JPS61238731A - ウロキナーゼ前駆体乾燥製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はウロキナーゼ前駆体の安定化方法及び乾燥製剤
に関する。

〔従来の技術〕

ヒト腎細胞から分泌されるウロキナーゼ前駆体は、それ
自身ではウロキナーゼ活性を発現しないが、プラスミン
等のプロディナーゼの作用を受けると著しいウロキナー
ゼ活性を発現する。

ウロキナーゼ前駆体は、フィブリンに対する親和性が高
く、血漿中のフィブリノーゲンに作用Ｃ分解）すること
なく、血栓を構成するフィブリンに到達し、血栓中の微
量のプラスミンの作用によりウロキナーゼ活性を発現す
る。

即ち、ウロキナーゼ前駆体は血栓部位に限定した線溶を
惹起させ、選択的かつ効率的に血栓を溶解する特性な有
するため、新規な血管栓塞疾患の治療剤として有望視さ
れている。

ところで、ウロキナーゼ前駆体は粗製段階及び精製過程
の高濃度中性溶媒中に保たれておれば比較的安定である
が高度精製された状態あるいは（凍結）乾燥した状態で
は不安定である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的はウロキナーゼ前駆体の安定化をはかるこ
とにある、 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは１本目的を解決すべく鋭意研究な重ねた結
果、無機塩及び有機酸塩から選ばれる少なくとも一種と
ヒト・アルブミンとを併用してウロキナーゼ前駆体に添
加することによって、ウロキナーゼ前駆体が相乗的に安
定化されるという新知見を得て本発明を完成した。

即ち１本発明は、ウロキナーゼ前駆体に、無機塩及び有
機酸塩から選ばれる少なくとも一種類の塩とアルブミン
を添加することを特徴とするウロキナーゼ前駆体の安定
化方法およびその乾燥製剤である。

（ウロキナーゼ前駆体） 本発明で用いられるウロキナーゼ前駆体とは。

尿及び人腎細胞及び遺伝子工学によって得られるものが
例示される（特願昭５８−１７０３５４！参照）。

本発明で用いられるウロキナーゼ前駆体は高度精製され
たものにおいて特に効果が著しい。

たとえば、比活性１００００Ｉμ／■蛋白の濃度フ が例示される〔なお、Ｉ′ＵはＵＫの国際単位の略であ
る。前駆体１−をプラスミン処理した時ののＵＫ活性に
相当するＩＩｕ／−は前駆体溶液１−をプラスミン処理
した時に、ＵＫＩＩｕと同等の活性を有することを意味
する。以下同様〕。

Ｃ安定化剤） 本発明で使用される無機塩としては、たとえばハロゲン
のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、リン酸のアル
カリ金属塩、アルカリ土類金属塩などが例示される。

好適には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナト
リウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウムがあげられ
る。

有機酸としては、水酸基を有していてもよい脂肪族カル
ボン酸が好ましく、そのカルボキシル基は１〜３個が、
また水酸基は０〜３個が好ましい。

かかる有機酸としては、たとえばクエン酸などのオキシ
酸、シュウ酸などの脂肪族ジカルボン酸、酢酸、マンデ
ル酸などの脂肪酸が好適に例示される。

これら有機酸の塩としては、アルカリ金属塩ナトリウム
、カリウムが例示される。

本発明に使用されるアルブミンは抗原性の問題からヒト
由来のアルブミンであることが好ましく、それらは医療
用に精製されたものであれば特に制限はない。その純度
は、電気泳動で分析して８０％以上がアルブミンである
ものが好ましい。ヒト由来アルブミンを得る方法として
は、エタノール分画法（特公昭４７−２８６９、特公昭
３５−５２９７）、有機酸の存在下で加勢する方法ｃ％
公昭４３−１６０４．特公昭５］−４０１３２１）等が
例示される。特に好ましくはアルブミンを加熱処理（好
ましくは、６０℃、１０時間程度）して肝炎ウィルス等
不活化処理を行なったものが使用される。

（安定化剤の添加１１） 安定化剤は、ウロキナーゼ前駆体１０，０００ＩＵ〜２
５０，０００ＩＵに対してヒトアルブミンは、１０〜５
０ηに相当する割合で、また無機塩又は／及び有機酸塩
は５〜３０ｒｎ９に相当する割合で添加される。

〔発明の効果〕

本発明において、前記安定化剤は、ウロキナーゼ前駆体
の精製時、製剤の保存時などウロキナーゼ前駆体が不活
性化されうる条件下に置かれる任意の時期に添加され効
果を発揮する。

〔実施例〕

以下の実験例及び実施例において１本発明をより明確に
説明する。

な・お、ウロキナーゼ前駆体の活性は、プラスミンによ
り活性化後合成基質（ＧＬｔ−Ｇ）Ｙ　−Ａｒｇ　−Ｍ
ＣＡ）を用い測定した゛。

実験例１ ０．１０Ｍ！Ｊン酸緩衝液を溶媒とした精製ウロキナー
ゼ前駆体（比活性１３５，０００　ＩＵ／１ｎ９は溶液
に同緩衝液を溶媒としたヒトアルブミンを加え、ヒトア
ルブミン２０　ｒｎ９／　ｍ１ｊＹ含むウロキナーゼ前
駆体溶液２５．０００　ＩＵ／−を調製した。この溶液
に各種添加物【無機塩、有機酸塩）を総量８ダ／ｍｌ加
え、凍結乾燥した。対照としては精製ウロキナーゼ前駆
体溶液に何も添加しないもの及びヒトアルブミンのみを
添加したものを同様に凍結乾燥したものを用いた。

これらを凍結乾燥直後と５０℃で３箇月間保存した後、
残存ウロキナーゼ前駆体力価（財）を測定し。

その結果を第１表に示した。

第１表 実験例２ 実験例１と同様にしてヒトアルブミンとクエン酸ナトリ
ウム及び食塩を種々の割合で混合し、凍結乾燥品を作成
した。

これらを凍結乾燥直後と５０℃１箇月間保存した後、残
存ウロキナーゼ前駆体力価（ト）を測定した。

結果は第２表に示すとおりである。

第１表及び第２表中に示した力価は、前記処理を行う前
っ力価を１００とした場合に対する残存活性である。

実施例１ 精製ウロキナーゼ前駆体（比活性１３５，０００ＩＵ　
／ｍｐ蛋白）　２５，０００ｒＵヒ）　フルフミン２０
１１１９゜クエン酸ナトリウム６．４ダをｐ　Ｈ７，０
，０，１Ｍリン酸緩衝液１ｒＩＬｌに溶解し、無菌ろ過
後、バイアル瓶に充填し、凍結乾燥し、製剤中ヒトアル
ブミン２０１１Ｉ９、クエン酸ナトリウム６．４■含有
するウロキナーゼ前駆体２５，０００単位の注射剤を得
た。

実施例２ 実施例１と同様に操作し、製剤中ヒトアルフミン２０覧
食塩６．４■を含有するウロキナーゼ前駆体２５，００
０ＩＵの製剤を得た。

実施例３ 精製ウロキナーゼ前駆体（比活性１３５，０００ＩＵ／
ダ蛋白）　５０，０００ＩＵとトアルブミン４０叩、ク
エン酸ナトリウム１２．８１１９を実施例１と同様に操
作し、製剤中ヒトアルブミン４０ｑ、クエン酸ナトリウ
ム１２．８■を含有するウロキナーゼ前駆体５０，００
０ＩＵの製剤を得た。

く参考例：製造例〉 培養人腎細胞を０．１％ヒト血清アルブミン添加無血清
培養液に３日間培養し、培養液を遠心分離し、その上清
を凍結して保存した。プールした培養上清をｐ　Ｈ５，
５に調整した後、　ＣＭ　−５ｅｐｈａｄｅｘＣ−５０
に接触した。０．１６Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ５，５）
でカラムを洗浄した後、０．１６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
８，５）で吸着していた本ウロキナーゼ前駆体を溶出さ
せた。

一方１本ウロキナーゼ前駆体で予め免疫しておいたマウ
スＢＡＬＢ）／（！の膵臓細胞とマウスミエローマ細胞
をポリエチレングリコールにより融合させたハイプリド
ーマのうち、本ウロキナーゼ前駆体に対する抗体産生の
高いクローンを選択した。

この融合細胞の培養液から、抗ウロキナーゼモノクロー
ナル抗体を回収した。このモノクローナル抗体をｆ３ｒ
ＣＮ活性化Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ社）に固定した。

このモノクローナル抗体カラムを０．４ＭＮａＣＪ！ｚ
１含有０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化
し、これに前記の本ウロキナーゼ前駆体を含！−ｆる溶
出液を接触した。０．４ＭＮａＣＪ、含有０．１　Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）でカラムを洗浄した後。

吸着していた本ウロキナーゼ前駆体を０．５ＭＮａＣＪ
／含有０．２　Ｍグリシン−ＨＣ丈水溶液（ＰＨ２゜５
）で溶出させた。溶出液を中和後、抗マウヌエｇＧウサ
ギＩｇＧを固定化した担体を通過し漏出してくる極く微
傷のマウスＩ　ｇＧ　？除去した。通過液を除菌を過し
た後、凍結乾燥し比活性が少なくともｓｏ、ｏｏＯＵ／
ｒｎ９の高度精製本ウロキナーゼ前駆体を得た。

なお、この精製品は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により分子量５万０１本の帯を示した。

（ばか３名） 手続補正書 昭和６０年６月〜日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ウロキナーゼ前駆体に、無機塩及び有機酸塩から選
   ばれる少なくとも一種類の塩とアルブミンを添加するこ
   とを特徴とするウロキナーゼ前駆体の安定化方法。 ２）ウロキナーゼ前駆体を主成分とし、安定化剤として
   無機塩及び有機酸塩から選ばれる少なくとも一種類の塩
   及びヒト・アルブミンを添加することを特徴とするウロ
   キナーゼ前駆体乾燥製剤。