JPH06166634A - プラスミノーゲン含有組成物の製造方法 - Google Patents
プラスミノーゲン含有組成物の製造方法Info
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- JPH06166634A JPH06166634A JP4343637A JP34363792A JPH06166634A JP H06166634 A JPH06166634 A JP H06166634A JP 4343637 A JP4343637 A JP 4343637A JP 34363792 A JP34363792 A JP 34363792A JP H06166634 A JPH06166634 A JP H06166634A
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
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- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
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- C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
- A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
- A61L2/0082—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using chemical substances
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- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
Abstract
(57)【要約】
【目的】 プラスミノーゲンとしての活性の損失を最小
限に止め、効率よく夾雑ウイルスを不活化し、医薬品と
してより安全なプラスミノーゲン含有組成物を製造する
方法を提供するものである。 【構成】 ウイルス夾雑の可能性のあるプラスミノーゲ
ン含有組成物を溶液状態において、トリアルキルホス
フェートと接触・処理し、そしてトリアルキルホスフ
ェートを除去する処理を行うことからなるウイルスの不
活性化されたプラスミノーゲン含有組成物の製造方法で
あり、好ましくは、トリアルキルホスフェートとの接触
・処理を弱酸性条件下で行うか、更に、凍結乾燥し、
そして、乾燥状態でプラスミノーゲン含有組成物を加
熱処理する。
限に止め、効率よく夾雑ウイルスを不活化し、医薬品と
してより安全なプラスミノーゲン含有組成物を製造する
方法を提供するものである。 【構成】 ウイルス夾雑の可能性のあるプラスミノーゲ
ン含有組成物を溶液状態において、トリアルキルホス
フェートと接触・処理し、そしてトリアルキルホスフ
ェートを除去する処理を行うことからなるウイルスの不
活性化されたプラスミノーゲン含有組成物の製造方法で
あり、好ましくは、トリアルキルホスフェートとの接触
・処理を弱酸性条件下で行うか、更に、凍結乾燥し、
そして、乾燥状態でプラスミノーゲン含有組成物を加
熱処理する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウイルス夾雑の可能性
のあるプラスミノーゲン含有組成物から実質的にウイル
スが不活化された高活性のプラスミノーゲン含有組成物
の製造方法に関するものである。
のあるプラスミノーゲン含有組成物から実質的にウイル
スが不活化された高活性のプラスミノーゲン含有組成物
の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】プラスミノーゲンはウロキナーゼ等のプ
ラスミノーゲン活性化因子によって活性化されてプラス
ミンとなり、これがフィブリンを溶解して線溶現象をも
たらす。このため、プラスミノーゲンは線溶系の治療剤
（血栓溶解剤）として臨床応用の可能性が認められてい
る。特にそのＮ末がリジル残基であるリジル型プラスミ
ノーゲンの有用性が期待されている。
ラスミノーゲン活性化因子によって活性化されてプラス
ミンとなり、これがフィブリンを溶解して線溶現象をも
たらす。このため、プラスミノーゲンは線溶系の治療剤
（血栓溶解剤）として臨床応用の可能性が認められてい
る。特にそのＮ末がリジル残基であるリジル型プラスミ
ノーゲンの有用性が期待されている。
【０００３】プラスミノーゲンはヒト血漿に由来するた
め、ウイルス、例えば、肝炎ウイルスやＡＩＤＳウイル
ス等がその含有組成物中に侵入する恐れがある。そこ
で、これらのウイルス伝播を防ぐため、血漿蛋白質含有
組成物を溶液状態で加熱する方法（特開昭５５−１４５
６１５、同５６−１３９４２２、同５６−１０６５９４
等）、乾燥状態で加熱する方法（特表昭５５−５００５
４８等）、トリアルキルホスフェートを接触・処理する
方法（特開昭６０−５１１１６等）が知られている。し
かし、加熱処理では熱に強いウイルスが残存する可能性
があり、トリアルキルホスフェート処理では非エンベロ
ープウイルスが残存する可能性がある。また、トリアル
キルホスフェート処理中に蛋白質の活性が低下する問題
があった。
め、ウイルス、例えば、肝炎ウイルスやＡＩＤＳウイル
ス等がその含有組成物中に侵入する恐れがある。そこ
で、これらのウイルス伝播を防ぐため、血漿蛋白質含有
組成物を溶液状態で加熱する方法（特開昭５５−１４５
６１５、同５６−１３９４２２、同５６−１０６５９４
等）、乾燥状態で加熱する方法（特表昭５５−５００５
４８等）、トリアルキルホスフェートを接触・処理する
方法（特開昭６０−５１１１６等）が知られている。し
かし、加熱処理では熱に強いウイルスが残存する可能性
があり、トリアルキルホスフェート処理では非エンベロ
ープウイルスが残存する可能性がある。また、トリアル
キルホスフェート処理中に蛋白質の活性が低下する問題
があった。
【０００４】これらの問題を解決すべく、トリアルキル
ホスフェートによる接触・処理後に乾燥状態で加熱状態
で加熱処理する方法（ＥＰ公開３７８２０８）、溶液状
態でトリアルキルホスフェートによる接触・処理および
加熱処理を同時に行う方法（特開平２−１８０８３３）
等が提案されている。
ホスフェートによる接触・処理後に乾燥状態で加熱状態
で加熱処理する方法（ＥＰ公開３７８２０８）、溶液状
態でトリアルキルホスフェートによる接触・処理および
加熱処理を同時に行う方法（特開平２−１８０８３３）
等が提案されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記事
情を考慮して、プラスミノーゲン含有組成物の製造に適
用すべく検討を行った。本発明はプラスミノーゲンとし
ての活性の損失を最小限に止め、効率よく夾雑ウイルス
を不活化し、医薬品としてより安全なプラスミノーゲン
含有組成物を製造する方法を提供するものである。
情を考慮して、プラスミノーゲン含有組成物の製造に適
用すべく検討を行った。本発明はプラスミノーゲンとし
ての活性の損失を最小限に止め、効率よく夾雑ウイルス
を不活化し、医薬品としてより安全なプラスミノーゲン
含有組成物を製造する方法を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、ウイルス夾雑
の可能性のあるプラスミノーゲン含有組成物を溶液状
態において、トリアルキルホスフェートと接触・処理
し、そしてトリアルキルホスフェートを除去する処理
を行うことからなるウイルスの不活性化されたプラスミ
ノーゲン含有組成物の製造方法である。
の可能性のあるプラスミノーゲン含有組成物を溶液状
態において、トリアルキルホスフェートと接触・処理
し、そしてトリアルキルホスフェートを除去する処理
を行うことからなるウイルスの不活性化されたプラスミ
ノーゲン含有組成物の製造方法である。
【０００７】本発明の方法が適用されるプラスミノーゲ
ンは特に限定されるものではなく、血漿由来、組織由
来、遺伝子組換えあるいは組織培養により得られうる。
本発明の方法が適用される出発原料としてのプラスミノ
ーゲン含有組成物（溶液状態）には特に制限はなく、例
えば、血清、血漿、腹水、胎盤抽出液、胎盤組織抽出
液、血漿から得たコーンの低温アルコール分画法の第II
＋III 画分あるいは第III 画分、その他の、血漿または
組織抽出液を各種分画法により処理して得た画分からな
る溶液、遺伝子組換え宿主または組織培養により得られ
る培養液、市販のプラスミノーゲン製剤（溶液状態）が
例示される。
ンは特に限定されるものではなく、血漿由来、組織由
来、遺伝子組換えあるいは組織培養により得られうる。
本発明の方法が適用される出発原料としてのプラスミノ
ーゲン含有組成物（溶液状態）には特に制限はなく、例
えば、血清、血漿、腹水、胎盤抽出液、胎盤組織抽出
液、血漿から得たコーンの低温アルコール分画法の第II
＋III 画分あるいは第III 画分、その他の、血漿または
組織抽出液を各種分画法により処理して得た画分からな
る溶液、遺伝子組換え宿主または組織培養により得られ
る培養液、市販のプラスミノーゲン製剤（溶液状態）が
例示される。
【０００８】また、本発明のトリアルキルホスフェート
との接触時のプラスミノーゲン含有組成物の精製度は、
特に限定されるものではなく、任意の精製度のものに適
用可能であり、従ってトリアルキルホスフェートとの接
触はプラスミノーゲンの分離、精製のいずれの段階に適
用してもよい。本発明に使用されるトリアルキルホスフ
ェートは特に限定されないが、好適にはトリ−（ｎ−ブ
チル）ホスフェート、トリ−（ｔｅｒｔ−ブチル）ホス
フェート、トリ−（ｎ−ヘキシル）ホスフェート、トリ
−（２−エチルヘキシル）ホスフェート、トリ−（ｎ−
デシル）ホスフェートなどが挙げれる。特に好ましいト
リアルキルホスフェートは、トリ−（ｎ−ブチル）ホス
フェート（以下ＴＮＢＰと言う）である。なお、２種類
以上の異なるトリアルキルホスフェートの混合物も使用
することができる。
との接触時のプラスミノーゲン含有組成物の精製度は、
特に限定されるものではなく、任意の精製度のものに適
用可能であり、従ってトリアルキルホスフェートとの接
触はプラスミノーゲンの分離、精製のいずれの段階に適
用してもよい。本発明に使用されるトリアルキルホスフ
ェートは特に限定されないが、好適にはトリ−（ｎ−ブ
チル）ホスフェート、トリ−（ｔｅｒｔ−ブチル）ホス
フェート、トリ−（ｎ−ヘキシル）ホスフェート、トリ
−（２−エチルヘキシル）ホスフェート、トリ−（ｎ−
デシル）ホスフェートなどが挙げれる。特に好ましいト
リアルキルホスフェートは、トリ−（ｎ−ブチル）ホス
フェート（以下ＴＮＢＰと言う）である。なお、２種類
以上の異なるトリアルキルホスフェートの混合物も使用
することができる。
【０００９】本発明に使用されるトリアルキルホスフェ
ートは、０．０１〜１０（ｗ／ｖ）％の範囲の量、好ま
しくは約０．１〜３（ｗ／ｖ）％の範囲の量において使
用される。トリアルキルホスフェートは界面活性剤を伴
ってまたは伴わないで使用することができる。好ましく
は、トリアルキルホスフェートを界面活性剤と組み合わ
せ使用する。この界面活性剤は、トリアルキルホスフェ
ートがプラスミノーゲン含有組成物と接触する前、同
時、または後の任意の段階に添加することができる。界
面活性剤の作用は、プラスミノーゲン含有組成物中のウ
イルスとトリアルキルホスフェートとの接触を強化する
ことである。
ートは、０．０１〜１０（ｗ／ｖ）％の範囲の量、好ま
しくは約０．１〜３（ｗ／ｖ）％の範囲の量において使
用される。トリアルキルホスフェートは界面活性剤を伴
ってまたは伴わないで使用することができる。好ましく
は、トリアルキルホスフェートを界面活性剤と組み合わ
せ使用する。この界面活性剤は、トリアルキルホスフェ
ートがプラスミノーゲン含有組成物と接触する前、同
時、または後の任意の段階に添加することができる。界
面活性剤の作用は、プラスミノーゲン含有組成物中のウ
イルスとトリアルキルホスフェートとの接触を強化する
ことである。
【００１０】界面活性剤としては、脂肪酸のポリオキシ
エチレン誘導体、ソルビトール無水物の部分エステル、
たとえばトゥイーン８０、トゥイーン２０およびポリソ
ルベート８０、および非イオン性油溶水洗剤、たとえば
トリトンＸ１００（オキシエチル化アルキルフェノー
ル）が挙げられる。さらに、デオキシコール酸ナトリウ
ム、およびスルホベタインとして周知の合成ツブイッテ
ルイオン洗剤であるＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔｓ、たとえ
ばＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−アンモニオ−
１−エタンスルホネート、およびその同族体、または非
イオン性洗浄剤、たとえばオクチル−β，Ｄ−グルコピ
ラノシドなどが挙げられる。
エチレン誘導体、ソルビトール無水物の部分エステル、
たとえばトゥイーン８０、トゥイーン２０およびポリソ
ルベート８０、および非イオン性油溶水洗剤、たとえば
トリトンＸ１００（オキシエチル化アルキルフェノー
ル）が挙げられる。さらに、デオキシコール酸ナトリウ
ム、およびスルホベタインとして周知の合成ツブイッテ
ルイオン洗剤であるＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔｓ、たとえ
ばＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−アンモニオ−
１−エタンスルホネート、およびその同族体、または非
イオン性洗浄剤、たとえばオクチル−β，Ｄ−グルコピ
ラノシドなどが挙げられる。
【００１１】界面活性剤を使用する場合、その量は臨界
的ではなく、たとえば約０．００１％〜約１０％、好ま
しくは約０．０１％〜３％の範囲で使用することができ
る。トリアルキルホスフェート処理は、エンベロープコ
ートウイルス、たとえばＢ型肝炎ウイルス、ｎｏｎＡｎ
ｏｎＢ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ）、ベシキュラーストマティティスウイルス（Ｖｅｓ
ｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、
シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｖｉｒｕｓ）等
の不活化に特に有用である。また、さらに乾燥状態で充
分な時間加熱処理することにより、熱に弱いウイルスも
不活化し得る。
的ではなく、たとえば約０．００１％〜約１０％、好ま
しくは約０．０１％〜３％の範囲で使用することができ
る。トリアルキルホスフェート処理は、エンベロープコ
ートウイルス、たとえばＢ型肝炎ウイルス、ｎｏｎＡｎ
ｏｎＢ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ）、ベシキュラーストマティティスウイルス（Ｖｅｓ
ｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、
シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｖｉｒｕｓ）等
の不活化に特に有用である。また、さらに乾燥状態で充
分な時間加熱処理することにより、熱に弱いウイルスも
不活化し得る。
【００１２】本発明のトリアルキルホスフェートによる
プラスミノーゲン含有組成物の処理は、０℃〜６０℃、
好ましくは２０℃〜４０℃の温度で、好適には３０分以
上、より好適には１〜３０時間、さらに好適には３〜１
０時間行う。また、本処理は弱酸性条件下で行う。具体
的には、ｐＨ４〜６、好ましくは、４．５〜５．５が例
示される。
プラスミノーゲン含有組成物の処理は、０℃〜６０℃、
好ましくは２０℃〜４０℃の温度で、好適には３０分以
上、より好適には１〜３０時間、さらに好適には３〜１
０時間行う。また、本処理は弱酸性条件下で行う。具体
的には、ｐＨ４〜６、好ましくは、４．５〜５．５が例
示される。
【００１３】血漿、血清中にはＮ末がグルタミン酸残基
であるグルタミル型プラスミノーゲンが、コーンの低温
アルコール分画法の第II＋III 画分、あるいは第III 画
分にはグルタミル型およびリジル型の両プラスミノーゲ
ンが存在する。リジル型プラスミノーゲンを得るために
は、グルタミル型プラスミノーゲンをリジル型に変換す
ることが必要であるが、トリアルキルホスフェート処理
を上述の弱酸性ｐＨ条件下で行うことにより、グルタミ
ル型を効果的にリジル型に変換できる。この場合は、プ
ロテアーゼ阻害剤の非存在下または所定の濃度のプロテ
アーゼ阻害剤の存在下で本処理を行うことにより、プラ
スミノーゲンの活性を損なうことなくリジル型プラスミ
ノーゲンを得ることができる。
であるグルタミル型プラスミノーゲンが、コーンの低温
アルコール分画法の第II＋III 画分、あるいは第III 画
分にはグルタミル型およびリジル型の両プラスミノーゲ
ンが存在する。リジル型プラスミノーゲンを得るために
は、グルタミル型プラスミノーゲンをリジル型に変換す
ることが必要であるが、トリアルキルホスフェート処理
を上述の弱酸性ｐＨ条件下で行うことにより、グルタミ
ル型を効果的にリジル型に変換できる。この場合は、プ
ロテアーゼ阻害剤の非存在下または所定の濃度のプロテ
アーゼ阻害剤の存在下で本処理を行うことにより、プラ
スミノーゲンの活性を損なうことなくリジル型プラスミ
ノーゲンを得ることができる。
【００１４】一方、中性および弱アルカリｐＨ条件下
で、本処理を行うことによりリジル型への変換を阻止し
たままグルタミル型プラスミノーゲンを得ることができ
る。その場合はプロテアーゼ阻害剤の存在下で行うのが
好ましい。プロテアーゼ阻害剤としては、実質的にプロ
テアーゼ活性を阻害する物質であれば特に限定されな
い。たとえば、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、リ
ジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸、ＤＦＰ、ＰＭ
ＳＦなどの化学物質、アプロチニンなどの蛋白質などが
例示される。
で、本処理を行うことによりリジル型への変換を阻止し
たままグルタミル型プラスミノーゲンを得ることができ
る。その場合はプロテアーゼ阻害剤の存在下で行うのが
好ましい。プロテアーゼ阻害剤としては、実質的にプロ
テアーゼ活性を阻害する物質であれば特に限定されな
い。たとえば、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、リ
ジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸、ＤＦＰ、ＰＭ
ＳＦなどの化学物質、アプロチニンなどの蛋白質などが
例示される。
【００１５】普通、トリアルキルホスフェート処理後、
トリアルキルホスフェートは除去される。界面活性剤や
安定化剤を用いたときはそれらも除去される。除去はい
ずれの方法によってもよいが、たとえばアフィニティー
クロマトグラフィーあるいはイオン交換クロマトグラフ
ィーでプラスミノーゲンを吸着する方法、プラスミノー
ゲンを沈殿により回収する方法、ゲル濾過によりプラス
ミノーゲンとこれらのものを分離する方法などが挙げら
れる。また、公知の加熱処理を行うこともできる。
トリアルキルホスフェートは除去される。界面活性剤や
安定化剤を用いたときはそれらも除去される。除去はい
ずれの方法によってもよいが、たとえばアフィニティー
クロマトグラフィーあるいはイオン交換クロマトグラフ
ィーでプラスミノーゲンを吸着する方法、プラスミノー
ゲンを沈殿により回収する方法、ゲル濾過によりプラス
ミノーゲンとこれらのものを分離する方法などが挙げら
れる。また、公知の加熱処理を行うこともできる。
【００１６】処理後、該プラスミノーゲン含有組成物を
アフィニティクロマトグラフィーまたはゲル濾過又はイ
オン交換クロマトグラフィーで処理する。アフィニティ
クロマトグラフィーまたはゲル濾過又はイオン交換クロ
マトグラフィーで処理することにより、トリアルキルホ
スフェート、界面活性剤、安定化剤を除去することがで
きる。さらに、非エンベロープコートウイルスであり、
特別熱に強いウイルスが残存していたとしても、本アフ
ィニティークロマトグラフィーまたはゲル濾過又はイオ
ン交換クロマトグラフィー処理で除去可能である。アフ
ィニティークロマトグラフィーは、プラスミノーゲンの
場合、固定化リジンによるクロマトグラフィーで処理す
ることができる。
アフィニティクロマトグラフィーまたはゲル濾過又はイ
オン交換クロマトグラフィーで処理する。アフィニティ
クロマトグラフィーまたはゲル濾過又はイオン交換クロ
マトグラフィーで処理することにより、トリアルキルホ
スフェート、界面活性剤、安定化剤を除去することがで
きる。さらに、非エンベロープコートウイルスであり、
特別熱に強いウイルスが残存していたとしても、本アフ
ィニティークロマトグラフィーまたはゲル濾過又はイオ
ン交換クロマトグラフィー処理で除去可能である。アフ
ィニティークロマトグラフィーは、プラスミノーゲンの
場合、固定化リジンによるクロマトグラフィーで処理す
ることができる。
【００１７】乾燥組成物の加熱処理を行う場合、乾燥組
成物はトリアルキルホスフェートなどを除去した後、プ
ラスミノーゲンを回収、所定の純度にまで精製を行った
後、公知の方法で凍結乾燥して得られる。加熱処理は、
通常３０℃〜１００℃、好ましくは５５℃〜７５℃にお
いて、通常３〜２００時間、好ましくは１０〜１００時
間実施される。また、蛋白質を熱から保護するため、安
定化剤の存在下で行ってもよい。安定化剤としては、た
とえば、ヒト血清アルブミン、糖、糖アルコール、アミ
ノ酸などが挙げられる。
成物はトリアルキルホスフェートなどを除去した後、プ
ラスミノーゲンを回収、所定の純度にまで精製を行った
後、公知の方法で凍結乾燥して得られる。加熱処理は、
通常３０℃〜１００℃、好ましくは５５℃〜７５℃にお
いて、通常３〜２００時間、好ましくは１０〜１００時
間実施される。また、蛋白質を熱から保護するため、安
定化剤の存在下で行ってもよい。安定化剤としては、た
とえば、ヒト血清アルブミン、糖、糖アルコール、アミ
ノ酸などが挙げられる。
【００１８】
【発明の効果】本発明の製造方法によれば、プラスミノ
ーゲンの活性を損失することなく、効率的にウイルスが
不活化されたプラスミノーゲン含有組成物が製造され
る。なお、トリアルキルホスフェート処理はエンベロー
プを持たないウイルスには不活化効果が弱い。ところ
が、本発明によれば乾燥状のプラスミノーゲン含有組成
物を加熱処理に付す工程があるので、かかるウイルスも
当該工程を経ることによって有意に不活化することがで
きる。
ーゲンの活性を損失することなく、効率的にウイルスが
不活化されたプラスミノーゲン含有組成物が製造され
る。なお、トリアルキルホスフェート処理はエンベロー
プを持たないウイルスには不活化効果が弱い。ところ
が、本発明によれば乾燥状のプラスミノーゲン含有組成
物を加熱処理に付す工程があるので、かかるウイルスも
当該工程を経ることによって有意に不活化することがで
きる。
【００１９】また、血栓溶解剤としての有用性が期待さ
れているリジル型プラスミノーゲンを得るためには、ト
リアルキルホスフェート処理工程を弱酸性アルカリ条件
下で行い、グルタミル型プラスミノーゲンを効率的にリ
ジル型に変換することによって達成できる。一方、本工
程をプロテアーゼ阻害剤存在下、中性またはアルカリ性
ｐＨ条件で実施することにより、グルタミル型プラスミ
ノーゲンを得ることができる。
れているリジル型プラスミノーゲンを得るためには、ト
リアルキルホスフェート処理工程を弱酸性アルカリ条件
下で行い、グルタミル型プラスミノーゲンを効率的にリ
ジル型に変換することによって達成できる。一方、本工
程をプロテアーゼ阻害剤存在下、中性またはアルカリ性
ｐＨ条件で実施することにより、グルタミル型プラスミ
ノーゲンを得ることができる。
【００２０】よって、本発明の製造方法は医薬品として
より安全なプラスミノーゲン含有組成物の工業的製法と
してきわめて好ましい方法を提供するものであり、ウイ
ルスの不活化されたプラスミノーゲン製剤を製造するの
に特に有用である。
より安全なプラスミノーゲン含有組成物の工業的製法と
してきわめて好ましい方法を提供するものであり、ウイ
ルスの不活化されたプラスミノーゲン製剤を製造するの
に特に有用である。
【００２１】
実施例１ コーンの冷エタノール分画法で得られた画分II＋III ペ
ースト抽出残渣（１００ｇ）を、１０単位／ｍｌのアプ
ロチニンと０．１Ｍ塩化ナトリウムを含むトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．３）に懸濁し、少時攪拌した後、５％硫
酸アンモニウムを添加・攪拌し遠心分離により上清を分
離した。更に、この上清に３０％硫酸アンモニウムを添
加・攪拌し遠心分離により沈殿１ｇを分離した。この沈
殿を０．９％塩化ナトリウムを含む０．９％グリシン溶
液（ｐＨ７．２）に懸濁した。
ースト抽出残渣（１００ｇ）を、１０単位／ｍｌのアプ
ロチニンと０．１Ｍ塩化ナトリウムを含むトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．３）に懸濁し、少時攪拌した後、５％硫
酸アンモニウムを添加・攪拌し遠心分離により上清を分
離した。更に、この上清に３０％硫酸アンモニウムを添
加・攪拌し遠心分離により沈殿１ｇを分離した。この沈
殿を０．９％塩化ナトリウムを含む０．９％グリシン溶
液（ｐＨ７．２）に懸濁した。
【００２２】このプラスミノーゲン含有溶液１ｍｌ当た
り、０．３％ＴＮＢＰ（トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェ
ート）および１％Ｔｗｅｅｎ８０を加えた溶液を調製
し、ｐＨ５で３０℃、６時間処理した。プラスミノーゲ
ン溶液をＤｅｕｔｓｃｈ，Ｄ．Ｇ．ら〔Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，１７０，１０９５，（１９７０）〕の方法に準じて
０．９％塩化ナトリウムを含む０．９％グリシン溶液
（ｐＨ７．２）で平衡化したリジン−セファロースカラ
ム（１００ｍｌ）に注入し、プラスミノーゲンを吸着さ
せ、次いで０．９％塩化ナトリウムを含む０．９％グリ
シン溶液（ｐＨ７．２）で洗浄、更に１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．２）５００ｍ
ｌで洗浄後、０．２５Ｍリジンを含む０．９％グリシン
溶液（ｐＨ７．２）を用いて吸着したプラスミノーゲン
を溶出せしめた。
り、０．３％ＴＮＢＰ（トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェ
ート）および１％Ｔｗｅｅｎ８０を加えた溶液を調製
し、ｐＨ５で３０℃、６時間処理した。プラスミノーゲ
ン溶液をＤｅｕｔｓｃｈ，Ｄ．Ｇ．ら〔Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，１７０，１０９５，（１９７０）〕の方法に準じて
０．９％塩化ナトリウムを含む０．９％グリシン溶液
（ｐＨ７．２）で平衡化したリジン−セファロースカラ
ム（１００ｍｌ）に注入し、プラスミノーゲンを吸着さ
せ、次いで０．９％塩化ナトリウムを含む０．９％グリ
シン溶液（ｐＨ７．２）で洗浄、更に１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．２）５００ｍ
ｌで洗浄後、０．２５Ｍリジンを含む０．９％グリシン
溶液（ｐＨ７．２）を用いて吸着したプラスミノーゲン
を溶出せしめた。
【００２３】この処理によりＴＮＢＰ、Ｔｗｅｅｎ８０
は除去される。こうして得られたプラスミノーゲンは、
所望の純度にまで精製を行った後、所定の濃度になるよ
うに溶解しバイアルに小分され、凍結乾燥される。凍結
乾燥されたプラスミノーゲン製剤は６０〜７０℃、７２
時間以上の乾燥加熱処理を行い、ウイルスに対し安全な
製剤を製造する。
は除去される。こうして得られたプラスミノーゲンは、
所望の純度にまで精製を行った後、所定の濃度になるよ
うに溶解しバイアルに小分され、凍結乾燥される。凍結
乾燥されたプラスミノーゲン製剤は６０〜７０℃、７２
時間以上の乾燥加熱処理を行い、ウイルスに対し安全な
製剤を製造する。
【００２４】実施例２ ＴＮＢＰ／Ｔｗｅｅｎ８０処理後に、セファクリルＳ−
３００および展開液として０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウ
ムを含む０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．２）を用いて
ゲル濾過を行い、固定化リジンによるアフィニティクロ
マトグラフィー処理を行った。実施例１と同様、高活性
でかつウイルスの不活化されたリジル型プラスミノーゲ
ン含有組成物を調製することができた。
３００および展開液として０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウ
ムを含む０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．２）を用いて
ゲル濾過を行い、固定化リジンによるアフィニティクロ
マトグラフィー処理を行った。実施例１と同様、高活性
でかつウイルスの不活化されたリジル型プラスミノーゲ
ン含有組成物を調製することができた。
【００２５】実施例３ ＴＮＢＰ／Ｔｗｅｅｎ８０処理時のｐＨ条件とグルタミ
ル型プラスミノーゲンからリジル型プラスミノーゲンへ
の変換の度合いを確認した。その結果を表１に示す。
ル型プラスミノーゲンからリジル型プラスミノーゲンへ
の変換の度合いを確認した。その結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】実施例４ コーンの冷エタノール分画法で得られた画分II＋III ペ
ースト抽出残渣（１．１ｋｇ）を、１０単位／ｍｌのア
プロチニンと０．１Ｍ塩化ナトリウムを含むトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８．３）に懸濁し、少時攪拌した後、遠心
分離、濾過により上清を分離した。
ースト抽出残渣（１．１ｋｇ）を、１０単位／ｍｌのア
プロチニンと０．１Ｍ塩化ナトリウムを含むトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８．３）に懸濁し、少時攪拌した後、遠心
分離、濾過により上清を分離した。
【００２８】この上清をリジン−セファロース（３リッ
トル）に注入し、プラスミノーゲンを吸着させ、次いで
０．９％塩化ナトリウムを含む０．９％グリシン溶液
（ｐＨ７．２）で洗浄、更に１Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．２）で洗浄後、０．２
５Ｍリジンを含む０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．２）
を用いて吸着したプラスミノーゲンを溶出せしめた。
トル）に注入し、プラスミノーゲンを吸着させ、次いで
０．９％塩化ナトリウムを含む０．９％グリシン溶液
（ｐＨ７．２）で洗浄、更に１Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．２）で洗浄後、０．２
５Ｍリジンを含む０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．２）
を用いて吸着したプラスミノーゲンを溶出せしめた。
【００２９】この溶出液につき濃縮を行い、２５０ｍｌ
の濃縮液を得た。このプラスミノーゲン含有濃縮液１ｍ
ｌ当たり、０．３％ＴＮＢＰおよび１％Ｔｗｅｅｎ８０
を加えた溶液を調製し、ｐＨ５．０で３０℃、６時間処
理した。処理後のプラスミノーゲン溶液を０．９％塩化
ナトリウムを含む０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．２）
で平衡化したセファクリルＳ３００カラム（１０リット
ル）にアプライし、ゲル濾過を行った。実施例１と同
様、高活性でかつウイルスの不活化されたリジル型プラ
スミノーゲン含有組成物を調製することができた。
の濃縮液を得た。このプラスミノーゲン含有濃縮液１ｍ
ｌ当たり、０．３％ＴＮＢＰおよび１％Ｔｗｅｅｎ８０
を加えた溶液を調製し、ｐＨ５．０で３０℃、６時間処
理した。処理後のプラスミノーゲン溶液を０．９％塩化
ナトリウムを含む０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．２）
で平衡化したセファクリルＳ３００カラム（１０リット
ル）にアプライし、ゲル濾過を行った。実施例１と同
様、高活性でかつウイルスの不活化されたリジル型プラ
スミノーゲン含有組成物を調製することができた。
【００３０】実施例５ コーンの冷エタノール分画法で得られた画分II＋III ペ
ースト抽出残渣（１．５ｋｇ）を、１００単位／ｍｌの
アプロチニンと０．１Ｍ塩化ナトリウムを含むトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．３）に懸濁し、少時攪拌した後、遠
心分離、濾過により上清を分離した。
ースト抽出残渣（１．５ｋｇ）を、１００単位／ｍｌの
アプロチニンと０．１Ｍ塩化ナトリウムを含むトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．３）に懸濁し、少時攪拌した後、遠
心分離、濾過により上清を分離した。
【００３１】この上清をリジン−セファロース（３リッ
トル）に注入し、プラスミノーゲンを吸着させ、次いで
０．９％塩化ナトリウムを含む０．９％グリシン溶液
（ｐＨ７．２）で洗浄、更に１Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．２）で洗浄後、０．２
５Ｍリジンを含む０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．２）
を用いて吸着したプラスミノーゲンを溶出せしめた。
トル）に注入し、プラスミノーゲンを吸着させ、次いで
０．９％塩化ナトリウムを含む０．９％グリシン溶液
（ｐＨ７．２）で洗浄、更に１Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．２）で洗浄後、０．２
５Ｍリジンを含む０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．２）
を用いて吸着したプラスミノーゲンを溶出せしめた。
【００３２】この溶出液に１００単位／ｍｌ（終濃度）
のアプロチニンを加え、濃縮を行い、２２０ｍｌの濃縮
液を得た。このプラスミノーゲン含有濃縮液１ｍｌ当た
り、０．３％ＴＮＢＰ、１％Ｔｗｅｅｎ８０および１０
０単位／ｍｌ（終濃度）のアプロチニンを加えた溶液を
調製し、ｐＨ７．２で３０℃、６時間処理した。
のアプロチニンを加え、濃縮を行い、２２０ｍｌの濃縮
液を得た。このプラスミノーゲン含有濃縮液１ｍｌ当た
り、０．３％ＴＮＢＰ、１％Ｔｗｅｅｎ８０および１０
０単位／ｍｌ（終濃度）のアプロチニンを加えた溶液を
調製し、ｐＨ７．２で３０℃、６時間処理した。
【００３３】処理後のプラスミノーゲン溶液を０．９％
塩化ナトリウムを含む０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．
２）で平衡化したセファクリルＳ３００カラム（１０リ
ットル）にアプライし、ゲル濾過を行った。実施例１と
同様、高活性でかつウイルスの不活化されたグルタミル
型プラスミノーゲン含有組成物を調製することができ
た。
塩化ナトリウムを含む０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．
２）で平衡化したセファクリルＳ３００カラム（１０リ
ットル）にアプライし、ゲル濾過を行った。実施例１と
同様、高活性でかつウイルスの不活化されたグルタミル
型プラスミノーゲン含有組成物を調製することができ
た。
Claims (3)
- 【請求項１】 ウイルス夾雑の可能性のあるプラスミノ
ーゲン含有組成物を 溶液状態において、トリアルキルホスフェートと接触
・処理し、そして トリアルキルホスフェートを除去する処理を行う ことからなるウイルスの不活性化されたプラスミノーゲ
ン含有組成物の製造方法。 - 【請求項２】 トリアルキルホスフェートとの接触・処
理を弱酸性条件下で行う請求項１記載の製造方法。 - 【請求項３】 更に、凍結乾燥し、そして、 乾燥状態でプラスミノーゲン含有組成物を加熱処理す
ることからなる請求項１記載の製造方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4343637A JPH06166634A (ja) | 1992-12-01 | 1992-12-01 | プラスミノーゲン含有組成物の製造方法 |
| PCT/JP1993/001744 WO1994012208A1 (en) | 1992-12-01 | 1993-11-30 | Process for producing plasminogen-containing composition |
| KR1019940702625A KR950700080A (ko) | 1992-12-01 | 1993-11-30 | 플라스미노겐 함유 조성물의 제조방법(Process for producing plasminogen-containing composition) |
| EP94901020A EP0638314A4 (en) | 1992-12-01 | 1993-11-30 | PROCESS FOR PRODUCING A COMPOSITION CONTAINING PLASMINOGEN. |
| CA002128694A CA2128694A1 (en) | 1992-12-01 | 1993-11-30 | Process for producing plasminogen-containing composition |
| TW082110688A TW299232B (ja) | 1992-12-01 | 1993-12-16 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4343637A JPH06166634A (ja) | 1992-12-01 | 1992-12-01 | プラスミノーゲン含有組成物の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06166634A true JPH06166634A (ja) | 1994-06-14 |
Family
ID=18363070
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4343637A Pending JPH06166634A (ja) | 1992-12-01 | 1992-12-01 | プラスミノーゲン含有組成物の製造方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0638314A4 (ja) |
| JP (1) | JPH06166634A (ja) |
| KR (1) | KR950700080A (ja) |
| CA (1) | CA2128694A1 (ja) |
| TW (1) | TW299232B (ja) |
| WO (1) | WO1994012208A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT201600091964A1 (it) * | 2016-09-13 | 2018-03-13 | Kedrion Spa | Processo per la purificazione del plasminogeno a partire da plasma umano. |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4495278A (en) * | 1981-04-27 | 1985-01-22 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Process for making novel blood clotting enzyme compositions |
| US4456590B2 (en) * | 1981-11-02 | 1989-05-30 | Heat treatment of lyphilized blood clotting factor viii concentrate | |
| US4540573A (en) * | 1983-07-14 | 1985-09-10 | New York Blood Center, Inc. | Undenatured virus-free biologically active protein derivatives |
| AT390001B (de) * | 1984-09-28 | 1990-03-12 | Immuno Ag | Verfahren zur inaktivierung von vermehrungsfaehigen filtrierbaren krankheitserregern |
| JPS61155332A (ja) * | 1984-12-28 | 1986-07-15 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 血液凝固第８因子の処理方法 |
| US4789545A (en) * | 1986-03-31 | 1988-12-06 | New York Blood Center, Inc. | Removal of lipid soluble process chemicals from biological materials by extraction with naturally occurring oils or synthetic substitutes thereof |
| JPH0725696B2 (ja) * | 1986-05-29 | 1995-03-22 | 株式会社ミドリ十字 | プラスミノ−ゲンの安定化方法 |
| JPH0278633A (ja) * | 1988-09-15 | 1990-03-19 | Green Cross Corp:The | ウイルス不活化方法 |
| US5094960A (en) * | 1988-10-07 | 1992-03-10 | New York Blood Center, Inc. | Removal of process chemicals from labile biological mixtures by hydrophobic interaction chromatography |
| JP2926728B2 (ja) * | 1988-12-29 | 1999-07-28 | 吉富製薬株式会社 | 蛋白質含有組成物の製造方法 |
| CA2007545A1 (en) * | 1989-01-13 | 1990-07-13 | Yahiro Uemura | Production method for protein-containing composition |
| ATE174383T1 (de) * | 1991-07-05 | 1998-12-15 | Bayer Ag | Verwendung von tri-n-butylphosphat bei niedrigem ph in lösungen von biologisch aktiven proteinen für eine verbesserte viruzide wirkung |
-
1992
- 1992-12-01 JP JP4343637A patent/JPH06166634A/ja active Pending
-
1993
- 1993-11-30 CA CA002128694A patent/CA2128694A1/en not_active Abandoned
- 1993-11-30 EP EP94901020A patent/EP0638314A4/en not_active Withdrawn
- 1993-11-30 KR KR1019940702625A patent/KR950700080A/ko not_active Application Discontinuation
- 1993-11-30 WO PCT/JP1993/001744 patent/WO1994012208A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1993-12-16 TW TW082110688A patent/TW299232B/zh active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0638314A4 (en) | 1996-01-31 |
| CA2128694A1 (en) | 1994-06-09 |
| WO1994012208A1 (en) | 1994-06-09 |
| KR950700080A (ko) | 1995-01-16 |
| EP0638314A1 (en) | 1995-02-15 |
| TW299232B (ja) | 1997-03-01 |
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