JP2681406B2 - 蛋白質含有組成物の製造方法 - Google Patents

蛋白質含有組成物の製造方法

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    • C12N2760/20263—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ウイルス夾雑の可能性のある蛋白質含有組
成物から実質的にウイルスが不活化された蛋白質含有組
成物を製造する方法に関する。
〔従来技術〕
人血液由来の蛋白質含有組成物には、ウイルス、たと
えば肝炎ウイルスやAIDSウイルスなどが混入してくる可
能性がある。
これらのウイルス伝播を防ぐために蛋白質含有液状組
成物を加熱する方法が知られている（特開昭55−145615
号公報、特開昭56−139422号公報、特開昭56−106594号
公報）。
また、蛋白質含有乾燥組成物を加熱する方法も知られ
ている（特表昭58−500548号公報、特開昭58−213721号
公報）。
さらに、蛋白質含有組成物をトリアルキルホスフェー
トと接触せしめてウイルスを除去する方法も知られてい
る（特開昭60−51116号公報）。
しかし、加熱処理では熱に強いウイルスが残存する可
能性があり、トリアルキルホスフェート処理では非エン
ベロープウイルスが残存する可能性がある。
また、トリアルキルホスフェート処理中に蛋白質の活
性が低下する問題があった。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明は蛋白質の活性を殆ど失うことなく効率よく夾
雑ウイルスを不活化し、医薬品としてより安全な蛋白質
含有組成物を製造する方法を提供しようとするものであ
る。
〔課題を解決するための手段〕
本発明はこれら課題を解決するために以下の方法を提
供する。
（１） ウイルス夾雑の可能性のある蛋白質含有組成物
からウイルスの不活化された蛋白質含有組成物を製造す
る方法であって、次の工程を含むことを特徴とする方
法。
（ａ）液状の蛋白質含有組成物をトリアルキルホスフェ
ートと接触させ、該蛋白質含有組成物からトリアルキル
ホスフェートを除去する、その後、 （ｂ）該蛋白質含有組成物を凍結乾燥し、乾燥状の該蛋
白質含有組成物を加熱処理する。
（２） ウイルス夾雑の可能性のある液状の蛋白質含有
組成物をプロテアーゼ阻害剤の存在下でトリアルキルホ
スフェートと接触させることを特徴とする前記（１）の
ウイルスの不活化された蛋白質含有組成物を製造する方
法。
これら発明により、蛋白質の活性を失うことなく効率
的にウイルスの不活化された蛋白質含有組成物が製造さ
れる。
本発明の方法が適用される蛋白質は特に限定されるも
のではなく、血漿由来蛋白質、他の組織由来蛋白質、遺
伝子組み換えや組織培養によって得られた蛋白質などが
挙げられる。蛋白質としては、たとえばプラスミノーゲ
ン、血漿凝固第Ｖ因子、血液凝固第VII因子、血液凝固
第VIII因子、血液凝固第IX因子、第Ｘ因子、血液凝固第
XIII因子、アンチトロンビンIII、ハプトグロビン、ト
ロンビン、プロトロンビン、免疫グロブリン、フィブリ
ノゲン、フィブロネクチン、アルブミン、ヘモグロビ
ン、インターフェロン、プラスミノーゲン活性化因子な
どが挙げられる。蛋白質含有液状組成物は、上記の如き
蛋白質を含有するものであれば、得に制限されない。
本発明の方法が適用される蛋白質含有液状組成物には
特に制限はなく、たとえば血漿または組織抽出液、血漿
または組織抽出液を各種分画法により処理して得た画分
からなる溶液、遺伝子組換え宿主または組織の培養によ
り得られる培養液、市販の蛋白質製剤（液状のもの）ま
たは溶液としたものなどが挙げられる。
また、本発明のトリアルキルホスフェートとの接触時
の蛋白質含有液状組成物の精製度は特に限定されるもの
ではなく、任意の精製度のものに適用可能であり、従っ
てトリアルキルホスフェートとの接触は蛋白質の分離、
精製のいずれの段階に適用してもよい。
本発明の製造方法においては、トリアルキルホスフェ
ート処理を先に行い、トリアルキルホスフェートを除去
した後、乾燥加熱処理を行う。
本発明で使用されるトリアルキルホスフェートは特に
限定されないが、好適にはトリ−（ｎ−ブチル）ホスフ
ェート、トリ−（tert−ブチル）ホスフェート、トリ−
（ｎ−ヘキシル）ホスフェート、トリ−（２−エチルヘ
キシル）ホスフェート、トリ−（ｎ−デシル）ホスフェ
ートなどが挙げられる。特に好ましいトリアルキルホス
フェートはトリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（以下TN
BPと言う）である。なお、２種以上の異なるトリアルキ
ルホスフェートの混合物も使用することができる。
本発明に使用されるトリアルキルホスフェートは、0.
01〜10（w/v）％の範囲の量、好ましくは約0.1〜３（w/
v）％の範囲の量において使用される。
トリアルキルホスフェートは界面活性剤を伴ってまた
は伴わないで使用することができる。好ましくは、トリ
アルキルホスフェートを界面活性剤と組み合わせて使用
する。この界面活性剤は、トリアルキルホスフェートが
蛋白質含有液状組成物と接触する前、同時、または後の
任意の段階に添加することができる。蛋白活性剤の機能
は、蛋白質含有組成物中のウイルスとトリアルキルホス
フェートとの接触を強化することである。
界面活性剤としては、脂肪酸のポリオキシエチレン誘
導体、ソルビトール無水物の部分エステル、たとえばポ
リソルベート80（商品名：トゥイーン80など）、ポリソ
ルベート20（商品名：トゥイーン20など）および非イオ
ン性油浴水洗剤、たとえばオキシエチル化アルキルフェ
ノール（商品名：トリトンX100など）が挙げられる。さ
らに、デオキシコール酸ナトリウム、およびスルホベタ
インとして周知の合成ツブイッテルイオン洗剤であるZw
ittergents、たとえばＮ−ドデシル−N,N−ジメチル−
２−アンモニオ−１−エタンスルホネート、およびその
同族体、または非イオン性洗浄、たとえばオクチル−
β,D−グルコピラノシドなどが挙げられる。
界面活性剤を使用する場合、その量は臨界的ではな
く、たとえば約0.001％〜約10％、好ましくは約0.01％
〜３％の範囲で使用することができる。
トリアルキルホスフェート処理は、エンベロープコー
トウイルス、たとえばＢ型肝炎ウイルス、nonAnonB型肝
炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ベシキュ
ラーストマティティスウイルス（Vesicular Stomatitis
Virus）、シンドビスウイルス（Sindbis Virus）等の
不活化に特に有用である。また、さらに乾燥状態で充分
な時間加熱処理することにより、熱に強いウイルスも不
活化し得る。
本発明のトリアルキルホスフェートによる蛋白質含有
組成物の処理は、−５℃〜70℃、好ましくは０℃〜60℃
の温度で、好適には30分以上、より好適には１〜30時
間、さらに好適には３〜10時間行う。
トリアルキルホスフェート処理は、蛋白質の活性低下
を防ぐために、プロテアーゼ阻害剤の存在下で行うのが
好ましい。
プロテアーゼ阻害剤としては、実質的にプロテアーゼ
の活性を阻害する物質であれば特に限定されない。たと
えば、ε−アミノカプロン酸（EACA）、リジン、アルギ
ニンなどの塩基性アミノ酸、アプロチニンなどの蛋白質
などが例示される。
普通、トリアルキルホスフェート処理後、トリアルキ
ルホスフェートは除去される。界面活性剤や安定化剤を
用いたときはそれらも除去される。除去はいずれの方法
によってもよいが、たとえばアフィニティークロマトグ
ラフィーで蛋白を吸着する方法、蛋白を沈澱により回収
する方法などが挙げられる。また、公知の加熱処理を行
うこともできる。
乾燥組成物（乾燥状の蛋白質含有組成物）の加熱処理
はトリアルキルホスフェート処理後に行う。トリアルキ
ルホスフェート処理後に行う場合、乾燥組成物はトリア
ルキルホスフェートなどを除去しぃた後、蛋白質を回
収、公知の方法で凍結乾燥して得られる。
乾燥組成物の加熱処理は、通常30℃〜100℃、好まし
くは55℃〜75℃において、通常３〜200時間、好ましく
は10〜100時間実施される。また、蛋白質を熱から保護
するため、安定化剤の存在下で行ってもよい。安定化剤
としては、たとえば、糖、糖アルコール、アミノ酸など
が挙げられる。
尚、乾燥組成物は実質的に水分を含まないものであ
り、通常、その水分含量が３％以下、好適には１％以下
が望ましい。
〔発明の作用および効果〕
本発明の製造方法によれば、蛋白質の活性を損失する
ことなく、効率的にウイルスが不活化された蛋白質含有
組成物が製造される。
なお、トリアルキルホスフェート処理はエンベロープ
を持たないウイルスには不活化効果が弱い。ところが、
本発明によれば乾燥状の蛋白質含有組成物を加熱処理に
付す工程があるので、かかるウイルスも当該工程を経る
ことによって有意に不活化することができる。
また、25℃〜30℃でのトリアルキルホスフェート処理
ではその温度で長く置くことにより溶液中に混在するプ
ロテアーゼによる蛋白質の分解が促進される可能性があ
るが、プロテアーゼ阻害剤の存在下で処理することによ
り蛋白質の活性低下を抑制することができる。
よって、本発明の製造方法は医薬品としてより安全な
蛋白質含有組成物の工業的製法としてきわめて好ましい
方法を提供するものであり、ウイルスの不活化された蛋
白質製剤を製造するのに特に有用である。
〔実施例〕
実施例１ 血液凝固第VIII因子含有組成物の製造方法 クリオプレシピテートを20mMトリス塩酸緩衝液で溶解
し、水酸化アルミニウムゲルを１％v/v添加し、脱プロ
トロンビン溶液を得る。この溶液にTNBP（トリ−（ｎ−
ブチル）ホスフェート〕を0.3％w/v、Tween80を１％w/v
になるように添加し、30℃で６時間ウイルス不活化処理
をする。そして、グリシンを2Mになるように添加し、遠
心してフィブリノゲンを沈澱して除去し、得られた上清
に、塩化ナトリウムを1.5Mになるように添加し、第VIII
因子を沈澱として回収する。回収した第VIII因子を20mM
トリス塩酸緩衝液に溶解し、再度グリシン分画、塩化ナ
トリウム分画を行い、残存しているTNBP、Tween80を除
去する。こうして得られた第VIII因子の沈澱は、所定の
濃度になるように溶解しバイアルに小分され、凍結乾燥
される。凍結乾燥された第VIII因子製剤は60℃、72時間
以上の乾燥加熱処理を行い、ウイルスに対し安全な製剤
を製造する。
実施例２ 血液凝固第IX因子含有組成物の製造方法 プラズマにDEAE−セファデックスを投入し、第IX因子
をゲルに吸着させる。そして、0.15M塩化ナトリウムを
含む緩衝液でよく洗浄した後、0.5M塩化ナトリウムを含
む緩衝液で第IX因子を溶出させる。この溶出液にTNBPを
0.3％w/v、Tween 80を１％になるように添加し、30℃、
６時間以上のウイルス不活化処理をする。ウイルス不活
化処理をされた第IX因子溶液は再度DEAE−セファデック
スを投入し、第IX因子を吸着させ、洗浄することにより
TNBP、Tween 80を洗液に除去することができる。またDE
AE−セファデックスの代わりに、第IX因子に対するモノ
クローナル抗体を結合させたゲルに第IX因子を結合さ
せ、同様に処理することができる。そして、ゲルより第
IX因子を溶出させた後、所定のイオン強度、力価に調製
され、小分され、凍結乾燥されて、第IX因子製剤を得
る。そして、さらに膜のないウイルスを不活化するため
に60℃、72時間以上の乾燥加熱が行われ、より安全な製
剤を製造する。
実施例３ トロンビン含有組成物の製造方法 コーンのFr.II＋IIIペーストまたはFr.IIIペーストを
0.15M塩化ナトリウム溶液で溶解した後、トロンボプラ
スチン（胎盤抽出液）を添加して、プロトロンビンをト
ロンビンに変換する。そしてSP−セファデックスでトロ
ンビンを吸着し、0.15M塩化ナトリウム溶液でよく洗浄
した後、0.5M塩化ナトリウムを含む緩衝液でトロンビン
を溶出する。この溶出液にTNBPを0.3％w/v、Tween 80を
１％w/v添加し、30℃、６時間以上のウイルス不活化処
理を行う。ウイルス不活化処理後トロンビンを再度SP−
セファデックスまたはヘパリン−ゲルに吸着しせ、よく
洗浄して、TNBP、Tween 80を除去した後、ゲルよりトロ
ンビンを溶出する。こうして得られたトロンビンは、イ
オン強度、力価を調整し、小分けされ、凍結乾燥した
後、60℃、72時間以上の乾燥加熱処理を行う。
実施例４ フィブリノゲン含有組成物の製造方法 コーンのFr.Iペーストまたはクリオプレシピテートを
生理食塩液で溶解し、TNBPを0.3％w/v、Tween 80を１％
w/vになるように添加し、30℃、６時間以上のウイルス
不活化処理を行う。そして、グリシン−塩化ナトリウム
分画またはエタノール分画にて、フィブリノゲンを沈澱
させる。得られたフィブリノゲンの沈澱は、生理食塩液
に溶解した後、再度グリシン−塩化ナトリウム分画また
はエタノール分画を行い、フィブリノゲンを沈澱して回
収する。この分画操作は２〜５回行われ、TNBP、Tween
80は上清に除去される。こうして得られたフィブリノゲ
ンの沈澱を所定の濃度に溶解し、小分、凍結乾燥した
後、60℃、72時間以上の乾燥加熱処理が行われる。
実施例５ 血液凝固第VIII因子含有組成物の製造方法 正常ヒト・血漿を凍結融解して得られたクリオプレシ
ピテートを出発材料に、これを20mMトリス−10mMクエン
酸緩衝液（pH7.0）で５倍抽出溶解し、水酸化アルミニ
ウムゲルをクリオプレシピテート投入重量の1/10容量を
添加して30分間撹拌した。その後ベントナイトを6g/
の割合で添加して１時間撹拌後4000rpm30分間遠心分離
し、上清を得、続いてウイルス不活化のための界面活性
剤処理（0.3％トリ−ｎ−ブチルホスフェイト、１％Twe
en 80の濃度になるように添加後、30℃、６時間撹拌）
を行い、これをグリシン分画に供した。グリシン分画の
条件は、この溶液にグリシンを150g/の割合で添加し
て30℃、１時間撹拌後遠心分離（4000rpm、30分間、30
℃）して上清を得、この上清に塩化ナトリウムを添加
（87g/）後１時間撹拌して第VIII因子画分を塩析させ
遠心沈澱（4000rpm、30分間、30℃）を得た。
その後、塩析沈澱を20mMトリス緩衝液（pH7.0）に溶
解し、280nm吸光度を25〜30に調整した後ゲル濾過カラ
ムの注入検体とした。カラムの充填剤はファルマシア製
のSephacryl S−400 HRを使用し、検体はカラムベッド
容量の５〜７％の注入量でカラムより排出された第VIII
因子活性画分を分取した。その条件版、次の通りであ
る： 注入サンプル：塩析沈澱溶解液 カラム:Sephacryl S−400HR 溶媒:20mM Tris（HCL）,10mM CaCl2,1M NaCl buffer,pH
7.0 その結果、血液凝固第VIII因子はカラムボイド画分に
観察され、夾雑蛋白が高度に分離されていた。その後、
所定のイオン強度、力価に調整され、小分され、凍結乾
燥されて、第VIII因子製剤を得る。
そして、さらに60℃、72時間以上の乾燥加熱が行わ
れ、より安全な製剤を製造する。
〔実験例〕
実験例１ ウイルス不活化効果 血液凝固第VIII因子含有組成物、血液凝固第IX因子含
有組成物、トロンビン含有組成物およびフィブリノゲン
含有組成物中のウイルスの不活化効果を検討した。
（実験方法） 第VIII因子ではクリオプレシピテートの溶解液、第IX
因子ではDEAE−セファデックス溶出液、トロンビンでは
SP−セファデックス溶出液、フィブリノゲンではFr.Iペ
ースト溶解液と各製剤の製造工程サンプルに、TNBPを0.
3％w/v、Teww 80を１％w/vになるように添加し、エンベ
ロープのあるウイルスとしてVSV、シンドビスウイルス
（sindbis virus）、エンベロープのないウイルスとし
てエコーウイルス（Echo virus）をモニターウイルスと
して106〜107個/ml添加し、30℃で加温して経時的にサ
ンプリングし、残存しているウイルスを第１表の方法に
より測定した。その結果は第２〜４表に示す通りであ
り、いずれの製剤においてもVSV、シンドビスウイルス
は30℃、１時間の処理で検出限界以下まで不活化され
た。一方、膜のないウィルスであるエコーウィルスは30
℃、60時間後もほとんど不活化されなかった。
実験例２ 蛋白質の安定性 第VIII因子ではクリオペーストの抽出液にTNBPを0.3
％w/v、Tween 80を１％w/v添加し、30℃で加温し、経時
的にサンプリングして第VIII因子活性を測定したが、24
時間後の残存活性が80％である（第１図参照）ことよ
り、30℃、６時間ではほとんど第VIII因子活性のロスが
ないと判断し、安定化剤のスクリーニングはしなかっ
た。また、乾燥加熱時の安定性も60℃、72時間後で95％
以上の活性を保持しており、あえて安定化剤のスクリー
ニングはしなかった。
第IX因子ではDEAE溶出液にTNBPを0.3％w/v、Tween 80
を１％w/v添加し、30℃で加温して経時的にサンプリン
グして第IX因子活性を測定したが、24時間後の残存活性
が76％で若干の活性低下が認められたが、30℃、６時間
ではほとんど問題にする低下でもないことにより、安定
化剤の添加はしなかった。（第２図参照）。
また乾燥加熱時の安定性も60℃、72時間後で95％以上
の活性を保持しており、あえて安定化剤のスクリーニン
グはしなかった。
トロンビンではSP−セファデックス溶出液にTNBPを0.
3w/v％、Tween 80を１％w/v添加し、30℃で加温して経
時的にサンプリングし、トロンビン活性を測定したが、
30時間後の活性ロスが大きく、30℃、６時間後でも90％
の活性維持が難しいと判断し、安定化剤のスクリーニン
グを行った。その結果、EACA（ε−アミノカプロン酸）
とアルギニンの添加により、トロンビンの活性低下を防
ぐことができ、特にEACAでは２％以上の添加で30℃、30
時間後も90％以上の活性を維持できた（第３図および第
４図参照）。
フィブリノゲンはFr.Iペーストの溶解液にTNBPを0.3
％w/v、Tween 80を１％w/v添加し、30℃で加温して、経
時的にサンプリングし、フィブリノゲン凝固活性を測定
した。その結果、30℃、24時間後では、全く凝固活性を
認めないことが判明し、安定化剤のスクリーニングを行
った。その結果、アプロチニンとEACAに安定化効果のあ
ることが判明した。EACAを５％以上添加することにより
30℃、24時間後も90％の凝固活性を維持できた（第５図
参照）。
【図面の簡単な説明】 第１図は、血液凝固第VIII因子の活性残存率に及ぼす界
面活性剤処理の影響を経時的に見たものである。…○…
は界面活性剤未添加時の場合を、−●−は界面活性剤添
加時の場合を各々示す。 第２図は血液凝固第IX因子の活性残存率に及ぼす界面活
性剤処理の影響を経時的に見たものである。…○…は界
面活性剤未添加時の場合を、−●−は界面活性剤添加時
の場合を各々示す。 第３図は、トロンビンの界面活性剤処理時の活性残存率
に及ぼすEACAの添加効果を経時的に見たものである。 はEACAの未添加時の場合を、 はEACA1％添加時の場合を、 はEACA2％添加時の場合を、 はEACA4％添加時の場合を、 はEACA8％添加時の場合を各々示す。 第４図は、トロンビンの界面活性剤処理時の活性残存率
に及ぼすアルギニンの添加効果を経時的に見たものであ
る。 はアルギニンの未添加時の場合を、 はアルギニン１％添加時の場合を、 はアルギニン２％添加時の場合を、 はアルギニン４％添加時の場合を、 はアルギニン８％添加時の場合を各々示す。 第５図は、フィブリノゲンの界面活性剤処理時の活性残
存率に及ぼすEACAの添加効果を経時的に見たものであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/48 Ａ６１Ｋ 37/54 38/55 37/64 47/24 37/47 37/14 (72)発明者 武智 和男 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の １ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 大村 孝男 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の １ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 平尾 豊 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の １ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 上村 八尋 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の １ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 横山 和正 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の １ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭60−51116（ＪＰ，Ａ) 特表 昭58−500548（ＪＰ，Ａ) Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ. 23，Ｐ．295−305（1986年)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ウイルス夾雑の可能性のある蛋白質含有組
    成物からウイルスの不活化された蛋白質含有組成物を製
    造する方法であって、次の工程を含むことを特徴とする
    方法。 （ａ）液状の蛋白質含有組成物をトリアルキルホスフェ
    ートと接触させ、該蛋白質含有組成物からトリアルキル
    ホスフェートを除去する、その後、 （ｂ）該蛋白質含有組成物を凍結乾燥し、乾燥状の該蛋
    白質含有組成物を加熱処理する。
  2. 【請求項２】ウイルス夾雑の可能性のある液状の蛋白質
    含有組成物をプロテアーゼ阻害剤の存在下でトリアルキ
    ルホスフェートと接触させることを特徴とする請求項１
    記載のウイルスの不活化された蛋白質含有組成物を製造
    する方法。
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