CZ303932B6

CZ303932B6 - Stabilní hemostaticky aktivní prípravek obsahující von Willebranduv faktor a zpusob jeho prípravy

Info

Publication number: CZ303932B6
Application number: CZ20023454A
Authority: CZ
Inventors: Josic@Djuro; Stadler@Monika; Gruber@Gerhard
Original assignee: Octapharma Ag
Priority date: 2000-04-18
Filing date: 2001-04-04
Publication date: 2013-07-03
Also published as: KR100685448B1; EP1274721A1; NO20025007D0; JP4976634B2; CA2406626C; ES2247117T3; KR20030019352A; DK1274721T3; CN100448888C; PL358388A1; HU225992B1; DE50107689D1; MXPA02010017A; HUP0301211A3; SI1274721T1; AU2001263835B2; EA200201104A1; US7985846B2; CZ20023454A3; US7166709B2

Abstract

Zpusob prípravy hemostaticky aktivního prípravku, který je stabilní ve vodném roztoku pri teplote místnosti po dobu alespon jednoho týdne a obsahuje von Willebranduv faktor, vWF, z výchozí frakce lidské plazmy, zahrnující i) chromatografické precistení plazmatické frakce obsahující vWF na aniontomenicovém materiálu, typu tentacle, který obsahuje vysunuté aniontomenicové skupiny na roubovaných polymerních strukturách a shromázdení frakce obsahující vWF; ii) precistení uvedené frakce za pouzití gelové permeacní chromatografie pro prípravu precisteného tepelne stabilního prípravku obsahujícího vWF; a iii) zahrívání prípravku v lyofilizovaném stavu na teplotu více nez 80 .degree.C po dobu 1 az 5 hodin pro inaktivaci viru. Prípravek pripravitelný tímto zpusobem.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu přípravy hemostaticky aktivního přípravku, kterýje stabilní ve vodném roztoku při teplotě místnosti po dobu alespoň jednoho týdne a obsahuje von Willebrandův faktor, vWF, z výchozí frakce lidské plazmy a přípravku obsahujícího hemostaticky aktivní vWF, který lze získat tímto způsobem.

Dosavadní stav techniky

Von Willebrandova nemoc je porucha krevní srážlivosti, která se - na rozdíl od hemofilie A nebo B, manifestuje sama jako krvácení do měkkých tkání, zejména do sliznic. Deficit v takzvaném von Willebrandově faktoru (vWF) byl určen jako příčina tohoto onemocnění. Dosud byl tento faktor podáván pacientům v přípravcích obsahujících faktor VIII, které také obsahují vWF, ale často v neuspokojivé kvalitě a v nežádoucím množství. Ačkoliv byla příprava vWF technikami genetického inženýrství úspěšná, existuje stále potřeba vylepšených přečišťovacích metod pro přípravu vWF z krve nebo plazmy dárců.

V EP-A-O 934 748 je popsán vysoce přečištěný vWF mající obsah alespoň 15 % vWF multimerů, které se skládají z 13 nebo více multimerů (HMW-VWF multimerů). Tento se získá vícestupňovým chromatografickým přečištěním, při kterém může být gelová filtrace v modu skupinové separace provedena místo kryoprecipitace. Pro inaktivaci virů je uváděno například zpracování rozpouštědly a detergenty a ošetření teplem v lyofilizovaném stavu po dobu 72 h při 80 °C. Josic et al., „Purification of factor VIII and vWF factor from human plasma by anion-exchange chromatography“, Journal of Chromatography B, 662 (1994), 131-190, a Schwinn et al., „A Solvent/detergent Treated, Pasteurized and Highly Purified Factor VIII Concentrate“, ArzneimittelForschung 1 Drug Research 44 (1), 2, 188-191 (1994), se týkají přečištění komplexu faktor VIII/vWF, kde toto přečištění se provede přes iontoměničový materiál, a provedou se dva nezávislé kroky pro inaktivaci virů. Provede se reakce s rozpouštědlem/detergentním činidlem a pasteurizace (10 h při 63 °C) za přítomnosti stabilizačních činidel. Ačkoliv je faktor VIII sotva denaturován pasteurizací (95 % zbytkové aktivity), mění se aktivita vWF a dochází ke změně distribuce multimerů (85 % zbytkový antigen) a ke ztrátě multimerů s vysokou molekulovou hmotností, což vede k zisku vWF antigenu s poměrem aktivity 2,2 (aktivita k antigenu = 0,5).

US-A-5 714 590 popisuje přečištění komplexu faktoru Vlil iontoměničovou chromatografií. Tak je použit EMD-TMAE-Fractogel materiál pro kolonu, který se také použije pro promývání gelu. Pro inaktivaci virů je navrženo zpracování rozpouštědlem, detergentním činidlem. Není uváděno tepelné zpracování. Získaný produkt také obsahuje vWF, aleje uvedena pouze antigenicita vWF.

Podstata vynálezu

Úkolem předkládaného vynálezu je poskytnutí nového způsobu pro přečištění vWF z lidské plazmy. Takový způsob by měl vést k získání vWF vyšší kvality a účinnosti.

Předmětem vynálezu v hlavním provedení i) způsob přípravy hemostaticky aktivního přípravku, který je stabilní ve vodném roztoku při teplotě místnosti po dobu alespoň jednoho týdne a obsahuje von Willebrandův faktor, vWF, z výchozí frakce lidské plazmy, zahrnující

- 1 CZ 303932 Β6

I. chromatografické přečištění plazmatické frakce obsahující vWF na aniontoměničovém materiálu, typu tentacle, který obsahuje vysunuté aniontoměničové skupiny na roubovaných polymerních strukturách a shromáždění frakce obsahující vWF;

jehož podstata spočívá v tom, že poté následuje

II. přečištění uvedené frakce za použití gelové permeační chromatografie pro přípravu přečištěného tepelně stabilního přípravku obsahujícího vWF; a

III. zahřívání přípravku v lyofilizovaném stavu na teplotu více než 80 °C po dobu 1 až 5 hodin pro inaktivaci virů.

Přednostní provedení tohoto aspektu vynálezu zahrnují zejména i i) způsob podle provedení i), při němž tepelně stabilní přípravek a zahříváním zpracovaný přípravek obsahuje pouze jeden pík při HPLC gelové filtrační analýze;

iii) způsob podle provedení i) nebo ii), při němž je přípravek zahříván při teplotě více než 90 °C;

iv) způsob podle provedení iii), při němž je přípravek zahříván při teplotě 100 °C;

v) způsob podle provedení iii) nebo iv), při němž je přípravek zahříván po dobu 2 až 3 hodin;

vi) způsob podle kteréhokoli z provedení i) až v), při němž je výchozí frakce přídavně přečištěna alespoň jednou adsorpční a/nebo afinitní chromatografií;

vii) způsob podle kteréhokoliv z provedení i) až vi), při němž se přečištění gelovou permeační chromatografií provádí jako závěrečné opatření purifikace proteinu;

viii) způsob podle kteréhokoliv z provedení i) až vii), při němž je uvedená počáteční frakce přečištěna ze spojené lidské plazmy.

Předmětem vynálezu je dále také (provedení vynálezu ix)) hemostaticky aktivní přípravek, který je stabilní ve vodném roztoku při teplotě místnosti po dobu alespoň jednoho týdne a obsahuje von Willebrandův faktor, vWF, připravitelný způsobem podle některého z provedení i) až viii). Přednostní provedení tohoto aspektu vynálezu zahrnují zejména

x) přípravek podle provedení ix), který neobsahuje žádné krví přenosné viry, jako je HIV, HBV, HCV, HAV a parvoviry;

xi) přípravek podle provedení ix) nebo x), který obsahuje vWF o vysoké molekulové hmotnosti vykazující minimálně 13 až 16 multimerových proužků po elektroforetické analýze;

xii) přípravek podle kteréhokoliv z provedení ix) až xi), v němž je poměr vWF aktivity měřený jako poměr ristocitinového kofaktoru k vWF antigenu alespoň 0,8;

xiii) přípravek podle kteréhokoliv z provedení ix) až xii), který dále obsahuje faktor Vlil v přirozené formě;

xiv) přípravek podle kteréhokoliv z provedení ix) až xiii), který obsahuje imunoglobuliny, fibrinogen, fíbronektin a inter-a-trypsinový inhibitory koncentraci pod limitem imunochemické detekce; a . 9 .

xv) přípravek podle kteréhokoliv z provedení ix) až xiv), který obsahuje vWF v přirozené formě a bez fragmentů.

Aniontoměničové materiály, typu tentacle, které obsahují vysunuté aniontoměničové skupiny na roubovaných polymemích strukturách, které mohou být použity ve způsobu podle předkládaného vynálezu jsou popsány, například, v EP-A-0 337 144. Tato publikace je zde uvedena jako odkaz. Uvedenými materiály jsou výhodně polyakrylamidové polymety s vysunutými skupinami roubované na dioly Fractogelu, který je dodáván Merck, Darmstadt, Germany.

Způsob podle vynálezu překvapivě vede k produktům majícím vysoký obsah vWF ve srovnání s F VIII. V důsledku promytí gelu dojde k eliminaci inter- α-trypsínového inhibitoru, stejně jako jiných faktorů, které mohou přispívat ke snížení kvality produktu při použití známých způsobů. Sekvence chromatografických stupňů podle předkládaného vynálezu poskytuje vWF přípravek, který je překvapivě stabilní. Překvapivě, frakce vWF získatelná za použití způsobu podle předkládaného vynálezu, je v podstatě stabilní ve vodném roztoku při teplotě místnosti po dlouhou dobu (měření bylo provedeno po dobu delší než je jeden týden). Kromě toho, přípravek podle předkládaného vynálezu obsahuje vWF v přirozené formě a bez fragmentů.

Výhodně vykazuje termálně stabilní přípravek a teplem zpracovaný přípravek pouze jeden pík při HPLC gelové filtrační analýze.

Podle vynálezu se za tepla stabilní přípravek může v lyofilizovaném stavu zahřívat při teplotě více než 80 °C. V dalším provedení způsobu podle předkládaného vynálezu je přípravek zahříván při teplotě více než 90 °C, konkrétně 100 °C. Zahřívání je výhodně prováděno po dobu alespoň 1 h až 5 h, lépe 2 až 3 h. Tak jsou všechny viry relevantní pro transfusi, zejména viry bez lipidového potahu, jako jsou parvoviry nebo viry hepatidy A, inaktivovány. Produkt získaný způsobem podle předkládaného vynálezu odolává tomuto tepelnému zpracování bez významné ztráty aktivity.

Podle předkládaného vynálezu může být přečištění frakce obsahující vWF dále provedeno alespoň jednou adsorpční- a/nebo afinitní-chromatografickou technikou.

V předkládaném vynálezu může být také použita frakce obsahující vWF, která je získána z lidské plazmy a která je přečištěna způsobem podle předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález se také týká hemostaticky aktivního přípravku obsahujícího vWF získaného způsobem podle předkládaného vynálezu.

Přípravek podle předkládaného vynálezu neobsahuje infekční krví přenosné viry, zejména HIV, HBV, HCV, HAV a parvoviry.

Konkrétně, přípravek podle předkládaného vynálezu obsahuje vWF ve formě s vyšší molekulovou hmotností, který vykazuje minimálně 13 až 16 multimerových proužků po elektroforetické analýze. Počet multimerů a jejich charakter distribuce určuje podobnost vWF přípravku s přirozeným vWF v plazmě. Dále, poměr ristocitinového kofaktoru jako markéru pro aktivitu vWF k vWF antigenu v přípravku podle předkládaného vynálezu je alespoň 0,8. Toto je dalším měřením integrity vWF molekuly.

Přípravek podle předkládaného vynálezu výhodně dále obsahuje faktor VIII v přirozené formě. Použití komplexů F VIII a vWF pro léčbu von Willebrandovy nemoci je zejména užitečné pro klinickou praxi.

Dále, následující proteiny byly odstraněny z přípravku podle předkládaného vynálezu na hodnoty nižší, než jsou detekční limity pro imunochemickou detekci: imunoglobuiiny, fibrinogen, fibro-3 CZ 303932 B6 nektin a inter-a-trypsinový inhibitor. Toto je pravděpodobně příčinnou mimořádné stability produktu podle předkládaného vynálezu.

Popis obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje stabilitu produktu získaného způsobem podle předkládaného vynálezu ve srovnání s produkty přečištěnými pouze aniontoměničovou chromatografií.

Vynález bude dále dokreslen následujícími příklady.

Příklady provedení vynálezu

Přibližně 47 kg kryosraženiny se zpracuje 15% (hmotn./hmotn.) 2% (hmotn./hmotn.) roztoku hydroxidu hlinitého. Po odstředění se vzorek inaktivuje z hlediska virů pomocí 0,3% TnBP/1% Triton X 100. Po olejové extrakci se provede aniontoměničová chromatografie na Fractogel EMD TMAE s vysunutými skupinami od Merck, Darmstadt, Germany).

Pufr pro reakci má následující složení:

Pufr AM, první promytí:

120mM NaCl, lOmM Na-citrát, osmolalita: 360-400 mosmoi/kg, 120mM glycin, lmM CaCl₂, pH 6,9-7,1;

Pufr BM, druhé promytí:

235mM NaCl, lOmM Na-citrát, osmolalita: 570-610 mosmol/kg, 120mM glycin, lmM CaCl₂, pH 6,9-7,l;

Pufr CM, eluce:

700mM NaCl, lOmM Na-citrát, 120mM glycin, lmM CaCl₂, pH 6,9-7,1; osmolalita: 1380— 1430 mosmol/kg.

Pufr DM, třetí promytí:

1,5M NaCl.

Frakce vykazující vWF/FVIIl aktivitu se zpracují chromatografií s vylučováním podle velikosti na Fractogel EMD Bio SEC (gel od Merck, Darmstadt, Germany). Po ultra/diafiltraci se připraví prostředek následujícího složení: 400mM NaCl, lOmM Na-citrát, lMm CaCl₂, 133mM glycin, 1 % sacharóza.

Potom se provede sterilní filtrace. Přípravek se naplní do fiol a lyofilizuje se a potom se provede tepelné zpracování při teplotě 100 °C. Toto tepelné zpracování trvá 120 minut.

Obr. 1 ukazuje stabilitu produktu získaného způsobem podle předkládaného vynálezu ve srovnání s produkty získanými pouze aniontoměničovou chromatografií. Po aniontoměničové chromatografií se produkt získaný způsobem podle předkládaného vynálezu zpracuje chromatografií s vylučováním podle velikosti. Bylo zjištěno, že produkt podle předkládaného vynálezu má stále ještě 80% aktivitu po skladování s nebo bez heparinu ve vodném roztoku při teplotě místnosti, zatímco

-4CZ 303932 B6 produkty nezpracované chromatografíí s vylučováním podle velikosti mají po 7 dnech pouze 20% aktivitu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy hemostaticky aktivního přípravku, který je stabilní ve vodném roztoku při teplotě místnosti po dobu alespoň jednoho týdne a obsahuje von Willebrandův faktor, vWF, z výchozí frakce lidské plazmy, zahrnující

1. chromatografické přečištění plazmatické frakce obsahující vWF na aniontoměničovém materiálu, typu tentacle, který obsahuje vysunuté aniontoměničové skupiny na roubovaných polymemích strukturách a shromáždění frakce obsahující vWF;

vyznačující se tím, že poté následuje

II. přečištění uvedené frakce za použití gelové permeační ehromatografie pro přípravu přečištěného tepelně stabilního přípravku obsahujícího vWF; a

III. zahřívání přípravku v lyofilizovaném stavu na teplotu více než 80 °C po dobu 1 až 5 hodin pro inaktivaci virů.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že tepelně stabilní přípravek a zahříváním zpracovaný přípravek obsahuje pouze jeden pík při HPLC gelové filtrační analýze.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že přípravek je zahříván při teplotě více než 90 °C.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, 100 °C.
5. Způsob podle nároku 3 nebo 4, vyznačující se dobu 2 až 3 hodin.

že přípravek je zahříván při teplotě tím, že přípravek je zahříván po
6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že výchozí frakce je přídavně přečištěna alespoň jednou adsorpční a/nebo afinitní chromatografíí.
7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že přečištění gelovou permeační chromatografíí se provádí jako závěrečné opatření purifikace proteinu.
8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že uvedená počáteční frakce je přečištěna ze spojené lidské plazmy.
9. Hemostaticky aktivní přípravek, který je stabilní ve vodném roztoku při teplotě místnosti po dobu alespoň jednoho týdne a obsahuje von Willebrandův faktor, vWF, připravitelný způsobem podle některého z nároků 1 až 8.
10. Přípravek podle nároku 9, vyznačující se tím, že neobsahuje žádné krví přenosné viry, jako je HIV, HBV, HCV, HA V a parvoviry.

-5CZ 303932 B6
11. Přípravek podle nároku 9 nebo 10, vyznačující se tím, že obsahuje vWF o vysoké molekulové hmotnosti vykazující minimálně 13 až 16 multimerových proužků po elektroforetické analýze.

5
12. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 9 až 11, vyznačující se tím, že poměr vWF aktivity měřený jako poměr ristocitinového kofaktoru k vWF antigenu je alespoň 0,8.
13. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 9 až 12, vyznačující se tím, že dále obsahuje faktor VIII v přirozené formě.
14. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 9 až 13, vyznačující se tím, že obsahuje imunoglobuliny, fibrinogen, fibronektin a inter-cc-trypsinový inhibitor v koncentraci pod limitem imunochemické detekce.
15 15. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 9 až 14, vyznačující se tím, že obsahuje vWF v přirozené formě a bez fragmentů.