CN106046147B - 纤维蛋白原生产方法 - Google Patents

纤维蛋白原生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106046147B
CN106046147B CN201610659096.1A CN201610659096A CN106046147B CN 106046147 B CN106046147 B CN 106046147B CN 201610659096 A CN201610659096 A CN 201610659096A CN 106046147 B CN106046147 B CN 106046147B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fibrinogen
content
buffer
solution
fibronectin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610659096.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106046147A (zh
Inventor
雷纳·佩奇
沃纳·格林格尔
佩特拉·舒尔茨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Okta Pharmaceutical Co
Original Assignee
Okta Pharmaceutical Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Okta Pharmaceutical Co filed Critical Okta Pharmaceutical Co
Publication of CN106046147A publication Critical patent/CN106046147A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106046147B publication Critical patent/CN106046147B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/75—Fibrinogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/363—Fibrinogen

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种制备节省病毒和朊病毒的原生纤维蛋白原浓缩物的方法或过程，所述纤维蛋白原浓缩物具有高的纯度和低含量的纤维蛋白肽A和纤维连接蛋白。

Description

纤维蛋白原生产方法
背景技术
纤维蛋白原，也称为凝血因子I，在止血和伤口愈合方面扮演着重要的角色。它是在肝脏合成的表观分子量（apparent molecular weight）为 340.000的糖蛋白，由两个二聚体构成，每个二聚体由三对称为 Aα、 Bβ 和 γ 的非完全相同的肽链构成，由二硫键连结。它以约 150-400µg/ml的浓度在血流中循环。在血管的损伤时，血小板被激活并且栓塞形成。纤维蛋白原通过协助交联活化血小板参与主要止血。
并行的，凝血级联系统开始启动。作为终点，纤维蛋白原通过纤维蛋白肽A的水解释放（proteolytic release）转化为纤维蛋白，以及，以较慢的速率——通过凝血酶（thrombin）转化为纤维蛋白肽B。可溶性纤维蛋白单体组装成双股扭合纤丝。随后，这些纤丝以横向方式排列，从而形成更粗的纤维。然后将这些纤维通过FXIIIa交叉连接成纤维蛋白网（fibrin network），所述纤维蛋白网通过纤维蛋白与活化血小板的相互作用稳定血小板栓，形成一个稳定的凝块。
紊乱和缺陷
先天性纤维蛋白原缺乏症（Congenital afibrinogenaemia）是一种罕见的出血性疾病，患者患有由于血纤维蛋白原缺乏或失灵造成的凝血不足。这种疾病可能会导致轻微损伤后或介入手术期间的自发性出血或出血过多。
获得性纤维蛋白原缺乏症比先天性纤维蛋白原缺乏症常见得多，其可能由血液稀释或其他事件，如手术过程的失血、创伤、弥漫性血管内凝血（DIC）或败血症诱发。
纤维蛋白原缺乏症可以通过静脉输注新鲜冰冻血浆或冷沉淀血浆纤维蛋白原的替代疗法，矫正为1.5-3克/升的正常纤维蛋白原（血浆中）水平。然而，这些治疗遭受病原体侵入风险的困扰，例如：病毒或朊病毒，传到患者体内，从而产生其他疾病。因此，建议静脉应用病毒灭活的纤维蛋白原组合物，以安全的方式恢复纤维蛋白原的生理水平。
尽管制剂中存在称为纤维蛋白胶、纤维蛋白原胶黏剂、组织胶和等等类似的纤维蛋白原，这些制剂设计成粉剂、糊剂、泡沫剂或与纤维织物混合，作为伤口上的石膏用于局部使用，它们并不适用于静脉内的应用，这是因为，它们的稠度（consistency）和组成（composition），决定了它们将在注射后立即引起血栓性事件。这些制剂还含有凝血酶、钙盐和相对高含量的凝血因子XIII。这类制剂的例子如US-A1-2008/003272, WO-A-95/22316或US-A1-2008/181878。
纤维蛋白原生产的工序已知来自欧洲药典EP-B1-1 240 200，涉及一种从含纤维蛋白原的溶液中的纯化纤维蛋白原的方法，包括，将含纤维蛋白原溶液应用于离子交换基质中，在纤维蛋白原与基质结合的条件下，用含有至少一种ω-氨基酸用缓冲溶液淋洗该离子交换基质，用由10mM三羟甲基氨基甲烷、10mM柠檬酸、45mM蔗糖和浓度为200mM 至1.0M的NaCl组成的缓冲液从基质中洗脱纤维蛋白原，并且选择性地从洗脱液中回收纤维蛋白原。
欧洲药典EP-B1-0771 324涉及一种生产无病毒纤维蛋白原浓缩物的方法，是通过将溶解的含纤维蛋白原的血浆成分经过化学灭活病毒处理获得，即S/D或有机溶剂/清洁剂处理，将所得病毒灭活成分于含氨基酸及酸性pH值的溶液中进行沉淀以获得上清液（supernatant），过滤上清液以获得纯化的纤维蛋白原浓缩物，回收纯化的纤维蛋白原浓缩物。回收的纤维蛋白原浓缩物经紫外辐射进行二次病毒灭活。在第三次病毒灭活之前稳定化并冷冻干燥该产品。
EP B1 1 519 944教导了在纤维蛋白原和纤维蛋白溶酶原结合至基质的条件下，使用固定化金属离子亲和层析基质，并分别从基质选择性地洗脱纤维蛋白原和93%的纤维蛋白溶酶原。
EP B1 0 555 135公开了一种静脉注射适用的纤维蛋白原的生产方法，其通过在阴离子交换凝胶上纯化纤维蛋白原溶液，所述凝胶基于含有季胺基团的交联琼脂糖。据称制得的纤维蛋白原不含有VIIIc因子。
EP B1 1 457 497涉及在纤维蛋白原溶液中去除病毒的方法，其特征是稳定并冻结溶液，随后对其进行解冻。在稀释蛋白质之前分离未溶解的物质，随后使用孔径小于35nm的过滤器对所得的溶液进行纳米过滤。
US-A1-2006/0009376也公开了一种生产纤维蛋白原的方法。其通过反复的溶解和纤维蛋白原的沉淀来去除因子XIII。
Goheen, S. C.等在Journal of Chromatography A. 816 (1998) 89-96中报道了关于在含有季胺或磺基官能团的无孔柱材料上对血浆蛋白白蛋白、纤维蛋白原和免疫球蛋白（G）进行HPLC离子交换层析。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种纤维蛋白原浓缩物，其通过生产方法中专门的病原体消除和/或灭活步骤来制备，以克服与病原体有关的疾病的不良反应或发展。所述病原体选自细菌、病毒和朊病毒，例如朊病毒蛋白质痒病（PrPsc）。这种纤维蛋白原产品的通过静脉途径的全身应用能够治疗先天性纤维蛋白原缺乏症和获得性纤维蛋白原缺乏症。这种标准化的纤维蛋白原浓缩物的应用能够在紧急情况下进行快速治疗，无需对新鲜冰冻血浆进行耗时的解冻，并有较低的容量负荷，由于其组成基本上恒定，还有可靠的凝固性。
本申请的进一步目的在于提供一种在工业水平上生产浓缩物的方法，即使用数百至数千公升的起始物料（例如血液或血浆），虽然小规模的生产（例如数1/10公升至数公升）也是可能的。
这些和进一步的目的通过权利要求1至14的方法实现，由本发明的方法所能获得的产品在权利要求15至19中请求。
大体上，本发明的从含有纤维蛋白原的来源纯化或生产纤维蛋白原的方法包括以下步骤：
-通过向含有纤维蛋白原的来源加入至少一种沉淀剂，形成富含纤维蛋白原的沉淀物；
-可选地分离富含纤维蛋白原的沉淀物，例如通过所述沉淀物的离心；
-在水介质中溶解富含纤维蛋白原的沉淀物，形成含有纤维蛋白原的溶液，再可选地进行过滤和/或超/渗滤；
-在具有强阴离子交换剂基团的固定相上对含有纤维蛋白原的溶液进行层析，通过在纤维蛋白原结合至所述相的条件下，将所述溶液与所述相接触；
-然后通过与前述步骤的离子强度相比离子强度更高的水溶液，从固定相洗脱纤维蛋白原，产生富含纤维蛋白原的部分，再将其收集；
-可选地，随后对富含纤维蛋白原的部分进行稀释和/或浓缩；
-并且可选地将富含纤维蛋白原的部分装填入合适的瓶子中。
在本发明的生产方法的一个实施方式中，含有纤维蛋白原的来源选自血浆、血浆成分（例如成分I），或冷沉淀、产生细胞培养物的纤维蛋白原和/或所述细胞培养物的上清液。如果不将冷沉淀作为起始物料，可以通过已知的方法（例如Cohn, Kistler-Nitschmann所披露的方法及其变形）制备作为起始物料的含有纤维蛋白原的中间物。
为了获得药学上可用的产品，有利的是，对含有纤维蛋白原的来源进行病毒灭活过程，例如溶剂洗涤剂过程。
根据本发明的另一个实施方式，在形成富含纤维蛋白原的沉淀物之前进行病毒灭活。但是，在不同的阶段进行病毒灭活也是可能的。
根据本发明的又一个实施方式，通过油萃取和/或强阴离子交换剂的层析去除灭活病毒的物质。
在本发明的生产方法中使用的典型的沉淀剂选自氨基酸（例如甘氨酸）、高盐浓缩物（盐析）或聚乙二醇。
根据本发明的又一个实施方式，所述溶解是在pH为7.5至8.5的缓冲液中对糊状物进行重悬。
根据本发明的进一步的实施方式，固定相具有叔胺或季胺基团。
特别地，可以在柱中进行本发明的生产方法中的层析步骤。
通常，填充后的富含纤维蛋白原的部分的储存形式是液态、冻结态，优选在<-15°C，最优选低于-30°C，或者形成冻干物。
本发明的主题也在于根据本发明的生产方法能够获得的富含纤维蛋白原的部分。本发明的富含纤维蛋白原的部分在每mg纤维蛋白原中含有例如0.01-9.0 ng纤维蛋白肽A。进一步地，本发明的富含纤维蛋白原的部分在每mg纤维蛋白原中含有0.80-1.10 mg纤维蛋白原-抗原（由Clauss方法测定）；每mg纤维蛋白原中VWF:Ag活性<0.1 IU；每mg纤维蛋白原中凝血因子XIII活性≥0.07IU；每mg纤维蛋白原中0.01-1.00 µg纤维连接蛋白以及每mg纤维蛋白原中小于0.03 IU凝血酶。
纤维蛋白原浓缩物在无菌过滤之后被装进最后的容器中，并可以以液体、液体冷冻或冻干的形式储存。
根据本方法制造的纤维蛋白原的特征在于非常低含量的确定产品生成的杂质，并允许对有需要的人进行长期治疗。FXIII优选在所包含的浓度，因为它支持所形成的纤维蛋白的稳定化，同时避免转谷氨酰胺酶的过载。
术语“包括”也能够被“由……组成”所替代，而不改变本说明所公开的内容。
详细说明
虽然根据本发明原则上可以使用所有含有纤维蛋白原的来源，但冷沉淀是优选的来源，以下在本发明的生产方法的进一步描述中，冷沉淀作为典型的纤维蛋白原来源。
通常地，将冷沉淀在合适的缓冲条件下重组或溶解，特别是在大约中性pH（6.9-7.0，例如在含有柠檬酸钠和NaCl的缓冲溶液中），然后特别地使用Al(OH)3进行吸附，通过例如离心去除所形成的凝胶。然后可以通过例如溶剂/清洁剂（S/D）处理来使上清液变得病毒灭活。该方法是常规技术人员所熟知的，并最初记载于EP-A-131 740中。S/D化合物，例如Triton（O-[4- (1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基]-聚乙氧基乙醇）和TnBP（三-n-丁基-磷酸），特别通过蓖麻油提取被去除。对于进一步纯化，可以对水相进行层析过程。通常可以通过将水相与强阴离子交换凝胶接触来实行，该凝胶是接枝在基质材料上的三-甲基-氨基-乙基盐（TMAE），例如Fractogel®EMD-TMAE。如果该层析是使用pH值为6.9-7.1并且渗透压为570-610 mosmol/l的缓冲液来进行的，则能够获得良好的结果。在这些条件之下，纤维蛋白原不会结合至固定相，因此在流体或上清液中发现（如果进行批量层析，则会是后者）。
将未结合的、含有通常约40 g/l（Clauss的比浊法）的纤维蛋白原溶液调节至pH=7.0-8.0，特别为pH=7.3-7.5。加入适当的沉淀剂（例如甘氨酸）至浓度为0.8-1.2 M（特别是0.9-1.1M）之后，可以搅拌所形成的溶液60-120分钟以沉淀纤维蛋白原。然后可以通过离心分离含有纤维蛋白原的沉淀物，该中间纤维蛋白原糊状物可以在≤-70°C（优选在-100°C至-70°C）下储存达一个月。单一沉淀物（例如通过甘氨酸）已经为进一步的处理提供了足够纯的纤维蛋白原糊状物。
可以将由此制得的中间物重悬于10-30 mM Tris缓冲液（pH=7.5至8.5）中，特别是pH=7.5-8.5的15-25 mM Tris缓冲液。然后可以将所得到的悬浮液滤出并进行超/渗滤，例如用体积为悬浮液5倍的相同或不同的缓冲液。
将所形成的含有纤维蛋白原的溶液加载到强阴离子交换凝胶上，所述凝胶优选地选自作为接枝至基质的配体的叔胺或季胺基团。所述功能性基团选自公知的二乙基-氨基-乙基盐（DEAE）、三-甲基-氨基盐、三-甲基-氨基-乙基盐（TMAE）和其他基团，但载体材料可以由纤维素、琼脂糖、二氧化硅、聚合材料或陶瓷材料组成。特别地，使用通过连接基团接枝至羟基化的甲基丙烯酸聚合物的三甲基-氨基基团（例如GigaCap Q-650M®），可以有效地减少纤维连接蛋白和玻连蛋白。这是非常意外的，因为化学性质相似的Marco–Prep High Q®在所述两种蛋白的减少中效率较低，它是一种由二亚乙基-乙二醇-二甲基丙烯酸/环氧丙基-甲基丙烯酸酯组成的甲基丙烯酸共聚物，也具有三甲基-氨基配体，但在其聚合物骨架中没有羟基官能团。粘性的纤维连接蛋白的有效减少对于可选的过滤（例如超/渗滤或纳米过滤）是非常有利的，因为阻塞的减少会增加过滤器的寿命。如果方法中要包括纳米过滤，优选使用稀释的溶液（纤维蛋白原浓度约2 g/l）来实施该方法，特别地使用层叠的纳米过滤器。特别地，在应用纤维蛋白原溶液之前，使用缓冲液对层析凝胶或树脂进行预平衡，该缓冲液与用来重悬中间纤维蛋白原糊状物的缓冲液相同。先后使用平衡缓冲液和洗涤缓冲液（1.5 g /l柠檬酸钠，6.0 g /l氯化钠，调节至pH=6.8-7.2，优选6.9-7.1，并在20-25°C的室温下具有11.0-13.0 mS/cm的电导率）将松散结合的物质洗掉。
然后可以使用洗脱缓冲液从层析柱洗脱纤维蛋白原，所述洗脱缓冲液含有1.5 g/l柠檬酸钠和10.0 g/l甘氨酸，特别地例如用HCl和/或NaOH调节至与洗涤缓冲液相同的pH范围，并用约7.0 g/l NaCl调节至20-25°C 的室温下电导率为13.1-15 mS/cm。在洗脱液中回收到大概74%的应用到柱的纤维蛋白原，同时纤维连接蛋白几乎被从含有纤维蛋白原的洗脱液中全部去除。
可以通过超/渗滤将过滤后的纤维蛋白原溶液进一步浓缩至约20-26 g/l，并用标称孔径≤0.2 µm的薄膜进行无菌过滤。本领域技术人员知晓其他浓缩物（例如1-19.9g/l或26.01-30 g/l或甚至更高）也是能够获得的。还可以用一般技术人员知晓的佐剂和稳定剂对本发明的纤维蛋白原浓缩物进行配方，例如碳水化合物（例如蔗糖、海藻糖、氨基酸（例如甘氨酸、组氨酸、丙氨酸、精氨酸））和清洁剂（例如聚氧乙烯-(20)- 脱水山梨糖醇-单油酸酯（TWEEN 80®））。该无菌过滤后的团块或者可选地在-70°C或更低温度（特别在-70°C至-80°C）下储存至5天，然后进行第二次无菌过滤，并装进最后的容器中，可选地进行冷冻干燥；又或者直接装进最后的容器中，并可选地进行冷冻干燥，而不进行第二次无菌过滤。
没有必要加入进一步的缓冲剂、稳定剂、佐剂或其他化合物（例如凝血因子XIII（FXIII））。凝血因子XIII在浓缩物中的活性为每mg纤维蛋白原≥0.05IU（Clauss方法），特别地每mg纤维蛋白原0.07-0.3IU、每mg纤维蛋白原0.06-0.5IU、或每mg纤维蛋白原0.05-1IU。
根据本方法制备的纤维蛋白原浓缩物展现以下生成性质：纤维蛋白原-抗原/纤维蛋白原- Clauss反应为0.80-1.10，特别为0.85-1.05，或0.90-1.00；纤维蛋白肽A的含量为每mg纤维蛋白原含0.01-9.0 ng（Clauss方法），特别地每mg纤维蛋白原含0.05-8.0 ng或每mg纤维蛋白原含0.08-6.0 ng；VWF:Ag活性为每mg纤维蛋白原<0.1 IU（Clauss方法），特别地每mg纤维蛋白原0.001-0.09 IU，每mg纤维蛋白原0.002-0.07IU，或每mg纤维蛋白原0.002-0.04 IU；因子XIII活性为每mg纤维蛋白原≥0.07IU（Clauss方法），特别地每mg纤维蛋白原0.07-0.3IU，每mg纤维蛋白原0.08-0.5IU，或每mg纤维蛋白原0.07-1IU；纤维连接蛋白的含量为每mg纤维蛋白原0.01-1.00 µg（Clauss方法），特别地每mg纤维蛋白原0.03-0.70 µg或每mg纤维蛋白原0.05-0.40 µg；以及纤维蛋白溶酶原活性为每mg纤维蛋白原1-11 mIU。在所有运行中凝血酶活性被确定为低于检测极限0.15IU/ml，并与表1所示的纤维蛋白原处于相同的浓度，其相当于每mg纤维蛋白原小于0.007 IU或0.0069-0.0001 IU/mg。
通过以下非限制性例子对本发明做进一步解释。
例子
将通过已建立的方法从血浆中制得的冷沉淀在约中性pH下重组或溶解，通过Al(OH)3进行吸附，通过离心去除所形成的凝胶。然后通过溶剂/清洁剂（S/D）处理将上清液病毒灭活。通过植物油提取S/D化合物（Triton和TnBP），并将水相与Fractogel®EMD-TMAE接触。设定层析条件（pH值为6.9-7.1，渗透压为570-610 mosmol/l），在该条件下纤维蛋白原不结合至凝胶，并因此在流体或上清液中发现。
加入甘氨酸（最终浓度为1mol/l，pH=7.4）后，将未结合的纤维蛋白原溶液搅拌约90分钟以沉淀纤维蛋白原。然后通过离心来离含有纤维蛋白原的沉淀物，得到中间纤维蛋白原糊状物。
在20mM Tris缓冲液（pH=约8.0）中重悬由此制得的中间物。然后过滤得到的悬浮液并进行超/渗滤。
然后将所形成的含有纤维蛋白原的溶液加载至GigaCap Q-650M® ，并在应用纤维蛋白原溶液之前，使用与用来重悬的Tris缓冲液相同的缓冲液对层析凝胶或树脂进行预平衡。用平衡缓冲液洗掉松散结合的物质，随后用洗涤缓冲液（1.5 g /l柠檬酸钠，6.0 g /l氯化钠，调节至pH=7.0，电导率为约12.0mS/cm）进行洗涤。然后用洗脱缓冲液（1.5 g/l柠檬酸钠和10.0 g/l甘氨酸，调节至与洗涤缓冲液相同的pH，并用约7.0 g/l NaCl调节至电导率为13.1-15 mS/cm）从层析柱洗脱纤维蛋白原中。
将获得的纤维蛋白原溶液进行浓缩、配方和无菌过滤。该无菌过滤后的团块在-80°C下储存5天，然后进行第二次无菌过滤，并装进最后的容器中。最后的容器的一部分被冻干，而其他部分则作为液体配方保存。
在重组冻干产品之后，对四个不同生产运行的产品进行分析。通过将注射用水（WFI）增加至冻干前的浓度，来完成冻干物的重组。所有生产运行都基本上以与本例子中所示方式相同的方式实行。结果展示在表1之中。
表1
表2展示了通过计算每mg纤维蛋白原的含量或活性获得的正常化的测量值，由Clauss方法测得。
表2
与商业可获得的产品的比较。
表3描述了商业可获得的纤维蛋白原浓缩物的测量值。所有产品都是冻干的产品，并根据厂家的指南进行重组。还展示出的是已在表1中展示的根据本发明的运行1-4的值的范围。
表3
表4展示了通过计算每mg纤维蛋白原的含量或活性而得到的商业可获得的产品的正常化的测量值，由Clauss方法测得。还展示出的是已在表2中展示的根据本发明的运行1-4的值的范围。
表4
与WO 01/48016的一个优选实施方式的比较。
使用8.33g提取缓冲液（0.8M NaCl，5mM ε-ACA（ε-氨基己酸），20mM柠檬酸钠，60IU/ml肝素， pH=7.3，即段落1.1.19的增强缓冲液）在37°C下对1g成分I糊状物进行提取2小时。将50g 2%氢氧化铝（铝胶）溶液加入提取物的上清液。将混合物在室温下搅拌15分钟，在5000g下离心10分钟，弃去沉淀。将铝胶上清液和甘氨酸/ NaCl缓冲液（2.1M甘氨酸，20mM柠檬酸钠，3.6M NaCl和2.4mM CaCl2）分别处理至30.2°C和29.7°C，并在4.5分钟内将上清液加入到缓冲液。在30.2-31.1°C下对1份上清液和2.05份缓冲液的混合物搅拌20分钟，然后在5000g下离心10分钟。在约21°C下连续搅拌2小时，使Gly/NaCl沉淀重新溶解在缓冲液D（代表成分1糊状物提取物的上清液的1/3体积）中。然后在约23°C、1%（聚山梨醇酯80）和0.3% (TnBP)的浓度下，使用聚山梨醇酯80和TnBP对重新溶解的沉淀进行S/D处理1小时。在XK26柱中、大约20cm床高（代表大约100ml柱体积）、10ml/min的流动速率下用MacroPrep®HQ树脂进行阴离子交换层析。使用增强MQ缓冲液（50mM TRIS，100mM NaCl，20mM ε-ACA，pH=8.0，段落2.2.3）的2个柱体积来进行平衡，并且电导率（柱后）达到MQ缓冲液的电导率+-10%的给定边界值。用6个柱体积的MQ缓冲液洗涤之后，使用增强缓冲液ME（500mM NaCl，1.1mMCaCl2，10mM柠檬酸钠，10mM Tris和45mM蔗糖，pH=7.0，即缓冲液D + 2x200mM NaCl）在单峰中洗脱纤维蛋白原。分析结果展示在表5中。
表5

Claims (11)

1.一种纤维蛋白原产品，其具有的纤维连接蛋白含量为每mg纤维蛋白原0.01-1.00μg，所述纤维蛋白原通过包括以下步骤的方法能够获得：
a)溶解冷沉淀，在pH为6.9-7.0的缓冲液中溶解；
b)使用Al(OH)3对溶液进行吸附，并除去所形成的凝胶；
c)使用Triton和TnBP通过溶剂/清洁剂(S/D)处理对步骤b)所形成的溶液进行病毒灭活，使用植物油提取S/D试剂，在6.9-7.1的pH值和570-610mosmol/l的渗透压下将水相与TMAE树脂接触；
d)使用1M甘氨酸沉淀纤维蛋白原，该纤维蛋白原是在步骤c)的流体或上清液中发现的，并分离纤维蛋白原糊状物；
e)在7.5-8.5的pH下、在10-30mM TRIS缓冲液中重悬纤维蛋白原糊状物，过滤，并且；
f)将步骤e)的过滤后的溶液加载至强阴离子交换树脂上，所述强阴离子交换树脂含有通过连接基团接枝至羟基化的甲基丙烯酸聚合物骨架的三甲基-氨基基团，使用11.0-13.0mS/cm电导率的洗涤缓冲液洗掉松散结合的物质；
g)使用洗脱缓冲液洗脱纤维蛋白原，所述洗脱缓冲液含有1.5g/l柠檬酸钠和10.0g/l甘氨酸，调节至6.8-7.2的pH，并且用氯化钠调节至13.1-15mS/cm的电导率；
h)浓缩、配方、无菌过滤并装填。
2.一种纤维蛋白原产品，具有以下特征：纤维蛋白原含量为20-26.0mg/ml，纤维蛋白原-抗原含量为每mg纤维蛋白原0.8-1.2mg，凝血因子XIII活性为每mg纤维蛋白原0.07-1.0IU，纤维连接蛋白含量为每mg纤维蛋白原0.01-1.00μg，以及纤维蛋白肽-A含量为每mg纤维蛋白原0.01-9.0ng，其中，纤维蛋白原的含量由动态浊度Clauss法测得。
3.根据权利要求2所述的纤维蛋白原产品，通过包括以下步骤的方法能够获得：
a)溶解冷沉淀，在pH为6.9-7.0的缓冲液中溶解；
b)使用Al(OH)3对溶液进行吸附，并除去所形成的凝胶；
c)使用Triton和TnBP通过溶剂/清洁剂(S/D)处理对步骤b)所形成的溶液进行病毒灭活，使用植物油提取S/D试剂，在6.9-7.1的pH值和570-610mosmol/l的渗透压下将水相与TMAE树脂接触；
d)使用1M甘氨酸沉淀纤维蛋白原，该纤维蛋白原是在步骤c)的流体或上清液中发现的，并分离纤维蛋白原糊状物；
e)在7.5-8.5的pH下、在10-30mM TRIS缓冲液中重悬纤维蛋白原糊状物，过滤，并且；
f)将步骤e)的过滤后的溶液加载至强阴离子交换树脂上，所述强阴离子交换树脂含有通过连接基团接枝至羟基化的甲基丙烯酸聚合物骨架的三甲基-氨基基团，使用11.0-13.0mS/cm电导率的洗涤缓冲液洗掉松散结合的物质；
g)使用洗脱缓冲液洗脱纤维蛋白原，所述洗脱缓冲液含有1.5g/l柠檬酸钠和10.0g/l甘氨酸，调节至6.8-7.2的pH，并且用氯化钠调节至13.1-15mS/cm的电导率；
h)浓缩、配方、无菌过滤并装填。
4.根据权利要求3所述的纤维蛋白原产品，其具有的纤维连接蛋白含量为每mg纤维蛋白原0.01-1.00μg。
5.根据权利要求4所述的纤维蛋白原产品，其特征在于它为冻干状态。
6.一种纤维蛋白原产品，具有以下特性：
纤维蛋白原-抗原/纤维蛋白原为0.80至1.10，纤维蛋白肽A的含量为每mg纤维蛋白原0.01至9.0ng，VWF:Ag活性为每mg纤维蛋白原＜0.1IU，凝血因子XIII活性为每mg纤维蛋白原＞0.07IU，纤维连接蛋白的含量为每mg纤维蛋白原0.01-1.00μg，以及纤维蛋白溶酶原浓度为1至11mIU，其中纤维蛋白原的含量由动态浊度Clauss法测得。
7.根据权利要求6所述的纤维蛋白原产品，其中纤维蛋白肽A的含量为每mg纤维蛋白原0.05至8.0ng，以及凝血因子XIII活性为每mg纤维蛋白原0.07至0.3IU。
8.根据权利要求7所述的纤维蛋白原产品，其中纤维蛋白原-抗原/纤维蛋白原为0.85至1.05，VWF:Ag活性为每mg纤维蛋白原0.001至0.09IU，以及纤维连接蛋白的含量为每mg纤维蛋白原0.03-0.70μg。
9.根据权利要求6所述的纤维蛋白原产品，其中纤维蛋白原-抗原/纤维蛋白原为0.90至1.00，纤维蛋白肽A的含量为每mg纤维蛋白原0.08至6.0ng，VWF:Ag活性为每mg纤维蛋白原0.002至0.07IU，凝血因子XIII活性为每mg纤维蛋白原0.08至0.5IU，纤维连接蛋白的含量为每mg纤维蛋白原0.05-0.40μg。
10.根据权利要求8所述的纤维蛋白原产品，其具有的纤维连接蛋白含量为每mg纤维蛋白原0.01-1.00μg，所述纤维蛋白原通过包括以下步骤的方法能够获得：
a)溶解冷沉淀，在pH为6.9-7.0的缓冲液中溶解；
b)使用Al(OH)3对溶液进行吸附，并除去所形成的凝胶；
c)使用Triton和TnBP通过溶剂/清洁剂(S/D)处理对步骤b)所形成的溶液进行病毒灭活，使用植物油提取S/D试剂，在6.9-7.1的pH值和570-610mosmol/l的渗透压下将水相与TMAE树脂接触；
d)使用1M甘氨酸沉淀纤维蛋白原，该纤维蛋白原是在步骤c)的流体或上清液中发现的，并分离纤维蛋白原糊状物；
e)在7.5-8.5的pH下、在10-30mM TRIS缓冲液中重悬纤维蛋白原糊状物，过滤，并且；
f)将步骤e)的过滤后的溶液加载至强阴离子交换树脂上，所述强阴离子交换树脂含有通过连接基团接枝至羟基化的甲基丙烯酸聚合物骨架的三甲基-氨基基团，使用11.0-13.0mS/cm电导率的洗涤缓冲液洗掉松散结合的物质；
g)使用洗脱缓冲液洗脱纤维蛋白原，所述洗脱缓冲液含有1.5g/l柠檬酸钠和10.0g/l甘氨酸，调节至6.8-7.2的pH，并且用氯化钠调节至13.1-15mS/cm的电导率；
h)浓缩、配方、无菌过滤并装填。
11.根据权利要求10所述的纤维蛋白原产品，其特征在于它为冻干状态。
CN201610659096.1A 2010-09-20 2011-09-20 纤维蛋白原生产方法 Active CN106046147B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10177640.9 2010-09-20
EP10177640 2010-09-20
US34471910P 2010-09-21 2010-09-21
US61/344,719 2010-09-21
CN201180045268.1A CN103328503B (zh) 2010-09-20 2011-09-20 纤维蛋白原生产方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180045268.1A Division CN103328503B (zh) 2010-09-20 2011-09-20 纤维蛋白原生产方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106046147A CN106046147A (zh) 2016-10-26
CN106046147B true CN106046147B (zh) 2019-11-19

Family

ID=43048945

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180045268.1A Active CN103328503B (zh) 2010-09-20 2011-09-20 纤维蛋白原生产方法
CN201610659096.1A Active CN106046147B (zh) 2010-09-20 2011-09-20 纤维蛋白原生产方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180045268.1A Active CN103328503B (zh) 2010-09-20 2011-09-20 纤维蛋白原生产方法

Country Status (12)

Country Link
US (2) US9371355B2 (zh)
EP (1) EP2619225B1 (zh)
JP (1) JP2013537215A (zh)
KR (1) KR20130112031A (zh)
CN (2) CN103328503B (zh)
AU (1) AU2011304364B2 (zh)
BR (1) BR112013006384B1 (zh)
CA (1) CA2809471A1 (zh)
ES (1) ES2586698T3 (zh)
MX (1) MX347190B (zh)
RU (1) RU2603103C2 (zh)
WO (1) WO2012038410A1 (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9371355B2 (en) 2010-09-20 2016-06-21 Octapharma Ag Process for production of fibrinogen
RU2663792C2 (ru) 2012-03-13 2018-08-09 Октафарма Аг Способ очистки фибриногена, продукт фибриногена и средство для очистки или производства продукта фибриногена
US10188965B2 (en) 2012-12-05 2019-01-29 Csl Behring Gmbh Hydrophobic charge induction chromatographic depletion of a protein from a solution
US20140154233A1 (en) 2012-12-05 2014-06-05 Csl Limited Method of purifying therapeutic proteins
RU2556804C2 (ru) * 2013-12-17 2015-07-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ Способ получения концентрата фибриногена
US9932388B2 (en) 2014-11-13 2018-04-03 Hemarus Therapeutics Limited Chromatographic process for producing high purity fibrinogen and thrombin
US10799533B2 (en) * 2015-10-23 2020-10-13 Cerus Corporation Plasma compositions and methods of use thereof
KR101841587B1 (ko) 2016-01-12 2018-05-14 주식회사 녹십자홀딩스 피브리노겐의 정제방법
JP2019524704A (ja) 2016-07-06 2019-09-05 ラボラトワール・フランセ・デュ・フラクシオンマン・エ・デ・ビョテクノロジーＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｆｒａｎｃａｉｓ Ｄｕ Ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ Ｅｔ Ｄｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 安定な液体フィブリノーゲン
CN107540743A (zh) * 2017-10-11 2018-01-05 南岳生物制药有限公司 一种双层析法制备人纤维蛋白原的方法
CA3161383A1 (en) * 2019-12-10 2021-06-17 Vera OTT Method for manufacturing a fibrinogen preparation
EP4384143A1 (en) 2021-08-13 2024-06-19 Biotest AG Fibrinogen compositions and methods of preparation
CN113698470B (zh) * 2021-09-02 2023-03-17 成都蓉生药业有限责任公司 一种人纤维蛋白原的纯化方法

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4278594A (en) * 1979-06-19 1981-07-14 David Amrani Process for separation and isolation of AHF, von Willebrand's ristocetin cofactor (VWF:RCF) and fibronectin from blood plasma
US4540573A (en) * 1983-07-14 1985-09-10 New York Blood Center, Inc. Undenatured virus-free biologically active protein derivatives
FR2686883B1 (fr) * 1992-02-04 1994-05-13 Aquitaine Develop Transf Sanguin Procede de fabrication de fibrinogene de tres haute purete, fibrinogene de tres haute purete obtenu ainsi qu'une composition pharmaceutique le contenant.
US5290918A (en) * 1993-02-23 1994-03-01 Haemacure Biotech Inc. Process for the obtention of a biological adhesive made of concentrated coagulation factors by acidic precipitation
ATE241340T1 (de) 1994-02-17 2003-06-15 New York Blood Ct Inc Biologische bioadhäsive präparate, die fibrinkleber und liposomen enthalten, verfahren für ihre herstellung und verwendung
EP0771324B2 (fr) 1994-07-14 2011-02-09 CAF-DCF Département Central de Fractionnement de la Croix Rouge S.C.R.L. Concentre de fibrinogene issu de plasma sanguin, procede et installation pour sa preparation
US6037457A (en) * 1997-01-31 2000-03-14 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method for recombinant fibrinogen production
US7572769B2 (en) 1998-12-23 2009-08-11 Csl Behring Gmbh Fibrin adhesive granulate and method for its preparation
WO2000047621A1 (en) * 1999-02-12 2000-08-17 Baxter Aktiengesellschaft A method for producing a preparation based on fibrinogen and fibronectin as well as protein compositions obtainable according to this method
CA2395431C (en) 1999-12-23 2010-08-17 Csl Limited Separation of fibrinogen from plasma proteases
EP1148063A1 (de) 2000-04-18 2001-10-24 Octapharma AG Haemostatisch aktives vWF enthaltendes Präparat und Verfahren zu seiner Herstellung
IL136552A (en) * 2000-06-05 2005-05-17 Omrix Biopharmaceuticals Ltd Method for the inactivation of viruses by a solvent - detergent combination and by nanofiltration
CA2447789C (en) * 2001-05-21 2012-11-06 Omrix Biopharmaceuticals S.A. Removal of plasminogen or plasmin from protein solutions
DE10211632A1 (de) 2002-03-15 2003-10-09 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Abtrennung von Viren aus einer Proteinlösung durch Nanofiltration
GB0216001D0 (en) 2002-07-10 2002-08-21 Nat Blood Authority Process and composition
AT501088A2 (de) 2002-12-18 2006-06-15 Bio Prod & Bio Eng Ag Stabile therapeutische proteine
ES2214967B1 (es) 2003-03-06 2005-06-16 Probitas Pharma, S.A Procedimiento para la eliminacion de virus en soluciones de fibrinogeno y fibrinogeno obtenido por dicho procedimiento.
FR2887883B1 (fr) 2005-06-29 2007-08-31 Lab Francais Du Fractionnement Procede de separation des proteines fibrinogene, facteur xiii et colle biologique d'une fraction plasmatique solubilisee et de preparation de concentres lyophilises desdites proteines
US7968682B2 (en) 2006-12-12 2011-06-28 Oregon Health & Science University Degradation-resistant fibrinogen sealants
EP2293776B8 (de) 2008-06-23 2016-05-11 Bio-Products & Bio-Engineering Aktiengesellschaft Lagerstabiles, funktionell intaktes virus-inaktiviertes fibrinogen
CN101703763B (zh) * 2009-11-05 2012-07-11 绿十字(中国)生物制品有限公司 人纤维蛋白原的生产方法
US9371355B2 (en) * 2010-09-20 2016-06-21 Octapharma Ag Process for production of fibrinogen
RU2663792C2 (ru) 2012-03-13 2018-08-09 Октафарма Аг Способ очистки фибриногена, продукт фибриногена и средство для очистки или производства продукта фибриногена

Also Published As

Publication number Publication date
US9371355B2 (en) 2016-06-21
JP2013537215A (ja) 2013-09-30
RU2013118323A (ru) 2014-10-27
EP2619225A1 (en) 2013-07-31
US20130274444A1 (en) 2013-10-17
MX347190B (es) 2017-04-19
ES2586698T3 (es) 2016-10-18
WO2012038410A1 (en) 2012-03-29
BR112013006384A2 (pt) 2017-07-18
BR112013006384B1 (pt) 2021-12-07
US20160264619A1 (en) 2016-09-15
KR20130112031A (ko) 2013-10-11
CN103328503A (zh) 2013-09-25
AU2011304364A1 (en) 2013-01-31
CA2809471A1 (en) 2012-03-29
AU2011304364B2 (en) 2015-07-09
MX2013002657A (es) 2013-04-08
EP2619225B1 (en) 2016-06-15
CN106046147A (zh) 2016-10-26
RU2603103C2 (ru) 2016-11-20
CN103328503B (zh) 2016-08-24
US9938318B2 (en) 2018-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106046147B (zh) 纤维蛋白原生产方法
US11401300B2 (en) Process for production of fibrinogen and fibrinogen produced thereby
CN104981476B (zh) 一种纯化治疗性蛋白质的方法
EP1568709B1 (de) Reinigung von Fibrinogen
JP3701028B2 (ja) 高純度フォンビルブラント因子の入手方法
JP5662988B2 (ja) 可溶化血漿フラクションから蛋白質フィブリノーゲン、第ｘｉｉｉ因子および生物学的グルーを分離し、そして該蛋白質の凍結乾燥濃縮物を調製するための方法
SK279533B6 (sk) Spôsob prípravy štandardizovaného vysoko čistého k
NO326257B1 (no) &#34;Fremgangsmate ved utvinning av faktor VIII:C&#34;
NO324659B1 (no) Utvinning av von Willebrand-faktor ved kationebytterkromatografi samt preparat inneholdende slik faktor og anvendelse derav.
US20220380439A1 (en) Purification of fviii from plasma using silicon oxide adsorption
US20020019036A1 (en) Von willebrand factor derivatives and methods of isolating proteins that bind to von willebrand factor
PL187886B1 (pl) Sposób wytwarzania nieimmunogennej kompozycji zawierającej czynnik krzepnięcia VIII

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant