JPH0753403A - ウロキナーゼ前駆体の加熱処理方法 - Google Patents
ウロキナーゼ前駆体の加熱処理方法Info
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- JPH0753403A JPH0753403A JP5207735A JP20773593A JPH0753403A JP H0753403 A JPH0753403 A JP H0753403A JP 5207735 A JP5207735 A JP 5207735A JP 20773593 A JP20773593 A JP 20773593A JP H0753403 A JPH0753403 A JP H0753403A
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- urokinase
- urokinase precursor
- precursor
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ウロキナーゼ前駆体含有水溶液をｐＨ４．５
〜６で加熱処理することを特徴とするウロキナーゼ前駆
体の加熱処理方法。 【効果】 溶液中に夾雑する可能性のある微生物の感染
性を効果的に不活化することができる。ｐＨ４．５〜６
で加熱処理を行うことにより、加熱処理時のウロキナー
ゼ前駆体の活性低下を抑制することができる。
〜６で加熱処理することを特徴とするウロキナーゼ前駆
体の加熱処理方法。 【効果】 溶液中に夾雑する可能性のある微生物の感染
性を効果的に不活化することができる。ｐＨ４．５〜６
で加熱処理を行うことにより、加熱処理時のウロキナー
ゼ前駆体の活性低下を抑制することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウロキナーゼ前駆体含
有水溶液を、当該水溶液中に夾雑する可能性のある微生
物を不活化するために加熱処理する方法に関する。
有水溶液を、当該水溶液中に夾雑する可能性のある微生
物を不活化するために加熱処理する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】ヒト腎細胞から分泌されるウロキナーゼ前
駆体は、それ自身では線溶活性を発現しないが、プラス
ミン等のプロテイナーゼの作用を受けるとウロキナーゼ
に変換して著しい線溶活性を発現する。ウロキナーゼ前
駆体は、フィブリンに対する親和性が高く、血漿中のフ
ィブリノーゲンに作用（分解）することなく、血栓を構
成するフィブリンに到達し、血栓中の微量のプラスミン
の作用により線溶活性を発現する（特開昭６０−６２９
８１号公報参照）。即ち、ウロキナーゼ前駆体は血栓部
位に限定した線溶を惹起させ、選択的かつ効率的に血栓
を溶解する特性を有するため、血管栓塞疾患の治療剤と
して有望視され、既に一部の適応症において臨床使用さ
れている。
駆体は、それ自身では線溶活性を発現しないが、プラス
ミン等のプロテイナーゼの作用を受けるとウロキナーゼ
に変換して著しい線溶活性を発現する。ウロキナーゼ前
駆体は、フィブリンに対する親和性が高く、血漿中のフ
ィブリノーゲンに作用（分解）することなく、血栓を構
成するフィブリンに到達し、血栓中の微量のプラスミン
の作用により線溶活性を発現する（特開昭６０−６２９
８１号公報参照）。即ち、ウロキナーゼ前駆体は血栓部
位に限定した線溶を惹起させ、選択的かつ効率的に血栓
を溶解する特性を有するため、血管栓塞疾患の治療剤と
して有望視され、既に一部の適応症において臨床使用さ
れている。
【０００３】アルブミン、血液凝固因子などの血漿分画
製剤では、ウィルス性肝炎などの微生物による感染症を
防止する目的で、微生物の不活化処理が行われている。
アルブミン製剤の場合、６０℃、１０時間の加熱処理に
付すことにより、微生物の感染性が不活化された臨床上
安全性の高い製剤が供給されている。ウロキナーゼ前駆
体製剤の場合は、製造工程中に夾雑する可能性のある微
生物の感染性を不活化する目的で加熱処理に付すことが
望ましい。しかしながら、加熱処理は微生物の不活化に
は有効であるが、一方で蛋白質の活性低下をきたすとい
う問題点がある。
製剤では、ウィルス性肝炎などの微生物による感染症を
防止する目的で、微生物の不活化処理が行われている。
アルブミン製剤の場合、６０℃、１０時間の加熱処理に
付すことにより、微生物の感染性が不活化された臨床上
安全性の高い製剤が供給されている。ウロキナーゼ前駆
体製剤の場合は、製造工程中に夾雑する可能性のある微
生物の感染性を不活化する目的で加熱処理に付すことが
望ましい。しかしながら、加熱処理は微生物の不活化に
は有効であるが、一方で蛋白質の活性低下をきたすとい
う問題点がある。
【０００４】例えばウロキナーゼの場合、水中において
６０℃、１０時間加熱処理するとウロキナーゼの活性は
ほとんど完全に失われる。ウロキナーゼの失活を防止す
るために、ｐＨ６〜８の条件下で加熱処理する方法が特
公昭６１−４０３９２号公報に記載されている。
６０℃、１０時間加熱処理するとウロキナーゼの活性は
ほとんど完全に失われる。ウロキナーゼの失活を防止す
るために、ｐＨ６〜８の条件下で加熱処理する方法が特
公昭６１−４０３９２号公報に記載されている。
【０００５】また特開平２−３１１４２４号公報には、
ウロキナーゼまたはウロキナーゼ前駆体の液状中での安
定性（特に加熱安定性および長期保存中の安定性）を改
善するために、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ンおよび二塩基酸から選ばれる安定化剤を添加すること
が記載されている。同公報の実験例には、ウロキナーゼ
含有水溶液を安定化剤の存在下、ｐＨ６〜７で６０℃、
２０時間加熱処理する方法が記載されている。
ウロキナーゼまたはウロキナーゼ前駆体の液状中での安
定性（特に加熱安定性および長期保存中の安定性）を改
善するために、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ンおよび二塩基酸から選ばれる安定化剤を添加すること
が記載されている。同公報の実験例には、ウロキナーゼ
含有水溶液を安定化剤の存在下、ｐＨ６〜７で６０℃、
２０時間加熱処理する方法が記載されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ウロ
キナーゼ前駆体の活性低下を抑制し、夾雑する可能性の
ある微生物を不活化し得るウロキナーゼ前駆体の加熱処
理方法を提供することにある。
キナーゼ前駆体の活性低下を抑制し、夾雑する可能性の
ある微生物を不活化し得るウロキナーゼ前駆体の加熱処
理方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく研究を重ねた結果、加熱処理をｐＨ４．５
〜６の条件下で行うことにより、ウロキナーゼ前駆体の
活性低下が抑制され、かつ微生物の感染性が効果的に不
活化されることを見出し本発明を完成するに到った。す
なわち、本発明はウロキナーゼ前駆体含有水溶液をｐＨ
４．５〜６で加熱処理することを特徴とするウロキナー
ゼ前駆体の加熱処理方法である。
を解決すべく研究を重ねた結果、加熱処理をｐＨ４．５
〜６の条件下で行うことにより、ウロキナーゼ前駆体の
活性低下が抑制され、かつ微生物の感染性が効果的に不
活化されることを見出し本発明を完成するに到った。す
なわち、本発明はウロキナーゼ前駆体含有水溶液をｐＨ
４．５〜６で加熱処理することを特徴とするウロキナー
ゼ前駆体の加熱処理方法である。
【０００８】本発明で使用されるウロキナーゼ前駆体
は、そのままではほとんど線溶活性を有しないが、プラ
スミン等の酵素処理により、ウロキナーゼに変換されて
線溶活性を示すものである。また、フィブリン存在下で
も若干の線溶活性を示すものである。本発明で使用され
るウロキナーゼ前駆体のまず第一の代表例は、分子量５
００００〜５５０００で、一本鎖のペプチド結合構造を
有するものである。このようなウロキナーゼ前駆体とし
ては、たとえば構成アミノ酸４１１個のものが挙げられ
る（アミノ酸配列は特開昭６０−６２９８１号公報参
照）。
は、そのままではほとんど線溶活性を有しないが、プラ
スミン等の酵素処理により、ウロキナーゼに変換されて
線溶活性を示すものである。また、フィブリン存在下で
も若干の線溶活性を示すものである。本発明で使用され
るウロキナーゼ前駆体のまず第一の代表例は、分子量５
００００〜５５０００で、一本鎖のペプチド結合構造を
有するものである。このようなウロキナーゼ前駆体とし
ては、たとえば構成アミノ酸４１１個のものが挙げられ
る（アミノ酸配列は特開昭６０−６２９８１号公報参
照）。
【０００９】上記ウロキナーゼ前駆体の由来には特に制
限はなく、たとえば、細胞培養法、遺伝子工学法などに
より調製されたものが例示される。細胞培養法は特開昭
６０−６２９８１号公報等に、遺伝子工学法は特開昭６
０−１８０５９１号、同６１−１７７９８７号、同６２
−１４９６２５号、同６３−１０５６７５号公報等に開
示されている。
限はなく、たとえば、細胞培養法、遺伝子工学法などに
より調製されたものが例示される。細胞培養法は特開昭
６０−６２９８１号公報等に、遺伝子工学法は特開昭６
０−１８０５９１号、同６１−１７７９８７号、同６２
−１４９６２５号、同６３−１０５６７５号公報等に開
示されている。
【００１０】本発明でいうウロキナーゼ前駆体は上記の
ものに限定されず、その誘導体をも包含する概念であ
る。かかる誘導体としてはウロキナーゼ前駆体のエピダ
ーマルグロースファクタードメインの全領域もしくはそ
の一部を欠失、または該全領域もしくはその一部を他の
アミノ酸残基で置換されている蛋白質分子等が挙げられ
る（特開昭６３−１４６７８９号公報、特開平３─８７
１８０号公報、同３−８７１８１号公報等）。従って、
特に言及しない限り、本明細書においてウロキナーゼ前
駆体とはウロキナーゼ前駆体自体および上記のごときウ
ロキナーゼ前駆体誘導体をも意味するものである。この
ウロキナーゼ前駆体誘導体は、通常分子量４万〜５万５
千程度でウロキナーゼ前駆体自体と同様に一本鎖ペプチ
ド結合構造を有する。また、その線溶活性の発現様式も
上記ウロキナーゼ前駆体自体と同じである。この誘導体
は、たとえば遺伝子工学的な手法により調製される（特
開昭６０−１４６７８９号公報参照）。また、ウロキナ
ーゼ前駆体にアネキシンが結合した複合体もウロキナー
ゼ前駆体誘導体の一種として例示される（ＰＣＴ国際公
開 ＷＯ９２／１９２７９等）。
ものに限定されず、その誘導体をも包含する概念であ
る。かかる誘導体としてはウロキナーゼ前駆体のエピダ
ーマルグロースファクタードメインの全領域もしくはそ
の一部を欠失、または該全領域もしくはその一部を他の
アミノ酸残基で置換されている蛋白質分子等が挙げられ
る（特開昭６３−１４６７８９号公報、特開平３─８７
１８０号公報、同３−８７１８１号公報等）。従って、
特に言及しない限り、本明細書においてウロキナーゼ前
駆体とはウロキナーゼ前駆体自体および上記のごときウ
ロキナーゼ前駆体誘導体をも意味するものである。この
ウロキナーゼ前駆体誘導体は、通常分子量４万〜５万５
千程度でウロキナーゼ前駆体自体と同様に一本鎖ペプチ
ド結合構造を有する。また、その線溶活性の発現様式も
上記ウロキナーゼ前駆体自体と同じである。この誘導体
は、たとえば遺伝子工学的な手法により調製される（特
開昭６０−１４６７８９号公報参照）。また、ウロキナ
ーゼ前駆体にアネキシンが結合した複合体もウロキナー
ゼ前駆体誘導体の一種として例示される（ＰＣＴ国際公
開 ＷＯ９２／１９２７９等）。
【００１１】ウロキナーゼ前駆体の精製の度合いは特に
限定されないが、比活性が、合成基質法で測定した場合
にそのままでは活性を示さず、フィブリン存在下で１０
０〜１０００ＵＫ国際単位（以下、単にＩＵと表示）／
ｍｇ程度、プラスミン処理時に８万〜２０万ＩＵ／ｍｇ
程度のものが例示される。
限定されないが、比活性が、合成基質法で測定した場合
にそのままでは活性を示さず、フィブリン存在下で１０
０〜１０００ＵＫ国際単位（以下、単にＩＵと表示）／
ｍｇ程度、プラスミン処理時に８万〜２０万ＩＵ／ｍｇ
程度のものが例示される。
【００１２】ウロキナーゼ前駆体の加熱処理は、ｐＨ
４．５〜６、好ましくはｐＨ４．５〜５．５、さらに好
ましくはｐＨ５．３〜５．５の水溶液中で行う。このよ
うな水溶液としてはリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、
マレイン酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液などの緩衝液が使用
され、好適にはリン酸緩衝液が使用される。緩衝液の濃
度は０．０１〜０．５Ｍ程度が好適である。加熱温度は
５０℃〜７０℃、好ましくは５５℃〜６５℃、さらに好
ましくは約６０℃である。加熱時間は１０分間〜２０時
間程度、好ましくは５〜１５時間、さらに好ましくは約
１０時間である。加熱処理溶液中のウロキナーゼ前駆体
の濃度は３万〜３００万ＩＵ／ｍｌ、好ましくは１０万
〜１００万ＩＵ／ｍｌである。
４．５〜６、好ましくはｐＨ４．５〜５．５、さらに好
ましくはｐＨ５．３〜５．５の水溶液中で行う。このよ
うな水溶液としてはリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、
マレイン酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液などの緩衝液が使用
され、好適にはリン酸緩衝液が使用される。緩衝液の濃
度は０．０１〜０．５Ｍ程度が好適である。加熱温度は
５０℃〜７０℃、好ましくは５５℃〜６５℃、さらに好
ましくは約６０℃である。加熱時間は１０分間〜２０時
間程度、好ましくは５〜１５時間、さらに好ましくは約
１０時間である。加熱処理溶液中のウロキナーゼ前駆体
の濃度は３万〜３００万ＩＵ／ｍｌ、好ましくは１０万
〜１００万ＩＵ／ｍｌである。
【００１３】ウロキナーゼ前駆体の加熱処理は、安定化
剤の存在下で行ってもよい。安定化剤としては、アルブ
ミン、ゼラチン、無機塩（例えば、塩化ナトリウム、リ
ン酸ナトリウム）、有機酸またはその塩（例えば、クエ
ン酸、マレイン酸、リンゴ酸またはそれらの塩）、塩基
性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジ
ン）、トリス−塩酸などが例示される。安定化剤の添加
量は、アルブミンの場合１〜１０ｗ／ｖ％、ゼラチンの
場合０．１〜１ｗ／ｖ％、無機塩の場合０．１〜５ｗ／
ｖ％、有機酸またはその塩の場合０．０１〜０．５Ｍま
たは０．１〜５ｗ／ｖ％、塩基性アミノ酸の場合０．１
〜５ｗ／ｖ％、トリス−塩酸の場合０．０１〜０．５Ｍ
程度が好適である。
剤の存在下で行ってもよい。安定化剤としては、アルブ
ミン、ゼラチン、無機塩（例えば、塩化ナトリウム、リ
ン酸ナトリウム）、有機酸またはその塩（例えば、クエ
ン酸、マレイン酸、リンゴ酸またはそれらの塩）、塩基
性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジ
ン）、トリス−塩酸などが例示される。安定化剤の添加
量は、アルブミンの場合１〜１０ｗ／ｖ％、ゼラチンの
場合０．１〜１ｗ／ｖ％、無機塩の場合０．１〜５ｗ／
ｖ％、有機酸またはその塩の場合０．０１〜０．５Ｍま
たは０．１〜５ｗ／ｖ％、塩基性アミノ酸の場合０．１
〜５ｗ／ｖ％、トリス−塩酸の場合０．０１〜０．５Ｍ
程度が好適である。
【００１４】
【発明の効果】本発明の加熱処理方法によれば、ウロキ
ナーゼ前駆体含有水溶液中に夾雑する可能性のある微生
物の感染性を効果的に不活化することができる。本発明
の加熱処理法により不活化されうる微生物としては、
(1) ウィルス、例えば、ＶＳＶ（Vesicular stomatitis
virus) 、ヘルペスシンプレックスウィルス、エコーウ
ィルス、ＣＨＶ（チクングニヤ・ウィルス）、シンドビ
スウィルス、ムンプスウィルス、ワクチニアウィルス、
Measles virus 、Rubella virus 、インフルエンザウィ
ルス、サイトメガロウィルス、ポリオウィルス、パルボ
ウィルス、アデノウィルス、ＨＩＶ（エイズウィル
ス）、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、非Ａ非Ｂ
型肝炎ウィルス、ＡＴＬ（成人型Ｔ細胞白血病ウィル
ス）等、(2) 細菌、例えば、大腸菌(Escherichia col
i)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌
(Staphylococcus aureus) 等、(3) その他の微生物、例
えば、真菌(Candida albicans)、麹菌(Aspergillus nig
er) 、枯草菌(Bacillus subtilis) 等が例示される。ま
た、本発明で特定するｐＨ範囲の条件下で加熱処理を行
うことにより、加熱処理時のウロキナーゼ前駆体の活性
低下を抑制することができる。したがって、本発明の方
法により調製されたウロキナーゼ前駆体は安全性の優れ
た製剤として臨床上極めて有用である。
ナーゼ前駆体含有水溶液中に夾雑する可能性のある微生
物の感染性を効果的に不活化することができる。本発明
の加熱処理法により不活化されうる微生物としては、
(1) ウィルス、例えば、ＶＳＶ（Vesicular stomatitis
virus) 、ヘルペスシンプレックスウィルス、エコーウ
ィルス、ＣＨＶ（チクングニヤ・ウィルス）、シンドビ
スウィルス、ムンプスウィルス、ワクチニアウィルス、
Measles virus 、Rubella virus 、インフルエンザウィ
ルス、サイトメガロウィルス、ポリオウィルス、パルボ
ウィルス、アデノウィルス、ＨＩＶ（エイズウィル
ス）、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、非Ａ非Ｂ
型肝炎ウィルス、ＡＴＬ（成人型Ｔ細胞白血病ウィル
ス）等、(2) 細菌、例えば、大腸菌(Escherichia col
i)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌
(Staphylococcus aureus) 等、(3) その他の微生物、例
えば、真菌(Candida albicans)、麹菌(Aspergillus nig
er) 、枯草菌(Bacillus subtilis) 等が例示される。ま
た、本発明で特定するｐＨ範囲の条件下で加熱処理を行
うことにより、加熱処理時のウロキナーゼ前駆体の活性
低下を抑制することができる。したがって、本発明の方
法により調製されたウロキナーゼ前駆体は安全性の優れ
た製剤として臨床上極めて有用である。
【００１５】
【実施例】以下に実施例および参考例を挙げて本発明を
具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定さ
れるものではない。 実施例１ ウロキナーゼ前駆体（比活性がプラスミン処理時１５万
ＩＵ／ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に
溶解して活性約１７万ＩＵ／ｍｌの試料を調製した。調
製した試料のｐＨを５．５、６．５、７．５および８．
５に調整し、６０℃で１０時間加熱処理した。加熱処理
後の活性残存率、性状（外観）および残存ウィルスの感
染性を調べた。活性残存率は対照（ｐＨ６．５、加熱
前）の活性を１００％として計算する。残存ウィルスの
感染性は、ウロキナーゼ前駆体含有溶液に予めＶＳＶを
添加しておき、加熱処理後、残存するウィルスの感染性
を測定することにより調べた。結果を表１に示す。
具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定さ
れるものではない。 実施例１ ウロキナーゼ前駆体（比活性がプラスミン処理時１５万
ＩＵ／ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に
溶解して活性約１７万ＩＵ／ｍｌの試料を調製した。調
製した試料のｐＨを５．５、６．５、７．５および８．
５に調整し、６０℃で１０時間加熱処理した。加熱処理
後の活性残存率、性状（外観）および残存ウィルスの感
染性を調べた。活性残存率は対照（ｐＨ６．５、加熱
前）の活性を１００％として計算する。残存ウィルスの
感染性は、ウロキナーゼ前駆体含有溶液に予めＶＳＶを
添加しておき、加熱処理後、残存するウィルスの感染性
を測定することにより調べた。結果を表１に示す。
【００１６】
【表１】
【００１７】実施例２ ウロキナーゼ前駆体（比活性がプラスミン処理時１５万
ＩＵ／ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に
溶解して活性約１７万ＩＵ／ｍｌの試料を調製した。調
製した試料のｐＨを２．５、３．０、４．０、４．５、
５．０および５．５に調整し、６０℃で１０時間加熱処
理した。実施例１と同様にして加熱処理後の活性残存
率、性状（外観）および残存ウィルスの感染性を調べ
た。活性残存率は対照（ｐＨ５．５、加熱前）の活性を
１００％として計算する。結果を表２に示す。
ＩＵ／ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に
溶解して活性約１７万ＩＵ／ｍｌの試料を調製した。調
製した試料のｐＨを２．５、３．０、４．０、４．５、
５．０および５．５に調整し、６０℃で１０時間加熱処
理した。実施例１と同様にして加熱処理後の活性残存
率、性状（外観）および残存ウィルスの感染性を調べ
た。活性残存率は対照（ｐＨ５．５、加熱前）の活性を
１００％として計算する。結果を表２に示す。
【００１８】
【表２】
【００１９】実施例３ ウロキナーゼ前駆体（比活性はプラスミン処理時１５万
ＩＵ／ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に
溶解して活性約１７万ＩＵ／ｍｌの試料を調製した。調
製した試料のｐＨを５．３、５．５、５．７、および
５．９に調整し、６０℃で１０時間加熱処理した。実施
例１と同様にして加熱処理後の活性残存率、性状（外
観）および残存ウィルスの感染性を調べた。活性残存率
は対照（ｐＨ６．５、加熱前）の活性を１００％として
計算する。結果を表３に示す。
ＩＵ／ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に
溶解して活性約１７万ＩＵ／ｍｌの試料を調製した。調
製した試料のｐＨを５．３、５．５、５．７、および
５．９に調整し、６０℃で１０時間加熱処理した。実施
例１と同様にして加熱処理後の活性残存率、性状（外
観）および残存ウィルスの感染性を調べた。活性残存率
は対照（ｐＨ６．５、加熱前）の活性を１００％として
計算する。結果を表３に示す。
【００２０】
【表３】
【００２１】以上の結果は、加熱処理をｐＨ４．５〜６
の条件下で行うことにより、ウロキナーゼ前駆体の活性
（プラスミン処理時にウロキナーゼ活性を示す）の低下
が抑制され、微生物による感染症の危険のないウロキナ
ーゼ前駆体が得られることを示している。
の条件下で行うことにより、ウロキナーゼ前駆体の活性
（プラスミン処理時にウロキナーゼ活性を示す）の低下
が抑制され、微生物による感染症の危険のないウロキナ
ーゼ前駆体が得られることを示している。
【００２２】実施例４ 実施例１〜３で加熱処理したウロキナーゼ前駆体の性状
を、ＵＶスペクトル、二次構造、等電点、抗原性、分子
量および高速液体クロマトグラフィーについて確認した
ところ、加熱前のものと同じであった。
を、ＵＶスペクトル、二次構造、等電点、抗原性、分子
量および高速液体クロマトグラフィーについて確認した
ところ、加熱前のものと同じであった。
【００２３】参考例１ ウロキナーゼ前駆体の調製 培養人腎細胞を０．１％ヒト血清アルブミン添加無血清
培養液に３日間培養し、培養液を遠心分離し、その培養
上清をｐＨ５．５に調製した後、CM-SephadexC-50に接
触させた。０．１６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）でカ
ラムを洗浄した後、０．１６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．
５）で吸着していたウロキナーゼ前駆体を溶出させた。
一方、ウロキナーゼ前駆体で予め免疫しておいたウマの
抗血清から、ウロキナーゼ前駆体抗体を回収した。この
抗体をＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア
社）に固定した。この抗体カラムを０．４Ｍ ＮａＣｌ
含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化し、
これに前記ウロキナーゼ前駆体を含有する溶出液を接触
させた。０．４Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄した後、吸着していたウ
ロキナーゼ前駆体を０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．２Ｍグ
リシン−ＨＣｌ水溶液（ｐＨ２．５）で溶出させた。溶
出液を除菌濾過した後、凍結乾燥し比活性が１５万ＩＵ
／ｍｇ蛋白（ウロキナーゼ変換時）の高度精製ウロキナ
ーゼ前駆体を得た。なお、この精製品はＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により分子量約５４０００
の単一バンドを示した。そのアミノ酸配列は特開昭６０
−６２９８１号公報に記載のものと同一であった。
培養液に３日間培養し、培養液を遠心分離し、その培養
上清をｐＨ５．５に調製した後、CM-SephadexC-50に接
触させた。０．１６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）でカ
ラムを洗浄した後、０．１６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．
５）で吸着していたウロキナーゼ前駆体を溶出させた。
一方、ウロキナーゼ前駆体で予め免疫しておいたウマの
抗血清から、ウロキナーゼ前駆体抗体を回収した。この
抗体をＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア
社）に固定した。この抗体カラムを０．４Ｍ ＮａＣｌ
含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化し、
これに前記ウロキナーゼ前駆体を含有する溶出液を接触
させた。０．４Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄した後、吸着していたウ
ロキナーゼ前駆体を０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．２Ｍグ
リシン−ＨＣｌ水溶液（ｐＨ２．５）で溶出させた。溶
出液を除菌濾過した後、凍結乾燥し比活性が１５万ＩＵ
／ｍｇ蛋白（ウロキナーゼ変換時）の高度精製ウロキナ
ーゼ前駆体を得た。なお、この精製品はＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により分子量約５４０００
の単一バンドを示した。そのアミノ酸配列は特開昭６０
−６２９８１号公報に記載のものと同一であった。
【００２４】参考例２ ウロキナーゼ前駆体の調製 参考例１で調製したウロキナーゼ前駆体を以下の方法に
よりさらに精製した。抗体カラムから溶出したウロキナ
ーゼ前駆体含有画分を０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）により濃縮・透析した。ウ
サギ由来抗ウマＩｇＧ抗体（ウマＩｇＧをウサギに免役
して得られた抗血清を精製したもの）を固定化したアガ
ロース（セファロース６Ｂ、ファルマシア社製）を上記
緩衝液で平衡化しておき、これにウロキナーゼ前駆体含
有画分を接触させ、非吸着画分を回収した。さらに、こ
の画分を、上記緩衝液で平衡化したパラアミノベンズア
ミジン−アガロース（ベンザミジン−セファロース６
Ｂ、ファルマシア社製）に接触させ、非吸着画分を回収
した。回収した画分を除菌濾過した後、凍結乾燥した。
得られたウロキナーゼ前駆体の性状は以下の通り。分子
量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（還
元下）で約５４０００であり、単一バンドを示した。ア
ミノ酸配列は特開昭６０−６２９８１号公報に記載のも
のと同一であった。
よりさらに精製した。抗体カラムから溶出したウロキナ
ーゼ前駆体含有画分を０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）により濃縮・透析した。ウ
サギ由来抗ウマＩｇＧ抗体（ウマＩｇＧをウサギに免役
して得られた抗血清を精製したもの）を固定化したアガ
ロース（セファロース６Ｂ、ファルマシア社製）を上記
緩衝液で平衡化しておき、これにウロキナーゼ前駆体含
有画分を接触させ、非吸着画分を回収した。さらに、こ
の画分を、上記緩衝液で平衡化したパラアミノベンズア
ミジン−アガロース（ベンザミジン−セファロース６
Ｂ、ファルマシア社製）に接触させ、非吸着画分を回収
した。回収した画分を除菌濾過した後、凍結乾燥した。
得られたウロキナーゼ前駆体の性状は以下の通り。分子
量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（還
元下）で約５４０００であり、単一バンドを示した。ア
ミノ酸配列は特開昭６０−６２９８１号公報に記載のも
のと同一であった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松本 勇彦 大阪市都島区都島中通３丁目５番44号 株 式会社ミドリ十字都島工場内 (72)発明者 佐古 英二 大阪市中央区今橋１丁目３番３号 株式会 社ミドリ十字内
Claims (2)
- 【請求項１】 ウロキナーゼ前駆体含有水溶液をｐＨ
４．５〜６で加熱処理することを特徴とするウロキナー
ゼ前駆体の加熱処理方法。 - 【請求項２】 加熱処理を５０℃〜７０℃で１０分間〜
２０時間おこなう請求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5207735A JPH0753403A (ja) | 1993-08-23 | 1993-08-23 | ウロキナーゼ前駆体の加熱処理方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5207735A JPH0753403A (ja) | 1993-08-23 | 1993-08-23 | ウロキナーゼ前駆体の加熱処理方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0753403A true JPH0753403A (ja) | 1995-02-28 |
Family
ID=16544676
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5207735A Pending JPH0753403A (ja) | 1993-08-23 | 1993-08-23 | ウロキナーゼ前駆体の加熱処理方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0753403A (ja) |
-
1993
- 1993-08-23 JP JP5207735A patent/JPH0753403A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041207 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050412 |