JP2681406C

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Publication number: JP2681406C
Authority: JP
Original assignee: 株式会社ミドリ十字
Publication date: 1999-07-05

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、ウイルス夾雑の可能性のある蛋白質含有組成物から実質的にウイル
スが不活化された蛋白質含有組成物を製造する方法に関する。〔従来技術〕人血液由来の蛋白質含有組成物には、ウイルス、たとえば肝炎ウイルスやＡＩ
ＤＳウイルスなどが混入してくる可能性がある。これらのウイルス伝播を防ぐために蛋白質含有液状組成物を加熱する方法が知
られている（特開昭５５−１４５６１５号公報、特開昭５６−１３９４２２号公
報、特開昭５６−１０６５９４号公報）。また、蛋白質含有乾燥組成物を加熱する方法も知られている（特表昭５８−５
００５４８号公報、特開昭５８−２１３７２１号公報）。さらに、蛋白質含有組成物をトリアルキルホスフェートと接触せしめてウイル
スを除去する方法も知られている（特開昭６０−５１１１６号公報）。しかし、加熱処理では熱に強いウイルスが残存する可能性があり、トリアルキ
ルホスフェート処理では非エンベロープウイルスが残存する可能性がある。また、トリアルキルホスフェート処理中に蛋白質の活性が低下する問題があっ
た。〔発明が解決しようとする課題〕本発明は蛋白質の活性を殆ど失うことなく効率よく夾雑ウイルスを不活化し、
医薬品としてより安全な蛋白質含有組成物を製造する方法を提供しようとするも
のである。〔課題を解決するための手段〕本発明はこれら課題を解決するために以下の方法を提供する。 (1) ウイルス夾雑の可能性のある蛋白質含有組成物からウイルスの不活化され
た蛋白質含有組成物を製造する方法であって、次の工程を含むことを特徴とする
方法。 (a) 液状の蛋白質含有組成物をトリアルキルホスフェートおよび界面活性剤と
接触させ、該蛋白質含有組成物からトリアルキルホスフェートおよび界面活性剤
を除去する、その後、 (b) 該蛋白質含有組成物を凍結乾燥し、乾燥状の該蛋白質含有組成物を加熱処
理する。 (2) ウイルス夾雑の可能性のある液状の蛋白質含有組成物をプロテアーゼ阻害
剤の存在下でトリアルキルホスフェートと接触させることを特徴とする前記(1)
のウイルスの不活化された蛋白質含有組成物を製造する方法。これら発明により、蛋白質の活性を失うことなく効率的にウイルスの不活化さ
れた蛋白質含有組成物が製造される。本発明の方法が適用される蛋白質は特に限定されるものではなく、血漿由来蛋
白質、他の組織由来蛋白質、遺伝子組み換えや組織培養によって得られた蛋白質
などが挙げられる。蛋白質としては、たとえばプラスミノーゲン、血液凝固第Ｖ
因子、血液凝固第ＶＩＩ因子、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、血液凝固第ＩＸ因子、
第Ｘ因子、血液凝固第ＸＩＩＩ因子、アンチトロンビンＩＩＩ、ハプトグロビン
、トロンビン、プロトロンビン、免疫グロブリン、フィブリノゲン、フィブロネクチン、アルブミン、ヘモグロビン、インターフェロン、プラスミノーゲン活性
化因子などが挙げられる。蛋白質含有液状組成物は、上記の如き蛋白質を含有す
るものであれば、特に制限されない。本発明の方法が適用される蛋白質含有液状組成物には特に制限はなく、たとえ
ば血漿または組織抽出液、血漿または組織抽出液を各種分画法により処理して得
た画分からなる溶液、遺伝子組換え宿主または組織の培養により得られる培養液
、市販の蛋白質製剤（液状のもの）または溶液としたものなどが挙げられる。また、本発明のトリアルキルホスフェートとの接触時の蛋白質含有液状組成物
の精製度は特に限定されるものではなく、任意の精製度のものに適用可能であり
、従ってトリアルキルホスフェートとの接触は蛋白質の分離、精製のいずれの段
階に適用してもよい。本発明の製造方法においては、トリアルキルホスフェート処理を先に行い、ト
リアルキルホスフェートおよび界面活性剤を除去した後、乾燥加熱処理を行う。本発明で使用されるトリアルキルホスフェートは特に限定されないが、好適に
はトリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート、トリ−（ｔｅｒｔ−ブチル）ホスフエー
ト、トリ−（ｎ−ヘキシル）ホスフェート、トリ−（２−エチルヘキシル）ホス
フェート、トリ−（ｎ−デシル）ホスフェートなどが挙げられる。特に好ましい
トリアルキルホスフェートはトリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（以下ＴＮＢＰ
と言う）である。なお、２種以上の異なるトリアルキルホスフェートの混合物も
使用することができる。本発明に使用されるトリアルキルホスフェートは、０．０１〜１０（ｗ／ｖ）
％の範囲の量、好ましくは約０．１〜３（ｗ／ｖ）％の範囲の量において使用さ
れる。トリアルキルホスフェートは界面活性剤と組み合わせて使用する。この界面活
性剤は、トリアルキルホスフェートが蛋白質含有液状組成物と接触する前、同時
、または後の任意の段階に添加することができる。界面活性剤の機能は、蛋白質
含有組成物中のウイルスとトリアルキルホスフェートとの接触を強化することで
ある。界面活性剤としては、脂肪酸のポリオキシエチレン誘導体、ソルビトール無水物の部分エステル、たとえばポリソルベート８０（商品名：トゥイーン８０など
）、ポリソルベート２０（商品名：トゥイーン２０など）および非イオン性油浴
水洗剤、たとえばオキシエチル化アルキルフェノール（商品名：トリトンＸ１０
０など）が挙げられる。さらに、デオキシコール酸ナトリウム、およびスルホベ
タインとして周知の合成ツブイッテルイオン洗剤であるＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ
ｓ、たとえばＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−アンモニオ−１−エタンス
ルホネート、およびその同族体、または非イオン性洗浄、たとえばオクチル−β
，Ｄ−グルコピラノシドなどが挙げられる。界面活性剤を使用する場合、その量は臨界的ではなく、たとえば約０．００１
％〜約１０％、好ましくは約０．０１％〜３％の範囲で使用することができる。トリアルキルホスフェート処理は、エンベロープコートウイルス、たとえばＢ
型肝炎ウイルス、ｎｏｎＡｎｏｎＢ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈ
ＩＶ）、ベシキュラーストマティティスウイルス（ＶｅｓｉｃｕｌａｒＳｔｏ
ｍａｔｉｔｉｓＶｉｒｕｓ）、シンドビスウイルス（ＳｉｎｄｂｉｓＶｉｒ
ｕｓ）等の不活化に特に有用である。また、さらに乾燥状態で充分な時間加熱処
理することにより、熱に強いウイルスも不活化し得る。本発明のトリアルキルホスフェートによる蛋白質含有組成物の処理は、−５℃
〜７０℃、好ましくは０℃〜６０℃の温度で、好適には３０分以上、より好適に
は１〜３０時間、さらに好適には３〜１０時間行う。トリアルキルホスフェート処理は、蛋白質の活性低下を防ぐために、プロテア
ーゼ阻害剤の存在下で行うのが好ましい。プロテアーゼ阻害剤としては、実質的にプロテアーゼの活性を阻害する物質で
あれば特に限定されない。たとえば、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、リジ
ン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸、アプロチニンなどの蛋白質などが例示さ
れる。普通、トリアルキルホスフェート処理後、トリアルキルホスフェートは除去さ
れる。界面活性剤や安定化剤を用いたときはそれらも除去される。除去はいずれ
の方法によってもよいが、たとえばアフィニティークロマトグラフィーで蛋白を
吸着する方法、蛋白を沈澱により回収する方法などが挙げられる。また、公知の加熱処理を行うこともできる。乾燥組成物（乾燥状の蛋白質含有組成物）の加熱処理はトリアルキルホスフェ
ート処理後に行う。トリアルキルホスフェート処理後に行う場合、乾燥組成物は
トリアルキルホスフェートなどを除去した後、蛋白質を回収、公知の方法で凍結
乾燥して得られる。乾燥組成物の加熱処理は、通常３０℃〜１００℃、好ましくは５５℃〜７５℃
において、通常３〜２００時間、好ましくは１０〜１００時間実施される。また
、蛋白質を熱から保護するため、安定化剤の存在下で行ってもよい。安定化剤と
しては、たとえば、糖、糖アルコール、アミノ酸などが挙げられる。尚、乾燥組成物は実質的に水分を含まないものであり、通常、その水分含量が
３％以下、好適には１％以下が望ましい。〔発明の作用および効果〕本発明の製造方法によれば、蛋白質の活性を損失することなく、効率的にウイ
ルスが不活化された蛋白質含有組成物が製造される。なお、トリアルキルホスフェート処理はエンベロープを持たないウイルスには
不活化効果が弱い。ところが、本発明によれば乾燥状の蛋白質含有組成物を加熱
処理に付す工程があるので、かかるウイルスも当該工程を経ることによって有意
に不活化することができる。また、２５℃〜３０℃でのトリアルキルホスフェート処理ではその温度で長く
置くことにより溶液中に混在するプロテアーゼによる蛋白質の分解が促進される
可能性があるが、プロテアーゼ阻害剤の存在下で処理することより蛋白質の活性
低下を抑制することができる。よって、本発明の製造方法は医薬品としてより安全な蛋白質含有組成物の工業
的製法としてきわめて好ましい方法を提供するものであり、ウイルスの不活化さ
れた蛋白質製剤を製造するのに特に有用である。〔実施例〕実施例１血液凝固第ＶＩＩＩ因子含有組成物の製造方法クリオプレシピテートを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で溶解し、水酸化アルミニウムゲルを１％ｖ／ｖ添加し、脱プロトロンビン溶液を得る。この溶液にＴＮＢ
Ｐ（トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート〕を０．３％ｗ／ｖ、Ｔｗｅｅｎ８０
を１％ｗ／ｖになるように添加し、３０℃で６時間ウイルス不活化処理をする。
そして、グリシンを２Ｍになるように添加し、遠心してフィブリノゲンを沈澱し
て除去し、得られた上清に、塩化ナトリウムを１．５Ｍになるように添加し、第
ＶＩＩＩ因子を沈澱として回収する。回収した第ＶＩＩＩ因子を２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液に溶解し、再度グリシン分画、塩化ナトリウム分画を行い、残存して
いるＴＮＢＰ、Ｔｗｅｅｎ８０を除去する。こうして得られた第ＶＩＩＩ因子
の沈澱は、所定の濃度になるように溶解しバイアルに小分され、凍結乾燥される
。凍結乾燥された第ＶＩＩＩ因子製剤は６０℃、７２時間以上の乾燥加熱処理を
行い、ウイルスに対し安全な製剤を製造する。実施例２血液凝固第ＩＸ因子含有組成物の製造方法プラズマにＤＥＡＥ−セファデックスを投入し、第ＩＸ因子をゲルに吸着させ
る。そして、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液でよく洗浄した後、０．５
Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液で第ＩＸ因子を溶出させる。この溶出液にＴＮＢ
Ｐを０．３％ｗ／ｖ、Ｔｗｅｅｎ８０を１％になるように添加し、３０℃、６
時間以上のウイルス不活化処理をする。ウイルス不活化処理をされた第ＩＸ因子
溶液は再度ＤＥＡＥ−セファデックスを投入し、第ＩＸ因子を吸着させ、洗浄す
ることによりＴＮＢＰ、Ｔｗｅｅｎ８０を洗液に除去することができる。また
ＤＥＡＥ−セファデックスの代わりに、第ＩＸ因子に対するモノクローナル抗体
を結合させたゲルに第ＩＸ因子を結合させ、同様に処理することができる。そし
て、ゲルより第ＩＸ因子を溶出させた後、所定のイオン強度、力価に調製され、
小分され、凍結乾燥されて、第ＩＸ因子製剤を得る。そして、さらに膜のないウ
イルスを不活化するために６０℃、７２時間以上の乾燥加熱が行われ、より安全
な製剤を製造する。実施例３トロンビン含有組成物の製造方法コーンのＦｒ．ＩＩ＋ＩＩＩペーストまたはＦｒ．ＩＩＩペーストを０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶解した後、トロンボプラスチン（胎盤抽出液）を添加
して、プロトロンビンをトロンビンに変換する。そしてＳＰ−セファデックスで
トロンビンを吸着し、０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液でよく洗浄した後、０．５
Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液でトロンビンを溶出する。この溶出液にＴＮＢＰ
を０．３％ｗ／ｖ、Ｔｗｅｅｎ８０を１％ｗ／ｖ添加し、３０℃、６時間以上
のウイルス不活化処理を行う。ウイルス不活化処理後トロンビンを再度ＳＰ−セ
ファデックスまたはヘパリン−ゲルに吸着させ、よく洗浄して、ＴＮＢＰ、Ｔｗ
ｅｅｎ８０を除去した後、ゲルよりトロンビンを溶出する。こうして得られた
トロンビンは、イオン強度、力価を調整し、小分けされ、凍結乾燥した後、６０
℃、７２時間以上の乾燥加熱処理を行う。実施例４フィブリノゲン含有組成物の製造方法コーンのＦｒ．Ｉペーストまたはクリオプレシピテートを生理食塩液で溶解し
、ＴＮＢＰを０．３％ｗ／ｖ、Ｔｗｅｅｎ８０を１％ｗ／ｖになるように添加
し、３０℃、６時間以上のウイルス不活化処理を行う。そして、グリシン−塩化
ナトリウム分画またはエタノール分画にて、フィブリノゲンを沈澱させる。得ら
れたフィブリノゲンの沈澱は、生理食塩液に溶解した後、再度グリシン−塩化ナ
トリウム分画またはエタノール分画を行い、フィブリノゲンを沈澱して回収する
。この分画操作は２〜５回行われ、ＴＮＢＰ、Ｔｗｅｅｎ８０は上清に除去さ
れる。こうして得られたフィブリノゲンの沈澱を所定の濃度に溶解し、小分、凍
結乾燥した後、６０℃、７２時間以上の乾燥加熱処理が行われる。実施例５血液凝固第ＶＩＩＩ因子含有組成物の製造方法正常ヒト・血漿を凍結融解して得られたクリオプレシピテートを出発材料に、
これを２０ｍＭトリス−１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で５倍抽出溶解
し、水酸化アルミニウムゲルをクリオプレシピテート投入重量の１／１０容量を
添加して３０分間攪拌した。その後ベントナイトを６ｇ／ｌの割合で添加して１
時間攪拌後４０００ｒｐｍ３０分間遠心分離し、上清を得、続いてウイルス不活
化のための界面活性剤処理（０．３％トリ−ｎ−ブチルホスフェイト、１％Ｔｗｅｅｎ８０の濃度になるように添加後、３０℃、６時間攪拌）を行い、これを
グリシン分画に供した。グリシン分画の条件は、この溶液にグリシンを１５０ｇ
／ｌの割合で添加して３０℃、１時間攪拌後遠心分離（４０００ｒｐｍ、３０分
間、３０℃）して上清を得、この上清に塩化ナトリウムを添加（８７ｇ／ｌ）後
１時間攪拌して第ＶＩＩＩ因子画分を塩析させ遠心沈澱（４０００ｒｐｍ、３０
分間、３０℃）を得た。その後、塩析沈澱を２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、２８０ｎ
ｍ吸光度を２５〜３０に調整した後ゲル濾過カラムの注入検体とした。カラムの
充填剤はファルマシア製のＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−４００ＨＲを使用し、検
体はカラムベッド容量の５〜７％の注入量でカラムより排出された第ＶＩＩＩ因
子活性画分を分取した。その条件は、次の通りである：注入サンプル：塩析沈澱溶解液カラム：ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−４００ＨＲ溶媒：２０ｍＭＴｒｉｓ（ＨＣＬ），１０ｍＭＣａＣｌ₂，１ＭＮａＣｌｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．０その結果、血液凝固第ＶＩＩＩ因子はカラムボイド画分に観察され、夾雑蛋白
が高度に分離されていた。その後、所定のイオン強度、力価に調整され、小分さ
れ、凍結乾燥されて、第ＶＩＩＩ因子製剤を得る。そして、さらに６０℃、７２時間以上の乾燥加熱が行われ、より安全な製剤を
製造する。〔実験例〕実験例１ウイルス不活化効果血液凝固第ＶＩＩＩ因子含有組成物、血液凝固第ＩＸ因子含有組成物、トロン
ビン含有組成物およびフィブリノゲン含有組成物中のウイルスの不活化効果を検
討した。（実験方法）第ＶＩＩＩ因子ではクリオプレシピテートの溶解液、第ＩＸ因子ではＤＥＡＥ
−セファデックス溶出液、トロンビンではＳＰ−セファデックス溶出液、フィブリノゲンではＦｒ．Ｉペースト溶解液と各製剤の製造工程サンプルに、ＴＮＢＰ
を０．３％ｗ／ｖ、Ｔｗｅｅｎ８０を１％ｗ／ｖになるように添加し、エンベ
ロープのあるウイルスとしてＶＳＶ、シンドビスウイルス（ｓｉｎｄｂｉｓｖ
ｉｒｕｓ）、エンベロープのないウイルスとしてエコーウイルス（Ｅｃｈｏｖ
ｉｒｕｓ）をモニターウイルスとして１０⁶〜１０⁷個／ｍｌ添加し、３０℃で加
温して経時的にサンプリングし、残存しているウイルスを第１表の方法により測
定した。その結果は第２〜４表に示す通りであり、いずれの製剤においてもＶＳ
Ｖ、シンドビスウイルスは３０℃、１時間の処理で検出限界以下まで不活化され
た。一方、膜のないウィルスであるエコーウィルスは３０℃、６０時間後もほと
んど不活化されなかった。実験例２蛋白質の安定性第ＶＩＩＩ因子ではクリオペーストの抽出液にＴＮＢＰを０．３％ｗ／ｖ、Ｔ
ｗｅｅｎ８０を１％ｗ／ｖ添加し、３０℃で加温し、経時的にサンプリングし
て第ＶＩＩＩ因子活性を測定したが、２４時間後の残存活性が８０％である（第
１図参照）ことより、３０℃、６時間ではほとんど第ＶＩＩＩ因子活性のロスが
ないと判断し、安定化剤のスクリーニングはしなかった。また、乾燥加熱時の安
定性も６０℃、７２時間後で９５％以上の活性を保持しており、あえて安定化剤
のスクリーニングはしなかった。第ＩＸ因子ではＤＥＡＥ溶出液にＴＮＢＰを０．３％ｗ／ｖ、Ｔｗｅｅｎ８
０を１％ｗ／ｖ添加し、３０℃で加温して経時的にサンプリングして第ＩＸ因子
活性を測定したが、２４時間後の残存活性が７６％で若干の活性低下が認められ
たが、３０℃、６時間ではほとんど問題にする低下でもないことより、安定化剤
の添加はしなかった。（第２図参照）。また乾燥加熱時の安定性も６０℃、７２時間後で９５％以上の活性を保持して
おり、あえて安定化剤のスクリーニングはしなかった。トロンビンではＳＰ−セファデックス溶出液にＴＮＢＰを０．３％ｗ／ｖ、Ｔ
ｗｅｅｎ８０を１％ｗ／ｖ添加し、３０℃で加温して経時的にサンプリングし
、トロンビン活性を測定したが、３０時間後の活性ロスが大きく、３０℃、６時
間後でも９０％の活性維持が難しいと判断し、安定化剤のスクリーニングを行っ
た。その結果、ＥＡＣＡ（ε−アミノカプロン酸）とアルギニンの添加により、
トロンビンの活性低下を防ぐことができ、特にＥＡＣＡでは２％以上の添加で３
０℃、３０時間後も９０％以上の活性を維持できた（第３図および第４図参照）
。フィブリノゲンはＦｒ．Ｉペーストの溶解液にＴＮＢＰを０．３％ｗ／ｖ、Ｔ
ｗｅｅｎ８０を１％ｗ／ｖ添加し、３０℃で加温して、経時的にサンプリング
し、フィブリノゲン凝固活性を測定した。その結果、３０℃、２４時間後では、
全く凝固活性を認めないことが判明し、安定化剤のスクリーニングを行った。そ
の結果、アプロチニンとＥＡＣＡに安定化効果のあることが判明した。ＥＡＣＡを５％以上添加することにより３０℃、２４時間後も９０％の凝固活性を維持で
きた（第５図参照）。

【図面の簡単な説明】第１図は、血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性残存率に及ぼす界面活性剤処理の影界面活性剤添加時の場合を各々示す。第２図は血液凝固第ＩＸ因子の活性残存率に及ぼす界面活性剤処理の影響を経性剤添加時の場合を各々示す。第３図は、トロンビンの界面活性剤処理時の活性残存率に及ぼすＥＡＣＡの添の場合を各々示す。第４図は、トロンビンの界面活性剤処理時の活性残存率に及ぼすアルギニンのン８％添加時の場合を各々示す。第５図は、フィブリノゲンの界面活性剤処理時の活性残存率に及ぼすＥＡＣＡ
の添加効果を経時的に見たものである。

Claims

【特許請求の範囲】【請求項１】ウイルス夾雑の可能性のある蛋白質含有組成物からウイルスの不
活化された蛋白質含有組成物を製造する方法であって、次の工程を含むことを特
徴とする方法。 (a) 液状の蛋白質含有組成物をトリアルキルホスフェートおよび界面活性剤と
接触させ、該蛋白質含有組成物からトリアルキルホスフェートおよび界面活性剤
を除去する、その後、 (b) 該蛋白質含有組成物を凍結乾燥し、乾燥状の該蛋白質含有組成物を加熱処
理する。【請求項２】ウイルス夾雑の可能性のある液状の蛋白質含有組成物をプロテア
ーゼ阻害剤の存在下でトリアルキルホスフェートと接触させることを特徴とする
請求項１記載のウイルスの不活化された蛋白質含有組成物を製造する方法。