JPH0578532B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

＜産業上の利用分野＞ 本発明は生物医学的生成物及び製薬生成物中の
肝炎Ｂ又は他のウイルスの発熱原性及び伝染性の
減少方法に関する。より特には、本発明は生物医
学的又は製薬生成物を固相に吸着させ且つそれに
ウイルス及び／又は発熱原（Pyrogen）を不活性
化する薬剤を用いる処理を施すことにより該生成
物を汚染しているウイルス及び発熱原を不活性化
する方法に関する。 ＜従来の技術＞ 生物剤及び製薬製剤即ち生物医学的及び製薬生
成物は伝染性生物的汚染物例えばウイルス、及び
特に感染性肝炎ウイルス例えば肝炎ウイルスＢ、
及び非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス、を含有している可能
性のあることは良く知られている。ウイルスに依
る汚染は使用した源及びその製造時の環境の両方
に由来する可能性がある。 発熱原（発熱性物質）はリポ多糖体であり、発
熱の生起凝固機構の活性化及びシヨツクの誘発を
含めたさまざまの生物的活性を有する菌体外毒素
としても知られている。従つて、生物学的又は医
薬的用途向けの生成物から発熱性物質を除去する
ことが必須である。ウイルス及び／又は発熱原の
不活性化又破壊方法には熱、酸又はアルカリを用
いる処理、過、ゲル、イオン交換樹脂及びそれ
以外の様々のかゝる吸着性物質を用いた吸着によ
る除去が含まれる。これらの方法の殆んどは煩わ
しく、時間がかゝるか又は処理の過酷さによる生
成物の破壊を招く。 トライトン（Triton）、トウイーン（Tween）、
β−プロピオラクトン又は次亜塩素酸塩の様なウ
イルス又は発熱原不活性化剤を用いる簡単な処理
はウイルス及び／又は発熱性物質を不活性化させ
る結果を生じようが、然し不安定な蛋白質の部分
的変性を伴なう。蛋白質が変性されない場合でさ
えも、残留ウイルス不活性剤又は発熱原不活性化
剤の定量的除去は極めて困難であろうし、そして
その汚染が生物医学的又は製薬生成物を望ましか
らざるものとするであろう。ウイルス及び／又は
発熱原不活性化剤の使用の例は米国特許第
43143957号で、そこでは両親媒性化合物
（amphiphile）を溶液中で血漿誘導体と直接々触
させることに依り、血漿誘導体中の菌体外毒素を
破壊し且つ肝炎ウイルスを不活性するための両親
媒性化合物の使用が開示されている。処理後、血
漿蛋白質は両親媒性化合物から沈澱によつて分離
される。かゝる沈殿は沈降蛋白質及び最終生成物
から不活性化剤を完全に除去しないであろうし、
従つて医薬的に有害な及び／又は望ましからざる
不活性化剤を含有していよう。 ＜発明の構成＞ 本発明は、生物医学的又は製薬生成物中の発熱
原消滅又はウイルスの不活性化方法に於て、該方
法が 該生成物を固相に吸着させ；該固相に吸着した
該生成物をウイルス不活性化又は発熱原消滅剤と
接触させ；固相をウイルス不活性化又は発熱原消
滅剤から分離し；固相から不純物及び残留不活性
化又は発熱原消滅剤を除去し；且つ固相から生成
物を回収する諸工程を有することを特徴とする生
物医学的又は製薬生成物中の発熱原消滅又はウイ
ルスの不活性化方法である。 本発明の方法は生物医学的又は治療的目的並び
に非治療的実験目的のためにヒト及び動物体への
使用を対象とする生物医学分野での如何なる物質
にも利用し得る。 ＜態様の詳細＞ 本発明の方法を用いて発熱原（性）消滅する
（depyro−genate）か又はウイルスを無くするこ
とが出来る対象となる生物医学的生成物及び物質
には非限定的な例として：血液フラクシヨン例え
ば抗血友病因子Ａ（AHF、因子）、プロトロン
ビン・コンプレツクス（複合体）（因子、、
及び）、因子、因子、因子、因子、
蛋白質Ｃ、抗トロンビン、Ｃ−１エステラーゼ
阻害剤、フイブロネクチン、ガンマーグロブリ
ン、及びアルブミン（いずれもヒト又は動物源か
ら誘導されたものである）のそれぞれ及び組合わ
せ；動物源から誘導された生物的及び製薬生成物
例えばインシユリン、酵素、補酵素、抗体、及び
ホルモン：ヒト又は動物胎盤から誘導された生物
的生成物例えば血液フラクシヨン、及びワクチン が包含される。これらの生成物及び物質はさまざ
まの市販源からなる入手出来るか又は周知の調製
方法に依り製造出来る。例えば血液フラクシヨン
及び血液蛋白質は公知の技術例えば一例として米
国特許第2390074号及びザ・ジヤーナル・オブ・
アメリカン・ケミカル・ソサイヤテイー〔the
Journal of the American Chemical Society〕
Vol.68、p.459（1946）にコーン（Cohn）が記載
したアルコール分別法、に従つて分別に依りヒト
の血漿から得ることが出来る。これらの方法並び
に他の技術は“ザ・プラズマ・プロテインズ
（The Plasma Proteins〕”、第２版、Volume、
pp.548−550、アカデミツク・プレス、ニユーヨ
ーク、ニユーヨーク州〔Academic Press、New
York、N.Y.〕（1977）に要約されている。 本明細書中で使用する、該生物医学的又は製薬
生成物がその上に吸着される“固相
（Solidphase）”とはイオン交換体として使用され
る物質、アフイニテイークロマトグラフイーに使
用される樹脂、特定又は関連する抗原に対する抗
体を取付けてある樹脂、イオン交換体としてある
いは特定の物質を吸着出来る特定の膜媒体、又は
イオン交換体アフイニテイー樹脂として作用する
表面をつくり出す処理を受けたガラスビードを意
味する。 対象となる固相物質には以下のものが包含され
る： ａ イオン交換体、例えばDEAEセフアデツクス
〔DEAE Sephadex〕、QAEセフアデツクス、
CM−セフアデツクス、SP−セフアデツクス、
DEAEバイオゲルＡ〔DEAE Biogel〕Ａ、CM
−バイオゲルＡ、バイオゲルHTP、DEAEセ
ルロース： ｂ アフイニテイークロマトグラフイーに用いら
れる樹脂、例えば、阻害剤、酵素、補酵素又は
ホルモンの様な付着（取付け）リガンドを有す
るセフアローズ2B〔Sepharose2B〕、セフアロ
ーズ4B、セフアローズ6B、セフアローズCL−
2B、セフアローズCL−4B及びバイオゲルＡ−
15、付着リガンドは生物医学的又は製薬生成物
を吸着する能力があり、例えばセフアローズ樹
脂に取付けたヘパリンは抗トロンビンを吸着
する。付着リガンドは生成物中に存在する抗原
又は関連抗原に対する抗体であつても良い。こ
の例は抗血友病因子を吸着するためにセフアロ
ーズ樹脂に取付けた抗血友病因子関連抗原対応
抗体である。付着抗体は生物医学的又は製薬生
成物としての単離が望まれている抗原に対応す
る炭クーロン性又は多クーロン性抗体ともなり
得る： ｃ 特定の抗原に対する付着（単クーロン性又は
多クーロン性）抗体又は抗原自身を有する上記
ｂで記載した樹脂： ｄ イオン交換体として作用する特別の膜媒体例
えば、ゼータ・プレプカートリツジ〔Zeta−
Prep^TMcartridge〕、DEAE、QAE及びSP； ｅ イオン交換体として作用する表面をつくり出
す処理を施した調節した細孔のガラスビード、
例えばDEAE−CPG、CML−CPG：及び ｆ 対象となる生物製剤例えば阻害剤、酵素、補
酵素、ホルモン、抗体及び抗原を取付けた調節
した細孔のガラスビード。 本発明で使用されるウイルス不活性化及び発熱
原消滅剤は両親媒性化合物、有機溶媒、次亜塩素
酸塩又はβ−プロピオラクトンである。用語“両
親媒性化合物（Amphiphile）”は親水性の水溶性
基と疎水性の水に不溶の基の雙方を含有している
物質であり、そして一般にカチオン（性）、アニ
オン（性）、両性及び非イオン界面活性剤として
分類されている。カチオン型の剤にはエチレンオ
キシドと第４級アンモニウム化合物との長鎖アミ
ン縮合物、例えばセチルトリメチルアンモニウム
ブロマイド及びドデシルジメチルアンモニウムプ
ロマイドが包含される。適切なアニオン剤には石
けん、硫酸の脂肪族モノエステルの塩、例えばナ
トリウムラウリルサルフエート及びナトリウムプ
タデシルサルフエート、スルホン化芳香族化合
物、例えばアルキルベンゼンスルオン酸及びその
塩例えばトリデシルベンゼンスルホン酸及び、ド
デシルベンゼンスルホン酸のナトリウム及びアミ
ノ塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩例えばナ
トリウムブチルナフタレンスルホネート、スルホ
クエン酸塩例えばナトリウムジオクチルスルホサ
クシネート、及びＮ−アシル−Ｎ−アルキル脂肪
酸タウレートが包含される。非イオン剤には下記
の様に、(a)エトキシル化アルキルフエノール類、
(b)エトキシ化脂肪族アルコール類、(c)カルボン酸
エステル及び(d)カルボン酸アミドが包含される。 (a) エトキシル化アルキルフエノール非イオン界
面活性剤には、様々のアルキルフエノールのポ
リエチレンオキシド縮合物、特にモノアルキル
フエノール又はジアルキルフエノール（但し、
アルキル基は約６乃至約12の炭素原子を枝分れ
鎖又は特に直鎖の構造で有している）、例えば
オクチルクレゾール、オクチルフエノール又は
ノニルフエノール、とエチレンオキシドとの縮
合生成物であつて、而して該エチレンオキシド
がアルキルフエノール１モル当り約５乃至約25
モルのエチレンオキシドに相当する量で存在し
ている縮合生成物が包含される。 (b) ある特定のタイプのエトキシル化脂肪族アル
コール非イオン界面活性剤は、約８乃至18個の
炭素原子を直鎖又は枝分れ鎖で有している脂肪
族アルコール例えばオレイル又はセチルアルコ
ールと、エチレンオキシドとの縮合生成物であ
つて、該エチレンオキシドがアルコール１モル
当り約30乃至約60モルのエチレンオキシドに相
当する量で存在している縮合生成物である。 (c) 特定のタイプのカルボン酸エステル非イオン
界面活性剤は先ず、部分、例えばモノエステル
であり、脂肪及び樹脂酸例えば約８乃至約18個
の炭素原子のものと、多価アルコール例えばグ
リセリン、グリコール例えばモノ−、ジ−、テ
トラ−及びヘキサエチレングリコール、ソルビ
タン等との反応によつて形成されるモノエステ
ル；及び脂肪酸のヒドロキシル基に様々のモル
比のエチレンオキシドの直接付加に依つて形成
される類似化合物である。第２のタイプのカル
ボン酸エステルは脂肪又は樹脂酸の部分、例え
ばエチレンオキシドとのモノエステルであり、
例えばポリオキシエチレンソルビタン及びソル
ビトールの脂肪又は樹脂酸エステル、例えばポ
リオキシエチレンソルビタンモノトール油エス
テルである。これらは、例えば１モル当り約３
乃至約80個のオキシエチレン単位及び約８乃至
約18個の炭素原子の脂肪又は樹脂酸を含有し得
る。使用可能な天然産脂肪酸混合物の例にはヤ
シ油及び獣脂からのものがあり一方単一脂肪酸
の例はドデカン酸及びオレイン酸がある。 (d) ある特定のタイプのカルボン酸アミド非イオ
ン界面活性剤は約８乃至約18個の炭素原子のア
シル鎖を有する脂肪酸のアンモニア、モノエタ
ノール及びジエタノールアミドである。 両性剤にはドデシルアラニン、Ｎ−ドデシル
アミノエタンスルホン酸、パルミトイルリゾレ
シチン及びドデシル−Ｎ−ベタインが包含され
る。 本発明の方法で使用出来る勇気溶媒には、ジ
メチルエーテル、ジエチルエーテル、エチルプ
ロピルエーテル、メチル−ブチルエーテル、メ
チルイソプロピルエーテル、メチルイソブチル
エーテル、クロムホルム、メタノール、エタノ
ール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−
ブダノール、イソブタノール、ｎ−ペンタノー
ル及びイソペンタノールが包含される。 さて本発明のプロセス工程を特に説明する
と、処理を受ける生成物は先ず固相上に吸着さ
れ、次にかく吸着された生成物を液相又は気相
中にウイルス又は発熱原不活性化剤でそれを完
全に不活性化し発熱原性を消滅させるのに充分
な時間処理する。ウイルス又は発熱原不活性化
剤は一般に、生成物の容積に対して0.1％乃至
50％、好ましくは0.5％乃至20％、そして最も
好ましくは１％乃至10％の量を存在させる。不
活性化剤が液相中にある場合には溶液のPHを約
５乃至９及び好ましくは約６乃至８にする必要
がある。不活性化を完了するのに必要な時間
は、一般に２分乃至16時間、より好ましくは１
乃至10時間である。不活性化方法は約０℃乃至
50℃の範囲の温度で実施できる；不活性化剤が
気態である場合には温度範囲が一般に低く、一
方、液体不活性化剤は室温又はそれに近い温度
で使用する。気態の不活性化剤は固相に吸着し
た生成物を処理するのにエーロゾル散布として
又はそのまゝ使用できる。 好ましくは固相に吸着させた生物医学的又は
製薬生成物の処理を、固相に吸着させた生成物
を不活性化剤を含有する緩衝溶液で処理するこ
とに依つて、ウイルス又は発熱原不活性化剤に
よる処理を実施する。処理は固相を不活性化剤
を含有する緩衝溶液中に浸漬又はソーキングす
ることに依り、カラム操作又はバツチ形式で実
施する。適切な緩衝溶液には；燐酸塩、クエン
酸塩、トリスアミノメタン、グリシン又は処理
を施す生物医学的又は製薬生成物に有害な相互
作用をしないその他の一切の緩衝剤が包含され
る。 不活性化工程が完了して、液又は気相を固相
から分離することによつて、不活性化剤を除去
する。液相はカラムの使用、遠心分離又は過
によつて分離出来る。分離を完了した時、固相
を従前の不活性化の工程で使用した緩衝剤溶液
で良く洗浄し、該緩衝溶液は0.05M乃至2.0M、
及びより好ましくは0.1M乃至0.25Mのイオン
強度、及び約５乃至９、及びより好ましくは約
６乃至８のPHを有する。洗浄は固相に吸着した
不純物を除去し且つ発熱原消滅又はウイルスの
不活性化に使用した薬剤を除去する。これは好
ましくはカラム又はバツチ式操作によつて達成
される。不純物の除去及び不活性化剤の定量的
除去には同一の緩衝剤の溶液が好ましいが、他
の溶液例えば燐酸塩、クエン酸塩、トリス、グ
リシン又は生物医学的又は製薬生成物と相互作
用しないその他の緩衝剤の溶液で且つ同様なイ
オン強度を有するものも使用し得る。 燐酸塩、クエン酸塩、トリスアミノメタン、
グリシン又は処理中の生物医学的又は製薬生成
物に有害な相互作用をしないその他の緩衝液の
溶液で且つ0.15M乃至3.5M、及び好ましくは
0.5M乃至2.5Mのイオン強度、及び約５乃至
９、及び好ましくは約６乃至８のPHを有する緩
衝溶液を用いて、次に純粋な生物医学的又は製
薬生成物を固相から溶離する。塩化ナトリウ
ム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ε−
カプロン酸の溶液又は上述の緩衝液中のクエン
酸ナトリウムも純粋生成物の溶離に使用出来
る。 本発明の特質とその実施方法をより完全に例示
するために、以下の実施例を示す： 実施例 １ プロトロンビン・コンプレツクス（複合体）単
離に用いるヒトの血漿フラクシヨン、寒冷沈殿物
の少い血漿、をDEAE−セフアデツクスＡ−50
（フアルマシア〔Pharmacia〕）に吸着させる。
プロトロンビン・コンプレツクス蛋白質を吸着さ
せて持つたイオン交換体を次にトリトン（³H）
で放射化標識したトライトンＸ−100（毎分167340
カウントの合計量を与える³H放射化標識トライ
トンＸ−100を含有する２％トライトンＸ−100）
を用いて処理した。トライトンＸ−100溶液を次
に過によつて分離し、DEAE−セフアデツクス
を緩衝溶液（0.01Mクエン酸ナトリウム、0.2M
塩化ナトリウム、PH7.0）を用いて３回洗浄する。
その洗浄中にすべてのトライトンＸ−100が洗い
去られる。その後フロトロンビン・コンプレツク
スをより高いイオン高度（0.01Mクエン酸ナトリ
ウム、2.0M塩化ナトリウム、PH7.0）の緩衝液を
用いて溶離する。この溶離液は表１に示す様にト
ライトンＸ−100が無いことが明らかとなる（表
１に示す様に99.99％以上の処理剤が除去され
る）、従つてウイルス又は発熱原の不活化に使用
した処理剤は定量的に除去され、そして最終生成
物には処理剤が含まれていない。

【表】 実施例 ２ （寒冷型沈殿物を除去した血漿の）プロトロン
ビン・コンプレツクス単離に用いる血漿フラクシ
ヨンをシンドビスウイルス又はビシキユラー・ス
トロマチチスウイルス（VSV）〔Sindbis or
Vesicular Stromatitis virus〕を加える。次に
これをDEAE−セフアデツクスに吸着させて２％
トライトンＸ−100溶液で30分間処理してウイル
スを不活性化する。イオン交換体を過によつて
次にトライトン・Ｘ−100溶液から分離して、
0.01Mクエン酸ナトリウム及び0.2M塩化ナトリ
ウムより成りPH7.0の緩衝液を用いて３回洗浄し、
残留トライトンＸ−100及びDEAE−セフアデツ
クスに非特異的に結合している不純物を除去す
る。プロトロンビン・コンプレツクスをより高い
イオン高度（2M塩化ナトリウム、0.01Mクエン
酸ナトリウム、PH7.0）の緩衝液によつて溶離し、
生理的条件に透析し、限外過する。対照として
それぞれのウイルスを血漿フラクシヨンに加えて
後、実験を繰返す。然しDEAE−セフアデツクス
にプロトロンビン・コンプレツクスを吸着させて
後の、２％トライトンＸ−100を用いる処理は対
照実験では行なわない。 最終のプロトロンビン・コンプレツクス、原料
血漿フラクシヨン、及び中間フラクシヨンをイ
ー・アール・プツフエルコン及びエツチ・エス・
ハンター〔E.R.Pfefferkon and H.S.Hunter〕
（ヴアロロジー〔Virology〕20、433−445、
1963）によつて記述されたものに類似し、且つ以
下に要約した方法によつてウイルスの活性をアツ
セイした。 チツク・エムブリオ・フイブロプラストス
〔Chick embryo fibroblasts〕（CEF）を100mmプ
ラスチツク皿に種付けして合会する迄生長させた
（48hr.）。10％胎児子牛血清を含む最小必須媒体
（MEM）中で試料の連続10倍稀釈及び1.0ml植付
けを培養媒体がすでにドレインしてあるレプリ
カ・プレートに行なつた。プレートを1hr、37℃、
５％CO₂で培養し、その後、接種物をアスピレー
シヨンし、そして10ml／プレートのオーバーレイ
媒体を加えた。オーバーレイ媒体は10％熱不活性
化胎児子牛血清と１％アガロースを含むMEMか
ら成つていた。オーバーレイを固化させ、その後
培養物を37℃、５％CO₂で、約24hr培養した。こ
の時点で細胞病原性〔cytopathology〕がボジテ
イブな培養物中で認められた燐酸塩緩衝食塩水中
の0.002％ニユートラル・レツド溶液を次に加へ、
培養物を更に4hr培養した。この時期の後で、プ
ラク（plagues）を計数し、ウイルス活性をプラ
ク形成単位（PFU）を用いて表わした。表２及
び３は本発明記載の方法を用いトライトンＸ−
100の処理を示し、シンドビス（Sindbis）及び
VSVのウイルス活性は対照実験に比して、それ
ぞれ１／2.07×10³及び１／8.48×10⁴に減少していた。

【表】 る。

【表】 実施例 ３ 寒冷型沈殿物を少なくした250mlの血漿の菌体
外毒素（endotoxin）を加えて100nｇ／mlの濃度
とする。この血漿を次に予備膨潤させた４ｇのセ
フアデツクスと撹拌して因子を含むプロトロン
ビン・コンプレツクス因子類を樹脂に吸着させ
る。次にこの樹脂を、PH7.0の0.01Mクエン酸ナ
トリウム、0.2M塩化ナトリウム中の２％トライ
トンＸ−100溶液を用いて処理する。その後、樹
脂を３回、PH7.0の0.01Mクエン酸ナトリウム、
0.2M塩化ナトリウム溶液の85mlで洗浄する。次
に因子をPH7.0の0.01Mクエン酸ナトリウム、
2M塩化ナトリウム溶液に依り樹脂から溶離し、
透析し、そしてPH7.0の0.13M塩化ナトリウム、
0.01Mクエン酸ナトリウムに対して限外過して
５mlの容積とする。対照実験では因子をDEAE
−セフアデツクスに吸着させて後の、トライトン
Ｘ−100を用いた処理を行なわない。かくして得
た最終のプロトロンビン・コンプレツクス濃縮物
を因子の効能、凝固因子活性化及び菌体外毒素
についてアツセイする。因子は、（トカンチン
ス及びカツエル、ブロツド・コーアギユレーシヨ
ン、ヘモラハジー・アンド・トロンボシス、ゲ
ン・アンド・ストラトン、ニユーヨーク
〔Tocantins and Kazel、Blood Coagulation、
Hemorrhage and Thrombosis、Grune and
Stratton、New York〕1964p.120中の）バロウ
及びグラハム〔Barrow and Graham〕の一段
法を多少改良した方法を用いてアツセイし、活性
化はキングトン等（Kingdon and coworkers〕
（Thromb.Diath.Haemorrh.33、617−631、1975）
のノンアクチベーテツド・パーシヤル・トロンボ
プラスチン・タイム・テスト〔Nonactivated
Partial Thromboplastin Time Test〕
（NAPTT）により測定し、菌体外毒素はレビン
等〔Levin and coworkers〕（Ann.Intern.
Med.76：１、1972）が報告したLALテストの改
良法によつて測定する。 表４に示した結果は、本発明の方法を用いた２
％トライトンＸ−100を用いた処理は実質上因子
の効能に影響を与えず、プロトロンビン・コン
プレツクス因子は（非活性化状態の）チモーゲン
型のままであり、菌体化毒素の濃度は70nｇ／ml
だけ減少した。

【表】 実施例１−３はDEAE−セフアデツクス樹脂を
固相として、そしてトライトンＸ−100をウイル
ス不活性化又は発熱原消滅剤として使用すると、
プロトロンビン・コンプレツクスの蛋白質、例え
ば因子は、発熱原が消滅し、そして汚染したウ
イルスの努力が涸渇させられ、そして最終生成物
は残存量のトライトンＸ−100が無い結果となる
ことを示している。 実施例 ４ リシン−セフアローズ固相上でのトライトンＸ
−100を用いた処理に依るプラスミノーゲンの
発熱原性消滅 血漿を20nｇ／mlの最終濃度で菌体外毒素で汚染
し、次にリシン−セフアローズ樹脂から成るカラ
ムに加える。プラスミノーゲンはカラムに吸着さ
れる。カラム中で、次に樹脂を２％トライトンＸ
−100を用いて処理しその発熱原を消滅させる。
残存トライトンは次にPH7.3の0.3M燐酸塩緩衝液
を用いた洗浄に依り除去し、プラスミノーゲンは
0.2Mε−アミノカプロン酸をPH7.3の0.05M燐酸塩
緩衝液に加えた溶液により溶離させる。最後に、
溶離液をPH7.3の燐酸塩緩衝食塩溶液に対して透
析する、そして0.1nｇ／ml以下の菌体外毒素を持
つ精製したプラスミノーゲン調製物が得られる。 実施例 ５ ヘパリン−セフアローズ、固相上での処理に依
る、抗トロンビン（アンチトロンビン）の単
離中の、ベシキユラー・ストマチス・ウイルス
〔Vesicular Stomatitis Virus〕（マーカー）の
不活性化 ヘパリンをセフアローズに取付けて、カラムに
充填した。寒冷型沈殿物を除いた血漿をVSVで
５×10⁶全PFUの力価に汚染してカラムを通す。
抗トロンビンが固相に吸着され、次に燐酸塩緩
衝食塩水中の２％トライトンＸ−100を用いて処
理しウイルスを不活性化する。次にカラムをPH
7.3の燐酸塩緩衝液中の0.5M塩化ナトリウムで良
く洗つて残留トライトンＸ−100及び固相に非特
異的に結合している不純物を除去する。その後、
抗トロンビンをPH7.3の燐酸塩緩衝液中の2M塩
化ナトリウムを用いて溶離させる。抗トロンビン
をPH7.3の燐酸塩緩衝食塩水に対して透析して
ウイルスが0.25PFU／ml以下に減少した最終の精
製抗トロンビン製剤を得る。 実施例 ６ 因子の単離時に、セフアローズに取付けた因
子：Ｒリガンド対抗単クーロン性抗体より成
る固相でのウイルスの不活性化 因子：RAg対抗単クーロン性抗体をセフア
ローズ樹脂に取付け、カラムに充填する。寒冷型
沈殿物の懸濁液を、対照実験として、大略５×
10⁷PFUの濃度にVSVで汚染する。次にこれをカ
ラムに通し、そこでは（因子：Ｃ抗原及び因子
：Ｒ抗原のサブユツトから成る）因子分子は
分子の因子：Ｒ抗原部分を通して吸着する。樹
脂を次に、PH7.0の100ｍＭリシン、20ｍＭヒスチ
ジン、0.15M塩化ナトリウムより成る洗浄緩衝液
中の２％トウイーン80溶液で処理しウイルスを不
活性化する。残留トウイーン80はカラムを上述の
洗浄緩衝液で良く洗つて除去する。因子分子の
因子：Ｃ部分を次に洗浄緩衝液中の0.25M塩化
カルシウムより成る溶離緩衝液によつて脱着させ
る。因子：Ｃ抗原を脱着させたら、残る因子
：Ｒ抗原も上述の洗浄緩衝液中の3Mチオシア
ン酸ナトリウムで脱着させる。因子：Ｃ及び因
子Ｒ溶液を別々に濃縮し、通常の生理食塩水に
対して透析し、実質上ウイルスの無い、即ち
0.25PFU／ml、因子：Ｃ（凝固）及び因子：
Ｒ（フオン・ウイルブランド〔Von
Willebrand〕）製剤を得る。 実施例 ７ 細孔ガラスCPG−DEAEより成る固相でのト
ライトンＸ−100を用いた処理による、ウイル
スの無い蛋白質Ｃの単離 マーカーウイルス、例えばVSVで５×10⁶全
PFUの濃度に汚染した寒冷型沈殿物を除いた血
漿をCPG−DEAEを充填したカラムに通す。蛋
白質Ｃがカラムに吸着され、これをPH7.0の
0.01Mクエン酸ナトリウム、0.2M塩化ナトリウ
ムの洗浄緩衝液中の２％トライトンＸ−100を用
いて処理しマーカーウイルスを不活性化する。残
留トライトンＸ−100及び他の不純物はカラムを
良く洗浄緩衝液で洗つて除く。蛋白質Ｃを次にカ
ラムから、PH６の0.25Mクエン酸ナトリウム、
0.55M塩化ナトリウムにより溶離させる。溶離液
を次に通常の生理的食塩水溶液に対して透析し
て、マーカーウイルス、VSVの無い
（0.25PFU／ml以下）蛋白質Ｃ製剤を得る。 本発明の開示を読めば、当業者にとつて本発明
の精神と範囲を離れること無く、様々の改変が可
能であろう；かゝる改変はすべて特許請求されて
いる範囲に属するものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 生物医学的又は製薬生成物中の発熱原消滅又
   はウイルス不活性化方法に於て、該方法が 該生成物を固相に吸着させ；該固相に吸着した
   該生成物をウイルス不活性化又は発熱原消滅剤と
   接触させ；固相をウイルス不活性化又は発熱原消
   滅剤から分離し；固相から不純物及び残留不活性
   化又は発熱原消滅剤を除去し；且つ固相から生成
   物を回収する諸工程を有することを特徴とする生
   物医学的又は製薬生成物中の発熱原消滅又はウイ
   ルス不活性化方法。 ２ 該固相がイオン交換樹脂である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３ 該固相が生物医学的又は製薬生成物を吸着し
   得るリガンドを取付けたアフイニテイー樹脂であ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 該リガンドが阻害剤、酵素、補酵素又はホル
   モンである特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ 該リガンドがヘパリンである特許請求の範囲
   第４項記載の方法。 ６ 該固相が単クーロン性又は多クーロン性抗体
   を取付けたアフイニテー樹脂である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ７ 該抗体が抗血友病因子抗原に対する抗体であ
   る特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８ 該固相がイオン交換又はアフイニテイー作用
   を行なうのに適する調節した細孔のガラスビード
   又は合成膜である特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ９ 調節した細孔のガラスビード又は合成膜を生
   物医学的又は製薬生成物を吸着し得る薬剤を用い
   て処理し、該薬剤が阻害剤、酵素、補酵素、ホル
   モン、抗体又は抗原である特許請求の範囲第８項
   記載の方法。 １０ ウイルス不活性化又は発熱原性消滅剤が両
   親媒性化合物、有機溶媒、次亜塩素酸塩、β−プ
   ロピオラクトン又はその混合物である特許請求の
   範囲第１項乃至第９項のいずれかに記載の方法。 １１ 両親媒性化合物がアニオン性、カチオン
   性、両性又は非イオン性である特許請求の範囲第
   １０項記載の方法。 １２ 該有機溶媒がジメチルエーテル、ジエチル
   エーテル、エチルプロピルエーテル、メチルブチ
   ルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチ
   ルイソブチルエーテル、クロロホルム、メタノー
   ル、エタノール、プロパノール、ブタノール又は
   ベンタノールである特許請求の範囲第１０項又は
   第１１項記載の方法。 １３ ウイルス不活性化又は発熱原消滅剤が５乃
   至９のPH及び0.05乃至2.0Mのイオン強度を持つ
   た緩衝溶液中に入れてあり、而して緩衝溶液がク
   エン酸塩、燐酸塩、硼酸塩、酢酸塩、重炭酸塩、
   コハク酸塩、マレイン酸塩、フタル酸塩、イミダ
   ゾール、トリスアミノメタン、グリシン、リシ
   ン、ヒスチジン又はその混合物から選ばれた緩衝
   剤を含有している特許請求の範囲第１項乃至第１
   ２項のいずれかに記載の方法。 １４ ウイルス不活性化又は発熱原消滅剤が気態
   又は液態である特許請求の範囲第１項乃至第１３
   項のいずれかに記載の方法。 １５ 過、遠心分離に依り又はカラムに依つ
   て、固相をウイルス不活性化又は発熱原消滅剤か
   ら分離する特許請求の範囲第１項乃至第１４項の
   いずれかに記載の方法。 １６ 不純物及び残留不活化又は発熱原消滅剤を
   該固相の緩衝溶液を用いる洗浄により除去し、而
   して該緩衝溶液がクエン酸塩、燐酸塩、硼酸塩、
   酢酸塩、重炭酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、
   フタル酸塩、イミダゾール、トリスアミノメタ
   ン、グリシン、リシン、ヒスチジン又はその混合
   物から選ばれた緩衝剤を含有し、該緩衝溶液が５
   乃至９のPH及び0.05乃至2.0Mのイオン強度を有
   している特許請求の範囲第１項乃至第１５項のい
   ずれかに記載の方法。 １７ 生成物を固相から緩衝溶液又は脱離剤を用
   いる溶離によつて回収し、而して緩衝溶液がクエ
   ン酸塩、燐酸塩、硼酸塩、酢酸塩、重炭酸塩、コ
   ハク酸塩、マレイン酸塩、フタル酸塩、イミダゾ
   ール、トリスアミノメタン、グリシン、リシン、
   ヒスチジン又はその混合物から選ばれた緩衝剤を
   含有し、そして脱離剤が塩化ナトリウム、塩化カ
   ルシウム、塩化マグネシウム、ε−アミノカプロ
   ン酸又はクエン酸ナトリウム及びその混合物であ
   り、緩衝溶液が５乃至９のPH及び0.15乃至3.5M
   のイオン強度を有している特許請求の範囲第１項
   乃至第１６項のいずれにか記載の方法。 １８ 生物医学的又は製薬生成物がヒト又は動物
   胎盤から誘導された、あるいは組換えDNAによ
   り又は遺伝子スプライシング法により調製された
   血漿蛋白質、酵素、補酵素、ホルモン、インシユ
   リンである特許請求の範囲第１項乃至第１７項の
   いずれかに記載の方法。