 濃度調査
濃度調査１
１．５ｇ、３ｇ、４．５ｇ、６ｇ、７．５ｇ、および９ｇの新鮮な画分１ペー
ストを、０．８Ｍ ＮａＣｌを含有する抽出バッファー５０ｇに可溶化した。全
てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血漿
のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表２２）。
ストを、０．８Ｍ ＮａＣｌを含有する抽出バッファー５０ｇに可溶化した。全
てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血漿
のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表２２）。
【０１２７】
表２２
可溶化画分１ペーストの特徴決定一覧
【表２２】
【０１２８】
画分１ペーストとバッファーとの比率に関わらず、抽出した凝固可能タンパク
のレベルは類似していた（図１参照）。 しかしながら、血漿のキログラム当たりに抽出されたフィブリノゲンの収量は
、一致しなかった（図２参照）。 この実験における最大収量は、ペースト：バッファー比が１：１１．１の場合
に得られた。２時間の抽出後には、１．５ｇ、３ｇおよび４．５ｇの画分１ペー
ストの抽出物が完全に可溶化されたが、６ｇ、７．５ｇおよび９ｇの画分１ペー
ストの抽出物は可溶化されなかったことに注意すべきである。これは、５０ｍＬ
バッファーにおける４．５ｇの画分１ペースト（１：１１．１）が、完全に抽出
される場合に、最大レベルのフィブリノゲンが抽出されることを示唆し得る。ペ
ーストと抽出バッファーとの比率が増すと、存在する全てのフィブリノゲンが抽
出されるわけではない。あるいは、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの
収量の差異は、出発物質の不均一性によるものかもしれない。
のレベルは類似していた（図１参照）。 しかしながら、血漿のキログラム当たりに抽出されたフィブリノゲンの収量は
、一致しなかった（図２参照）。 この実験における最大収量は、ペースト：バッファー比が１：１１．１の場合
に得られた。２時間の抽出後には、１．５ｇ、３ｇおよび４．５ｇの画分１ペー
ストの抽出物が完全に可溶化されたが、６ｇ、７．５ｇおよび９ｇの画分１ペー
ストの抽出物は可溶化されなかったことに注意すべきである。これは、５０ｍＬ
バッファーにおける４．５ｇの画分１ペースト（１：１１．１）が、完全に抽出
される場合に、最大レベルのフィブリノゲンが抽出されることを示唆し得る。ペ
ーストと抽出バッファーとの比率が増すと、存在する全てのフィブリノゲンが抽
出されるわけではない。あるいは、血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの
収量の差異は、出発物質の不均一性によるものかもしれない。
【０１２９】
濃度調査２
４．５ｇ、９ｇ、１３．５ｇ、１８ｇ、２２．５ｇおよび２７ｇを、０．８Ｍ
ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリンを含有する１５０ｍＬの抽出バッファーに
、３７℃で９０分間可溶化した。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表２３）。
、３７℃で９０分間可溶化した。 全てのサンプルを、全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、
血漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表２３）。
【０１３０】
表２３
可溶化画分１ペースト＃２の特徴決定一覧
【表２３】
【０１３１】
この実験では、９０分の抽出時間の後に、全ての画分１ペーストサンプルが、
完全に可溶化されたことに注意すべきである。 画分１ペーストとバッファーとの比率に関わらず、抽出した凝固可能タンパク
のレベルは類似していた（表２３参照）。 血漿のキログラム当たりに抽出されたフィブリノゲンの収量も、ペーストとバ
ッファーとの比率の範囲にわたって変化しなかった（図３）。これは、先の実験
の一致した結果（図２）が、ヘパリンペーストの不均一な性質によるものである
ことを示唆する。さらに、このデータは、より高いペースト：バッファー比を最
初の抽出に用いることができ、これはより少ない可溶化画分１ペースト量をもた
らすことを示唆している。
完全に可溶化されたことに注意すべきである。 画分１ペーストとバッファーとの比率に関わらず、抽出した凝固可能タンパク
のレベルは類似していた（表２３参照）。 血漿のキログラム当たりに抽出されたフィブリノゲンの収量も、ペーストとバ
ッファーとの比率の範囲にわたって変化しなかった（図３）。これは、先の実験
の一致した結果（図２）が、ヘパリンペーストの不均一な性質によるものである
ことを示唆する。さらに、このデータは、より高いペースト：バッファー比を最
初の抽出に用いることができ、これはより少ない可溶化画分１ペースト量をもた
らすことを示唆している。
【０１３２】
1.2.8 抽出温度の調査
新鮮な画分１ペースト（１８ｇ）を、１５０ｍＬのバッファー（２０ｍＭ ク
エン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）に、１ｇ：８
．３３ｇバッファーの比率で、２時間、室温および３７℃で抽出した。抽出の間
、サンプルを、３０分、６０分、９０分、および１２０分の時点で得た。可溶化
ペーストを遠心し、別のサンプルを得た（１２５分）。 全てのサンプルを全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血
漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表２４）。
エン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）に、１ｇ：８
．３３ｇバッファーの比率で、２時間、室温および３７℃で抽出した。抽出の間
、サンプルを、３０分、６０分、９０分、および１２０分の時点で得た。可溶化
ペーストを遠心し、別のサンプルを得た（１２５分）。 全てのサンプルを全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血
漿のキログラム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表２４）。
【０１３３】
表２４
可溶化画分１ペーストの特徴決定一覧
【表２４】
【０１３４】
ＲＴおよび３７℃で抽出した全タンパクおよび凝固可能タンパクは経時的に変
化しなかった（図４参照）。 しかしながら、収量の算出は、３７℃で抽出した画分１ペーストから抽出され
たフィブリノゲンレベルが、室温であらゆる時点で抽出されたものよりも高いこ
とを示した。また、画分１ペーストは、室温で２時間抽出した後では完全には可
溶化されなかったが、３７℃で２時間抽出した後には完全に可溶化されていたこ
とにも注意すべきである（図５参照）。
化しなかった（図４参照）。 しかしながら、収量の算出は、３７℃で抽出した画分１ペーストから抽出され
たフィブリノゲンレベルが、室温であらゆる時点で抽出されたものよりも高いこ
とを示した。また、画分１ペーストは、室温で２時間抽出した後では完全には可
溶化されなかったが、３７℃で２時間抽出した後には完全に可溶化されていたこ
とにも注意すべきである（図５参照）。
【０１３５】
1.2.9 製造規模の抽出
抽出１
新鮮な画分１ペースト（２０．０ｋｇ）を、３７℃で、９０分間、２０ｍＭ
クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリ
ン、ｐＨ７．３のバッファーに、１ｇペースト：８．３３ｇバッファーの比率で
抽出した。 可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaCl沈降を行った。こ
の沈降物を二つに分け、半分の沈降物を１００ｍＭのεＡＣＡを含有するバッフ
ァーＤに可溶化し、他の半分を−８０℃で凍結させた。この可溶化したGly／NaC
l沈降物の半分を、次いでＳＤで処理し、MacroPrepカラムに添加した。この溶出
物を回収し、サンプル化し、−８０℃で凍結させた。他の半分をＳＤで処理し、
湿熱処理し、MacroPrepカラムに添加した。溶出物を回収し、サンプル化し、−
８０℃で凍結させた。この凍結させたGly／NaClペレットを解凍し、可溶化し（
ＦＴＲ）、全タンパクおよび凝固可能タンパク用のサンプルとした。全てのサン
プルを全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血漿のキログラ
ム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表２５）。
クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリ
ン、ｐＨ７．３のバッファーに、１ｇペースト：８．３３ｇバッファーの比率で
抽出した。 可溶化画分１ペーストをＡｌ（ＯＨ）3で処理し、Gly／NaCl沈降を行った。こ
の沈降物を二つに分け、半分の沈降物を１００ｍＭのεＡＣＡを含有するバッフ
ァーＤに可溶化し、他の半分を−８０℃で凍結させた。この可溶化したGly／NaC
l沈降物の半分を、次いでＳＤで処理し、MacroPrepカラムに添加した。この溶出
物を回収し、サンプル化し、−８０℃で凍結させた。他の半分をＳＤで処理し、
湿熱処理し、MacroPrepカラムに添加した。溶出物を回収し、サンプル化し、−
８０℃で凍結させた。この凍結させたGly／NaClペレットを解凍し、可溶化し（
ＦＴＲ）、全タンパクおよび凝固可能タンパク用のサンプルとした。全てのサン
プルを全タンパクおよび凝固可能タンパクについてアッセイし、血漿のキログラ
ム当たりのフィブリノゲンの収量を算出した（表２５）。
【０１３６】
表２５
特徴決定一覧
【表２５】
【０１３７】
製造規模で抽出された画分１ペーストの特徴決定は、小さい実験規模で以前に
抽出されたものと非常に類似した結果を示した。約６２％の凝固可能なタンパク
が、この段階で、血漿のキログラム当たり１．７８ｇのフィブリノゲンの収量で
抽出された。Gly／NaCl沈降後、凝固可能なタンパクは、予想通り８５％より多
く増大した。（解凍および可溶化後の凍結Gly／NaCl沈降物の分析は、全タンパ
ク、凝固可能タンパクまたは血漿のｋｇ当たりのフィブリノゲンの収量に全く損
失を示さなかった。）カラムを溶出した物質も、凝固可能タンパクと収量におい
て高かった。この溶出物のプラスミノゲンレベルは、０．６６μｇ／ｍＬで非常
に低く、これはこの工程を経てプラスミノゲンレベルの１６０倍の低減に匹敵す
る。 湿熱処理し、イオン交換カラムに添加した可溶化Gly／NaCl沈降物は、湿熱処
理の前後で凝固可能タンパクにおいて高かった。フィブリノゲンの損失は、湿熱
処理工程で全く見られなかった。湿熱処理した物質は、イオン交換カラムからの
溶出後、凝固可能タンパクにおいて高かったが、僅かに３０％だけのフィブリノ
ゲンしか回収されなかった。プラスミノゲンレベルも、０．４２μｇ／ｍＬで低
かった。ＧＡＳＦＰのイオン交換クロマトグラフィーおよび湿熱処理したＧＡＳ
ＦＰの結果は、産物からプラスミノゲンを除去するのに有効に作用していること
を示している。
抽出されたものと非常に類似した結果を示した。約６２％の凝固可能なタンパク
が、この段階で、血漿のキログラム当たり１．７８ｇのフィブリノゲンの収量で
抽出された。Gly／NaCl沈降後、凝固可能なタンパクは、予想通り８５％より多
く増大した。（解凍および可溶化後の凍結Gly／NaCl沈降物の分析は、全タンパ
ク、凝固可能タンパクまたは血漿のｋｇ当たりのフィブリノゲンの収量に全く損
失を示さなかった。）カラムを溶出した物質も、凝固可能タンパクと収量におい
て高かった。この溶出物のプラスミノゲンレベルは、０．６６μｇ／ｍＬで非常
に低く、これはこの工程を経てプラスミノゲンレベルの１６０倍の低減に匹敵す
る。 湿熱処理し、イオン交換カラムに添加した可溶化Gly／NaCl沈降物は、湿熱処
理の前後で凝固可能タンパクにおいて高かった。フィブリノゲンの損失は、湿熱
処理工程で全く見られなかった。湿熱処理した物質は、イオン交換カラムからの
溶出後、凝固可能タンパクにおいて高かったが、僅かに３０％だけのフィブリノ
ゲンしか回収されなかった。プラスミノゲンレベルも、０．４２μｇ／ｍＬで低
かった。ＧＡＳＦＰのイオン交換クロマトグラフィーおよび湿熱処理したＧＡＳ
ＦＰの結果は、産物からプラスミノゲンを除去するのに有効に作用していること
を示している。
【０１３８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
全てのサンプルが、還元条件下で４５から６６ｋＤａの間の主な３つのバンド
により見られるようなフィブリノゲンに富んでいた。 ３７℃での安定性 サンプルの安定性は、先の知見と類似していた（安定性ゲルに関する補足を参
照）。可溶化画分１ペーストは約１５時間安定であった。このサンプルは３７℃
で３９時間以前に凝固した。Ａｌ（ＯＨ）3吸着後、フィブリノゲン分子は４８
時間安定であった、そしてGly／NaCl沈降後は＞７０時間安定であった。イオン
交換カラムから溶出後、湿熱処理および非湿熱処理のフィブリノゲンは、少なく
とも１１３時間安定であった。
により見られるようなフィブリノゲンに富んでいた。 ３７℃での安定性 サンプルの安定性は、先の知見と類似していた（安定性ゲルに関する補足を参
照）。可溶化画分１ペーストは約１５時間安定であった。このサンプルは３７℃
で３９時間以前に凝固した。Ａｌ（ＯＨ）3吸着後、フィブリノゲン分子は４８
時間安定であった、そしてGly／NaCl沈降後は＞７０時間安定であった。イオン
交換カラムから溶出後、湿熱処理および非湿熱処理のフィブリノゲンは、少なく
とも１１３時間安定であった。
【０１３９】
抽出２
新鮮な画分１ペースト（３０．０ｋｇ）を、３７℃で、９０分間、２０ｍＭ
クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリ
ン、ｐＨ７．３のバッファーに、１ｇペースト：８．３３ｇバッファーの比率で
抽出した。 全タンパクおよび凝固可能タンパクを調べ、血漿のキログラム当たりの収量を
以下の表２６に算出した。
クエン酸Ｎａ、５ｍＭ εＡＣＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、６０ＩＵ／ｍＬ ヘパリ
ン、ｐＨ７．３のバッファーに、１ｇペースト：８．３３ｇバッファーの比率で
抽出した。 全タンパクおよび凝固可能タンパクを調べ、血漿のキログラム当たりの収量を
以下の表２６に算出した。
【０１４０】
表２６
可溶化画分１ペーストの特徴決定一覧
【表２６】
【０１４１】
この実験で抽出した画分１ペーストは、上記“濃度調査２”と題した箇所で用
いたものと同じバッチのものである。小規模では、血漿のキログラム当たりのフ
ィブリノゲンの平均収量は１．１６であった。この実験規模の１０００倍以上の
規模では、収量は１．４９ｇ／ｋｇ血漿であることが示された。これはさらに、
画分１ペーストの不均一性の結果として、製造規模で期待される収量を象徴しな
いことを示唆する。 これら二つの製造規模の抽出の結果は、血漿のキログラム当たりのフィブリノ
ゲンの予期される収量が１．５−１．８ｇ／ｋｇであることを示す。
いたものと同じバッチのものである。小規模では、血漿のキログラム当たりのフ
ィブリノゲンの平均収量は１．１６であった。この実験規模の１０００倍以上の
規模では、収量は１．４９ｇ／ｋｇ血漿であることが示された。これはさらに、
画分１ペーストの不均一性の結果として、製造規模で期待される収量を象徴しな
いことを示唆する。 これら二つの製造規模の抽出の結果は、血漿のキログラム当たりのフィブリノ
ゲンの予期される収量が１．５−１．８ｇ／ｋｇであることを示す。
【０１４２】
1.2.10 フィブリノゲン精製のための出発物質としての画分１ペーストおよびヘ
パリンペーストの比較 この報告で説明した実験から得られたデータを、以下の表２７にまとめる。
パリンペーストの比較 この報告で説明した実験から得られたデータを、以下の表２７にまとめる。
【０１４３】
表２７
５０ｍＬのバッファーに対して６ｇのペーストの比率で抽出した
新鮮な画分１ペーストおよびヘパリンペーストからの収量の比較
【表２７】
【０１４４】
画分１ペーストとヘパリンペーストの比較は、血漿のｋｇ当たりに生成された
フィブリノゲンの収量に顕著な増大を示した。 安定性に関する画分１ペーストとヘパリンペーストの比較は、両方の処理を介
してフィブリノゲンの安定性が増すことを示した。最終的なフィブリノゲン濃度
は、出発物質に関わりなく同様に安定であった。
フィブリノゲンの収量に顕著な増大を示した。 安定性に関する画分１ペーストとヘパリンペーストの比較は、両方の処理を介
してフィブリノゲンの安定性が増すことを示した。最終的なフィブリノゲン濃度
は、出発物質に関わりなく同様に安定であった。
【０１４５】
1.3 論評
フィブリノゲンを、小規模で画分１ペーストから最初に抽出した。ATIIIとヘ
パリンをバッファーに加える効果を評価し、かつ、抽出処理の温度の影響を評価
するために実験した。結果は、抽出バッファーにおけるヘパリンの存在が、処理
のこの段階およびその後の段階でフィブリノゲン分子の安定性を増加することを
示した。同じ安定性は、可溶化Gly／NaCl段階で、少なくとも１２５ｍＭのεＡ
ＣＡを添加することによっても得られた。 ３７℃で抽出を行うことにより、フィブリノゲンの抽出率、および血漿のキロ
グラム当たりのフィブリノゲンの収量を増加することが示された。かくして、画
分１ペーストについて推奨される抽出条件は、２０ｍＭ クエン酸三ナトリウム(
Tri-sodium citrate)、０．８Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ εＡＣＡ、６０ＩＵ／ｍＬ
ヘパリン、ｐＨ７．３、３７℃で９０分間の抽出である。
パリンをバッファーに加える効果を評価し、かつ、抽出処理の温度の影響を評価
するために実験した。結果は、抽出バッファーにおけるヘパリンの存在が、処理
のこの段階およびその後の段階でフィブリノゲン分子の安定性を増加することを
示した。同じ安定性は、可溶化Gly／NaCl段階で、少なくとも１２５ｍＭのεＡ
ＣＡを添加することによっても得られた。 ３７℃で抽出を行うことにより、フィブリノゲンの抽出率、および血漿のキロ
グラム当たりのフィブリノゲンの収量を増加することが示された。かくして、画
分１ペーストについて推奨される抽出条件は、２０ｍＭ クエン酸三ナトリウム(
Tri-sodium citrate)、０．８Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ εＡＣＡ、６０ＩＵ／ｍＬ
ヘパリン、ｐＨ７．３、３７℃で９０分間の抽出である。
【０１４６】
製造規模では、画分１ペーストの抽出は、研究規模の７５０倍より大きな規模
で行った。これらの大規模な実験では、画分１ペーストは、最適化バッファー（
ヘパリンを含有し、３７℃で実施）で抽出され、結果的な収量は１．７８ｇ／ｋ
ｇ血漿および１．４９ｇ／ｋｇ血漿であった。同じバッチの画分１ペーストを、
同一の抽出条件下で実験規模および製造規模の両方で抽出したところ、得られた
収量はそれぞれ、１．１５ｇ／ｋｇおよび１．４９ｇ／ｋｇであった。可溶化画
分１ペースト段階では血漿のキログラム当たり１．５ｇのフィブリノゲンという
予想収量であったが、画分１ペーストからの収量は、ヘパリンペーストから抽出
されたもの（０．４２ｇ／ｋｇ血漿）よりも顕著に高かった。 種々の画分１ペースト：抽出バッファー比は、４．５ｇ：５０ｍＬバッファー
（１：１１．１の比）が最も高い収量／ｋｇ血漿を得るのに最適であるというこ
とを、最初の小規模の実験で示唆した。しかしながら、この規模の三倍で、改善
された抽出バッファーを用いて行ったその後の実験では、最も高いペースト：バ
ッファー比（１：５．５）であっても、全てのフィブリノゲンが抽出された。こ
の結果は、ヘパリンペースト（１：８．３３）と比較して、より多くの量の画分
１ペーストが、抽出バッファーに可溶化されうることを示唆しており、これはよ
り小さい全抽出量とする。
で行った。これらの大規模な実験では、画分１ペーストは、最適化バッファー（
ヘパリンを含有し、３７℃で実施）で抽出され、結果的な収量は１．７８ｇ／ｋ
ｇ血漿および１．４９ｇ／ｋｇ血漿であった。同じバッチの画分１ペーストを、
同一の抽出条件下で実験規模および製造規模の両方で抽出したところ、得られた
収量はそれぞれ、１．１５ｇ／ｋｇおよび１．４９ｇ／ｋｇであった。可溶化画
分１ペースト段階では血漿のキログラム当たり１．５ｇのフィブリノゲンという
予想収量であったが、画分１ペーストからの収量は、ヘパリンペーストから抽出
されたもの（０．４２ｇ／ｋｇ血漿）よりも顕著に高かった。 種々の画分１ペースト：抽出バッファー比は、４．５ｇ：５０ｍＬバッファー
（１：１１．１の比）が最も高い収量／ｋｇ血漿を得るのに最適であるというこ
とを、最初の小規模の実験で示唆した。しかしながら、この規模の三倍で、改善
された抽出バッファーを用いて行ったその後の実験では、最も高いペースト：バ
ッファー比（１：５．５）であっても、全てのフィブリノゲンが抽出された。こ
の結果は、ヘパリンペースト（１：８．３３）と比較して、より多くの量の画分
１ペーストが、抽出バッファーに可溶化されうることを示唆しており、これはよ
り小さい全抽出量とする。
【０１４７】
可溶化画分１ペーストのタンパク特徴決定は、可溶化ヘパリンペーストとの類
似性と差異を示した。各出発物質から得られた凝固可能なタンパクの量は、約６
５％で類似している。プラスミノゲンおよび第XIII因子のレベルは、ヘパリンペ
ーストから抽出されたものよりも可溶化画分１ペーストでより高かったが、フィ
ブロネクチンのレベルは顕著に低かった。可溶化画分１ペーストがヘパリンペー
スト法を用いてさらに処理される場合には、この物質は、後の精製工程で、ヘパ
リンペースト物質と同様に挙動した。アルヒドロゲル吸着は、第II因子を検出不
能なレベルにまで低減し、これは３７℃でのフィブリノゲンの安定性の増大に関
連する。Gly／NaCl沈降は、８０％より高い凝固可能タンパクまでにフィブリノ
ゲンの精製をもたらし、かつフィブロネクチンの減少を無視できるレベルとした
。イオン交換クロマトグラフィーは、溶出物中においてプラスミノゲンを無視で
きるレベルにまで低減し、かつ、フィブリノゲンの安定性を、ヘパリンペースト
溶出物の安定性と同等な約１２０時間までに増大させることが示された。 画分１ペーストは別の産生処理の副生成物であるので、フィブリノゲン製造処
理を開始する前の段階で産物を保持することが有利である。ヘパリンペースト、
第VIII因子濃縮物の副生成物は、かつて抽出された凝固可能なタンパクの結果的
なレベルに影響を与えることなく、−８０℃で１３ヶ月までの間凍結貯蔵するこ
とができる。
似性と差異を示した。各出発物質から得られた凝固可能なタンパクの量は、約６
５％で類似している。プラスミノゲンおよび第XIII因子のレベルは、ヘパリンペ
ーストから抽出されたものよりも可溶化画分１ペーストでより高かったが、フィ
ブロネクチンのレベルは顕著に低かった。可溶化画分１ペーストがヘパリンペー
スト法を用いてさらに処理される場合には、この物質は、後の精製工程で、ヘパ
リンペースト物質と同様に挙動した。アルヒドロゲル吸着は、第II因子を検出不
能なレベルにまで低減し、これは３７℃でのフィブリノゲンの安定性の増大に関
連する。Gly／NaCl沈降は、８０％より高い凝固可能タンパクまでにフィブリノ
ゲンの精製をもたらし、かつフィブロネクチンの減少を無視できるレベルとした
。イオン交換クロマトグラフィーは、溶出物中においてプラスミノゲンを無視で
きるレベルにまで低減し、かつ、フィブリノゲンの安定性を、ヘパリンペースト
溶出物の安定性と同等な約１２０時間までに増大させることが示された。 画分１ペーストは別の産生処理の副生成物であるので、フィブリノゲン製造処
理を開始する前の段階で産物を保持することが有利である。ヘパリンペースト、
第VIII因子濃縮物の副生成物は、かつて抽出された凝固可能なタンパクの結果的
なレベルに影響を与えることなく、−８０℃で１３ヶ月までの間凍結貯蔵するこ
とができる。
【０１４８】
出発物質としての凍結画分１ペーストの安定性は有望である。イオン交換カラ
ムに関して処理した後では、産物は優れた安定性を示した（＞２０８時間）。後
の実験では（セクション４．５）、凍結画分１ペーストを、ATIIIの存在下およ
び不在下で抽出した。いずれのバッファーにおいても、凍結画分１ペーストの抽
出後には操作上の問題はなく、ＳＦＰとＡＳＦＰの安定性は、先のまたは後の実
験について観察されたものよりもはるかに高かった。 また、可溶化の前にGly／NaCl沈降段階でこの処理を用いる可能性を評価する
ために実験を行った。−８０℃で凍結され、その後解凍され、可溶化されたGly
／NaClペレットの結果は、この実施時点が、凝固可能タンパクに関する品質、安
定性、または収量を落とさないことを示した。 ここに示した結果は、画分Ｉペーストがフィブリノゲンの精製に適した出発物
質であり、最終産物の収量をヘパリンペーストと比較して３倍に増加する可能性
を有することを示す。
ムに関して処理した後では、産物は優れた安定性を示した（＞２０８時間）。後
の実験では（セクション４．５）、凍結画分１ペーストを、ATIIIの存在下およ
び不在下で抽出した。いずれのバッファーにおいても、凍結画分１ペーストの抽
出後には操作上の問題はなく、ＳＦＰとＡＳＦＰの安定性は、先のまたは後の実
験について観察されたものよりもはるかに高かった。 また、可溶化の前にGly／NaCl沈降段階でこの処理を用いる可能性を評価する
ために実験を行った。−８０℃で凍結され、その後解凍され、可溶化されたGly
／NaClペレットの結果は、この実施時点が、凝固可能タンパクに関する品質、安
定性、または収量を落とさないことを示した。 ここに示した結果は、画分Ｉペーストがフィブリノゲンの精製に適した出発物
質であり、最終産物の収量をヘパリンペーストと比較して３倍に増加する可能性
を有することを示す。
【０１４９】
実施例２：イオン交換クロマトグラフィーを用いたプラスミノゲンからのフィブ
リノゲンの分離 2.1 物質と方法 2.1.1 サンプル調製 Gly／NaCl沈降物を、Winklemanら,1989に記載された方法の修正を用いて寒冷
沈降物から得た。最初に、凍結した可溶化Gly／NaCl沈降物（−８０℃）をウォ
ーターバスで３０℃で解凍した。４０ｇの可溶化Gly／NaCl沈降物に、２．１９
ｇのストック界面活性剤溶液と１３２ｍｇのＴＮＢＰとを加えた。このサンプル
を、伝導度が１０．５ｍＳ／ｃｍ以下となるまで、サンプル希釈バッファー（２
５ｍＭ Tris、ｐＨ８．０）を用いて希釈した。最後に、このサンプルを、０．
８μｍの膜フィルターを通して濾過した。各サンプルを、それぞれを流し始める
直前に調製した。サンプルを希釈しないと、多くの場合、大量の未結合ピークを
もたらし、すなわち一部のフィブリノゲンが未結合物中に溶出されてしまう。
リノゲンの分離 2.1 物質と方法 2.1.1 サンプル調製 Gly／NaCl沈降物を、Winklemanら,1989に記載された方法の修正を用いて寒冷
沈降物から得た。最初に、凍結した可溶化Gly／NaCl沈降物（−８０℃）をウォ
ーターバスで３０℃で解凍した。４０ｇの可溶化Gly／NaCl沈降物に、２．１９
ｇのストック界面活性剤溶液と１３２ｍｇのＴＮＢＰとを加えた。このサンプル
を、伝導度が１０．５ｍＳ／ｃｍ以下となるまで、サンプル希釈バッファー（２
５ｍＭ Tris、ｐＨ８．０）を用いて希釈した。最後に、このサンプルを、０．
８μｍの膜フィルターを通して濾過した。各サンプルを、それぞれを流し始める
直前に調製した。サンプルを希釈しないと、多くの場合、大量の未結合ピークを
もたらし、すなわち一部のフィブリノゲンが未結合物中に溶出されてしまう。
【０１５０】
2.1.2 MacroPrep HQ精製
以下のクロマトグラフィー条件を用いて、可溶化gly／NaClペーストを精製し
た： ベッド高さ−約２０ｃｍ カラム量−約１００ｍｌ 流速−１０ｍｌ／分（〜１１３ｃｍ／時間） 検出−ＵＶ＠２８０ｎｍ クロマトグラフィー方法 平衡化：≧１．５ＣＶのＭＱバッファーおよび伝導度（カラム後）が９０−１１
０％の場合調製したバッファー 充填サンプル 洗浄：６ＣＶのＭＱバッファー 溶出：ＭＥバッファー−バッファーＤ＆２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０ 再生：２ＣＶの１Ｍ ＮａＣｌ
た： ベッド高さ−約２０ｃｍ カラム量−約１００ｍｌ 流速−１０ｍｌ／分（〜１１３ｃｍ／時間） 検出−ＵＶ＠２８０ｎｍ クロマトグラフィー方法 平衡化：≧１．５ＣＶのＭＱバッファーおよび伝導度（カラム後）が９０−１１
０％の場合調製したバッファー 充填サンプル 洗浄：６ＣＶのＭＱバッファー 溶出：ＭＥバッファー−バッファーＤ＆２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０ 再生：２ＣＶの１Ｍ ＮａＣｌ
【０１５１】
2.2 結果
2.2.1 洗浄バッファー（ＭＱ-２５ｍＭ トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８
．０）を用いた精製 洗浄（ＭＱ）バッファーとして、２５ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐ
Ｈ８．０を用いて二重に流した。サンプルをMacroPrepカラムに充填し、回収し
た画分を分析した。結果は表２８に記載されている。
．０）を用いた精製 洗浄（ＭＱ）バッファーとして、２５ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐ
Ｈ８．０を用いて二重に流した。サンプルをMacroPrepカラムに充填し、回収し
た画分を分析した。結果は表２８に記載されている。
【０１５２】
表２８
ＭＱ-２５ｍＭ トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０
【表２８】
【０１５３】
フィブリノゲンの平均回収率は８２％であり、プラスミノゲンは１０％であっ
た。これらの数値は、この方法に対するさらなる修正の成功を評価するベンチマ
ークとして用いた。
た。これらの数値は、この方法に対するさらなる修正の成功を評価するベンチマ
ークとして用いた。
【０１５４】
2.2.2 サンプルを充填するためのＥＡＣＡの添加
大規模製造では、全てのサンプルを、一回のイオン交換で処理できる訳ではな
く、かくして、一部の希釈されたサンプルが室温で放置され、その他のサンプル
が精製される。この間にサンプルが破壊されることが見出された。 １００ｍＭのεアミノカプロン酸、ＥＡＣＡ（未希釈の可溶化Gly／NaClペー
ストの量に対して）を、サンプルに添加することにより、０−１５時間から１５
−２３時間へとサンプルの安定性が増加する。クロマトグラフィープロフィール
に顕著な変化はなく、フィブリノゲンの回収率は９３％であった。
く、かくして、一部の希釈されたサンプルが室温で放置され、その他のサンプル
が精製される。この間にサンプルが破壊されることが見出された。 １００ｍＭのεアミノカプロン酸、ＥＡＣＡ（未希釈の可溶化Gly／NaClペー
ストの量に対して）を、サンプルに添加することにより、０−１５時間から１５
−２３時間へとサンプルの安定性が増加する。クロマトグラフィープロフィール
に顕著な変化はなく、フィブリノゲンの回収率は９３％であった。
【０１５５】
2.2.3 洗浄（ＭＱ）バッファーへのＥＡＣＡおよびリシンの添加
以下の洗浄バッファーを精製プロトコルに用いた：(i)５０ｍＭ トリス、２０
ｍＭ リシン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０および（ii）５０ｍＭ トリス
、２０ｍＭ ＥＡＣＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０。サンプルを、Macrop
repカラムを用いて精製し、回収した画分を比較した。結果は、以下の表２９に
示されている。
ｍＭ リシン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０および（ii）５０ｍＭ トリス
、２０ｍＭ ＥＡＣＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０。サンプルを、Macrop
repカラムを用いて精製し、回収した画分を比較した。結果は、以下の表２９に
示されている。
【０１５６】
表２９
ＭＱバッファーへのＥＡＣＡおよびＬｙｓの添加
【表２９】
【０１５７】
２０ｍＭ ＥＡＣＡと２５ｍＭ トリスのＭＱバッファーへの添加により、回収
された画分の安定性は７１−９１時間に増加し、凝固可能タンパクの回収率は７
１．３％であった。より長い安定性は、おそらくは、プラスミノゲンの除去によ
るものであろう。クロマトグラムの未結合領域は、低いＵＶ吸収を示した。 平均の凝固可能タンパク回収率は、２０ｍＭのリシンおよび２５ｍＭのトリス
をＭＱバッファーに加えた場合に、５１．３％に減少した。クロマトグラフィー
プロフィールでは、洗浄工程中の吸収は、ＭＱを用いて得られるものよりも大き
かった。かくして、ＭＱへのリシンとトリスの添加は、フィブリノゲンを未結合
ピークに溶出させると仮定できる。回収された画分の安定性は、４８−７１時間
の間であった。 これらの結果は、ＥＡＣＡの添加およびＭＱにおけるトリス濃度の増加が、凝
固可能タンパクの回収率とカラム溶出物の安定性を増加したことを示す。
された画分の安定性は７１−９１時間に増加し、凝固可能タンパクの回収率は７
１．３％であった。より長い安定性は、おそらくは、プラスミノゲンの除去によ
るものであろう。クロマトグラムの未結合領域は、低いＵＶ吸収を示した。 平均の凝固可能タンパク回収率は、２０ｍＭのリシンおよび２５ｍＭのトリス
をＭＱバッファーに加えた場合に、５１．３％に減少した。クロマトグラフィー
プロフィールでは、洗浄工程中の吸収は、ＭＱを用いて得られるものよりも大き
かった。かくして、ＭＱへのリシンとトリスの添加は、フィブリノゲンを未結合
ピークに溶出させると仮定できる。回収された画分の安定性は、４８−７１時間
の間であった。 これらの結果は、ＥＡＣＡの添加およびＭＱにおけるトリス濃度の増加が、凝
固可能タンパクの回収率とカラム溶出物の安定性を増加したことを示す。
【０１５８】
2.2.4 ＭＱバッファー組成の変更
この実験の目的は、ＭＱバッファーへのリシンおよびＥＡＣＡの添加の有効性
を調べ、かつ、サンプルへのＥＡＣＡの添加の効果を評価することである。表３
０は、画分１の結果をまとめたものである。
を調べ、かつ、サンプルへのＥＡＣＡの添加の効果を評価することである。表３
０は、画分１の結果をまとめたものである。
【０１５９】
表３０
洗浄バッファー組成の変更の結果
【表３０】
【０１６０】
これらの結果は、ＥＡＣＡをサンプルに添加せず、かつ、ＭＱ（２５ｍＭ ト
リス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を洗浄バッファーとして用いた場合
に、HPPC04およびHPPC06に関する画分１の平均タンパク回収率がそれぞれ７７％
および７８％であったことを示している。安定性は、HPPC04について約２４時間
であり、HPPC06について＜４７時間であった。
リス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を洗浄バッファーとして用いた場合
に、HPPC04およびHPPC06に関する画分１の平均タンパク回収率がそれぞれ７７％
および７８％であったことを示している。安定性は、HPPC04について約２４時間
であり、HPPC06について＜４７時間であった。
【０１６１】
２５ｍＭ トリスをＭＱバッファーに添加した場合、タンパク回収率はＭＱを
用いて得られたものと類似していたが、回収した画分の安定性は６６時間まで増
加した。 ＭＱバッファー（５０ｍＭ トリス、２０ｍＭ リシン、１００ｍＭ ＮａＣｌ
、ｐＨ８．０）に対するリシンの添加では、HPPC06に関する画分１の平均タンパ
ク回収率は４８％であり、安定性は＜４７時間であった。プラスミノゲン回収率
は、１０．２％から０．５％未満に劇的に低下した。
用いて得られたものと類似していたが、回収した画分の安定性は６６時間まで増
加した。 ＭＱバッファー（５０ｍＭ トリス、２０ｍＭ リシン、１００ｍＭ ＮａＣｌ
、ｐＨ８．０）に対するリシンの添加では、HPPC06に関する画分１の平均タンパ
ク回収率は４８％であり、安定性は＜４７時間であった。プラスミノゲン回収率
は、１０．２％から０．５％未満に劇的に低下した。
【０１６２】
Macroprepカラムに充填する前にサンプルにＥＡＣＡを添加し、かつ、洗浄バ
ッファーがリシンを含むＭＱである場合、タンパクおよびプラスミノゲンの回収
率は、ＥＡＣＡをサンプルに添加しない場合に得られたものとほぼ同じであった
。しかしながら、溶出物の安定性は、HPPC06について、＜４７時間から６８−９
３時間に増加し、HPPC04については４１時間に増加した。 ＥＡＣＡをサンプルに加え、洗浄バッファーが５０ｍＭ トリス、２０ｍＭ Ｅ
ＡＣＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０である場合には、タンパク回収率は
、ＭＱを用いた場合と類似していた。すなわち、HPPC04では６８％であり、HPPC
06では７９％であった。顕著な差異は、回収された画分の安定性であった。安定
性は、ＭＱバッファーを用いた場合の約２４時間と比較して１１３時間多かった
。 これらの結果は、５０ｍＭ トリス、２０ｍＭ ＥＡＣＡ、１００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、ｐＨ８．０を含む洗浄バッファーが、良好な結果を与えたことを示す。特に
、これらの回収された画分は、高いタンパク回収率、低いプラスミノゲン回収率
、および長い安定性を有していた。
ッファーがリシンを含むＭＱである場合、タンパクおよびプラスミノゲンの回収
率は、ＥＡＣＡをサンプルに添加しない場合に得られたものとほぼ同じであった
。しかしながら、溶出物の安定性は、HPPC06について、＜４７時間から６８−９
３時間に増加し、HPPC04については４１時間に増加した。 ＥＡＣＡをサンプルに加え、洗浄バッファーが５０ｍＭ トリス、２０ｍＭ Ｅ
ＡＣＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０である場合には、タンパク回収率は
、ＭＱを用いた場合と類似していた。すなわち、HPPC04では６８％であり、HPPC
06では７９％であった。顕著な差異は、回収された画分の安定性であった。安定
性は、ＭＱバッファーを用いた場合の約２４時間と比較して１１３時間多かった
。 これらの結果は、５０ｍＭ トリス、２０ｍＭ ＥＡＣＡ、１００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、ｐＨ８．０を含む洗浄バッファーが、良好な結果を与えたことを示す。特に
、これらの回収された画分は、高いタンパク回収率、低いプラスミノゲン回収率
、および長い安定性を有していた。
【０１６３】
2.2.5 個々におよびプールしたMacroPrep画分の安定性
予め、４つの画分をMacroPrep溶出物から回収した。回収率を増加させるため
に画分をプールできるか否かを調べるべく、以下の実験を設計した。回収した画
分を、個別に、およびまるで一つの画分が回収されたかのような比率でプールし
て、安定性について調べた。 精製方法は、洗浄バッファーとして、５０ｍＭ Tris、２０ｍＭ ＥＡＣＡ、１
００ｍＭ ＮａＣｌの使用を含み、そして、ＥＡＣＡをMacroPrepカラムに充填す
る前にサンプルに加えた。結果を表３１に示す。 一般に、表３１は、最初の画分が後の画分よりも安定であることを示している
。これは、恐らくは、後者の画分が、画分１よりも顕著に低く濃縮されているか
らであり、画分の組成によるものではない。これは、さらに、カラムから溶出さ
れるのと同じ比率で画分をプーリングすることによって調べられた。 ４つの画分がプールされた場合、安定性は画分１と同じであった。全部で４つ
の画分をプーリングすることにより、タンパクの回収率は、約２５％増加した。
に画分をプールできるか否かを調べるべく、以下の実験を設計した。回収した画
分を、個別に、およびまるで一つの画分が回収されたかのような比率でプールし
て、安定性について調べた。 精製方法は、洗浄バッファーとして、５０ｍＭ Tris、２０ｍＭ ＥＡＣＡ、１
００ｍＭ ＮａＣｌの使用を含み、そして、ＥＡＣＡをMacroPrepカラムに充填す
る前にサンプルに加えた。結果を表３１に示す。 一般に、表３１は、最初の画分が後の画分よりも安定であることを示している
。これは、恐らくは、後者の画分が、画分１よりも顕著に低く濃縮されているか
らであり、画分の組成によるものではない。これは、さらに、カラムから溶出さ
れるのと同じ比率で画分をプーリングすることによって調べられた。 ４つの画分がプールされた場合、安定性は画分１と同じであった。全部で４つ
の画分をプーリングすることにより、タンパクの回収率は、約２５％増加した。
【０１６４】
表３１−画分プーリングの結果
【表３１】
サンプルＦ17 11ａ＆Ｆ17 11ｂは可溶化Gly／NaCl沈降物バッチNo.HPPC04を使用
し、Ｆ19 11ａ＆Ｆ19 11ｂは可溶化Gly／NaCl沈降物バッチNo.HPPC06を使用した
。
し、Ｆ19 11ａ＆Ｆ19 11ｂは可溶化Gly／NaCl沈降物バッチNo.HPPC06を使用した
。
【０１６５】
2.2.6 溶出バッファーの変更
上記2.2.5に記載された結果は、MacroPrepカラムからの画分溶出をプールでき
ることを示している。結合画分のプロフィールは、テーリングを伴う大きなピー
クを示し、次いで、カラムを１Ｍ ＮａＣｌで洗浄した場合に第二のピークを示
した。第二のピークは、１Ｍ ＮａＣｌの高いイオン強度によるテーリングの圧
縮である。単一のピークとしてフィブリノゲンを溶出するために、溶出バッファ
ーのイオン強度を増加することが決められた。それゆえ、ＭＥバッファーにおけ
るＮａＣｌの濃度を、３００ｍＭから５００ｍＭ、７５０ｍＭおよび１Ｍまで増
加した。結果を表３２に示す。
ることを示している。結合画分のプロフィールは、テーリングを伴う大きなピー
クを示し、次いで、カラムを１Ｍ ＮａＣｌで洗浄した場合に第二のピークを示
した。第二のピークは、１Ｍ ＮａＣｌの高いイオン強度によるテーリングの圧
縮である。単一のピークとしてフィブリノゲンを溶出するために、溶出バッファ
ーのイオン強度を増加することが決められた。それゆえ、ＭＥバッファーにおけ
るＮａＣｌの濃度を、３００ｍＭから５００ｍＭ、７５０ｍＭおよび１Ｍまで増
加した。結果を表３２に示す。
【０１６６】
表３２
ＭＥバッファーにおけるＮａＣｌ濃度の増加
【表３２】
【０１６７】
溶出バッファーＭＥへの余分の２００ｍＭ ＮａＣｌの添加は、ほとんどテー
リングを伴わずに、単一のピークにフィブリノゲンを溶出するのに十分であった
。回収された画分の特徴決定の結果には顕著な差異がなかった。７５０ｍＭおよ
び１Ｍ ＮａＣｌを含むＭＥバッファーも作用するが、精製処理に以後の工程を
必要とするため５００ｍＭを含むＭＥを用いるのが好ましい。
リングを伴わずに、単一のピークにフィブリノゲンを溶出するのに十分であった
。回収された画分の特徴決定の結果には顕著な差異がなかった。７５０ｍＭおよ
び１Ｍ ＮａＣｌを含むＭＥバッファーも作用するが、精製処理に以後の工程を
必要とするため５００ｍＭを含むＭＥを用いるのが好ましい。
【０１６８】
2.2.7 カラム溶出物の安定性および回収率に対するサンプル中のＥＡＣＡの効
果 この実験の目的は、１００または２００ｍＭのＥＡＣＡを含むサンプル（可溶
化Gly／NaCl沈降物）からMacroPrepカラムを溶出した結合画分を比較することで
ある。 結果は、タンパク回収率（９３．７％、９５．４％）、凝固可能タンパク（９
６．０％、９９．２％）、プラスミノゲン（両方とも＜０．２μｇ／ｍｌ）、お
よび安定性の結果（両方とも＞１日）が、両方のサンプルから回収された画分に
ついて同等であることを示した。言い換えると、同様の結果が、１００または２
００ｍＭεＡＣＡを含む可溶化Gly／NaClサンプルについて得られた。 上記イオン交換クロマトグラフィー法を含む好ましいフィブリノゲン精製処理
を図６に示した。
果 この実験の目的は、１００または２００ｍＭのＥＡＣＡを含むサンプル（可溶
化Gly／NaCl沈降物）からMacroPrepカラムを溶出した結合画分を比較することで
ある。 結果は、タンパク回収率（９３．７％、９５．４％）、凝固可能タンパク（９
６．０％、９９．２％）、プラスミノゲン（両方とも＜０．２μｇ／ｍｌ）、お
よび安定性の結果（両方とも＞１日）が、両方のサンプルから回収された画分に
ついて同等であることを示した。言い換えると、同様の結果が、１００または２
００ｍＭεＡＣＡを含む可溶化Gly／NaClサンプルについて得られた。 上記イオン交換クロマトグラフィー法を含む好ましいフィブリノゲン精製処理
を図６に示した。
【０１６９】
当業者であれば、広く記載された本発明の精神または範囲から離れることなく
、特定の実施態様に示された発明に対して、多くの変更および／または修正をな
すことができることを理解するであろう。それゆえ、本発明の実施態様は、例示
的であって制限的でないと考えるべきである。
、特定の実施態様に示された発明に対して、多くの変更および／または修正をな
すことができることを理解するであろう。それゆえ、本発明の実施態様は、例示
的であって制限的でないと考えるべきである。
【０１７０】
「参考文献」
【図１】 ペースト-バッファー比研究（I）で得られた凝固可能なフィブリ
ノゲンの収量
ノゲンの収量
【図２】 ペースト-バッファー比研究（１）で得られた全フィブリノゲン
の収量
の収量
【図３】 ペースト-バッファー比研究（２）で得られた全フィブリノゲン
の収量
の収量
【図４】 画分Ｉペーストの抽出中に経時的に得られた凝固可能なフィブリ
ノゲンの収量
ノゲンの収量
【図５】 画分Ｉペーストからのフィブリノゲンの抽出に対する温度の効果
【図６】 本発明の方法のイオン交換クロマトグラフィーを含む好ましいフ
ィブリノゲン精製方法を図示するフローチャート
ィブリノゲン精製方法を図示するフローチャート
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
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ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
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ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 テレサ・マルチネリ
オーストラリア・3071・ヴィクトリア・ソ
ーンバリー・バランティーン・ストリー
ト・77
Ｆターム(参考） 4H045 AA10 AA20 CA42 GA01 GA05
GA23
Claims (45)
- 【請求項１】 フィブリノゲンを精製する方法であって、フィブリノゲンが
抽出バッファーに可溶化されるように、画分Ｉ沈降物を抽出バッファーと混合す
ることにより画分Ｉ沈降物からフィブリノゲンを抽出することを含み、ここで、
前記抽出バッファーが少なくとも０．１Ｍの濃度で塩を含み、かつ、少なくとも
１０ＩＵ／ｍｌの濃度でヘパリンを含む方法。 - 【請求項２】 塩の濃度が少なくとも０．４Ｍである、請求項１記載の方法
。 - 【請求項３】 塩が、塩化物、リン酸塩、および酢酸塩またはこれらの混合
物からなる群から選択される、請求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 塩がＮａＣｌである、請求項１ないし３のいずれか一項に記
載の方法。 - 【請求項５】 ヘパリンの濃度が少なくも約２０ＩＵ／ｍｌである、請求項
１ないし４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】 ヘパリンの濃度が少なくも約６０ＩＵ／ｍｌである、請求項
１ないし４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】 抽出バッファーが、約２０ｍＭの濃度でクエン酸三ナトリウ
ムをさらに含む、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項８】 抽出バッファーが、少なくとも一つのω-アミノ酸をさらに
含む、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項９】 少なくとも一つのω-アミノ酸が、少なくとも５ｍＭの濃度
で抽出バッファー中に存在する、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 抽出バッファーが、少なくとも約１ＩＵ／ｍｌの濃度でア
ンチトロンビンIII（ATIII）をさらに含む、請求項１ないし９のいずれか一項に
記載の方法。 - 【請求項１１】 抽出バッファーが、約２０ｍＭの濃度でクエン酸三ナトリ
ウム、約０．８Ｍの濃度でＮａＣｌ、約６０ＩＵ／ｍｌの濃度でヘパリン、およ
び、約５ｍＭの濃度で少なくとも一つのω-アミノ酸を含む、請求項１ないし１
０のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１２】 抽出バッファーが約７．３のｐＨを有する、請求項１ない
し１１のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１３】 フィブリノゲンの抽出が、約３７℃で行われる、請求項１
ないし１２のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１４】 抽出された溶液中のフィブリノゲンを水酸化アルミニウム
とインキュベートし、遠心して沈降物を取り出す工程をさらに含む、請求項１な
いし１３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１５】 グリシンとＮａＣｌの添加により、抽出されたフィブリノ
ゲン溶液中のフィブリノゲンを沈降させる工程をさらに含む、請求項１ないし１
４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１６】 約１００ｍＭの濃度のＮａＣｌ、約１．１Ｍの濃度のＣａ
Ｃｌ2、約１０ｍＭの濃度のクエン酸Ｎａ、約１０ｍＭの濃度のトリス、および
約４５ｍＭの濃度のスクロースを含み、約６．９のｐＨを有するバッファーに、
フィブリノゲン沈降物を可溶化させる工程をさらに含む、請求項１５記載の方法
。 - 【請求項１７】 以下の工程： イオン交換マトリックスに、抽出したフィブリノゲン溶液を、フィブリノゲン
が前記マトリックスに結合するような条件下で適用する工程； マトリックスからフィブリノゲンを溶出する工程；および 任意に溶出物からフィブリノゲンを回収する工程； をさらに含む、請求項１ないし１６のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１８】 マトリックスからフィブリノゲンを溶出する前に、少なく
とも一つのω-アミノ酸を含むバッファーでイオン交換マトリックスを洗浄する
ことをさらに含む、請求項１７記載の方法。 - 【請求項１９】 以下の工程 （ａ）フィブリノゲンが、少なくとも０．１Ｍの濃度の塩を含む抽出バッファー
に可溶化されるように、画分Ｉ沈降物を抽出バッファーと混合して、画分Ｉ沈降
物からフィブリノゲンを抽出する工程； （ｂ）フィブリノゲンを沈降させる工程；および （ｃ）少なくとも１００ｍＭの濃度で少なくとも一つのω-アミノ酸を含む溶液
にフィブリノゲンを可溶化させる工程； を含む、フィブリノゲンを精製する方法。 - 【請求項２０】 抽出バッファーの塩の濃度が、少なくとも０．４Ｍである
、請求項１８記載の方法。 - 【請求項２１】 塩が、塩化物、リン酸塩および酢酸塩、またはこれらの混
合物からなる群から選択される、請求項１９または２０記載の方法。 - 【請求項２２】 塩がＮａＣｌである、請求項１９ないし２１のいずれか一
項に記載の方法。 - 【請求項２３】 バッファーが、約２０ｍＭの濃度でクエン酸三ナトリウム
をさらに含む、請求項１９ないし２２のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２４】 抽出バッファーが、少なくとも１０ＩＵ／ｍｌの濃度でヘ
パリンをさらに含む、請求項１９ないし２３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２５】 少なくとも一つのω-アミノ酸が、少なくとも５ｍＭの濃
度で抽出バッファーに存在する、請求項１９ないし２４のいずれか一項に記載の
方法。 - 【請求項２６】 抽出バッファーが、約２０ｍＭの濃度のクエン酸Ｎａ、約
０．８Ｍの濃度のＮａＣｌ、および約６０ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンを含む、
請求項１９ないし２５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２７】 フィブリノゲンを、グリシンとＮａＣｌを含むバッファー
の添加により、工程（ｂ）において沈降させる、請求項１９ないし２６のいずれ
か一項に記載の方法。 - 【請求項２８】 フィブリノゲン沈降物を、約１００ｍＭの濃度のＮａＣｌ
、約１．１Ｍの濃度のＣａＣｌ2、約１０ｍＭの濃度のクエン酸Ｎａ、約１０ｍ
Ｍの濃度のトリス、および約４５ｍＭの濃度のスクロースを含むバッファーを用
いて、工程（ｃ）において可溶化させる、請求項１９ないし２７のいずれか一項
に記載の方法。 - 【請求項２９】 以下の工程： （ｄ）イオン交換マトリックスに、工程（ｃ）のフィブリノゲン溶液を、フィブ
リノゲンが前記マトリックスに結合するような条件下で適用する工程； （ｅ）マトリックスからフィブリノゲンを溶出する工程；および （ｆ）任意に溶出物からフィブリノゲンを回収する工程； をさらに含む、請求項１９ないし２８のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項３０】 マトリックスからフィブリノゲンを溶出する前に、少なく
とも一つのω-アミノ酸を含むバッファーでイオン交換マトリックスを洗浄する
ことをさらに含む、請求項２９記載の方法。 - 【請求項３１】 少なくとも一つのω-アミノ酸がε-アミノカプロン酸（Ｅ
ＡＣＡ）である、請求項８ないし３０のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項３２】 以下の工程 （ａ）少なくとも５ｍＭの濃度の少なくとも一つのω-アミノ酸を含む抽出バッ
ファーにフィブリノゲンが溶解されるように、フィブリノゲン含有物質を抽出バ
ッファーと混合することにより前記物質からフィブリノゲンを抽出する工程； （ｂ）イオン交換マトリックスに、工程（ａ）で得られた抽出バッファーを、フ
ィブリノゲンが前記マトリックスに結合するような条件下で適用する工程； （ｃ）前記マトリックスからフィブリノゲンを溶出する工程；および （ｄ）任意にフィブリノゲンを溶出物から回収する工程； を含む、フィブリノゲンを精製する方法。 - 【請求項３３】 工程（ｂ）の後に、少なくとも一つのω-アミノ酸を含む
溶液で、イオン交換マトリックスを洗浄することをさらに含む、請求項３２記載
の方法。 - 【請求項３４】 フィブリノゲン含有溶液からフィブリノゲンを精製する方
法であって、以下の工程： （ａ）前記溶液をイオン交換マトリックスに、フィブリノゲンがマトリックスに
結合するような条件下で適用する工程； （ｂ）イオン交換マトリックスを、少なくとも一つのω-アミノ酸を含む溶液で
洗浄する工程； （ｃ）マトリックスからフィブリノゲンを溶出する工程；および （ｄ）任意に溶出物からフィブリノゲンを回収する工程 を含む方法。 - 【請求項３５】 ω-アミノ酸がε-アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）である、
請求項３２ないし３４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項３６】 ω-アミノ酸が、５−５００ｍＭの濃度で抽出バッファー
中に存在する、請求項３２ないし３５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項３７】 ω-アミノ酸が、５０−５００ｍＭの濃度で抽出バッファ
ー中に存在する、請求項３６記載の方法。 - 【請求項３８】 ω-アミノ酸が、１００ｍＭの濃度で抽出バッファー中に
存在する、請求項３７記載の方法。 - 【請求項３９】 フィブリノゲン含有溶液が、イオン交換マトリックスに適
用する前に、伝導度が１０．５ｍＳ／ｃｍ以下となるように希釈される、請求項
３２ないし３８のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項４０】 イオン交換マトリックスを洗浄するために用いられるバッ
ファーが、（i）約５０ｍＭの濃度のトリス、（ii）約２０ｍＭの濃度のω-アミ
ノ酸、および約９０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む、請求項３３ないし３９のいず
れか一項に記載の方法。 - 【請求項４１】 イオン交換マトリックスを洗浄するために用いられるバッ
ファーが、約８．０のｐＨを有する、請求項４０記載の方法。 - 【請求項４２】 イオン交換マトリックスを洗浄するために用いられるバッ
ファーが、約１１．１ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する、請求項４０または４１記載
の方法。 - 【請求項４３】 フィブリノゲンを、約１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのクエ
ン酸塩、４５ｍＭのスクロース；および２００ｍＭから１．０Ｍの間の濃度のＮ
ａＣｌを含むバッファーにおいてマトリックスから溶出させる、請求項３２ない
し４２のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項４４】 ＮａＣｌが、約４００−５００ｍＭの濃度である、請求項
４３記載の方法。 - 【請求項４５】 溶出バッファーが約７．０のｐＨを有する、請求項４３ま
たは４４記載の方法。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016501878A (ja) * | 2012-12-05 | 2016-01-21 | ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー | 治療タンパク質の精製方法 |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002348491A1 (en) * | 2001-10-03 | 2003-04-14 | Christopher J. Woolverton | Storage-stable human fibrinogen solutions |
| DE10261126A1 (de) | 2002-08-13 | 2004-03-04 | Aventis Behring Gmbh | Lagerungsstabile, flüssige Fibrinogen-Formulierung |
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| FR2887883B1 (fr) * | 2005-06-29 | 2007-08-31 | Lab Francais Du Fractionnement | Procede de separation des proteines fibrinogene, facteur xiii et colle biologique d'une fraction plasmatique solubilisee et de preparation de concentres lyophilises desdites proteines |
| FR2952641B1 (fr) * | 2009-11-18 | 2012-01-13 | Lfb Biomedicaments | Procede de traitement du plasma sanguin comprenant une etape de lavage par dispersion |
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| WO2014016829A1 (en) * | 2012-07-22 | 2014-01-30 | Mx Biotech Ltd. | Insoluble fibrinogen particles (ifp) and coatings : composition, fabrication methods, and applications for harvesting and culturing mammalian cells |
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| CN106800583A (zh) * | 2015-11-26 | 2017-06-06 | 上海洲跃生物科技有限公司 | 一种速溶无析出的冻干人纤维蛋白原制备工艺 |
| US20180369346A1 (en) * | 2016-01-07 | 2018-12-27 | Eio Biomedical Ltd. | Methods, compositions and kits for reducing tissue adhesions |
| KR101841587B1 (ko) | 2016-01-12 | 2018-05-14 | 주식회사 녹십자홀딩스 | 피브리노겐의 정제방법 |
| CN107540743A (zh) * | 2017-10-11 | 2018-01-05 | 南岳生物制药有限公司 | 一种双层析法制备人纤维蛋白原的方法 |
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992013495A1 (en) * | 1991-02-07 | 1992-08-20 | Fibratek, Inc. | Fibrinogen based adhesive |
| JPH10506607A (ja) * | 1994-07-14 | 1998-06-30 | クロア−ルージュ ド ベルジーク | 血漿から得られるフィブリノーゲン濃縮物、その製法及び製造設備 |
| WO1999023111A1 (en) * | 1997-10-30 | 1999-05-14 | Haemacure Corporation | Process for the production of highly viral safe components for forming fibrin glue from a pool of human plasma |
| WO1999037680A1 (en) * | 1998-01-23 | 1999-07-29 | Csl Limited | Purification of fibrinogen |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT359652B (de) * | 1979-02-15 | 1980-11-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung eines gewebekleb- stoffes |
| AT359653B (de) * | 1979-02-15 | 1980-11-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung eines gewebekleb- stoffes |
| US4341764A (en) * | 1980-03-05 | 1982-07-27 | Cutter Laboratories, Inc. | Method of preparing fibronectin and antihemophilic factor |
| AT369990B (de) | 1981-07-28 | 1983-02-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung eines gewebeklebstoffes |
| DE3203775A1 (de) * | 1982-02-04 | 1983-08-11 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Fibrinogenzubereitung, verfahen zu ihrer herstellungund ihre verwendung |
| DE3230849A1 (de) * | 1982-08-19 | 1984-02-23 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Pasteurisiertes human-fibrinogen (hf) und verfahren zu dessen herstellung |
| GB8505882D0 (en) * | 1985-03-07 | 1985-04-11 | Central Blood Lab Authority | Purification of blood coagulation factor viii |
| US5278289A (en) * | 1991-11-12 | 1994-01-11 | Johnson Alan J | Antihemophilic factor stabilization |
| DE4202667C1 (ja) * | 1992-01-29 | 1993-05-13 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg, De | |
| DK82592D0 (da) * | 1992-06-23 | 1992-06-23 | Novo Nordisk As | Fremstilling af proteiner |
| US5395923A (en) | 1993-02-23 | 1995-03-07 | Haemacure-Biotech, Inc. | Process for the obtention of a biological adhesive made of concentrated coagulation factors by "salting-out" |
| US5330974A (en) * | 1993-03-01 | 1994-07-19 | Fibratek, Inc. | Therapeutic fibrinogen compositions |
| JP2896235B2 (ja) * | 1994-03-18 | 1999-05-31 | バクスター、インターナショナル、インコーポレイテッド | 局所フィブリノーゲン複合体 |
| EP1115745B1 (en) * | 1998-09-24 | 2006-05-31 | Pharming Intellectual Property BV | Purification of fibrinogen from fluids by precipitation and hydrophobic interaction chromatography |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992013495A1 (en) * | 1991-02-07 | 1992-08-20 | Fibratek, Inc. | Fibrinogen based adhesive |
| JPH10506607A (ja) * | 1994-07-14 | 1998-06-30 | クロア−ルージュ ド ベルジーク | 血漿から得られるフィブリノーゲン濃縮物、その製法及び製造設備 |
| WO1999023111A1 (en) * | 1997-10-30 | 1999-05-14 | Haemacure Corporation | Process for the production of highly viral safe components for forming fibrin glue from a pool of human plasma |
| WO1999037680A1 (en) * | 1998-01-23 | 1999-07-29 | Csl Limited | Purification of fibrinogen |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016501878A (ja) * | 2012-12-05 | 2016-01-21 | ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー | 治療タンパク質の精製方法 |
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