PL187886B1 - Sposób wytwarzania nieimmunogennej kompozycji zawierającej czynnik krzepnięcia VIII - Google Patents
Sposób wytwarzania nieimmunogennej kompozycji zawierającej czynnik krzepnięcia VIIIInfo
- Publication number
- PL187886B1 PL187886B1 PL32045097A PL32045097A PL187886B1 PL 187886 B1 PL187886 B1 PL 187886B1 PL 32045097 A PL32045097 A PL 32045097A PL 32045097 A PL32045097 A PL 32045097A PL 187886 B1 PL187886 B1 PL 187886B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- fviii
- solution
- detergent
- mixture
- plasma
- Prior art date
Links
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 title claims abstract description 146
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 50
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims abstract description 152
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims abstract description 152
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 9
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 23
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 21
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 10
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 10
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 6
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 claims description 5
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 4
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 4
- 108010012557 prothrombin complex concentrates Proteins 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 22
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 32
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 239000000047 product Substances 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 21
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 15
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 10
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 4
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 4
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 4
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 4
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 4
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- -1 alkyl phosphates Chemical class 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000003686 blood clotting factor concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 2
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 241001288393 Belgica Species 0.000 description 1
- 241000701922 Bovine parvovirus Species 0.000 description 1
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010021703 Indifference Diseases 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241000701370 Plasmavirus Species 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 102100028516 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase U Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N bvdv Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CN=CN1 PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003754 machining Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940005755 monoclate Drugs 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 238000002616 plasmapheresis Methods 0.000 description 1
- 229920001469 poly(aryloxy)thionylphosphazene Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000006076 specific stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania nieimmunogennej kompozycji zawierajacej czynnik krzep- niecia VIII (FVIII), znamienny tym, ze roztwór zawierajacy FVIII traktuje sie mieszani- na fosforanu trój-n-butylowego oraz detergenta, nastepnie raptownie zamraza sie go w temperaturze ponizej -190°C, po czym zamrozony material poddaje sie liofilizacji i kolejno, po liofilizacji, material zawierajacy FVIII poddaje sie obróbce cieplnej, w temp. 100°C przez 15-120 min, az do uzyskania resztkowej wilgotnosci materialu od 0,3 do 1 ,8 % wagowych. PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nieimmunogennej kompozycji zawierającej czynnik krzepnięcia VIII. Sposób wytwarzania pozwala na otrzymanie kompozycji o szczególnie wysokiej czystości, zawierającej podwójnie dezaktywowany wirusowo czynnik krzepnięcia VIII pochodzący z osocza krwi ludzkiej (przeciwkrwawiączkowy czynnik VIII, w skrócie „FVIII”).
Znanych jest szereg sposobów wytwarzania produktów o wysokiej czystości, zawierających dezaktywowany wirusowo FVIII, wyodrębnianych z osocza krwi ludzkiej. Przykładowo: sposób wytwarzania produktu zawierającego FVIII, w którym do oczyszczania FVIII stosuje się jonity, jest znany z opisu EP 0 367 840. W tym sposobie, w celu dezaktywacji wirusów roztwór FVIII poddaje się obróbce biologicznie tolerowanymi rozpuszczalnikami organicznymi z detergentami.
Z opisu DE 42 04 694 są znane anionity o różnych własnościach, nadające się do oczyszczania FVIII.
Z opisu EP 0 337 144 są znane materiały rozdzielcze do frakcjonowania biopolimerów, które można stosować w chromatografii wybiórczej, sorpcji lub w chromatografii jonowymiennej.
Kompleksowy sposób oczyszczania chromatograficznego z zastosowaniem obróbki FVIII środkami powierzchniowo czynnymi w wodnym roztworze oraz obróbki cieplnej preparatów FVIII w stanie stałym jest znany z opisu EP 0 567 448. Obróbkę cieplną prowadzi się gorącą parą w obecności metanolu lub etanolu ze wskazaniem określonych proporcji ilościowych.
187 886
Zastosowanie amonitów do wytwarzania FVIII z krioprecypitatów jest znane z opisu WO 93/15105.
Wytwarzanie koncentratu FVIII przez strącanie FVIII poliglikolem etylenowym (PEG) i obróbkę cieplną w obecności sacharozy (od 1,2 do 0,6 .g/m koncentratu FVIII) jest znane z opisu Ep 0 399 321, a z opisu FBE 0 383 645 jest znane wytwarzanie koncentratu FVIII przez oddzielanie FVIII od czynnika Willebranda. Z opisu EP 0 412 466 jest znany sposób wytwarzania FVIII o wysokiej aktywności właściwej, przy czym zgodnie z tym sposobem FVIII jest dodatkowo pasteryzowany.
Ogrzewanie liofilizowanych koncentratów krzepnięcia w celu zmniejszenia zakaźności wirusów, jeśli ona występuje, jest znane z opisu patentowego USA 5 099 002, a z opisu WO 94/17834 jest znana dezaktywacja wirusów przez obróbkę fosforanami alkilowymi materiałów, w których wirusy te występują. Materiał poddawany obróbce poddaje się jednoczesnemu lub następującemu potem oddziaływaniu temperatury od 55°C do 67°C, przez okres od 5 do 30 godzin.
Z opisu EP 018 561 jest znane wytwarzanie czynników krzepnięcia przez ogrzewanie w 60-70°C w obecności glicyny i sacharydu w roztworze, a z opisu EP 0 094 611 jest znana kompozycja do wytwarzania leków wzbogacona w FVIII. Kompozycję tę ogrzewa się w stanie liofilizowanym w temperaturze od 60°C do 125°C. Ma ona aktywność właściwą ponad 300 jednostek FVIII na gram białka.
W czasopiśmie „Hemophilia World”, 1995; tom 2, nr 3, w dodatku do tego numeru pod tytułem „Clotting Factor Concentrates, USA 1995” („Koncentraty krzepnięcia, USA 1995”) zebrano informacje o znanych w USA koncentratach FVIII i FIX. Z publikacji tej zostały zaczerpnięte dane o koncentratach FVIII i sposobach dezaktywacji wirusów w tych koncentratach. Dane te, uzupełnione nazwami produktów i ich europejskich wytwórców przedstawiono w tabeli 1.
Tabela 1
Koncentraty czynnika VIII (produkty handlowe w 1995 r.)
| Nr | Nazwa handlowa | Producent | Dezaktywacja wirusów | Aktywność właściwa, końcowy pojemnik bez albuminy. |
| 1 | Haemate | Behringwerke | 60°C, 10 h; ciecz + stabilizator | 1-2 |
| 2 | Beriate P | Behringwerke | 60°C, 10 h; ciecz + stabilizator | około 100 |
| 3 | Profilate HAC | Alpha | SD; 80°C, 72 (GT) | 5-15 |
| 4 | Koate | Miles/Cutter | SD | 10-20 |
| 5 | Octavi SD Plus | Octapharma | SD;63°C, 10 h; ciecz + stabilizator | około 100 |
| 6 | Emoclot | Aima | SD; 100°C, 30 min | około 100 |
| 7 | Haemoctin SDH | Biotest Pharma | SD; 100°C, 30 min | około 100 |
| 8 | Immunate | Immuno AG | 60°C, 10 h; para | 10 |
| 9 | Alpanate | Alpha | SD | 20-30 |
| 10 | Hemofil M | Baxter | SD | >500 2-10 |
| 11 | Monoclate | Armour | 60°C, 10 h; ciecz + stabilizator | >500 2-10 |
| 12 | Octanativ | Kabi | SD | >500 około 20 |
SD - rozpuszczalnik-detergent GT - liofilizowany
Przedstawione w tabeli 1 koncentraty FVIII zostały wytworzone w ciągu ostatnich dziesięciu lat (Kasper C.K., Lusher J.M. and the Transfusion Practices Committee of the American
187 886
Association of Blood Banks (Kasper C.K., Lusher J.M. i Komisja Praktyki Transfuzyjnej Amerykańskiego Towarzystwa Banków Krwi): „Recent evolution of clothing factor concentrates for hemophilia A nad B” („Ostatnie udoskonalenia koncentratów czynników krzepnięcia dla hemofilii A i B”); Transfńsion 1993, 33: 422-4334). Najważniejszym celem przy wytwarzaniu tych produktów było polepszenie bezpieczeństwa ich stosowania, zwłaszcza pod względem przenoszenia wirusów. Cel ten osiągano przez badanie przesiewowe dawców oraz stosowanie nowych sposobów dezaktywacji wiru sów i oczyszczania FVIII.
W końcu lat siedemdziesiątych i w latach osiemdziesiątych rozwinięto dwa spośród najważniejszych sposobów dezaktywacji wirusów w koncentratach FVIII. Jeden z tych sposobów polega na obróbce cieplnej FVIII w roztworze, w obecności stabilizatorów'. Drugi sposób polega na stosowaniu fosforanów alkilowych.
W roku 1979, w EP 0 018 561 ujawniono ogrzewanie FVIII w roztworze, w obecności cukrów (40-60%) i aminokwasów (1-2,5 M), a następnie stwierdzono, że ogrzewanie białek w roztworze, w obecności cukrów, jest bardziej korzystne przy wprowadzeniu dodatku soli zawierających jony Ca (EP 0 106 269).
Opisane sposoby dezaktywacji wirusów w roztworach białek są wciąż udoskonalane; np. zgodnie ze sposobem według opisu EP 0 035 204, w którym to sposobie podwyższono zakres temperatur z 60°C do 75°C i stosowano stężenia cukru od 30% aż do nasycenia.
Ogrzewanie frakcji białek zawierających FVIII w stanie liofilizowanym opisano w EP 0 171 506. Zakres stosowanych w tym sposobie temperatur znajduje się w granicach 60°C do 125°C.
Obróbkę frakcji osocza, zawierających FVIII, z zastosowaniem połączenia fosforanu alkilowego i detergenta ujawniono w opisie EP 0 131 740. Sposób ten okazał się szczególnie skuteczny w przypadku dezaktywacji osłanianych wirusów (Horowitz M.S. i in., Lancet 1988, 2: 186-189; Horowitz B., Curr. Stud. Hematol. Blood Transfus. 1989, 56: 83-96; Horowitz B., Transfusion, 25: 516-522). Ten sposób dezaktywacji wirusów (sposób rozpuszczalnik detergent (SD)) w zasadzie nie jest jednak w stanie dezaktywować wirusów bez powłoki osłonowej, zawierającej lipidy.
Wytwarzanie leków z osocza krwi ludzkiej przy stosowaniu badania przesiewowego osocza dawców również nie wyklucza niebezpieczeństwa przenoszenia czynników zakaźnych, toteż stale należy dążyć do minimalizacji tego niebezpieczeństwa.
Potrzeba stosowania ulepszonych sposobów dezaktywacji osłanianych wirusów ujawniła się szczególnie wyraźnie po tym, jak w latach 1992/1993 doniesiono o około 100 przypadkach zapalenia wątroby A (Lancet (1992), 340: 123; Lancet (1993), 341:179; Ann. Intern. Med. (1994); MMWR (1996), tom 45, nr 2: 29-32), w związku ze stosowaniem koncentratu FVIII poddawanego obróbce SD. Ujawnienie tych przypadków zapalenia wątroby A było powodem podjęcia, między innymi, wieloetapowego planu badań przez niemieckie władze (Pharm. Ind. 1993; 4: 71-72).
Głównym problemem podstawieniowego leczenia krwawiączki A, obok niebezpieczeństwa przenoszenia czynników zakaźnych przez produkty zawierające FVIII, jest powstawanie inhibitorów FVIII (przeciwciał FVIII). Te przeciwciała powstają u 3-52% chorych na ciężką krwawiączkę A i można to wytłumaczyć różnymi zmiennymi czynnikami (De Biasi R. i in. Thrombosin Haemostatis 1994; 71: 544-7; Ehrenforth S. i in., Lancet 1992, 339: 594-8; Scharrer I. i in., Blood Coag Fibrinol 1993, 4: 753-8; McMillan C.W. i in., Blood 1988, 71: 344-8). Te zmienne czynniki dotyczą wieku chorych, częstości leczenia i rodzaju preparatu FVIII (Addiego J.E. i in., Thromb. Haemost. 1993, 67: 19-27; Bumouf T. i in., Vox Sang. 1991, 60: 8-15; Peerlinck K. i in., Thromb. Haemost. 1993, 69: 115-8; Rodendaal F.R. i in., Blood 1993, 81: 2180-6; Sultan Y., Thromb. Haemost. 1992, 67: 600-2; Peerlinck K. i in., Blood 1993, 81: 332-5, Guerois C. i in., Thrombos Haemostas 1995, 73 (2): 215-8).
Na powstawanie inhibitorów (Roberts H.R., Blood Coag and Fibrinol 1991, 2 (1): 21-23; Hoyer L, Brit. J. of Haematology 1995, 90, 498-501 mogą wpływać różnice w odpowiedzi immunologicznej u chorych lub ich genetyczne skłonności do występowania różnych mutacji genowych, powiązanych z powstawaniem przeciwciał FVIII (Schwaab R. i in., „Thrombosis and Haemostasis” 1975, 74 (6), 1402-1406).
187 886
Poniżej zestawiono czynniki, które wpływają, na występowanie inhibitorów FVIII:
1. Chory: wady genetyczne, charakterystyczne reakcje odpornościowe, stan odpornościowy
2. Leczenie: rodzaj produktu FVIII, liczba ekspozycji
3. Ocena: Kontrola i czułość metod kontrolnych
Chociaż dziś jeszcze nie jest możliwe jednoznaczne przypisanie konkretnych przyczyn powstawania przeciwciał FVIII o własnościach powstrzymujących, to jednak wyniki niektórych badań wskazują na znaczenie, jakie ma dla preparatów FVIII wprowadzenie inhibitorów FVIII (Vermylen I i in., Acta Clinica Belgica (1991); 46:20).
Chorych na krwawiączkę A leczonych już wcześniej (PTPs - hemofilicy uprzednio wielokrotnie poddawani transfuzji), poddano w okresie od maja 1990 do września 1991 leczeniu nowym koncentratem FVII. Produkt ten oczyszczano przez chromatografię na szkle i pasteryzowano. Spośród 47 chorych, których leczono wyłącznie tym produktem, u 4 pacjentów rozwinął się wysoko mianowany inhibitor (40, 90, 100 i 200 jednostek Bethesda (BU)). Dalszy pacjent, u którego stwierdzono wystąpienie inhibitorów (20 BU) był w zasadzie również leczony tym produktem FVIII. Na podstawie przeprowadzonych obserwacji i wyników leczenia zaniechano stosowania tego produktu.
Wytwarzanie koncentratu FVIII o wysokiej czystości, o aktywności . właściwej około 100, z dużych zbiorników osocza wymaga konieczności spełnienia wielu warunków. Należy przy tym stale pamiętać o wpływie sposobu dezaktywacji wirusów przy wytwarzaniu koncentratów FN/III na strukturę białka, zwłaszcza w aspekcie powstawania inhibitorów.
Przede wszystkim, przy wszystkich sposobach obróbki koncentratów FVIII należy stale pamiętać, że musi być zachowana najważniejsza biologiczna funkcja FVIII, czyli jego aktywność. W koncentratach FVIII, które będą stosowane w leczeniu chorych na krwawiączkę, powinien być też być zachowany niemal identyczny stosunek Ag-FVIII do białka FVIII, taki jak w środowisku osocza, z którego ten czynnik wyodrębniono.
Koncentrat FVIII, który uzyskuje się z osocza po jego oczyszczeniu, powinien zawierać zasadniczo tylko FVIII oraz czynnik von Willebranda (vWF), czyli naturalne białko nośnikowe dla FVIII. Celem zabiegów oczyszczania FVIII z osocza jest oddzielenie go od pozostałych białek osocza, należy więc unikać stosowania białek osocza jako stabilizatorów, ponieważ w przeciwnym przypadku uprzednie zabiegi oczyszczające będą miały znikome znaczenie. Zgodnie z tym, chory na krwawiączkę powinien otrzymać wyłącznie potrzebne mu białko. Oczyszczony FVIII z osocza stanowi mieszaninę polipeptydów o masach cząsteczkowych od 80 do 210 kDalton, które reprezentują szereg podjednostek z serii heterodimerów (Kaufmann, R., Transfusion Medicine Reviews 1992,4:235-246).
Z wyżej wymienionych powodów, zadaniem postawionym do rozwiązania przez twórców wynalazku było opracowanie sposobu oczyszczania i dezaktywacji wirusowej materiałów zawierających FVIII, w zasadzie bez stosowania stabilizatorów.
Według wynalazku, sposób wytwarzania nieimmunogennej kompozycji zawierającej czynnik krzepnięcia VIII (FVIII) charakteryzuje się tym, że roztwór zawierający FVIII traktuje się mieszaniną fosforanu trój-n-butylowego oraz detergenta i następnie raptownie zamraża się go w temperaturze poniżej -190°C. Zamrożony materiał zawierający FVIII poddaje się liofilizacji i kolejno, po liofilizacji, poddaje się go obróbce cieplnej, w temp. 100°C przez 15-120 min, aż do uzyskania resztkowej wilgotności materiału od 0,3 do 1,8% wagowych.
Jako detergent, w sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się polioksyetylenową pochodną estru sorbitanowego.
Z roztworu zawierającego FVIII, przed traktowaniem go mieszaniną fosforanu trój-n-butylowego oraz detergenta, korzystnie usuwa się fibrynogen i ewentualnie strąca się etanolem i/lub adsorbuje się na A!(OH)3 dalsze czynniki krzepnięcia z zespołu PPSB, natomiast po potraktowaniu roztworu zawierającego czynnik VIII mieszaniną fosforanu trój-n-butylowego oraz detergenta, korzystnie usuwa się mieszaninę fosforanu trój-n-butylowego oraz detergenta, stosując chromatografię jonowymienną. W szczególności roztwór zawierający FVIII, będący eluatem z chromatografii jonowymiennej poddaje się diafiltracji i/lub ultrafiltracji i ewentualnie po diafiltracji i/lub ultrafiltracji roztwór zawierający FVIII poddaje się filtracji sterylnej.
187 886
W szczególnym przypadku, obróbkę cieplną liofilizowanego materiału zawierającego FVIII prowadzi się w autoklawie. '
Sposób wytwarzania nie działającego immunogennie koncentratu FVIII o wysokiej czystości z osocza ludzkiego według wynalazku polega na jednoczesnym stosowaniu dwóch różnych sposobów dezaktywacji wirusów'. Ta podwójna dezaktywacja wirusów obejmuje, jak to podano wyżej, obróbkę roztworu FVIII fosforanem trój-n-butylowym (TNBP) i pochodną polioksyetylenową estru sorbitanowego (Tween®) (SD: rozpuszczalnik/detergent), korzystnie 0,2-0,5% wagowych TNBP/0,5-3% wagowych Tween®, oraz obróbkę cieplną liofilizowanego końcowego wyżej, obróbkę roztworu FVIII fosforanem trój-n-butylowym (TNBP) i pochodną polioksyetylenową estru sorbitanowego (Tween®) (SD: rozpuszczalnik/detergent), korzystnie 0,2-0,5% wagowych TNBP/0,5-3% wagowych Tween®, oraz obróbkę cieplną liofilizowanego końcowego produktu FVIII w końcowym pojemniku w 100°C przez 30 minut przy resztkowej zawartości wilgoci od około 0,3 do 1,8% wagowych. Do tego korzystnie dochodzą inne etapy zubażające w wirusy w czasie wytwarzania koncentratu.
Koncentrat FVIII wytwarzany z osocza ludzkiego według niniejszego wynalazku będzie w dalszym ciągu tekstu zwany „FVIII SDH” (SDH - rozpuszczalnik/detergent/ogrzewanie). FVIII SDH korzystnie wytwarza się z krioprecypitatu jako materiału wyjściowego, który uzyskuje się znanymi sposobami z osocza zbieranego. W krioprecypitacie tym występują prawie wszystkie białka osocza, a niektóre z nich w postaci wzbogaconej względem osocza, zwłaszcza FVIII i fibrynogen.
W korzystnym rozwiązaniu, sposób wytwarzania FVIII SDH według wynalazku obejmuje następujące etapy:
(1) Oddzielanie fibrynogenu i ewentualnie usunięcie dalszych czynników krzepnięcia z zespołu PPSB, odbywające się np. przez strącanie etanolem i/lub przez adsorpcję na Al(OH)3.
(2) Dezaktywacja wirusów w surowej frakcji FVIII, zachodząca korzystnie pod działaniem TNBP/Tween® 80.
(3) Wybiórcza chromatografia kolumnowa na jonitach prowadzi do usunięcia TNBP i Tween® 80, a także do oddzielenia resztkowych białek osocza.
(4) Eluat korzystnie poddaje się diafiltracji i/lub ultrafiltracji, przy czym nastawia się żądane stężenie elektrolitu.
(5) Po sterylnej filtracji następuje końcowe napełnianie szklanych butelek, które zanurza się w ciekłym azocie (około - 195°C), dzięki czemu roztwór FVIII raptownie zamarza.
(6) Liofilizacja zamrożonego roztworu FVIII następuje w wysokiej próżni i prowadzi do resztkowej wilgotności końcowego produktu w zakresie od 0,3 do 1,8%.
(7) Liofilizowane preparaty ogrzewa się w autoklawie przez 30 min wl00°C.
Produkty FVIII wytworzone według niniejszego wynalazku nie działają immunogennie i są wzbogacone w stosunku do wyjściowego osocza np. z krotnością około 10'4 zwłaszcza przy stosowaniu oczyszczania chromatograficznego.
Etapy usuwające wirusy w przeróbce FVIII i oczyszczania od osocza ludzkiego, stosowane w sposobie według niniejszego wynalazku w celu wytwarzania koncentratów FVIII nie działających immunogennie, przedstawiono w tabeli 2. Dla niektórych osłanianych i nieosłanianych wirusów przedstawiono w skali log 10 stopień ich dezaktywacji dla każdego etapu przeróbki przy wytwarzaniu koncentratów F VIII.
Tabela 2
Usuwanie i dezaktywacja wirusów przy wytwarzaniu z osocza nie działających immunogennie FVIII (zmniejszanie zawartości i aktywności wirusów: log 10)
| Etap/Obróbka | ||||||||
| Wirus | Zobojętnianie | Krioprecy- pitacja | AI(OH)3 | TNBP/- Tween | Chromato- grafia | 100° C/30 min | Ogólny współczynnik zmniejszania | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| HIV-I | 1,3 | 0,4 | >6,4 | 1,9 | >6,6 | 16,2 | ||
| PSR | 3,2 | 1,1 | >6,8 | 1,1 | >4,6 | > 16,8 |
187 886
c.d. tabeli 2
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| VSV | 1,5 | 0,5 | >4,7 | 0,6 | >5,8 | > 11,9 | ||
| BVDV | 1,2 | nb | >6,8* | 1,1 | >6,6 | > 15,7 | ||
| Sindb. | 7 | nb*** | 3,5 | >4,5 | 1,0 | nb | >9,0 | |
| Polio | nb | 5,0 | nb | 2,2 | 5,0 | 12,2 | ||
| Parvo** | 1,3 | 0,5 | 2,^. | 1,4 | 5,1 | |||
| Reo | 1,6 | nb | >6,0 | >7,6 | ||||
| HAY | 4,4 | 4,1 | >5,3 | > 13,8 |
* HCV: >4,5 log 10 (badanie na szympansach) ** Parvovirus bydlęcy *** nb - nie badano
Koncentraty FVII, wytworzone z osocza ludzkiego sposobem według niniejszego wynalazku, zawierają FVIII np. w ilości 10000 razy wzbogaconej w porównaniu z zawartością w osoczu. Stwierdzone stężenia poszczególnych białek w 1000 IE FVIII SDH (IE - jednostki międzynarodowe) porównano ze stężeniami tych białek, występującymi w 1 dm3 osocza (tabela 3).
Tabela 3:
Stężenia białek w osoczu i w FVIII SDH (wartości średnie)
| Białko | Stężenie w osoczu (mg/dm3) | FVIII SDH (mg/1000 IE) | Metoda |
| FVIII | 0,1-0,2 | 0,1-0,2 | 1 |
| Suma białek | 65000 | 10 | 2 |
| vWF | 18 | 6 | 1 |
| Fibrynogen | 3000 | 3,50 | 3 |
| Fibronektyna | 30 | 0,30 | 3 |
| Albumina | 44000 | 0,03 | 3 |
| IgG | 12000 | 0,50 | 3 |
| IgM | 1400 | 0,20 | 3 |
| IgA | 2100 | <0,01 | 3 |
- Elisa (Enzyme linked immunosorbent assay - próba immunosorbenta wiążącego enzymy)
- Brandford (autor metody) (Bradford M.M.: Analytical Biochemistry 1976, 72: 248-254)
- RID (Radiale Immunodiffusion - immunodyfuzja radialna)
W tym przedstawieniu danych o stężeniach białek stwierdzonych w FVIII SDH można wyczytać, że np. 96% ilości białek stwierdzonych w tym produkcie stanowią FVIII, vWF i niekrzepliwy fibrynogen. Fibrynogen ten występuje jako fibrynogen niekrzepliwy, tj. oznaczanie fibrynogenu według Claussa daje negatywne wyniki (Clauss A., Acta Haemat. 1957,17:237-246).
Sposoby, stosowane w celu wytwarzania koncentratów FVIII i w celu dezaktywacji lub usuwania wirusów występujących w osoczu, mają, być może, wpływ na strukturę i biologiczną aktywność białek.
Podstawowym warunkiem stosowalności produktów FVIII jest to, aby przed ich zastosowaniem, po dodaniu rozpuszczalnika - zwykle rozpuszczalnikiem jest woda odpowiednia do zastosowań klinicznych (aqua ad injectabilia) - rozpuszczały się one całkowicie. Skażone białka są w zasadzie nierozpuszczalne w wodzie. Struktura i biologiczna aktywność produktów FVIII, otrzymywanych według niniejszego wynalazku, pozostaje zachowana, jeśli otrzymuje się je sposobem według niniejszego wynalazku, ponieważ tylko w tych warunkach koncentraty FVID, również po ogrzewaniu do 2 godzin w 100°C, rozpuszczają się całkowicie w aqua ad injectabilia.
Decydującym warunkiem, aby FVIII SDH według niniejszego wynalazku mógł być ogrzewany przez 30 min w 100°C bez skażenia i mimo to pozostawał całkowicie rozpuszczalny w wodzie bez konieczności dodawania do buforu liofilizacyjnego stabilizatorów
187 886 w postaci białek lub cukrów, jest raptowne zamrożenie roztworu FVIII w ciekłym azocie w temperaturze -195°C przed liofilizacją. Koncentrat FVIII, wytwarzany sposobem według niniejszego wynalazku, czyli FVIII SDH, nieoczekiwanie nie zmienia się pod względem struktury biologicznej i biologicznej aktywności oraz nie następuje w nim skażenie białek w czasie ogrzewania.
W celu sprawdzenia wpływu sposobu wytwarzania według niniejszego wynalazku na strukturę białek przeprowadzono szereg prób fizycznych i biologicznych (Kotitschke R. i in., Hamostaseologie 1994, 14: 100-3, Arrigi i in., Thromb. Haemost. 1995, 74 (3): 868-73). W szczególności sprawdzono wpływ obróbki cieplnej na białka w warunkach sposobu wytwarzania według niniejszego wynalazku, ponieważ wiadomo, że FVIII jest skrajnie nietrwały przy przechowywaniu i wrażliwy na obróbkę cieplną.
Obróbka cieplna FVIII w roztworze wymaga zwykle stabilizowania FVIII przez dodawanie określonych stabilizatorów. Obróbka cieplna FVIII w stanie liofilizowanym bez znacznego zmniejszenia aktywności jest ponadto znana jedynie w odniesieniu do takich produktów FVIII, których aktywność właściwa po ich wytworzeniu z osocza jest bardzo niska (np. < 20), albo do których trzeba dodawać stabilizatory w postaci białek lub cukrów (patrz tabela 1).
Produkt FVIII SDH według niniejszego wynalazku nieoczekiwanie można ogrzewać w 100°C przez 2 godziny bez znacznego zmniejszenia aktywności, jeśli resztkowa zawartość wilgoci wynosi w nim mniej niż około 1,8%, a temperatura zamrażania przed jego liofilizacją wynosi -195°C. Z przytoczonych dalej danych stanie się oczywiste, że ogrzewane i nieogrzewane produkty FVIII przy sprawdzaniu struktury i aktywności dają identyczne wyniki (fig. 2 i tabela 4).
Tabela 4
Hemoktyna (R) SDH: FVIII C/FVIII Ag
| Obróbka | FVIIIC (x10) | FVIIIAg (x 1110) | FVIIIC/FVIIIAg (/10) |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| Krioprecypitacja | 0,98 | 1,66 | 5,9 |
| Al(OH)3 | 0,79 | 1,38 | 5,7 |
| TNBP/Tween | 0,59 | 1,01 | 5,8 |
| Eluat | 3,18 | 4,68 | 6,8 |
| ZP(UF/DF) | 5,79 | 8,55 | 6,8 |
| GT | 5,57 | 6,95 | 8 |
| SDH | 5,25 | 6,8 | 7,7 |
| Krioprecypitacja | 1,29 | 1,3 | 9,9 |
| Al(OH)j | 0,99 | 1,01 | 9,8 |
| TNBP/Tween | 0,67 | 0,70 | 9,6 |
| Eluat | 4,46 | 5 | 8,9 |
| ZP(UF/DF) | 6,31 | 6,45 | 9,7 |
| GT | 6,25 | 5,90 | 10,5 |
| SDH | 5,55 | 5,70 | 9,7 |
| Krioprecypitacja | 0,98 | 0,98 | 10 |
| Al(OH)3 | 0,83 | 0,73 | 11 |
187 886
c.d. tabeli 4
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| TNBP/Tween | 0,61 | 0,67 | 9,10 |
| Eluat | 3,8 | 4,34 | 8,8 |
| ZP (UF/DF) | 6,2 | 6,38 | 9,7 |
| GT | 5,78 | 5,7 | 10,1 |
| SDH | 5,52 | 5,3 | 10,4 |
Figury przedstawiają:
Figura 1 schematycznie przedstawia wytwarzanie FVIII SDH w postaci korzystnego rozwiązania.
Figura 2 przedstawia wartości stosunku F VIII C/F VIII Ag w różnych etapach wytwarzania FVIII dla trzech szarży FVIII SDH. Szarża a różni się od szarży b oraz c znacznie niższym stosunkiem w wyjściowym produkcie do wytwarzania FVIII z krioprecypitacji. W celu umożliwienia przedstawienia na tym wykresie kolumn odpowiadających poszczególnym parametrom o mniej więcej porównywalnych wysokościach wartości tych poszczególnych parametrów albo mnożono przez 10, albo dzielono przez 10. Wartości wymienionego stosunku muszą być w tym przedstawieniu dzielone przez 10, dzięki czemu zaznacza się, że w przypadku szarż b i c w każdym etapie wytwarzania są one bliskie 1,0. Krioprecypitat z szarży a wykazuje wartość tego stosunku około 0,6, co wskazuje na wystąpienie utraty aktywności FVIII przy wytwarzaniu i przechowywaniu tej szarży krioprecypitatu. Proces przeróbki na koncentrat FVIII o wysokiej czystości podwyższa wartość tego stosunku do 0,8, ale już nie do 1,0. W tych badaniach istotne jest jednak porównanie wartości tego stosunku dla próbek ogrzewanych i nieogrzewanych. Te wartości są dla obydwu produktów prawie jednakowe, co potwierdza względnie znikome zmniejszenie aktywności przez obróbkę cieplną.
Wpływ sposobu wytwarzania według niniejszego wynalazku na strukturę białek weryfikuje się na podstawie rozkładu mas cząsteczkowych oraz elektroforezy żelu SDS-poliakrylamidowego (PAGE). Ponadto sprawdza się nieogrzewany produkt (FVIII SD) i ogrzewany produkt (FVIII SDH) na powstawanie neoantygenów (R. Kotitschke i in. Hamostaseologie 1994; 14: 100-3; S. Arighi i in., Thromb. Haemost. 1995; 73 (3): 868-73). Te próby dają identyczne wyniki dla FVIII SD i FVIII SDH, co wskazuje, że w koncentratach FVIII wytwarzanych według niniejszego wynalazku struktura białek pozostaje niezmieniona.
Figura 3 przedstawia obserwacje przy stosowaniu FVIII SDH. Te obserwacje zastosowań rozpoczęto w 1993 roku w siedmiu ośrodkach leczących hemofilię A. Do tych obserwacji zastosowań włączono 51 chorych, z najdłuższym okresem obserwacji wynoszącym 27 miesięcy. Na Węgrzech od roku 1993 prawie wszystkich chorych na hemofilię A leczono krioprecypitatem i/lub tylko koncentratem FN/III.- Dlatego też było możliwe wykonanie prób nad występowaniem inhibitora w stosunkowo jednorodnej grupie chorych po leczeniu ich FVIII SDH i porównanie występowania inhibitora w tej grupie (grupie I) z ośrodkami leczenia hemofilii A w Niemczech (grupa II), leczącymi różnymi koncentratami FVIII. U żadnego spośród tych 51 chorych nie występuje inhibitor. Chorzy ci byli badani w odstępach czasu od 4 do 26 miesięcy, w przeważającej części w odstępach co 12 miesięcy. Maksymalna łączna liczba dni leczenia wyniosła 349. Dzień leczenia obejmował taką ilość FVIII, którą stosowano do leczenia jednego wypadku krwawienia.
„Reakcję”, „odzysk in νινσ” oraz okres półtrwania określono na podstawie 1-stopniowego testu oraz podłoża chromogenowego (u 16 chorych); patrz tabela 5. Dane te odpowiadają danym, opublikowanym dawniej przez innych autorów dla koncentratów FVIII pd (pd - plasma derived - wytworzony z osocza).
187 886
Tabela 5
FVIII SDH: Biologiczny okres półtrwania oraz odzysk in vivo u 16 chorych na hemofilię A
| 1 -stopniowy test | Podłoże chromogenowe | |
| Odzysk in vivo (%) | 71±15 | 77±17 |
| Reakcja (%) | 1 ,6±0,4 | 1,7±0,4 |
| Okres półtrwania | 13,0±2,8 | 12,7±3,2 |
Sposób według niniejszego wynalazku bliżej objaśniają następujące przykłady.
PRZYKŁAD I
Wytwarzanie FVIII z osocza ludzkiego, który po podaniu chorym jest nieimmunogenny
Osocze dawców: Dziewięć części żylnej krwi dawców dodaje się do jednej części 3,8% roztworu stabilizatora, którym jest cytrynian sodowy. Krew tę bezpośrednio po jej pobraniu odwirowuje się i zawiesinę krwinek czerwonych w roztworze soli fizjologicznej ponownie wlewa się dawcy (plazmafereza). Osocze zamraża się najpóźniej w ciągu 18 godzin.
Zamrożone osocze rozmraża się w temperaturze od +2°C do +4°C. Osocza od wielu dawców miesza się (zbiera razem). Krioprecypitat uzyskuje się w znany sposób przez odwirowanie.
Z 1 kg krioprecypitatu, uzyskanego z około 100 dm3 osocza, tworzy się zawiesinę w 3 kg mieszaniny wody i etanolu (10 g etanolu na 1 dm3 wody), zawierającej 900 Ie heparyny.
Wartość pH tej zawiesiny doprowadza się podczas mieszanina, dodając 0,1 M kwas octowy, do pH 7,0. Mieszaninę tę ogrzewa się do pokojowej temperatury i miesza przez 30 minut. Do otrzymanego w ten sposób roztworu dodaje się 108 g 2% zawiesiny Al(OH)3 na kg wprowadzonego krioprecypitatu i miesza w pokojowej temperaturze przez 15 minut. Przez dodawanie 0,1 M kwasu octowego doprowadza się wartość pH do pH 6,55 i obniża temperaturę do 15°C. Osad odwirowuje się i odrzuca.
Warstwę znad osadu poddaje się obróbce mieszaniną. fosforanu trój-n-butylowego (TNBP) (0,3% wagowych) i Tween® 80 (1% wagowy). Na 1 kg roztworu FVIII trzeba użyć 10,52 g Tween® 80 i 3,16 cm3 TNBP. Tween® 80 rozpuszcza się w 4 cm3 wody destylowanej. Wartość pH roztworu FVIII doprowadza się do pH 7,1, dodając 1 M NaOH, i roztwór ten ogrzewa się wstępnie do 25°C. Dodaje się mieszaninę TNBP i Tween® 80 w ciągu 15 minut podczas mieszania. Roztwór FVIII z dodaną mieszaniną TNBP/Tween® 80 miesza się przez 13 godzin w temperaturze około 25°C. Następnie ten roztwór FVIII poddaje się chromatografii na żelu anionowymiennym. Przed wprowadzeniem do kolumny roztworu białek doprowadza się ją do równowagi z roztworem buforowym o pH 6,95, zawierającym NaCl (0,12 M), cytrynian Na (0,01 M), glicynę (0,12 M) i CaCl2 (0,001 M). Ekstynkcję eluatu z kolumny mierzy się przy 280 nm. Na żel doprowadzony do równowagi nanosi się sterylizowany roz twór F VIII i przemywa roztworem buforowym, z którym ten żel był w równowadze, aż sygnał w nadfiolecie osiągnie linię podstawową. W celu usunięcia towarzyszących białek kolumnę przemywa się roztworem buforowym o podwyższonej sile jonowej i pH 6,95, zawierającym NaCl (0,16 M), cytrynian Na (0,01 M), glicynę (0,12 M) oraz CaCl2 (0,001 M).
Elucję FVIII prowadzi się następującym buforowym eluentem: 0,25 M NaCl, 0,01 M cytrynian Na, 0,12 M glicyna, 0,001 M CaCb pH 6,95. Eluat z chromatografii zawierający FVIII zatęża się przez ultrafiltrację mniej więcej do połowy użytej objętości eluatu i rozcieńcza roztworem buforowym, zawierającym 0,01 M cytrynian Na, 0,12 M glicynę i 0,001 M CI2 do uzyskania roztworu o aktywności F VIII wynoszącej około 110 IE FVIII na cm3. Ten roztwór FVIII poddaje się sterylnej filtracji i napełnia nim porcjami po 10 citf końcowe pojemniki (szklane butelki o pojemności 20 cm3). Te szklane butelki z roztworem FVI11 zanurza się w -195°C do ciekłego azotu, a następnie w urządzeniu do liofilizacji suszy się produkt FVIII do uzyskania w nim resztkowej wilgotności około 0,5%.
Butelki z liofilizowanym produktem umieszcza się w autoklawie i ogrzewa w 100°C przez 30 minut. Temperaturę mierzy się przyrządem „Datatrace Micropack” firmy Hero Instruments Electronic Yertriebs Gm-bH, Niemcy. Bezpośrednio po wyjęciu z autoklawu butel187 886 ki przenosi się do chłodni (około +4°C) w celu ich ochłodzenia. Aktywność FVIII w ogrzewanych próbkach wynosi 95% aktywności próbek nieogrzewanych.
PRZYKŁAD II kg krioprecypitatu wytwarza się w ten sam sposób, jak w przykładzie 1, i rozpuszcza. Przeróbkę tego krioprecypitatu aż do ultrafiltracji prowadzi się w taki sam sposób, jak to opisano w przykładzie 1. Zatężony roztwór eluatu z kolumny, zawierający FVIII, rozcieńcza się roztworem buforowym, zawierającym 0,01 M cytrynian Na, 0,12 M glicynę i 0,01 M CaCl2, do aktywności FVIII wynoszącej 50 IE FVIII na cm3. Ten roztwór FVIII poddaje się sterylnej filtracji i napełnia nim porcjami po 10 cm3 końcowe pojemniki (szklane butelki o pojemności 20 cm3). Zamrażanie tych butelek, a także liofilizacja i obróbka cieplna odbywają się tak, jak opisano w przykładzie I.
187 886
M·
O>
U «
O.
S *c
Φ w
Q) <0
Φ g
C u
Φ
N
T3
Ή
GL τ- n
Fig. 3 Ośrodki leczenia hemofilii
PM ti (Λ
s.
« ό
m re
T3
CO £
<3 ε
4>
e c
Ε E = φ φ 2 co ffl u.
ε £
u re c
o ε
o.
X £
«0 c
i, ft-ży-';
i
M *C £
S
CO re £
O
u.
X.
(Z)
Σ
W ♦»» w
IA £
O
C o
u £
!2 c
187 886
FVIII SDH: FVIIIC/FVIIIAg
187 886
Schemat wytwarzania FVIII SDH
Egfesstes
Aktywność właściwa — 0,1 lE/mg
Krioprecypitacja
Przechowywanie -70°C
SJ*» ίΛ.Λώ £ξΛΛ·ζ
S8
Aktywność właściwa ~ 1,0 IE/mg
SM.??
Oddzielanie fibrynogenu, fibronektyny, PPSB, IgG
1. Etanol/Heparyi
2. Wodorotlenek na łfe· esjsś glinu &
Surowa frakcja
Dezaktywacja wirusów SD (rozpuszczalnik/detergent TNBP/Tween 80,25°C i®»
9) ¢5 Aktywność ps właściwa 23 -100 IE/mg
Wybiórcza chromatografia kolumnowa na jonicie;
1. Usuwanie TNBP/Tween 80
2. Oddzielanie towarzyszą$<g
MS
SŚ3
Aktywność właściwa ~ 100 IE/mg
Fig.1 \>UU4JGia η f cych białek
4Eluat
I gs i£8»
5.·Λ3Λ» x’j;
β ¢8
Diafiltracja, ultrafiltracja Filtracja sterylna
Końcowe napełnianie Liofilizacja
Dezaktywacja wirusów H (obróbka cieplna) 100°C, 30 min
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.
Wfc-'ίΓ
Claims (7)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania nieimmunogennej kompozycji zawierającej czynnik krzepnięcia VIII (FVIII), znamienny tym, że roztwór zawierający FVIII traktuje się mieszaniną fosforanu trój-n-butylowego oraz detergenta, następnie raptownie zamraża się go w temperaturze poniżej -190°C, po czym zamrożony materiał poddaje się liofilizacji i kolejno, po liofilizacji, materiał zawierający FVIII poddaje się obróbce cieplnej, w temp. 100°C przez 15-120 min, aż do uzyskania resztkowej wilgotności materiału od 0,3 do 1,8% wagowych.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się detergent, który jest polioksyetylenową pochodną estru sorbitanowego.
- 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że przed traktowaniem roztworu zawierającego FVIII mieszaniną fosforanu trój-n-butylowego oraz detergenta z roztworu zawierającego FVIII usuwa się fibrynogen i ewentualnie strąca się etanolem i/lub adsorbuje się na AI(OH)3 dalsze czynniki krzepnięcia z zespołu PPSB.
- 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że po potraktowaniu roztworu zawierającego czynnik VIII mieszaniną fosforanu trój-n-butylowego oraz detergenta usuwa się z roztworu zawierającego FVIII mieszaninę fosforanu trój-n-butyłowego oraz detergenta, stosując chromatografię jonowymienną.
- 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że roztwór zawierający FVIII, będący eluatem z chromatografii jonowymiennej poddaje się diafiltracji i/lub ultrafiltracji.
- 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że po diafiltracji i/lub ultrafiltracji roztwór zawierający FVIII poddaje się filtracji sterylnej.
- 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że obróbkę cieplną prowadzi się w autoklawie.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19623293A DE19623293C2 (de) | 1996-06-11 | 1996-06-11 | Nicht-immunogene Faktor VIII-enthaltende Zusammensetzung und ein Verfahren zu ihrer Herstellung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL320450A1 PL320450A1 (en) | 1997-12-22 |
| PL187886B1 true PL187886B1 (pl) | 2004-10-29 |
Family
ID=7796648
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL32045097A PL187886B1 (pl) | 1996-06-11 | 1997-06-09 | Sposób wytwarzania nieimmunogennej kompozycji zawierającej czynnik krzepnięcia VIII |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0812858B1 (pl) |
| AT (1) | ATE340806T1 (pl) |
| CZ (1) | CZ177497A3 (pl) |
| DE (2) | DE19623293C2 (pl) |
| ES (1) | ES2268718T3 (pl) |
| HU (1) | HUP9700987A3 (pl) |
| PL (1) | PL187886B1 (pl) |
| PT (1) | PT812858E (pl) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2787465A1 (fr) | 1998-12-21 | 2000-06-23 | Transgene Sa | Procede d'inactivation des virus enveloppes dans une preparation virale de virus non enveloppes |
| ES2167180B1 (es) * | 1999-10-27 | 2003-08-16 | Lucea Jose Antonio Aznar | Preparacion de concentrados terapeuticos de factor viii antigenico y aplicacion correspondiente. |
| WO2023020914A1 (en) | 2021-08-18 | 2023-02-23 | Biotest Ag | Dry heat treatment of plasma-derived factor viii |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4456590B2 (en) * | 1981-11-02 | 1989-05-30 | Heat treatment of lyphilized blood clotting factor viii concentrate | |
| DE3577801D1 (de) * | 1985-08-05 | 1990-06-28 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von praeparationen auf basis von blutgerinnungsfaktoren. |
| CA2007545A1 (en) * | 1989-01-13 | 1990-07-13 | Yahiro Uemura | Production method for protein-containing composition |
| AT399818B (de) * | 1992-04-24 | 1995-07-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer hochgereinigten virussicheren faktor viii-präparation |
| EP0683678B1 (de) * | 1993-02-09 | 1998-07-15 | Octapharma Ag | Verfahren zur inaktivierung von viren, die nicht mit lipidhüllen versehen sind |
-
1996
- 1996-06-11 DE DE19623293A patent/DE19623293C2/de not_active Revoked
-
1997
- 1997-06-03 HU HU9700987A patent/HUP9700987A3/hu unknown
- 1997-06-09 DE DE59712735T patent/DE59712735D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-09 AT AT97109314T patent/ATE340806T1/de active
- 1997-06-09 PT PT97109314T patent/PT812858E/pt unknown
- 1997-06-09 EP EP97109314A patent/EP0812858B1/de not_active Revoked
- 1997-06-09 ES ES97109314T patent/ES2268718T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-09 PL PL32045097A patent/PL187886B1/pl unknown
- 1997-06-09 CZ CZ971774A patent/CZ177497A3/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP9700987A3 (en) | 1998-06-29 |
| HU9700987D0 (en) | 1997-07-28 |
| PL320450A1 (en) | 1997-12-22 |
| ES2268718T3 (es) | 2007-03-16 |
| DE59712735D1 (de) | 2006-11-09 |
| CZ177497A3 (en) | 1997-12-17 |
| PT812858E (pt) | 2006-12-29 |
| DE19623293C2 (de) | 1998-10-22 |
| EP0812858B1 (de) | 2006-09-27 |
| HUP9700987A2 (hu) | 1998-03-02 |
| ATE340806T1 (de) | 2006-10-15 |
| EP0812858A1 (de) | 1997-12-17 |
| DE19623293A1 (de) | 1997-12-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU645172B2 (en) | Process for an industrial-scale preparation of a standardized human von Willebrand factor concentrate of very high purity and suitable for therapeutic use | |
| JP5662988B2 (ja) | 可溶化血漿フラクションから蛋白質フィブリノーゲン、第ｘｉｉｉ因子および生物学的グルーを分離し、そして該蛋白質の凍結乾燥濃縮物を調製するための方法 | |
| EP1027371B1 (en) | Process for the production of highly viral safe thrombin for forming fibrin glue from a pool of human plasma | |
| ES2586698T3 (es) | Proceso para la producción de fibrinógeno | |
| US5639730A (en) | Method of producing a virus-safe biological preparation | |
| US4490361A (en) | Virus inactivating heat treatment of plasma fractions | |
| JPS6236493B2 (pl) | ||
| SK278640B6 (en) | Method of the factor viii isolation | |
| NO324659B1 (no) | Utvinning av von Willebrand-faktor ved kationebytterkromatografi samt preparat inneholdende slik faktor og anvendelse derav. | |
| PL210616B1 (pl) | Sposób rozdzielania i oczyszczania fibrynogenu i plazminogenu | |
| USH1509H (en) | Heparin enhanced process for separating antihemophilic factor (Factor VIII) and fibronectin from cryoprecipitate | |
| CZ303932B6 (cs) | Stabilní hemostaticky aktivní prípravek obsahující von Willebranduv faktor a zpusob jeho prípravy | |
| JPH06505494A (ja) | Ｉｘ因子の調製 | |
| WO1997017370A1 (en) | Anion exchange process for the purification of factor viii | |
| CA1182748A (en) | Method for synthesizing procoagulant factor viii activity | |
| PL187886B1 (pl) | Sposób wytwarzania nieimmunogennej kompozycji zawierającej czynnik krzepnięcia VIII | |
| Palmer et al. | Development of a heat-treated factor VIII/von Willebrand factor concentrate prepared from heparinized plasma | |
| CN114787185A (zh) | 一种凝血因子ⅷ中间品的冻存方法 | |
| Ng et al. | Preparation of high purity factor VIII concentrates | |
| RU2814332C1 (ru) | Способ криоконсервации промежуточного продукта фактора viii свертывания крови | |
| Smith et al. | Advances in Plasma Fractionation and in the Production of Factor VIII Concentrates | |
| Branović et al. | Characterization of F VIII concentrates produced by two methods incorporating double virus inactivation | |
| JP2004123566A (ja) | ヒト血漿由来血液凝固第ｘｉｉｉ因子製剤およびその製造方法 | |
| WO2023020914A1 (en) | Dry heat treatment of plasma-derived factor viii | |
| Fuhge et al. | Modern methods for the manufacture of coagulation factor concentrates |