JPH02504587A - ７ａ因子に富む画分の製造方法及び医薬としてのその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■ａ因子に富む画分の製造方法及び医薬としてのその用途本発明は、血液凝固■ ａ因子を多く含み、実質的に■因子、■因子、Ｘ因子及び■因子を含まない両分 の製造方法、並びに循環系阻害因子を持った血友病Ａ患者の治療用薬剤としての その用途に関する。

■因子は外因系の血液凝固に関与する。このビタミンに依存性蛋白質は、分子量 ５０．０００ダルトンの酵素前駆体（プロ酵素）であり、種々の活性化因子、特 にＸｌ１ａ因子（活性化ハーゲマン因子）によって活性されうる。

■因子の生物学的活性は血液循環系に存在しない蛋白質である組織因子（Ｔ、Ｆ 、）、または組織トロンボプラスチンともいう蛋白質との相互作用に依存する。

この組織因子は分子量４５．０００ダルトンの蛋白質部分とリン脂質部分とから 成る。カルシウムの存在下で形成されたＦ■−ＴＦおよび／またはＦＶＩｌａ− ＴＦ複合体はＸ因子（酵素前駆体）を活性化Ｘ因子（酵素）へ変換する。後者は プロトロンビンを、フィブリノーゲンからフィブリンを生成させることによる血 液凝塊（血餅）の形成を担う酵素であるトロンビンに変換する。

Ｆ■（■因子）及びＦｖｌａ（■ａ因子）の２つの形態は、同程度の親和性で組 織因子とカルシウム依存性複合体を形成しうる。しかしながら、Ｆ１ａ−ＴＦ複 合体は、Ｆ■−ＴＦ複合体の２５〜１００倍高い凝固活性を有する。

循環系阻害因子（■因子に対する抗体の存在）をもつ血友病Ａ愚者の治療におい ては、いわゆる“活性化”画分が、これらの患者において正常な止血を回復する ために代用的な治療として用いられてきたし、現在もそうである。

これらの画分は、もとの及び活性化された形でプロトロンビン複合体の因子を含 み、実際ＩＸａ、Ｘａ、ＸＴａ、Ｘ１１ａ及び■ａ、並びにわずかのトロンビン の存在が認められる。抗血友病因子の短縮回路効果（バイパス効果）を担ってい る物質はこれまで解明されていない。

活性化■因子は有望な候補であり、事実これらの製剤であるオートブレンクス（ ＡＬＩＴＯＰＬＥＸ）（Ｈｙｌａｎｄ　Ｔｒａｖｅｎｏｌ）及びファイバ（ＦＥ ＩＢＡ）　（Ｉｍｍｕｎｏ　ＡＧ）に存在する。一方、１９８３年に１１、Ｈｅ ｎｄｎｅｒと−、　Ｋ１５ｉｅｌはＦ■の阻害因子の抗体価の高い血友病Ａ愚者 ２人に対する、高度に精製された■ａ因子の有効性を臨床的に実証することがで きた（Ｕ、　Ｈｅｄｎｅｒ及びＷ、　Ｋ１５ｉｅｌ、　１９８３．　Ｊ、　Ｃｌ １ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　７１．　ｐ１８３６〜１８４１）　。

他の活性化因子に比較して、Ｆ１ａは、例えば外傷（重い関節血症、外科手術、 抜歯等）時のような組織の損傷の後に放出されるその補因子である組織因子を利 用できることにより局部的に作用しうるという利点をもつ、バイパスとして■ａ 因子を用する際の他の利点は、その半減期が非常に短い、即ち４時間程度である ことであり、これに対して、プロトロンビン複合体を形成するその他の因子は、 より長い半減期をもち、従って外科手術の後の維持治療中にある種類の因子（特 に■及びＸ）がＷ積する。

本発明は、凝固活性がそれほど損なわれずにウィルスに関して不活性化された、 活性化ＦＶＩ：ａ縮物を得る方法に関する。

このようにして得られた濃縮物は、他の活性化画分に比べて、一方では抗原性Ｆ ■をごくわずかしか含有せず、また他方では■、Ｘ及び■因子の含有量も少ない という利点をもつ。

このＦ■ａｍＷｉＭ物は、■及び■ａ因子、並びに■、χ及び■因子のような他 の蛋白質を含有する血漿蛋白質分画の副生物、特にプロトロンビン複合体（ＰＰ ＳＢ：　Ｐ−プロトロンエアート因子即ちＦＸ、Ｂ−抗血友病因子Ｂ即ちＦＩＸ ）の調製には用いられないサブ画分（ｓｕｂ−ｆｒａｃｔｉｏｎ）の、吸着次い で溶離によって得られる。このサブ画分をＰＰ５Ｈのプレ溶出液という、これは 、Ｆ■に冨み、■、■及びＸ因子の少ない、有機溶剤を用いない分画副生物であ るのが好ましい。

より詳しくは、本発明は次の点に特徴をもつ、■ａ因子に冨む画分の製造方法に 関する。

一■及び■ａ因子を含有する画分、特にＰＰ５Ｂのプレ溶出液を、水不溶性２価 金属塩から選ばれた、カルシウムに結合する蛋白質に選択的親和性をもつ吸着剤 により吸着させ、−この固定化した蛋白質を、固定した蛋白質と置換しうる可溶 性塩を含有する緩衝液の添加により溶離し、−■ａ因子に富んだ溶出液を回収す る。

本発明による方法は、Ｆ１ａを含む非常に多様な百分からＦ　Ｖｌ　ａに冨む画 分を得るのに用いることができるが、ＰＰ５Ｂ調製時の寒冷沈降（クリオプレシ ピテーシッン）からの上澄み画分を用いるのが特に有利である。

より正確には、まず、プレ溶出液を、例えば３０μ／蒙ｌの割合で加えられたカ リクレイン阻害剤であるアプロチニンの存在下での限外濾過により濃縮する。プ レ溶出液を、ｐＨ７〜９に緩衝された、２０〜８０ｇ／ｆｆｉの濃度、０．１２ 〜０．２？Ｉ　Ｎａαの浸透圧濃度とする。用いる吸着剤は、ビタミンに依存性 因子、特るこ■因子を保持することが知られているリン酸三カルシウム、特にハ イドロアパタイト又はブラッシャイトの形態であるのが好ましいが、その他の塩 、例えばクエン酸塩を用いてもよい、リン酸三カルシウムは５〜１５ｇ／　Ｉ。

の量で蛋白質溶液に添加する。得られた懸濁液を室温、即ち１５〜３０℃で、２ ０分〜１時間撹拌し、次いで遠心分離する。

吸着工程及び溶離工程は一本のカラムで行ってもよい。

遠心分離（即ち吸着されなかった）上澄みを取り除き、残った担体をｐ１１７〜 ９に緩衝した０、１〜０．２Ｍ　ＮａｃＱを含む溶液で洗浄する（洗浄に用いる 量は吸着に用いたと同じ）。

この第２の懸濁液を１５〜３０℃の温度で１５分〜１時間撹拌し、前と同様の条 件下、例えば連続供給式遠心分離１ｍ（シーバ又はシャープレス型）、流速４０ ±５１１ｂで遠心分離する。

このようにして、第２の上澄みを除去し、得られたぺ１／ツトを出発時の１／７ の体積の溶離液に再懸濁する。溶離液は、０．１５〜０．５Ｍ　ＮａｃＱを含む ０．２〜０．３Ｍのリン酸二水素ナトリウムとリン酸水素ニナトリウムの混合物 であるか、又は０．１５１’ｌ　〜０．５１’ｌ　ＮａＣ１２を含む０．１〜０ ．２５Ｆｌのクエン酸三ナトリウムであり、いずれの場合も−ｆｆＪ！液はｐＨ ７〜９に調整される。

この新しい懸濁液を１５〜３０℃で２０分〜１時間撹拌し、次いで遠心分離する 。この遠心分離では、ペレットの方を除去し、上澄みを回収して、血液透析器又 は限界濾過により透析し、塩の含有量を０．１５Ｍ　Ｎａａ２相当まで減少させ る。こうして、透析前に得られた粗溶出液の蛋白質濃度は０．８〜２．３　ｇ／ ｊ！であり、凝固因子■の含有量は１０〜１００μ７ｍｌである。

この段階で適当な分析により、この溶液がＦ■と活性化Ｆ■の混合物を含むこと が分かる。この段階でＦ■を、Ｘ■因子をＸＩＩａ因子に活性化することが知ら れている、セライト又はカオリンによってさらに活性化することができる。これ により、生成したＸＩＩａがＦＶＩを活性化する。用いるセライトの濃度は、前 に得た透析溶出液に対し５〜１５８ノ！である。この新しい懸濁液を室温で撹拌 し、次いで遠心分離する。遠心分離上澄みを回収し、ＰＨを６〜８に調整する。

こうして得た分画はウィルス、特に脂質膜をもつウィルスであるＨＩＶ、Ｂ型肝 炎及び非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスを含んでいる可能性もありうる。従って、本発明 による方法は、生成物を、ウィルスの膜に対する溶剤及び非イオン系洗浄剤を含 む混合物で不活性化するための温Ｗ（インキュベーション）により、これらのウ ィルスを除去する工程も含む、用いる不活性化用混合物は、蛋白質溶液に対し重 量／体積で１％のトウィーン８０及び０．３％のＴｎＢＰ　（リン酸ｎ−）リプ チル）の混合物であるのが好ましい、不活性化の時間は、２４℃の温度でウィル スの不活性化後６時間であり、不活性化用混合物は蛋白質から、簡単な方法、特 にＱ−セファロース樹脂によるタラマドグラフィーによって分離しなければなら ない。

汚染の可能性のあるウィルスは、未処理の材料（ＰＰＳＢのプレ溶出液）の段階 、又は最終のＦ　Ｖｌ　ａ濃縮物の段階のいずれかにおいて、生成物の活性をあ まり損なうことなく不活性化することができる。

こうして得られた画分は、１５０〜５００単位／−１程度のヒトトロンボプラス チン（ＴｐＨ）に対するＦ■活性、及び１〜５ｇ＃！程度の蛋白質割合に対して 、次のような活性をもち、Ｆ■／　Ｔ　ｐ　Ｈ／ｍｇ活性は７０〜２００である 。

Ｆｎ＜５１１ノー！ ＦＤ（＜１Ｏ− ＦＸ＜１０　　＃ この百分は医薬、殊にアルブミンのような蛋白質の安定化剤をさらに含む医薬組 成物の形で、特に循環系阻害因子を持った血友病Ａ！Ａ者の治療に用いるのに有 用である。

本発明方法のその他のＢＩａ及び利点は以下の実施例より明らかとなろう。

！旅■上 出発材料の寒冷沈降の上澄み、　７００　ｆｆｉから、１４０！の量のＰＰ５Ｈ のプレ溶出液を回収し、これに４　ＸＩＯ’のアプロチニン単位相当物を加える 。このプレ溶出液を０．２μフイルターで無菌濾過し、次いで１０．０００ダル トンのカセットで限外濾過することにより７１の量に濃縮する（濃度は約２０倍 ）。

濃縮液は１１０ｇ＃！の蛋白質濃度で、浸透圧濃度は０．２Ｍ　Ｎａαに相当し 、ｐｎは７．５である。

この段階で、生成物を次の操作のために一４０℃で２１ずつの血漿ポケットに凍 結してもよい。

これらのポケットを３７℃で解凍し、次いで得られた溶液を０．１８Ｍ　　Ｎａ Ｑ！　１５ｊｉ！で希釈し、このようにして２１！の量のプレ溶出液を３７ｇ／ 　ｊ！蛋白質濃度で得る。この新しい溶液のｐＢを、ＩＮ水酸化ナトリウム（即 ち３５−１　）で８に調整する１次いで吸着をリン酸三カルシウムで行う、すな わち、２００ｇの粉末を散布して加え、室温で４０分撹拌を続けた後、得られた 懸濁液を４０　ｆ　／ｂの流速で遠心分離する。上澄みを除き、残ったペレット をリン酸水素ニナトリウムでｐＨ８に緩衝した０、１５Ｍ　ＮａＣｆ１’溶液中 に再懸濁させる。

この新しい懸濁液を再び室温で１５分間撹拌し、次いで４０１ｂで遠心分離する 。この第２の上澄みを除き、ペレットを回収する。

次いでペレットを次の組成の溶離液３ｋに再懸濁させる。

リン酸二水素ナトリウム　　０．２５Ｍリンリン酸二素ナトリウム０．２５Ｆ！ ＮａＣ２０，４Ｍ　　ｐＨ８ 得られた懸濁液を室温で１時間撹拌し、次いで遠心分離して上澄み（即ち粗溶出 液）を回収し、ペレットを取り去る。

粗溶出液を濃縮し、１０にダルトンカセットでの限外濾過により透析し、容積を １１に、当量浸透圧濃度を０．１５Ｍ　Ｈａα相当にし、ｐＨ壱〇、ＩＮ酢酸で ７に調整する。

このように：ａ！＠された溶出液は３　ｇ／　４２の蛋白質割合に対して２４５ Ｕ／ｄのＦ■活性をもち、生成物はウイルス不活性化工程までの間−４０℃に凍 結してもよい。

１旌１一 実施例１で得られた■因子の濃縮液１！に、２４°Ｃでトウィーン１％−ＴｎＢ Ｐ　Ｏ，３％の溶液を加え、溶液を同じ温度で６時間撹拌する。

不活性化用混合物を、イオン交換樹脂、例えばＱＡＥ−セファロース（これは■ 因子をよく保持しろる利点がある）への蛋白質の吸着により蛋白質から分離する 。Ｆ■の吸着を容易にするために、不活性化溶液を萎留水で１／２に希釈して、 ｐｌ＋は７に維持したまま、塩の濃度を０．０７５Ｍ　ＮａＣ！２に相当する値 に下げることもできる。

これらの条件下では、不活性化用混合物は保持されず、蛋白質は、ｐＨを一定に 保ち、イオン強度を高めることにより溶離する。予め膨潤させたゲルをＮａ（ｍ 　Ｏ，０７５？ＩでｐＨ７の３０ｍ１’！リン酸モノ−ジナトリウム緩衝液で平 衡化する。

溶離は、０．５？Ｉ　ＮａＣ：Ｑを含む以外は平衡化用と同じ緩衝液で行う。得 られた溶出液を透析し、ｐｔ＋を７に保ちながら等張になるまで濃縮する。

カラムへの濃縮液の導入の前に、溶液に０．２〜０．５　Ｕ／〆の抗トロンビン ■を加えることが可能であり、これにより不活性化の過程で生成するトロンビン を阻害でき、これを行わないクロマトグラフィーは活性化■因子の凝固活性には 不利である。

こうして、不活性化溶液２ｋを１００ｃｍ／ｈの流速でＱ−セファロースカラム （１，ｉ）に吸着させる。最初のピークは不活性化用混合物を含む。第２のピー クすなわち溶離ピークにより、吸着された蛋白質の回収（即ち約２１容積）が可 能となる。溶離ピークを容積１！に濃縮し、等張でｐＨ７となるまで透析する。

この段階で、５〜１０ｇ／　ｊ２のアルブミンを加えることができ、これによっ て蛋白質を安定化できる。

このようにして３４００　Ｆ八τ／ｍｊ！の活性及び１１５１１　Ｆ■／簡ｇの 比活性（アルブミン添加前はｑＳｐ　１０＋Ｉｇ／＋Ｉｊりを有する生成物を得 る。

１隻皿主 濃′ｌ＠物中の凝固因子、特に■、Ｉχ、Ｘ、■及び活性化■因子の存在を調べ た。各因子の分析に用いた方法は、慣用の方法、すなわち欠けている因子を含む 試料の存在下での欠陥のある血漿の凝固時間の短縮である。

調製物中の活性化■因子の存在は、Ｆ■及び活性化Ｆ■が種々の起源のトロンボ プラスチンに対して親和性が異なることに基づいている。即ち、活性化Ｎ１因子 はヒトトロンボプラスチン（ＴｐＨ）よりもウシトロンボフ゛ラスチン（丁ｐＢ ）に対してより大きい親和性をもつ。

■（ＴｐＢ）／■（ＴｐＨ）の活性比はＦ■の活性化の指標である。

この比が１より大きいことは活性化型の■因子の存在を示す０本発明による調製 物に通常みられる値は５〜５０、一般には５〜１５であり、これは活性化■因子 の高い含量を表す。

Ｆ■（ＴｐＥ）　　　　　　　　３００　　　１００Ｆ■（ＴｐＢ）　　　　　 　　２．５００ＦＩＩ　　　　　　　　　　　　２　　　　＜１Ｆｌχ　　　　 　　　　　　７　　　　＜２．５ＦＸ　　　　　　　　　　　　７　　　　　＜ ２．５Ｆ■　　　　　　　　　　　０．５　　　　＜０．２ＦＶ　　　　　　　 　　　　０．１　　　　＜０．０４トロンビン　　　　　　微量　　　− 一蛋白質の割合：２〜４ｇ／ｌ −Ｆ■（ＴｐＨ）／和ｇ単位の比活性；９５〜１３０注二パーセントはＦ■（Ｔ ｐ）ｌ）活性に対する値。

災施■土　生生方夏来 ２０ｋｇ重で凝固■因子血”Ａ’／Ｉｓ度が２〜４％であるピーグル種の血友病 Ａの犬について試験した。

出血時間は、頬内壁の粘膜で中空穿孔による２１直径ＩＩＩＩＩ深さのくずれて いない傷において測定する。

生成物を静注しく前腕の背側静脈）、試料をクエン酸塩節（３，１ｇ／　１で１ ０％溶液）のプラスチック管にとるか、あるいは静脈カテーテル（前腕の背側静 脈又は頚静脈）を通しＨＤＴＡにとる。

出血時間を注射前の最初の傷の際に測定し、注射後２０分後に同様にして第２の 傷をつけ、出血時間を測定する。

０．０１　　　　０．３８　　１２分　　７分０．１　　　　３．８　　　１４ 分　３〜５分０．５　　　　１９　　　１５分　３〜４分１．０　　　　３８　 　　１２分　　４分■因子の濃度はヒトトロンボプラスチンを用いて求めた。

得られた結果は、Ｆ　Ｖｌｌ　ａの濃縮物により血漿１ｍ１当りＦ■０．０１単 位、即ち０．３８単位／ｋｇからかなり出血時間が短縮することを示す。

有効量は４単位Ｆ■／　ｋｇである。

参考文献 −Ｒｅｎｄｅｒ　Ｕ、及びＫ１５ｉｅｌ　Ｗ、；　（１９８３）ｓ　Ｊ、　Ｃｌ １ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、。

７１：　１８３６−１８４１．　　高力価阻害因子を持つ２人の血友病Ａ患者の 治療におけるヒト■ａ因子の使用、−５ｅｌｉｇｓｏｈｎ　Ｕ、、　Ｋａｓｐｅ ｒ　Ｃ，に、、　０ｓｔｅｒｕｄ　Ｂ、及びＲａｐａｐｏｒｔＳ、１．；　（１ ９７９）、　Ｂｌｏｏｄ、　５３：　８２３−８３７．　　活性化■因子；■因 子濃縮物中の存在及び注入後の循環系中での持続性、−５ｏｕｌｉｅｒ　Ｊ、Ｐ 、、　Ｂｌａｔｒｉｘ　Ｃ，及び５ｔｅｉｎｂｕｃｈ　！１．；　（１９６４） ＋Ｐｒｅｓｓｅ　Ｍｅｄ−＋　７２＝　１２２３．　　リン酸三カルシウムによ り吸着可能な血液凝固因子を含む血液凝固画分、−Ｖａｎ　Ｄｅｉｊｋ　Ｗ、Ａ 、、　Ｖａｎ　Ｄａｍ−Ｍｉｅｒａｓ　ＭＣＥ、＋　Ｍｕｌｌｅｒ　Ａ、Ｄ、及 びＢｅ１Ｉｋｅｒ　）１．ｃ、；　（１９８３）＋　Ｈｅ＋ｍｏｓｔａｓｉｓ、 　１３：　１９２−１９７゜国際調査報告 一一鞠！−−−＝　ＰＣＴ／ＦＲ８９１００２９シ２　　　　　　　国際調査報 告

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）水不溶性２価金属の塩から選ばれた、カルシウムに結合する蛋白質に 対して選択的親和性をもつ収着剤により、ＰＰＳＢのプレ溶出液の吸着を行うこ と、（ｂ）こうして固定した蛋白質を、固定した蛋白質と置換しうる可溶性塩を 含有する緩衡液を添加して溶離させること、（ｃ）ＶＩＩａ因子が濃縮された溶 出液を回収することを特徴とする、ＶＩＩａ因子を多く含む画分の製造方法。
2. ２．プレ溶出液をカリクレインの阻害剤の存在下で濃縮する請求の範囲１記載の 方法。
3. ３．カリクレインの阻害剤がアプロチニンである請求の範囲２記載の方法。
4. ４．２価金属の塩がリン酸三カルシウムである請求の範囲１〜３のいずれかに記 載の方法。
5. ５．可溶性塩が、 −リン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムの混合物及びＮａＣ２、な らびに −クエン酸三ナトリウムおよびＮａＣ２、から選ばれたものである請求の範囲１ 〜４のいずれかに記載の方法。
6. ６．溶出液をＦＶＩＩの活性化剤により活性化する請求の範囲１〜５のいずれか に記載の方法。
7. ７．ＦＶＩＩの活性化剤がセライトおよびカオリンの中から選ばれる請求の範囲 ６記載の方法。
8. ８．ＦＶＩＩａの濃縮溶出液またはＰＰＳＢのプレ溶出液を非イオン系洗浄剤お よびウィルス膜に対する溶剤と共に温置する請求の範囲１〜７のいずれかに記載 の方法。
9. ９．ＦＶＩＩａの濃縮溶出液またはＰＰＳＢのプレ溶出液をトウィーンおよびリ ン酸ｎ−トリブチルの混合物と共に温置する請求の範囲８記載の方法。
10. １０．温置した画分を、選択的に蛋白質を保持するカラムに通すことにより、非 イオン系洗浄剤およびウィルス膜の溶剤を除去する請求の範囲８または９に記載 の方法。
11. １１．カラムがＱＡＥ−セファローズカラムである請求の範囲１０記載の方法。
12. １２．温置後得られた画分を抗トロンビンＩＩＩで処理する請求の範囲８〜１１ のいずれかに記載の方法。
13. １３．請求の範囲１〜１２のいずれがに記載の方法を実施することにより得られ たＶＩＩａ因子を多く含む画分。
14. １４．活性比、ＶＩＩ（ＴｐＢ）／ＶＩＩ（ＴｐＨ）が５〜５０、好ましくは５ 〜１５である請求の範囲１３記載の画分。
15. １５．蛋白質安定化剤の存在下で請求の範囲１３または１４に記載の画分を含む 医薬組成物。