JPH02180833A - 蛋白質含有組成物の製造方法 - Google Patents
蛋白質含有組成物の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野)
本発明は、ウィルス夾雑の可能性のある蛋白質含有組成
物から実質的にウィルスが除去された高活性の蛋白質含
有組成物を製造する方法に関する。
物から実質的にウィルスが除去された高活性の蛋白質含
有組成物を製造する方法に関する。
人血液由来の蛋白質含有組成物は、ウィルス、たとえば
肝炎ウィルスやAIDSウィルスなどが混入してくる可
能性がある。
肝炎ウィルスやAIDSウィルスなどが混入してくる可
能性がある。
これらのウィルス伝播を防ぐために液状の蛋白含有組成
物を加熱する方法が知られている(特開昭55−145
615号公報、特開昭5(i−139422号公報、特
開昭5f3−106594号公報)。
物を加熱する方法が知られている(特開昭55−145
615号公報、特開昭5(i−139422号公報、特
開昭5f3−106594号公報)。
また、蛋白質含有組成物をトリアルキルホスフェートと
接触せしめてウィルスを除去する方法が知られている(
特開昭60−51116号公報)。
接触せしめてウィルスを除去する方法が知られている(
特開昭60−51116号公報)。
しかし、加熱処理では熱に強いウィルスが残存する可能
性があり、トリアルキルホスフェート処理では非エンベ
ロープウィルスが残存する可能性がある。
性があり、トリアルキルホスフェート処理では非エンベ
ロープウィルスが残存する可能性がある。
本発明の目的は蛋白質の活性を殆ど失うことなく効率よ
く、通常のウィルスはもとよりのこと熱に強いウィルス
、非エンベロープウィルス等の夾雑ウィルスをも不活化
し、医薬品としてより安全な蛋白質含有組成物を提供し
ようとするものである。
く、通常のウィルスはもとよりのこと熱に強いウィルス
、非エンベロープウィルス等の夾雑ウィルスをも不活化
し、医薬品としてより安全な蛋白質含有組成物を提供し
ようとするものである。
(課題を解決するための手段〕
当該目的ないしは課題は本発明、即ちウイルス夾雑の可
能性のある蛋白賞金を液状組成物を50℃以上の温度条
件下でトリアルキルホスフェートと接触せしめてウィル
スを不活化せしめた後、アフィニティークロマトグラフ
ィーで処理することによる蛋白質含有組成物の製造方法
によって解決され、かくして蛋白質の活性を失うことな
く効率的にウィルスの不活化された蛋白質含有組成物が
提供される。
能性のある蛋白賞金を液状組成物を50℃以上の温度条
件下でトリアルキルホスフェートと接触せしめてウィル
スを不活化せしめた後、アフィニティークロマトグラフ
ィーで処理することによる蛋白質含有組成物の製造方法
によって解決され、かくして蛋白質の活性を失うことな
く効率的にウィルスの不活化された蛋白質含有組成物が
提供される。
本発明の方法が適用できる蛋白質は特に限定されるもの
ではなく、血漿由来蛋白質、他の組織由来蛋白質、遺伝
子組み換えや&IIta培養によって得られた蛋白質な
どが挙げられる。蛋白質としては、たとえばプラスミノ
ーゲン、血液凝固第■囚子、血液凝固第■因子、血液凝
固第X■因子、アンチトロンビン■、ハプトグロビン、
トロンビン、免疫グロブリンなどが挙げられる。蛋白質
含有組成物は、上記の如き蛋白質を含有するものであれ
ば特に制限はない。
ではなく、血漿由来蛋白質、他の組織由来蛋白質、遺伝
子組み換えや&IIta培養によって得られた蛋白質な
どが挙げられる。蛋白質としては、たとえばプラスミノ
ーゲン、血液凝固第■囚子、血液凝固第■因子、血液凝
固第X■因子、アンチトロンビン■、ハプトグロビン、
トロンビン、免疫グロブリンなどが挙げられる。蛋白質
含有組成物は、上記の如き蛋白質を含有するものであれ
ば特に制限はない。
本発明の方法が適用される蛋白賞金存液状組成物には特
に制限はなく、たとえば血漿または組織抽出液、血漿ま
たは&[l織抽出液を各種分画法により処理して得た百
分からなる溶液、遺伝子組換え宿主または組織の墳養に
より得られる培養液、市販の蛋白質製剤(液状のもの)
または溶液としたものなどが挙げられる。
に制限はなく、たとえば血漿または組織抽出液、血漿ま
たは&[l織抽出液を各種分画法により処理して得た百
分からなる溶液、遺伝子組換え宿主または組織の墳養に
より得られる培養液、市販の蛋白質製剤(液状のもの)
または溶液としたものなどが挙げられる。
また、本発明のトリアルキルホスフェートとの接触時の
蛋白賞金を液状組成物の精製度は特に限定されるもので
はなく、任意の精製度のものに適用可能であり、従ワて
トリアルキルホスフェートとの接触は蛋白質の分離、間
型のいずれの段階に適用してもよい。
蛋白賞金を液状組成物の精製度は特に限定されるもので
はなく、任意の精製度のものに適用可能であり、従ワて
トリアルキルホスフェートとの接触は蛋白質の分離、間
型のいずれの段階に適用してもよい。
本発明で使用されるトリアルキルホスフェートは特に限
定されないが、好適にはトリー(n−ブチル)ホスフェ
ート、トリー(tert−ブチル)ホスフェ−F、F’
J (n−ヘキシル)ホスフェ−)、)+J−(2
−エチルヘキシル)ホスフェート、トリー(n−デシル
)ホスフェートなどが挙げられる。特に好ましいトリア
ルキルホスフェートはトリー(n−ブチル)ホスフェー
ト(以下TNBPと言う)である、なお、211以上の
異なるトリアルキルホスフェートの混合物も使用するこ
とができる。
定されないが、好適にはトリー(n−ブチル)ホスフェ
ート、トリー(tert−ブチル)ホスフェ−F、F’
J (n−ヘキシル)ホスフェ−)、)+J−(2
−エチルヘキシル)ホスフェート、トリー(n−デシル
)ホスフェートなどが挙げられる。特に好ましいトリア
ルキルホスフェートはトリー(n−ブチル)ホスフェー
ト(以下TNBPと言う)である、なお、211以上の
異なるトリアルキルホスフェートの混合物も使用するこ
とができる。
本発明に使用されるトリアルキルホスフェートは、0.
01〜10 (W/V)%の範囲の量、好ましくは約0
.1〜3(w/v)%の範囲の量において使用される。
01〜10 (W/V)%の範囲の量、好ましくは約0
.1〜3(w/v)%の範囲の量において使用される。
トリアルキルホスフェートは界面活性剤を伴ってまたは
伴わないで使用することができる。好ましくは、トリア
ルキルホスフェートを界面活性剤と組み合わせて使用す
る。この界面活性剤は、トリアルキルホスフェートが蛋
白賞金を液状組成物と接触する前、同時、または後の任
意の段階に添加することができる。界面活性剤の作用は
、蛋白質含有組成物中のウィルスとトリアルキルホスフ
ェートとの接触を強化することである。
伴わないで使用することができる。好ましくは、トリア
ルキルホスフェートを界面活性剤と組み合わせて使用す
る。この界面活性剤は、トリアルキルホスフェートが蛋
白賞金を液状組成物と接触する前、同時、または後の任
意の段階に添加することができる。界面活性剤の作用は
、蛋白質含有組成物中のウィルスとトリアルキルホスフ
ェートとの接触を強化することである。
界面活性剤としては、脂肪酸のポリオキシエチレン誘導
体、ソルビトール無水物の部分エステル、たとえばトウ
ィーン80、トウィーン20およびポリソルベート80
、および非イオン性油溶水洗剤、たとえばトリトンX1
00 (オキシエチル化アルキルフェノール)が挙げら
れる。さらに、デオキシコール酸ナトリウム、およびス
ルホベクインとして周知の合成ツブイッテルイオン洗剤
であるZwltter(ents、たとえばN−ドデシ
ル−N、 N−ジメチル−2−アンモニオ−1−エタン
スルホネート、およびその同族体、または非イオン性洗
浄、たとえばオクチル−β、D−グルコピラノシドなど
が挙げられる。
体、ソルビトール無水物の部分エステル、たとえばトウ
ィーン80、トウィーン20およびポリソルベート80
、および非イオン性油溶水洗剤、たとえばトリトンX1
00 (オキシエチル化アルキルフェノール)が挙げら
れる。さらに、デオキシコール酸ナトリウム、およびス
ルホベクインとして周知の合成ツブイッテルイオン洗剤
であるZwltter(ents、たとえばN−ドデシ
ル−N、 N−ジメチル−2−アンモニオ−1−エタン
スルホネート、およびその同族体、または非イオン性洗
浄、たとえばオクチル−β、D−グルコピラノシドなど
が挙げられる。
界面活性剤を使用する場合、その螢は臨界的ではなく、
たとえば約0.QO1%〜約10%、好ましくは約0.
01%〜1.5%の範囲で使用することができる。
たとえば約0.QO1%〜約10%、好ましくは約0.
01%〜1.5%の範囲で使用することができる。
トリアルキルホスフェート処理は、エンベロープコート
ウィルス、たとえばB型肝炎ウィルス、nonAnon
B型肝炎ウィルスの不活化に特に有用である。また、さ
らに50°C以上で充分な時間加熱処理することにより
、熱に強いウィルスも同時に不活化し得る。
ウィルス、たとえばB型肝炎ウィルス、nonAnon
B型肝炎ウィルスの不活化に特に有用である。また、さ
らに50°C以上で充分な時間加熱処理することにより
、熱に強いウィルスも同時に不活化し得る。
よって、本発明のトリプルキルホスフェートによる蛋白
質含有組成物の処理は、50”C以上、好ましくは60
〜75℃の温度条件下で30分以上、好ましくは3〜3
0時間行う、最適には、60°C程度で10〜20時間
程度の処理である。
質含有組成物の処理は、50”C以上、好ましくは60
〜75℃の温度条件下で30分以上、好ましくは3〜3
0時間行う、最適には、60°C程度で10〜20時間
程度の処理である。
また、加熱処理は蛋白質を熱から保護するために安定化
剤の存在下で行ってもよい、安定化剤としては、糖、糖
アルコール、アミノ酸などが挙げられる。
剤の存在下で行ってもよい、安定化剤としては、糖、糖
アルコール、アミノ酸などが挙げられる。
処理後、該蛋白質含有組成物をアフィニティークロマト
グラフィーで処理する。アフィニティークロマトグラフ
ィーで処理することにより、トリアルキルホスフェート
、界面活性剤、加熱処理時の安定化剤を除去することが
できる。さらに、非エンベロープコートウィルスであり
、特別熱に強いウィルスが残存していたとしても、本ア
フィニティークロマトグラフィー処理で除去可能である
。
グラフィーで処理する。アフィニティークロマトグラフ
ィーで処理することにより、トリアルキルホスフェート
、界面活性剤、加熱処理時の安定化剤を除去することが
できる。さらに、非エンベロープコートウィルスであり
、特別熱に強いウィルスが残存していたとしても、本ア
フィニティークロマトグラフィー処理で除去可能である
。
アフィニティークロマトグラフィーは、蛋白質の種類に
よって適当に選択され得る。たとえば、プラスミノーゲ
ンの場合、固定化リジンによるクロマトグラフィーで処
理することができる。
よって適当に選択され得る。たとえば、プラスミノーゲ
ンの場合、固定化リジンによるクロマトグラフィーで処
理することができる。
固定化リジンとは、不溶性担体にリジンを固定化したも
のである。不溶性坦体としては、アガロース、架橋デキ
ストラン、セルロース、ボI77クリルアミド、親水性
とニルポリマーなどが挙げられる。
のである。不溶性坦体としては、アガロース、架橋デキ
ストラン、セルロース、ボI77クリルアミド、親水性
とニルポリマーなどが挙げられる。
固定化方法は特に限定されるものではなく、自体公知の
方法にて行えばよい。
方法にて行えばよい。
処理方法はバッチ法、カラム法のいずれを用いてもよい
、平61溶媒および吸着溶媒としては、pH6〜8(好
ましくはpH7〜7.5)の緩衝液(たとえば、リン酸
緩衝液、グリシン11衝液など)が用いられる。また、
塩化ナトリウムなどを添加しておくことも可能である。
、平61溶媒および吸着溶媒としては、pH6〜8(好
ましくはpH7〜7.5)の緩衝液(たとえば、リン酸
緩衝液、グリシン11衝液など)が用いられる。また、
塩化ナトリウムなどを添加しておくことも可能である。
上記条件下、蛋白質は不溶性担体に吸着する。溶出溶媒
としては、たとえば50〜500mM(好ましくはI
Q O〜、300mM)のEACA (イプシロンアミ
ノカプロン酸)あるいはリジンを含む溶媒(pH6〜8
)が用いられる。カラム法の場合、常識的には、プラス
ミノゲン吸着後、ゲル量の約2.5倍の上記緩衝液によ
る洗浄で未吸着物は洗浄除去されるが、本発明における
トリアルキルホスフェートなどの洗浄、除去には4倍以
上(好ましくは4〜10倍)の上記緩衝液による洗浄を
行うのが望ましい。
としては、たとえば50〜500mM(好ましくはI
Q O〜、300mM)のEACA (イプシロンアミ
ノカプロン酸)あるいはリジンを含む溶媒(pH6〜8
)が用いられる。カラム法の場合、常識的には、プラス
ミノゲン吸着後、ゲル量の約2.5倍の上記緩衝液によ
る洗浄で未吸着物は洗浄除去されるが、本発明における
トリアルキルホスフェートなどの洗浄、除去には4倍以
上(好ましくは4〜10倍)の上記緩衝液による洗浄を
行うのが望ましい。
血液凝固第X因子は抗第■囚子抗体よりなる吸着剤、具
体的には固定化抗第■因子抗体を用いたアフィニティー
クロマトグラフィーで処理することができる。担体とし
ては、ポリクローナル抗体カラム、モノクローナル抗体
カラムのどちらを用いてもよい。
体的には固定化抗第■因子抗体を用いたアフィニティー
クロマトグラフィーで処理することができる。担体とし
ては、ポリクローナル抗体カラム、モノクローナル抗体
カラムのどちらを用いてもよい。
ポリクローナル抗体に関して、抗第■因子抗体は、高度
に精製した第X因子を動物に免疫し、得られた血清から
回収・精製することによって得られる。
に精製した第X因子を動物に免疫し、得られた血清から
回収・精製することによって得られる。
当該抗血清の製造は公知の方法にて行なえばよく、たと
えば高度精製第■因子とフロイントの完全アジュバント
の混合乳液を作り、動物の皮肉に2〜3回注射し、最終
免疫の数日後採血を行ない室温で凝固せしめた後、4℃
で一夜放置し、3.00Orpm 、20分間の遠心分
離により当該抗血清が得られる。
えば高度精製第■因子とフロイントの完全アジュバント
の混合乳液を作り、動物の皮肉に2〜3回注射し、最終
免疫の数日後採血を行ない室温で凝固せしめた後、4℃
で一夜放置し、3.00Orpm 、20分間の遠心分
離により当該抗血清が得られる。
免疫に用いる動物としては、特に動物種を這ぶ必要はな
く、たとえば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマな
どが挙げられる。当該抗血清の精製は、たとえば、j、
八m、 Ches、 Soc、、 64.3386 (
1940)、 Fed、 Proc、、 u、 116
1 (1958)に記載の方法にて行なわれる。
く、たとえば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマな
どが挙げられる。当該抗血清の精製は、たとえば、j、
八m、 Ches、 Soc、、 64.3386 (
1940)、 Fed、 Proc、、 u、 116
1 (1958)に記載の方法にて行なわれる。
モノクローナル抗体に関して、抗第■因子抗体は細胞融
合法によって得られる。細胞融合法は自体既知の手段に
て行なわれ、その−例は増殖性を持った細胞と目的とす
る抗体を産生しているリンパ球とをポリエチレングリコ
ールの存在下で反応せしめることにより、増殖性と抗体
産生能とを同時に兼ね備えた細胞を製し、この細胞に抗
体を産生せしめるものであり、当該抗体は一個の抗原決
定基に対してのみ反応する単一の抗体である。
合法によって得られる。細胞融合法は自体既知の手段に
て行なわれ、その−例は増殖性を持った細胞と目的とす
る抗体を産生しているリンパ球とをポリエチレングリコ
ールの存在下で反応せしめることにより、増殖性と抗体
産生能とを同時に兼ね備えた細胞を製し、この細胞に抗
体を産生せしめるものであり、当該抗体は一個の抗原決
定基に対してのみ反応する単一の抗体である。
より具体的には増殖性を持つ細胞としてマウスミエロー
マ細胞を、抗体産生リンパ球として第X因子で免疫され
たマウスI11臓細胞(BwJ胞)を用いて融合させ、
さらに目的とする抗体を産生じている細胞をスクリーニ
ングして、当X亥細胞から第X因子のモノクローナル抗
体を得る。
マ細胞を、抗体産生リンパ球として第X因子で免疫され
たマウスI11臓細胞(BwJ胞)を用いて融合させ、
さらに目的とする抗体を産生じている細胞をスクリーニ
ングして、当X亥細胞から第X因子のモノクローナル抗
体を得る。
また、このようにして得られた抗第■囚子抗体をその活
性を失うことなく固定化する方法としては、以下の不溶
性マトリックスを応用する方法をあげることができ石、
かかる方法としては、たとえばアミノ酸のコポリマーを
使用する方法(J。
性を失うことなく固定化する方法としては、以下の不溶
性マトリックスを応用する方法をあげることができ石、
かかる方法としては、たとえばアミノ酸のコポリマーを
使用する方法(J。
[1io1. Chepx、、皿1970 (1961
)) 、セルロースを使用する方法(Nature、
189 576 (1961))、アガロースあるいは
セファデックスを使用する方法(Nature、 1J
51.1491 (1967)、 Nature、 2
45 3059(1970)) 、ポリアクリルアミド
を使用する方法(Biochem、、 fJ、 407
4 (1966))などがあげられる。
)) 、セルロースを使用する方法(Nature、
189 576 (1961))、アガロースあるいは
セファデックスを使用する方法(Nature、 1J
51.1491 (1967)、 Nature、 2
45 3059(1970)) 、ポリアクリルアミド
を使用する方法(Biochem、、 fJ、 407
4 (1966))などがあげられる。
これらの方法により抗第■囚子抗体を効率良く固定化し
うる。また、このようにして得られた吸着剤を用いるこ
とにより、収率良く、しかも高純度の第X因子を得るこ
とができる。
うる。また、このようにして得られた吸着剤を用いるこ
とにより、収率良く、しかも高純度の第X因子を得るこ
とができる。
本発明に関して、固定化抗血液凝固第■因子坑体による
処理は、たとえば以下の通りにして行われる。まず、適
度に情調した第■因子含有水溶液を適当な溶媒〔例えば
、0.01〜0.1 M )リス緩衝液(pH6〜8)
〕で平衡化した固定化抗第■因子抗体にアプライする。
処理は、たとえば以下の通りにして行われる。まず、適
度に情調した第■因子含有水溶液を適当な溶媒〔例えば
、0.01〜0.1 M )リス緩衝液(pH6〜8)
〕で平衡化した固定化抗第■因子抗体にアプライする。
同じ溶媒で洗浄後、溶出液で溶出させた第X因子画分を
回収する。
回収する。
血液凝固第■因子も、たとえば固定化抗第■囚子抗体を
用いたアフィニティークロマトグラフィーで処理するこ
とができる。
用いたアフィニティークロマトグラフィーで処理するこ
とができる。
アンチトロンビン■は、たとえば固定化ヘパリンを用い
たアフィニティークロマトグラフィーで処理することが
できる(特開昭48−35017号公報)。
たアフィニティークロマトグラフィーで処理することが
できる(特開昭48−35017号公報)。
ハプトグロビンは、たとえば固定化グロビンを用いたア
フィニティークロマトグラフィーで処理することができ
る(特開昭55−111496号公報)。
フィニティークロマトグラフィーで処理することができ
る(特開昭55−111496号公報)。
その他、蛋白によってアフィニティークロマトグラフィ
ーを適当に選択することができる。
ーを適当に選択することができる。
本発明の製造方法によれば、蛋白質の活性の極めて少な
い損失の下に、効率的にウィルスを不活化することがで
きるので、ウィルス感染性が極めて少なく、かつ活性の
高い蛋白質含有組成物を提供することができる。
い損失の下に、効率的にウィルスを不活化することがで
きるので、ウィルス感染性が極めて少なく、かつ活性の
高い蛋白質含有組成物を提供することができる。
より具体的には、本発明は以下の作用効果を有するもの
である。
である。
熱に強いウィルスはトリアルキルホスフェート処理によ
って不活化することができるが、トリアルキルホスフェ
ート処理は非エンベロープコートウィルスには不活化効
果が弱く、50”C以上の温度条件下でウィルスを不活
化処理を行うことによりそれを補う効果がある。そして
、たとえなお残存しているウィルスがあったとしても、
その後のアフィニティークロマトグラフィー処理でその
ウィルスを除去することができる。
って不活化することができるが、トリアルキルホスフェ
ート処理は非エンベロープコートウィルスには不活化効
果が弱く、50”C以上の温度条件下でウィルスを不活
化処理を行うことによりそれを補う効果がある。そして
、たとえなお残存しているウィルスがあったとしても、
その後のアフィニティークロマトグラフィー処理でその
ウィルスを除去することができる。
また、25℃〜30℃でのトリアルキルホスフェート処
理ではその温度で長くおくことより溶液中に混在するプ
ラスミンなどのプロテアーゼによる蛋白質の分解が促進
される可能性がある。しかし、50℃以上で処理をする
ときには、混在プロテアーゼによる蛋白質の分解は考え
られない。
理ではその温度で長くおくことより溶液中に混在するプ
ラスミンなどのプロテアーゼによる蛋白質の分解が促進
される可能性がある。しかし、50℃以上で処理をする
ときには、混在プロテアーゼによる蛋白質の分解は考え
られない。
よって、本発明の製造方法は医薬品としてより安全な蛋
白質含有組成物の工業的製法としてきゎめて好ましい方
法を提供するものである。
白質含有組成物の工業的製法としてきゎめて好ましい方
法を提供するものである。
実施例1
コーンの冷エタノール分画法で得られた両分■+■ペー
スト抽出残査(100g)を、10単位/麺1のアプロ
チニンと0.1M塩化ナトリウムを含むトリス塩M1S
街液(pH8,3)に懸濁し、少時撹拌した後、5%硫
酸アンモニウムを添加・撹拌し遠心分離により上清を分
離した。更に、この上清に30%硫酸アンモニウムを添
加・撹拌し遠心分離により沈R1gを分離した。′この
沈澱を、アプロチニン40 K T E/ml、0.9
%塩化ナトリウムを含む0.9%グリシン溶液(pH1
7,2)に懸濁した。
スト抽出残査(100g)を、10単位/麺1のアプロ
チニンと0.1M塩化ナトリウムを含むトリス塩M1S
街液(pH8,3)に懸濁し、少時撹拌した後、5%硫
酸アンモニウムを添加・撹拌し遠心分離により上清を分
離した。更に、この上清に30%硫酸アンモニウムを添
加・撹拌し遠心分離により沈R1gを分離した。′この
沈澱を、アプロチニン40 K T E/ml、0.9
%塩化ナトリウムを含む0.9%グリシン溶液(pH1
7,2)に懸濁した。
このプラスミノゲン含有溶液1ml当たり、シュクロー
スf、75g、0.3%TNBP(トリー(n−ブチル
)ホスフェート)および1%〒ween 80を加えた
溶液を調製し、60°c10時間加熱した。
スf、75g、0.3%TNBP(トリー(n−ブチル
)ホスフェート)および1%〒ween 80を加えた
溶液を調製し、60°c10時間加熱した。
加熱後、プラスミノゲン溶液をDeutsch、 D、
G。
G。
ら(Science、 Hム1095. (1970)
)の方法に準じて0.9%塩化ナトリウムを含む0.
9%グリシン溶液(p)17.2)で平衡化したりジン
−セファロースカラム(100+sl)に注入し、プラ
スミノゲンを吸着させ、次いで0.9%塩化ナトリウム
を含む0.9%グリシン溶液(pH7,2)で洗浄、更
に1M塩化ナトリウムを含む0.9%グリシン溶液(p
H7,2)500鵬lで洗浄後、0.25 Mリジンを
含む0.9%グリシン溶液(pH7,2)を用いて吸着
したプラスミノゲンを溶出せしめた。
)の方法に準じて0.9%塩化ナトリウムを含む0.
9%グリシン溶液(p)17.2)で平衡化したりジン
−セファロースカラム(100+sl)に注入し、プラ
スミノゲンを吸着させ、次いで0.9%塩化ナトリウム
を含む0.9%グリシン溶液(pH7,2)で洗浄、更
に1M塩化ナトリウムを含む0.9%グリシン溶液(p
H7,2)500鵬lで洗浄後、0.25 Mリジンを
含む0.9%グリシン溶液(pH7,2)を用いて吸着
したプラスミノゲンを溶出せしめた。
実験例1
実施例1で得られたプラスミノゲン含有溶液をシュクロ
ース存在下あるいはシュクロース、TNB P /Tw
een 80共存下で60℃、10時間液状加熱した時
のプラスミノゲンの安定性を検討した。
ース存在下あるいはシュクロース、TNB P /Tw
een 80共存下で60℃、10時間液状加熱した時
のプラスミノゲンの安定性を検討した。
(実験方法)
プラスミノゲン含を溶液にアプロチニン40KIE/鋤
lを添加後、!++1当たり、シュクロースを1.5
g、 1.75 gあるいは2.0g加え、60℃、1
0時間加熱し、PLO(プラスミノゲン)の安定性を検
討した。シュクロース1.5g、1.75g添加の系で
はさらに0.3%TNBP/1%Tween80を加え
た溶液も調製し、界面活性剤のT’LG安定性への影響
を検討した。PLO活性はMCA (メチルクマリルア
ミド合成基質を用いて測定し、プラスミノゲン標準品の
検狙線に基づいて活性を換算した。
lを添加後、!++1当たり、シュクロースを1.5
g、 1.75 gあるいは2.0g加え、60℃、1
0時間加熱し、PLO(プラスミノゲン)の安定性を検
討した。シュクロース1.5g、1.75g添加の系で
はさらに0.3%TNBP/1%Tween80を加え
た溶液も調製し、界面活性剤のT’LG安定性への影響
を検討した。PLO活性はMCA (メチルクマリルア
ミド合成基質を用いて測定し、プラスミノゲン標準品の
検狙線に基づいて活性を換算した。
(結果)
プラスミノゲンの安定性は、プラスミノゲンの活性回収
率として表1に示した。
率として表1に示した。
表1に示すように11の溶液に対し、1.5g以上のシ
ュクロースを添加した溶液で60″C110時間加熱後
、70%以上の活性を口取した。また、シュクロース添
加液にさらに界面活性剤を添加しても活性回収率の低下
は認められなかった。この結果は、60°C,10時間
加熱でもPLOは界面活性剤によって失活されないこと
を示唆した。
ュクロースを添加した溶液で60″C110時間加熱後
、70%以上の活性を口取した。また、シュクロース添
加液にさらに界面活性剤を添加しても活性回収率の低下
は認められなかった。この結果は、60°C,10時間
加熱でもPLOは界面活性剤によって失活されないこと
を示唆した。
表1 プラスミノゲン含存溶液の液状加熱におけるプラ
スミノゲンの活性回収率 シュクロース濃度”(g) 活性回収率(%) プラスミノゲン含有溶液 1001.5
72 1.75 B12.0
82 1.5+D” 841.75+0
9201=溶液11に対するシュ
クロース添加量。
スミノゲンの活性回収率 シュクロース濃度”(g) 活性回収率(%) プラスミノゲン含有溶液 1001.5
72 1.75 B12.0
82 1.5+D” 841.75+0
9201=溶液11に対するシュ
クロース添加量。
sl、 Dは0.3%TNBP/1%Tween80添
加。
加。
実験例2
・ウィルス不活化効果
実施例!で得られたプラスミノゲン含存溶液を用いて界
面活性剤のウィルス不活化効果を30°C160°Cで
検討した。
面活性剤のウィルス不活化効果を30°C160°Cで
検討した。
(実験方法)
プラスミノゲン含有溶液1ml当たりシュクロース1.
5gを加えた溶液、およびその溶液にさらに0、3%T
NBP、1%Tween 80を加えた溶液を調製し、
一定量のウィルスを添加後、60″Cで加温した。一方
、30℃加温によるウィルス不活化検討用として、プラ
スミノゲン含有コーンのフラクシッンにT N B P
/ Tween 80を加えた溶液、および上記のシ
ュクロース溶液を4倍希釈後、’rNBP /Twee
n 80を加えた溶液を調製し、一定量のウィルスを添
加後、30′Cで加温した。その後、5分後、10分後
、30分後、60分後および120分後にサンプリング
し、下記に示す方法でウィルス感染価を測定した。
5gを加えた溶液、およびその溶液にさらに0、3%T
NBP、1%Tween 80を加えた溶液を調製し、
一定量のウィルスを添加後、60″Cで加温した。一方
、30℃加温によるウィルス不活化検討用として、プラ
スミノゲン含有コーンのフラクシッンにT N B P
/ Tween 80を加えた溶液、および上記のシ
ュクロース溶液を4倍希釈後、’rNBP /Twee
n 80を加えた溶液を調製し、一定量のウィルスを添
加後、30′Cで加温した。その後、5分後、10分後
、30分後、60分後および120分後にサンプリング
し、下記に示す方法でウィルス感染価を測定した。
(ウィルスおよび細胞)
供試ウィルスとその宿主細胞ならびにウィルス感染価の
測定は、表2に示した系で行った。
測定は、表2に示した系で行った。
表2 供試ウィルスとその宿主細胞およびウィルス感染
価測定法 供試ウィルス 宿主細胞 ウィルス感染価測定法 Vesicular stomaLitls FL
プラーク形成法virus ・(Indian
a) 各細胞は、イーグルMEM培地(日永製薬)に非働化牛
脂児血清(Flow)を10%の割合に添加した培地で
培養し、ウィルス感染時には血清添加量を2%に減じた
維持培地を用いた。
価測定法 供試ウィルス 宿主細胞 ウィルス感染価測定法 Vesicular stomaLitls FL
プラーク形成法virus ・(Indian
a) 各細胞は、イーグルMEM培地(日永製薬)に非働化牛
脂児血清(Flow)を10%の割合に添加した培地で
培養し、ウィルス感染時には血清添加量を2%に減じた
維持培地を用いた。
(結果)
プラスミノジン含有溶液にT N B P /Twee
n 80を加え、30℃で加温した時、ウィルス感染価
は30分で検出限界以下になった(表3参照)。
n 80を加え、30℃で加温した時、ウィルス感染価
は30分で検出限界以下になった(表3参照)。
一方、TNBP/界面活性剤のウィルス不活化効果への
シュクロースの影響を検討するために、シュクロースを
添加したプラスミノジン含有コーンのフラクション溶液
を4倍希釈(30℃では原液では粘稠すぎるため)後、
TNBP/丁ween 80を加えた溶液についてウィ
ルス不活化効果を検討した。その結果、30”C加温後
、5分以内にウィルス感染価は駆出限界以下になった。
シュクロースの影響を検討するために、シュクロースを
添加したプラスミノジン含有コーンのフラクション溶液
を4倍希釈(30℃では原液では粘稠すぎるため)後、
TNBP/丁ween 80を加えた溶液についてウィ
ルス不活化効果を検討した。その結果、30”C加温後
、5分以内にウィルス感染価は駆出限界以下になった。
この結果はプラスミノゲン含存溶液の希釈が、TNBP
界面活性剤によるウィルス不活化効果を高めることを示
唆すると同時に、少なくともシュクロースの共存がTN
BP/界面活性剤のウィルス不活化効果に影響しないこ
とを示すと考えられた。
界面活性剤によるウィルス不活化効果を高めることを示
唆すると同時に、少なくともシュクロースの共存がTN
BP/界面活性剤のウィルス不活化効果に影響しないこ
とを示すと考えられた。
一方、プラスミノジン含有溶液にシュクロースを添加し
た溶液を60℃で加温′したところ、30分後でも、ウ
ィルス感染価が認められたが、その溶液にさらにT N
B P /Tween 80を加え、60°Cで加温
したところ、5分以内でウィルス感染価は駆出限界以下
になり、60℃での界面活性剤の強いウィルス不活化効
果が確認された。
た溶液を60℃で加温′したところ、30分後でも、ウ
ィルス感染価が認められたが、その溶液にさらにT N
B P /Tween 80を加え、60°Cで加温
したところ、5分以内でウィルス感染価は駆出限界以下
になり、60℃での界面活性剤の強いウィルス不活化効
果が確認された。
〔以下余白)
実験例3
・TNBP/↑ween 80の除去効果1%Twse
n 80およびQ、3 TNBPを含む精製プラスミノ
ジン(250CU/sl) 500pgをDeu ts
ch、 D、G、ら(Scier+ce、 皿1095
. (1970) )の方法に準じ、0.9%塩化ナト
リウムを含む0.9%グリシンmW (p+t7.2
)で平衡化したりジン−セファロースカラム11に注入
し、プラスミノジンを吸着させ、次いで0.9%塩化ナ
トリウムを含む0゜9%グリシン溶液(pH7,2)で
洗浄後、0.25 Mリジンを含む0.9%グリシンイ
液(pl!7.2 >を用いて吸着したプラスミノジン
を溶出せしめた。そして、出発原料、洗浄液および溶出
液について、それぞれ↑wean 80fiおよびTN
BPIを測定した。
n 80およびQ、3 TNBPを含む精製プラスミノ
ジン(250CU/sl) 500pgをDeu ts
ch、 D、G、ら(Scier+ce、 皿1095
. (1970) )の方法に準じ、0.9%塩化ナト
リウムを含む0.9%グリシンmW (p+t7.2
)で平衡化したりジン−セファロースカラム11に注入
し、プラスミノジンを吸着させ、次いで0.9%塩化ナ
トリウムを含む0゜9%グリシン溶液(pH7,2)で
洗浄後、0.25 Mリジンを含む0.9%グリシンイ
液(pl!7.2 >を用いて吸着したプラスミノジン
を溶出せしめた。そして、出発原料、洗浄液および溶出
液について、それぞれ↑wean 80fiおよびTN
BPIを測定した。
↑wean 80定量は、バリウムとヨードの複合体形
成(SkOOgらの方法、Vox Sang 37.3
45〜349 (1979年))により測定した。
成(SkOOgらの方法、Vox Sang 37.3
45〜349 (1979年))により測定した。
TNBPの定量は、ガスクロマトグラフィーで行った。
(実験結果)
ウィルス不活化の目的で添加したtween 80およ
びTNBPは、リジン−セファロースの溶出画分には検
出されなかった(表4.5参照)。
びTNBPは、リジン−セファロースの溶出画分には検
出されなかった(表4.5参照)。
表4 リジン−セファロースによるTweon 80の
除去効果Tween 80濃度(sg/s+1) 容
fi(ml) 収率(χ)表5 リジン−セファロースによるTNBPの除去効果TNn
r’fi度(mg/s+1) 容量(1) 収率(χ)
除去効果Tween 80濃度(sg/s+1) 容
fi(ml) 収率(χ)表5 リジン−セファロースによるTNBPの除去効果TNn
r’fi度(mg/s+1) 容量(1) 収率(χ)
Claims (1)
- ウィルス夾雑の可能性のある蛋白質含有液状組成物を5
0℃以上の温度条件下でトリアルキルホスフェートと接
触せしめてウィルスを不活化せしめた後、アフィニティ
ークロマトグラフィーで処理することを特徴とする蛋白
質含有組成物の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63333100A JP2926728B2 (ja) | 1988-12-29 | 1988-12-29 | 蛋白質含有組成物の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63333100A JP2926728B2 (ja) | 1988-12-29 | 1988-12-29 | 蛋白質含有組成物の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02180833A true JPH02180833A (ja) | 1990-07-13 |
JP2926728B2 JP2926728B2 (ja) | 1999-07-28 |
Family
ID=18262279
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63333100A Expired - Fee Related JP2926728B2 (ja) | 1988-12-29 | 1988-12-29 | 蛋白質含有組成物の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2926728B2 (ja) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994012208A1 (en) * | 1992-12-01 | 1994-06-09 | The Green Cross Corporation | Process for producing plasminogen-containing composition |
WO1994017834A1 (de) * | 1993-02-09 | 1994-08-18 | Octapharma Ag | Verfahren zur inaktivierung von viren, die nicht mit lipidhüllen versehen sind |
WO1998030230A1 (fr) * | 1997-01-09 | 1998-07-16 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. | Compositions proteinees et procede de production |
WO2000033868A1 (fr) * | 1998-12-07 | 2000-06-15 | Welfide Corporation | Compositions contenant un cofacteur ii de l'heparine et procede de production associe |
KR100273010B1 (ko) * | 1992-05-28 | 2001-02-01 | 존 떠블유. 애담슨 | 혈액-유래조성물로부터 응고인자를 보존시키며 항체를 제거하는 방법 |
JP2003528803A (ja) * | 1999-05-20 | 2003-09-30 | アルファ・セラピューティック・コーポレーション | 静注用免疫グロブリンの2回ウイルス不活化方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6051116A (ja) * | 1983-07-14 | 1985-03-22 | ニユ−ヨ−ク ブラツド センタ−,インコ−ポレイテイド | 脂質含有ウイルスを含まない蛋白質含有組成物及びその製造方法 |
-
1988
- 1988-12-29 JP JP63333100A patent/JP2926728B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6051116A (ja) * | 1983-07-14 | 1985-03-22 | ニユ−ヨ−ク ブラツド センタ−,インコ−ポレイテイド | 脂質含有ウイルスを含まない蛋白質含有組成物及びその製造方法 |
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JPH08506498A (ja) * | 1993-02-09 | 1996-07-16 | オクタファルマ・アクチエンゲセルシャフト | 非脂質被覆ウイルスの失活方法 |
WO1998030230A1 (fr) * | 1997-01-09 | 1998-07-16 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. | Compositions proteinees et procede de production |
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JP2003528803A (ja) * | 1999-05-20 | 2003-09-30 | アルファ・セラピューティック・コーポレーション | 静注用免疫グロブリンの2回ウイルス不活化方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2926728B2 (ja) | 1999-07-28 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |