JPH09227405A - 蛋白質含有組成物の製造方法 - Google Patents
蛋白質含有組成物の製造方法Info
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- JPH09227405A JPH09227405A JP9070126A JP7012697A JPH09227405A JP H09227405 A JPH09227405 A JP H09227405A JP 9070126 A JP9070126 A JP 9070126A JP 7012697 A JP7012697 A JP 7012697A JP H09227405 A JPH09227405 A JP H09227405A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ウイルス不活化の目的で行われる蛋白質含有
組成物のトリアルキルホスフェート処理中の蛋白質の活
性低下を抑制すること。 【解決手段】 ウイルス夾雑の可能性のある蛋白質含有
液状組成物をプロテアーゼ阻害剤の存在下でトリアルキ
ルホスフェートと接触させることを特徴とするウイルス
の不活化された蛋白質含有組成物の製造方法。 【効果】 プロテアーゼ阻害剤の存在下でトリアルキル
ホスフェート処理することにより蛋白質の活性低下を抑
制することができる。
組成物のトリアルキルホスフェート処理中の蛋白質の活
性低下を抑制すること。 【解決手段】 ウイルス夾雑の可能性のある蛋白質含有
液状組成物をプロテアーゼ阻害剤の存在下でトリアルキ
ルホスフェートと接触させることを特徴とするウイルス
の不活化された蛋白質含有組成物の製造方法。 【効果】 プロテアーゼ阻害剤の存在下でトリアルキル
ホスフェート処理することにより蛋白質の活性低下を抑
制することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ウイルス夾雑の可
能性のある蛋白質含有組成物から実質的にウイルスが不
活化された蛋白質含有組成物を製造する方法に関する。
能性のある蛋白質含有組成物から実質的にウイルスが不
活化された蛋白質含有組成物を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】人血液由来の蛋白質含有組成物には、ウ
イルス、たとえば肝炎ウイルスやＡＩＤＳウイルスなど
が混入してくる可能性がある。
イルス、たとえば肝炎ウイルスやＡＩＤＳウイルスなど
が混入してくる可能性がある。
【０００３】これらのウイルス伝播を防ぐために蛋白質
含有液状組成物を加熱する方法が知られている（特開昭
５５−１４５６１５号公報、特開昭56−139422号公報、
特開昭５６−１０６５９４号公報）。
含有液状組成物を加熱する方法が知られている（特開昭
５５−１４５６１５号公報、特開昭56−139422号公報、
特開昭５６−１０６５９４号公報）。
【０００４】また、蛋白質含有乾燥組成物を加熱する方
法も知られている（特表昭５８−５００５４８号公報、
特開昭５８−２１３７２１号公報）。
法も知られている（特表昭５８−５００５４８号公報、
特開昭５８−２１３７２１号公報）。
【０００５】さらに、蛋白質含有組成物をトリアルキル
ホスフェートと接触せしめてウイルスを除去する方法が
知られている（特開昭６０−５１１１６号公報）。
ホスフェートと接触せしめてウイルスを除去する方法が
知られている（特開昭６０−５１１１６号公報）。
【０００６】しかし、トリアルキルホスフェート処理中
に蛋白質の活性が低下する問題があった。
に蛋白質の活性が低下する問題があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明はトリアルキル
ホスフェート処理工程において蛋白質の活性を殆ど失う
ことなく効率よく夾雑ウイルスを不活化し、医薬品とし
てより安全な蛋白質含有組成物を製造する方法を提供し
ようとするものである。
ホスフェート処理工程において蛋白質の活性を殆ど失う
ことなく効率よく夾雑ウイルスを不活化し、医薬品とし
てより安全な蛋白質含有組成物を製造する方法を提供し
ようとするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明はこれら課題を解
決するために、ウイルス夾雑の可能性のある蛋白質含有
液状組成物をプロテアーゼ阻害剤の存在下でトリアルキ
ルホスフェートと接触させることを特徴とするウイルス
の不活化された蛋白質含有組成物の製造方法を提供す
る。
決するために、ウイルス夾雑の可能性のある蛋白質含有
液状組成物をプロテアーゼ阻害剤の存在下でトリアルキ
ルホスフェートと接触させることを特徴とするウイルス
の不活化された蛋白質含有組成物の製造方法を提供す
る。
【０００９】本発明の方法により、トリアルキルホスフ
ェート処理工程において蛋白質の活性を失うことなく効
率的にウイルスの不活化された蛋白質含有組成物が製造
される。
ェート処理工程において蛋白質の活性を失うことなく効
率的にウイルスの不活化された蛋白質含有組成物が製造
される。
【００１０】本発明の方法が適用される蛋白質は特に限
定されるものではなく、血漿由来蛋白質、他の組織由来
蛋白質、遺伝子組み換えや組織培養によって得られた蛋
白質などが挙げられる。蛋白質としては、たとえばプラ
スミノーゲン、血液凝固第Ｖ因子、血液凝固第VII 因
子、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、血液凝固
第Ｘ因子、血液凝固第XIII因子、アンチトロンビンIII
、ハプトグロビン、トロンビン、プロトロンビン、免
疫グロブリン、フィブリノゲン、フィブロネクチン、ア
ルブミン、ヘモグロビン、インターフェロン、プラスミ
ノーゲン活性化因子などが挙げられる。蛋白質含有液状
組成物は、上記の如き蛋白質を含有するものであれば、
特に制限されない。
定されるものではなく、血漿由来蛋白質、他の組織由来
蛋白質、遺伝子組み換えや組織培養によって得られた蛋
白質などが挙げられる。蛋白質としては、たとえばプラ
スミノーゲン、血液凝固第Ｖ因子、血液凝固第VII 因
子、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、血液凝固
第Ｘ因子、血液凝固第XIII因子、アンチトロンビンIII
、ハプトグロビン、トロンビン、プロトロンビン、免
疫グロブリン、フィブリノゲン、フィブロネクチン、ア
ルブミン、ヘモグロビン、インターフェロン、プラスミ
ノーゲン活性化因子などが挙げられる。蛋白質含有液状
組成物は、上記の如き蛋白質を含有するものであれば、
特に制限されない。
【００１１】本発明の方法が適用される蛋白質含有液状
組成物には特に制限はなく、たとえば血漿または組織抽
出液、血漿または組織抽出液を各種分画法により処理し
て得た画分からなる溶液、遺伝子組換え宿主または組織
の培養により得られる培養液、市販の蛋白質製剤（液状
のもの）または溶液としたものなどが挙げられる。
組成物には特に制限はなく、たとえば血漿または組織抽
出液、血漿または組織抽出液を各種分画法により処理し
て得た画分からなる溶液、遺伝子組換え宿主または組織
の培養により得られる培養液、市販の蛋白質製剤（液状
のもの）または溶液としたものなどが挙げられる。
【００１２】また、本発明のトリアルキルホスフェート
との接触時の蛋白質含有液状組成物の精製度は特に限定
されるものではなく、任意の精製度のものに適用可能で
あり、従ってトリアルキルホスフェートとの接触は蛋白
質の分離、精製のいずれの段階に適用してもよい。
との接触時の蛋白質含有液状組成物の精製度は特に限定
されるものではなく、任意の精製度のものに適用可能で
あり、従ってトリアルキルホスフェートとの接触は蛋白
質の分離、精製のいずれの段階に適用してもよい。
【００１３】本発明で使用されるトリアルキルホスフェ
ートは特に限定されないが、好適にはトリ−（ｎ−ブチ
ル）ホスフェート、トリ−（tert−ブチル）ホスフェー
ト、トリ−（ｎ−ヘキシル）ホスフェート、トリ−（２
−エチルヘキシル）ホスフェート、トリ−（ｎ−デシ
ル）ホスフェートなどが挙げられる。特に好ましいトリ
アルキルホスフェートはトリ−（ｎ−ブチル）ホスフェ
ート（以下TNBPと言う）である。なお、２種以上の異な
るトリアルキルホスフェートの混合物も使用することが
できる。
ートは特に限定されないが、好適にはトリ−（ｎ−ブチ
ル）ホスフェート、トリ−（tert−ブチル）ホスフェー
ト、トリ−（ｎ−ヘキシル）ホスフェート、トリ−（２
−エチルヘキシル）ホスフェート、トリ−（ｎ−デシ
ル）ホスフェートなどが挙げられる。特に好ましいトリ
アルキルホスフェートはトリ−（ｎ−ブチル）ホスフェ
ート（以下TNBPと言う）である。なお、２種以上の異な
るトリアルキルホスフェートの混合物も使用することが
できる。
【００１４】本発明に使用されるトリアルキルホスフェ
ートは、０．０１〜１０（ｗ／ｖ）％の範囲の量、好ま
しくは約０．１〜３（ｗ／ｖ）％の範囲の量において使
用される。
ートは、０．０１〜１０（ｗ／ｖ）％の範囲の量、好ま
しくは約０．１〜３（ｗ／ｖ）％の範囲の量において使
用される。
【００１５】トリアルキルホスフェートは界面活性剤を
伴ってまたは伴わないで使用することができる。好まし
くは、トリアルキルホスフェートを界面活性剤と組み合
わせて使用する。この界面活性剤は、トリアルキルホス
フェートが蛋白質含有液状組成物と接触する前、同時、
または後の任意の段階に添加することができる。界面活
性剤の機能は、蛋白質含有組成物中のウイルスとトリア
ルキルホスフェートとの接触を強化することである。
伴ってまたは伴わないで使用することができる。好まし
くは、トリアルキルホスフェートを界面活性剤と組み合
わせて使用する。この界面活性剤は、トリアルキルホス
フェートが蛋白質含有液状組成物と接触する前、同時、
または後の任意の段階に添加することができる。界面活
性剤の機能は、蛋白質含有組成物中のウイルスとトリア
ルキルホスフェートとの接触を強化することである。
【００１６】界面活性剤としては、脂肪酸のポリオキシ
エチレン誘導体、ソルビトール無水物の部分エステル、
たとえばポリソルベート８０（商品名：トゥイーン８０
など）、ポリソルベート２０（商品名：トゥイーン２０
など）および非イオン性油浴水洗剤、たとえばオキシエ
チル化アルキルフェノール（商品名：トリトンＸ１００
など）が挙げられる。さらに、デオキシコール酸ナトリ
ウム、およびスルホベタインとして周知の合成ツブイッ
テルイオン洗剤であるZwittergents、たとえばＮ−ドデ
シル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−アンモニオ−１−エタン
スルホネート、およびその同族体、または非イオン性洗
剤、たとえばオクチル−β，Ｄ−グルコピラノシドなど
が挙げられる。
エチレン誘導体、ソルビトール無水物の部分エステル、
たとえばポリソルベート８０（商品名：トゥイーン８０
など）、ポリソルベート２０（商品名：トゥイーン２０
など）および非イオン性油浴水洗剤、たとえばオキシエ
チル化アルキルフェノール（商品名：トリトンＸ１００
など）が挙げられる。さらに、デオキシコール酸ナトリ
ウム、およびスルホベタインとして周知の合成ツブイッ
テルイオン洗剤であるZwittergents、たとえばＮ−ドデ
シル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−アンモニオ−１−エタン
スルホネート、およびその同族体、または非イオン性洗
剤、たとえばオクチル−β，Ｄ−グルコピラノシドなど
が挙げられる。
【００１７】界面活性剤を使用する場合、その量は臨界
的ではなく、たとえば約０．００１％〜約１０％、好ま
しくは約０．０１％〜３％の範囲で使用することができ
る。
的ではなく、たとえば約０．００１％〜約１０％、好ま
しくは約０．０１％〜３％の範囲で使用することができ
る。
【００１８】トリアルキルホスフェート処理は、エンベ
ロープコートウイルス、たとえばＢ型肝炎ウイルス、ｎ
ｏｎＡｎｏｎＢ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）、ベシキュラーストマティティスウイルス
（Vesicular Stomatitis Virus）、シンドビスウイルス
（Sindbis Virus)等の不活化に特に有用である。また、
さらに乾燥状態で充分な時間加熱処理することにより、
熱に強いウイルスも不活化し得る。
ロープコートウイルス、たとえばＢ型肝炎ウイルス、ｎ
ｏｎＡｎｏｎＢ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）、ベシキュラーストマティティスウイルス
（Vesicular Stomatitis Virus）、シンドビスウイルス
（Sindbis Virus)等の不活化に特に有用である。また、
さらに乾燥状態で充分な時間加熱処理することにより、
熱に強いウイルスも不活化し得る。
【００１９】本発明のトリアルキルホスフェートによる
蛋白質含有組成物の処理は、−５℃〜７０℃、好ましく
は０℃〜６０℃の温度で、好適には３０分以上、より好
適には１〜３０時間、さらに好適には３〜１０時間行
う。
蛋白質含有組成物の処理は、−５℃〜７０℃、好ましく
は０℃〜６０℃の温度で、好適には３０分以上、より好
適には１〜３０時間、さらに好適には３〜１０時間行
う。
【００２０】プロテアーゼ阻害剤としては、実質的にプ
ロテアーゼの活性を阻害する物質であれば特に限定され
ない。たとえば、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、
リジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸、アプロチニ
ンなどの蛋白質などが例示される。
ロテアーゼの活性を阻害する物質であれば特に限定され
ない。たとえば、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、
リジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸、アプロチニ
ンなどの蛋白質などが例示される。
【００２１】普通、トリアルキルホスフェート処理後、
トリアルキルホスフェートは除去される。界面活性剤や
安定化剤を用いたときはそれらも除去される。除去はい
ずれの方法によってもよいが、たとえばアフィニティー
クロマトグラフィーで蛋白を吸着する方法、蛋白を沈澱
により回収する方法などが挙げられる。
トリアルキルホスフェートは除去される。界面活性剤や
安定化剤を用いたときはそれらも除去される。除去はい
ずれの方法によってもよいが、たとえばアフィニティー
クロマトグラフィーで蛋白を吸着する方法、蛋白を沈澱
により回収する方法などが挙げられる。
【００２２】本発明において、プロテアーゼ阻害剤の存
在下でのトリアルキルホスフェート処理の前または後に
さらに公知の加熱処理を行ってもよい。加熱処理は液
状、乾燥状のいずれで行ってもよい。
在下でのトリアルキルホスフェート処理の前または後に
さらに公知の加熱処理を行ってもよい。加熱処理は液
状、乾燥状のいずれで行ってもよい。
【００２３】乾燥組成物（乾燥状の蛋白質含有組成物）
の加熱処理はトリアルキルホスフェート処理の前後どち
らに行ってもよいが、好ましくはトリアルキルホスフェ
ート処理後に行う。トリアルキルホスフェート処理後に
行う場合、乾燥組成物はトリアルキルホスフェートなど
を除去した後、蛋白質を回収、公知の方法で凍結乾燥し
て得られる。
の加熱処理はトリアルキルホスフェート処理の前後どち
らに行ってもよいが、好ましくはトリアルキルホスフェ
ート処理後に行う。トリアルキルホスフェート処理後に
行う場合、乾燥組成物はトリアルキルホスフェートなど
を除去した後、蛋白質を回収、公知の方法で凍結乾燥し
て得られる。
【００２４】乾燥組成物の加熱処理は、通常３０℃〜１
００℃、好ましくは５５℃〜７５℃において、通常３〜
２００時間、好ましくは１０〜１００時間実施される。
また、蛋白質を熱から保護するため、安定化剤の存在下
で行ってもよい。安定化剤としては、たとえば、糖、糖
アルコール、アミノ酸などが挙げられる。
００℃、好ましくは５５℃〜７５℃において、通常３〜
２００時間、好ましくは１０〜１００時間実施される。
また、蛋白質を熱から保護するため、安定化剤の存在下
で行ってもよい。安定化剤としては、たとえば、糖、糖
アルコール、アミノ酸などが挙げられる。
【００２５】尚、乾燥組成物は実質的に水分を含まない
ものであり、通常、その水分含量が３％以下、好適には
１％以下が望ましい。
ものであり、通常、その水分含量が３％以下、好適には
１％以下が望ましい。
【００２６】液状での加熱処理は、トリアルキルホスフ
ェート処理の前後どちらに行ってもよいが、好ましくは
トリアルキルホスフェート処理後に行う。トリアルキル
ホスフェート処理後に行う場合、トリアルキルホスフェ
ートなどを除去した後に蛋白質を加熱する。
ェート処理の前後どちらに行ってもよいが、好ましくは
トリアルキルホスフェート処理後に行う。トリアルキル
ホスフェート処理後に行う場合、トリアルキルホスフェ
ートなどを除去した後に蛋白質を加熱する。
【００２７】液状で加熱処理を行う場合、加熱処理は、
通常３０℃〜１００℃、好ましくは５５℃〜７５℃にお
いて、通常１〜１００時間、好ましくは５〜30時間実施
される。また、蛋白質を熱から保護するため、安定化剤
の存在下で行ってもよい。安定化剤としては、たとえ
ば、糖、糖アルコール、アミノ酸などが挙げられる。
通常３０℃〜１００℃、好ましくは５５℃〜７５℃にお
いて、通常１〜１００時間、好ましくは５〜30時間実施
される。また、蛋白質を熱から保護するため、安定化剤
の存在下で行ってもよい。安定化剤としては、たとえ
ば、糖、糖アルコール、アミノ酸などが挙げられる。
【００２８】
【発明の作用および効果】本発明の製造方法によれば、
トリアルキルホスフェート処理工程において蛋白質の活
性を殆ど損失することなく、効率的にウイルスが不活化
された蛋白質含有組成物が製造される。
トリアルキルホスフェート処理工程において蛋白質の活
性を殆ど損失することなく、効率的にウイルスが不活化
された蛋白質含有組成物が製造される。
【００２９】２５℃〜３０℃でのトリアルキルホスフェ
ート処理ではその温度で長く置くことにより溶液中に混
在するプロテアーゼによる蛋白質の分解が促進される可
能性があるが、プロテアーゼ阻害剤の存在下で処理する
ことより蛋白質の活性低下を抑制することができる。
ート処理ではその温度で長く置くことにより溶液中に混
在するプロテアーゼによる蛋白質の分解が促進される可
能性があるが、プロテアーゼ阻害剤の存在下で処理する
ことより蛋白質の活性低下を抑制することができる。
【００３０】なお、トリアルキルホスフェート処理はエ
ンベロープを持たないウイルスには不活化効果が弱い。
本発明のトリアルキルホスフェート処理の前または後
に、蛋白質含有組成物を加熱処理に付す工程を経ること
によってエンベロープを持たないウイルスも有意に不活
化することができる。
ンベロープを持たないウイルスには不活化効果が弱い。
本発明のトリアルキルホスフェート処理の前または後
に、蛋白質含有組成物を加熱処理に付す工程を経ること
によってエンベロープを持たないウイルスも有意に不活
化することができる。
【００３１】よって、本発明の製造方法は医薬品として
より安全な蛋白質含有組成物の工業的製法としてきわめ
て好ましい方法を提供するものであり、ウイルスの不活
化された蛋白質製剤を製造するのに特に有用である。
より安全な蛋白質含有組成物の工業的製法としてきわめ
て好ましい方法を提供するものであり、ウイルスの不活
化された蛋白質製剤を製造するのに特に有用である。
【００３２】
実施例１ コーンのＦｒ．Ｉペーストを０．０２５Ｍ ＥＤＴＡ−
２Ｎａおよび１０単位／mlのアプロチニンを含む０．０
５５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．４で溶解し
た後、５０℃で３０分加熱しフィブリノゲンを変性・除
去する。この液を濃縮後、濃縮液にアプロチニンを３０
単位／ml加え、ＴＮＢＰを０．３％ｗ／ｖ、Tween 80を
１％ｗ／ｖ添加し、３０℃、６時間以上のウイルス不活
化処理を行う。ウイルス不活化処理後フィブロネクチン
をＤＥＡＥ−セファデックスに吸着させ、よく洗浄し
て、ＴＮＢＰ、Tween 80を除去した後、ゲルよりフィブ
ロネクチンを溶出し、濃縮する。
２Ｎａおよび１０単位／mlのアプロチニンを含む０．０
５５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．４で溶解し
た後、５０℃で３０分加熱しフィブリノゲンを変性・除
去する。この液を濃縮後、濃縮液にアプロチニンを３０
単位／ml加え、ＴＮＢＰを０．３％ｗ／ｖ、Tween 80を
１％ｗ／ｖ添加し、３０℃、６時間以上のウイルス不活
化処理を行う。ウイルス不活化処理後フィブロネクチン
をＤＥＡＥ−セファデックスに吸着させ、よく洗浄し
て、ＴＮＢＰ、Tween 80を除去した後、ゲルよりフィブ
ロネクチンを溶出し、濃縮する。
【００３３】実施例２ 実施例１のフィブロネクチンを０．０５Ｍトリス−リン
酸緩衝液、pH８．０で３０mg／mlとなるように調製後
に、その水溶液１Ｌにショ糖１kgを添加してよく攪拌し
た後、６０℃で１０時間加熱し、ウイルスに対して安全
な製剤を製造する。
酸緩衝液、pH８．０で３０mg／mlとなるように調製後
に、その水溶液１Ｌにショ糖１kgを添加してよく攪拌し
た後、６０℃で１０時間加熱し、ウイルスに対して安全
な製剤を製造する。
【００３４】実施例３ クリオプレシピテートを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で溶
解し、水酸化アルミニウムゲルを１％ｗ／ｖ添加し、脱
プロトロンビン溶液を得る。この溶液にグリシンを２Ｍ
になるように添加し、フィブリノゲンを沈澱として除去
し、得られた上清に塩化ナトリウムを１．５Ｍになるよ
うに添加し、フィブロネクチンを上清に回収する。この
液を脱塩濃縮後、濃縮液にＥＡＣＡ（ε−アミノカプロ
ン酸）を４％加え、ＴＮＢＰを０．３％ｗ／ｖ、Tween
80を１％ｗ／ｖ添加し、３０℃、６時間以上のウイルス
不活化処理を行う。ウイルス不活化処理後、実施例１お
よび２と同様にＴＮＢＰおよびTween 80を除去し、さら
に６０℃で１０時間加熱処理し、ウイルスに対し安全な
製剤を製造する。
解し、水酸化アルミニウムゲルを１％ｗ／ｖ添加し、脱
プロトロンビン溶液を得る。この溶液にグリシンを２Ｍ
になるように添加し、フィブリノゲンを沈澱として除去
し、得られた上清に塩化ナトリウムを１．５Ｍになるよ
うに添加し、フィブロネクチンを上清に回収する。この
液を脱塩濃縮後、濃縮液にＥＡＣＡ（ε−アミノカプロ
ン酸）を４％加え、ＴＮＢＰを０．３％ｗ／ｖ、Tween
80を１％ｗ／ｖ添加し、３０℃、６時間以上のウイルス
不活化処理を行う。ウイルス不活化処理後、実施例１お
よび２と同様にＴＮＢＰおよびTween 80を除去し、さら
に６０℃で１０時間加熱処理し、ウイルスに対し安全な
製剤を製造する。
【００３５】
実験例１ 蛋白質の安定性 トロンビンでは、コーンのＦｒ．II＋III ペーストまた
はＦｒ．III ペーストを０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液
で溶解した後、トロンボプラスチン（胎盤抽出液）を添
加して、プロトロンビンをトロンビンに変換する。そし
てSP−セファデックスでトロンビンを吸着し、０．15Ｍ
塩化ナトリウム溶液でよく洗浄した後、０．５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む緩衝液でトロンビンを溶出する。ＳＰ−
セファデックス溶出液にＴＮＢＰを０．３％ｗ／ｖ、Tw
een 80を１％ｗ／ｖ添加し、３０℃で加温して経時的に
サンプリングし、トロンビン活性を測定したが、３０時
間後の活性ロスが大きく、３０℃、６時間後でも９０％
の活性維持が難しいと判断し、安定化剤のスクリーニン
グを行った。その結果、ＥＡＣＡ（ε−アミノカプロン
酸）とアルギニンの添加により、トロンビンの活性低下
を防ぐことができ、特にＥＡＣＡでは２％以上の添加で
３０℃、３０時間後も９０％以上の活性を維持できた
（図１および図２参照）。
はＦｒ．III ペーストを０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液
で溶解した後、トロンボプラスチン（胎盤抽出液）を添
加して、プロトロンビンをトロンビンに変換する。そし
てSP−セファデックスでトロンビンを吸着し、０．15Ｍ
塩化ナトリウム溶液でよく洗浄した後、０．５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む緩衝液でトロンビンを溶出する。ＳＰ−
セファデックス溶出液にＴＮＢＰを０．３％ｗ／ｖ、Tw
een 80を１％ｗ／ｖ添加し、３０℃で加温して経時的に
サンプリングし、トロンビン活性を測定したが、３０時
間後の活性ロスが大きく、３０℃、６時間後でも９０％
の活性維持が難しいと判断し、安定化剤のスクリーニン
グを行った。その結果、ＥＡＣＡ（ε−アミノカプロン
酸）とアルギニンの添加により、トロンビンの活性低下
を防ぐことができ、特にＥＡＣＡでは２％以上の添加で
３０℃、３０時間後も９０％以上の活性を維持できた
（図１および図２参照）。
【００３６】フィブリノゲンは、Ｆｒ．Ｉペーストを生
理食塩液に溶解した溶解液にＴＮＢＰを０．３％ｗ／
ｖ、Tween 80を１％ｗ／ｖ添加し、30℃で加温して、経
時的にサンプリングし、フィブリノゲン凝固活性を測定
した。その結果、３０℃、２４時間後では、全く凝固活
性を認めないことが判明し、安定化剤のスクリーニング
を行った。その結果、アプロチニンとＥＡＣＡに安定化
効果のあることが判明した。ＥＡＣＡを０．５Ｍ以上添
加することにより３０℃、２４時間後も９０％の凝固活
性を維持できた（図３参照）。
理食塩液に溶解した溶解液にＴＮＢＰを０．３％ｗ／
ｖ、Tween 80を１％ｗ／ｖ添加し、30℃で加温して、経
時的にサンプリングし、フィブリノゲン凝固活性を測定
した。その結果、３０℃、２４時間後では、全く凝固活
性を認めないことが判明し、安定化剤のスクリーニング
を行った。その結果、アプロチニンとＥＡＣＡに安定化
効果のあることが判明した。ＥＡＣＡを０．５Ｍ以上添
加することにより３０℃、２４時間後も９０％の凝固活
性を維持できた（図３参照）。
【００３７】実験例２ 実施例３で得たフィブロネクチンの脱塩濃縮液にＴＮＢ
Ｐを０．３％ｗ／ｖ、Tween 80を１％ｗ／ｖ添加し、３
０℃で加温して３時間後、６時間後、３０時間後にフィ
ブロネクチンのゼラチン結合活性を測定したところ、６
時間後の活性残存率は８５％であり、３０時間後では５
５％に低下したため、安定化剤のスクリーニングを行っ
た。その結果、ＥＡＣＡの場合は２％以上、アプロチニ
ンでは１０単位／ml以上添加することにより、フィブロ
ネクチンの活性低下を防ぐことができた（表１および表
２参照）。
Ｐを０．３％ｗ／ｖ、Tween 80を１％ｗ／ｖ添加し、３
０℃で加温して３時間後、６時間後、３０時間後にフィ
ブロネクチンのゼラチン結合活性を測定したところ、６
時間後の活性残存率は８５％であり、３０時間後では５
５％に低下したため、安定化剤のスクリーニングを行っ
た。その結果、ＥＡＣＡの場合は２％以上、アプロチニ
ンでは１０単位／ml以上添加することにより、フィブロ
ネクチンの活性低下を防ぐことができた（表１および表
２参照）。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
【００４０】実験例３ ウイルス不活化効果 フィブロネクチン含有組成物中のウイルスの不活化効果
を検討した。 （実験方法）実施例３で得たフィブロネクチンの脱塩濃
縮液にアプロチニンを30単位／ml加え、ＴＮＢＰを０．
３％ｗ／ｖ、Tween 80を１％ｗ／ｖになるように添加
し、エンベロープのあるウイルスとしてＶＳＶ、シンド
ビスウイルス（sindbis virus)、エンベロープのないウ
イルスとしてエコーウィルス(Echo virus)をモニターウ
イルスとして１０6 〜１０7 個／ml添加し、３０℃で加
温して経時的にサンプリングし、残存しているウイルス
を表３の方法により測定した。その結果は表４に示す通
りであり、いずれの製剤においてもＶＳＶ、シンドビス
ウイルスは３０℃、３０時間の処理で検出限界以下まで
不活化された。一方、膜のないウイルスであるエコーウ
イルスは３０℃、６時間後もほとんど不活化されなかっ
た。
を検討した。 （実験方法）実施例３で得たフィブロネクチンの脱塩濃
縮液にアプロチニンを30単位／ml加え、ＴＮＢＰを０．
３％ｗ／ｖ、Tween 80を１％ｗ／ｖになるように添加
し、エンベロープのあるウイルスとしてＶＳＶ、シンド
ビスウイルス（sindbis virus)、エンベロープのないウ
イルスとしてエコーウィルス(Echo virus)をモニターウ
イルスとして１０6 〜１０7 個／ml添加し、３０℃で加
温して経時的にサンプリングし、残存しているウイルス
を表３の方法により測定した。その結果は表４に示す通
りであり、いずれの製剤においてもＶＳＶ、シンドビス
ウイルスは３０℃、３０時間の処理で検出限界以下まで
不活化された。一方、膜のないウイルスであるエコーウ
イルスは３０℃、６時間後もほとんど不活化されなかっ
た。
【００４１】
【表３】
【００４２】
【表４】
【図１】トロンビンのトリアルキルホスフェート処理時
の活性残存率に及ぼすＥＡＣＡの添加効果を経時的に見
たものである。
の活性残存率に及ぼすＥＡＣＡの添加効果を経時的に見
たものである。
【図２】トロンビンのトリアルキルホスフェート処理時
の活性残存率に及ぼすアルギニンの添加効果を経時的に
見たものである。
の活性残存率に及ぼすアルギニンの添加効果を経時的に
見たものである。
【図３】フィブリノゲンのトリアルキルホスフェート処
理時の活性残存率に及ぼすＥＡＣＡの添加効果を経時的
に見たものである。
理時の活性残存率に及ぼすＥＡＣＡの添加効果を経時的
に見たものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 武智 和男 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 大村 孝男 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 平尾 豊 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 上村 八尋 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 横山 和正 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字中央研究所内
Claims (3)
- 【請求項１】 ウイルス夾雑の可能性のある蛋白質含有
液状組成物をプロテアーゼ阻害剤の存在下でトリアルキ
ルホスフェートと接触させることを特徴とするウイルス
の不活化された蛋白質含有組成物の製造方法。 - 【請求項２】 蛋白質含有液状組成物をプロテアーゼ阻
害剤と界面活性剤の存在下でトリアルキルホスフェート
と接触させることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 蛋白質が血液凝固第VIII因子、血液凝固
第IX因子、トロンビン、フィブリノゲンおよびフィブロ
ネクチンからなる群より選ばれる少なくとも１つである
請求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9070126A JP2965069B2 (ja) | 1989-01-13 | 1997-03-24 | 蛋白質含有組成物の製造方法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP673689 | 1989-01-13 | ||
| JP1-308466 | 1989-11-27 | ||
| JP1-6736 | 1989-11-27 | ||
| JP30846689 | 1989-11-27 | ||
| JP9070126A JP2965069B2 (ja) | 1989-01-13 | 1997-03-24 | 蛋白質含有組成物の製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005588A Division JP2681406B2 (ja) | 1989-01-13 | 1990-01-12 | 蛋白質含有組成物の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09227405A true JPH09227405A (ja) | 1997-09-02 |
| JP2965069B2 JP2965069B2 (ja) | 1999-10-18 |
Family
ID=27277320
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9070126A Expired - Lifetime JP2965069B2 (ja) | 1989-01-13 | 1997-03-24 | 蛋白質含有組成物の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2965069B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001514672A (ja) * | 1997-12-24 | 2001-09-11 | アルファー セラピューティック コーポレーション | 静脈投与用ガンマグロブリンの製造方法とその生産物 |
| JP2003528803A (ja) * | 1999-05-20 | 2003-09-30 | アルファ・セラピューティック・コーポレーション | 静注用免疫グロブリンの２回ウイルス不活化方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02504587A (ja) * | 1988-06-09 | 1990-12-27 | フォンダシオン・ナシオナール・ドゥ・トランスフューシオン・サンギーヌ | ７ａ因子に富む画分の製造方法及び医薬としてのその用途 |
-
1997
- 1997-03-24 JP JP9070126A patent/JP2965069B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02504587A (ja) * | 1988-06-09 | 1990-12-27 | フォンダシオン・ナシオナール・ドゥ・トランスフューシオン・サンギーヌ | ７ａ因子に富む画分の製造方法及び医薬としてのその用途 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001514672A (ja) * | 1997-12-24 | 2001-09-11 | アルファー セラピューティック コーポレーション | 静脈投与用ガンマグロブリンの製造方法とその生産物 |
| JP2003528803A (ja) * | 1999-05-20 | 2003-09-30 | アルファ・セラピューティック・コーポレーション | 静注用免疫グロブリンの２回ウイルス不活化方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2965069B2 (ja) | 1999-10-18 |
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