JPH0585524B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は、血漿性酵素類およびプロ酵素類、
活性化された、または活性化されてない凝固フア
クター類、例えばフアクター，，，，
，，，「FEIBA」、プロトロンビン複合
体製剤、血漿性阻害物質類、免疫グロブリン類ま
たは他の血液産物、例えばフイブロネクチンおよ
びフイブリノゲン等を含有する製剤中の、増殖可
能な病原体を不活性化する方法に関するものであ
る。ここに血漿性阻害物質類とは血漿プロテアー
ゼ阻害物質あるいは血漿阻害物質と同意義であ
り、具体的にはα₁−アンチトリプシン、α₁−アン
チキモトリプシン、アンチトロンビン、α₂−マク
ログロブリン、インター−α−トリプシン阻害因
子、C₁−不活化因子およびα₂−プラスミン阻害
因子を意味する（Harpel，Proc.Int.Workshop
on Protein Separation and Plasmas
Fractionation（1977），289−302頁による）。 公開されたヨーロツパ特許出願第0018561号に
は、凝固因子類の溶液中にアミノ酸および単糖類
または少糖類あるいは糖アルコールを加えること
によつて凝固フアクター含有製剤類（これらは事
実上フイブリノゲンを含有していない）を熱の影
響に対して安定化する方法が開示されている。上
記の処理の後、この製剤を60℃で10時間加熱する
ことができる。この様な処置により、ヒト−アル
ブミン中の肝炎ウイルスが不活化されることは知
られている。この既知の方法は、凝固フアクター
類の収率が不十分であるという欠点を有する。さ
らには、この方法は、ウイルス模型を用いて試験
されていないので、この安定化処理法の各種の病
原体に対する不活性化能力は不明である。 公開されたヨーロツパ特許出願第0052827号に
は、さらに、肝炎に対して安全であるとみなされ
る、凝固フアクターおよび／またはの製剤の
製造方法が開示されている。この方法は、製剤
を、アミノ酸、糖類あるいは糖アルコール類、並
びにエチレンジアミン四酢酸の塩の如きキレート
化剤の存在下に加熱することからなる。 公開されたヨーロツパ特許出願第0053338号で
は、血液凝固フアクターおよび／またはを含
有し、肝炎に対して安全であると考えられる製剤
の製造方法において、この製剤をアミノ酸、糖類
または糖アルコールおよびCaイオン類（ここに
Caイオン類は、フアクターおよびを熱的不
活性化作用に対して安定化する作用を有するとい
われている）の存在下に加熱している。 公開されたヨーロツパ特許出願第0035204号に
もタンパク成分の調製方法が記載されており、そ
の方法は、該成分をポリオールと混合し、この混
合物を該タンパク成分の殺菌に充分な時間、加熱
することからなつている。この方法の改良法が、
公開されたヨーロツパ特許出願第0065256号に記
載されており、そこでは、プラスミノーゲン溶液
（所望により、アミノ酸、糖類または糖アルコー
ルを含有させてもよい）をタンパク分解酵素阻害
剤の存在下に加熱している。この方法の場合もま
た、その処理による不活性化能力が不明であり、
しかも収率が不十分である。 その他の先行技術がアメリカ特許第2337626号
に記載されており、この方法はプラスミノーゲン
溶液の製剤を滅菌するために、リジンの存在下、
60℃で10時間加熱している。この文献からも、あ
るウイルススペクトルに関する活性を知ることは
できない。 さらに他の文献例、即ちFed.Proc.Vol.41、
1982、要約2877、763頁には、濃縮物を含有する
C₁−不活性化剤（C₁−INA）は、このものを、
肝炎の伝染の危険性を軽減するためにクエン酸カ
リウムまたはアンモニウムの存在下、60℃で10時
間加熱した後であれば、治療に好都合に用いるこ
とができる、と記載されている。 同様の方法は、抗トロンビン製剤の安定化に関
するJounal of Biological Chemistry、Vol.256、
1981、No.23、12140頁にも報告されている。 ドイツ公開公報第3102217号では、プラスミノ
ーゲン製剤を、生理学的に適合性を有する無機
塩、リジン、フエニルメタンスルホニルフルオラ
イド、アプロチニンまたは大豆トリプシン阻害剤
と混合する方法が開示されている。しかし、この
既知の方法においては、添加された塩類または阻
害剤が除去されずに最終生成物中に残存し、製剤
の活性並びに適合性を減少することになる。 これらの方法の全てに共通する欠点は、その処
理の不活性化能力が不明であり、収率が不充分で
あるという点である。 本発明は上記の問題点を回避することを目的と
するものである。本発明は、生物学的および薬学
的媒質中の病原体の不活性化が、製剤中に含まれ
るタンパク類によつて阻害される、という新発見
に基くものである。本発明は安全な血液製剤の利
用を可能にするために、タンパク類の生物学的な
活性並びに分子の完全さを保持しながら、上記の
如き病原体に対するタンパク類の保護作用を破
壊、克服することを目的とするものである。先行
技術の方法は、この様な効果を有していない。反
対に、それらのうちのあるものは、さらに病原体
を安定化する作用を有する。 最初に定義した種類の方法に係る本発明は、製
剤に硫酸アンモニウム（AMS）を加えて塩濃度
を0.5モル以上に調節し、熱処理し、製剤中の硫
酸アンモニウムを製剤から除去することから成
る。 タンパク含有量0.001〜30％の製剤が使用に適
する。 製剤の熱処理には、硫酸アンモニウムを２〜４
モル濃度の割合で用いるのが好ましい。 好ましい実施態様では、硫酸アンモニウムを添
加してタンパクおよびAMSを含有する沈殿を回
収し、次いでこの沈殿を熱処理に付す。 さらに、硫酸アンモニウムを含有する沈殿を凍
結乾燥し、この凍結乾燥物質を熱処理に付し、次
いでこの凍結乾燥物質に水性溶媒を加えて再び溶
液にし、この溶液から塩を除去してもよい。 溶液の熱処理は、40℃から121℃の間の温度で
１秒〜100時間に渡つて行なわれる。この熱処理
は、シヨツク療法として行なうことが好ましい。 処理の間、製剤のPHは５〜11、好ましくは6.5
〜8.5に保持する。 タンパク質安定化物質、例えばグリシンおよ
び／またはカプリレートの如き抗微生物物質を熱
処理の前に加えることが好ましい。 本発明方法では、製剤からの硫酸アンモニウム
の除去は半透膜を用いることにより首尾良く行な
われる。 本発明はまた、血漿性酵素類およびプロ酵素
類、活性化された、または活性化されていない凝
固因子類、例えば凝固フアクター，，，
，，，、「FEIBA」、プロトロンビン
複合製剤類、血漿性阻害剤、免疫グロブリンまた
はフイブロネクチンおよびフイブリノゲンの如き
血液産物、を含有する製剤に関するものであつ
て、その製剤を0.5モル濃度以上の硫酸アンモニ
ウムで処理すると共に熱処理し、該製剤から塩を
除去し、安定化（特に、凍結乾燥法により）する
ことによつて得られる製剤に関するものである。 既に指摘した様に、本発明は、タンパク質の病
原体に対する保護作用が硫酸アンモニウムおよび
熱処理によつて中和される、という事実の発見に
基づいて達成されたものである。この事実を、以
下のモデル分析において、種々のウイルスによつ
て例証する。 分析例 １ 型ポリオウイルスを１方では等張生理食塩水
に、他方では５％血漿性タンパク溶液に加えた。
ポリオウイルスを混合したこれらの２つの溶液を
45℃で10時間加熱し、ウイルス力価の測定に供し
た。次の表中の値は、0.1mlあたりのTCID₅₀の常
用対数である。なお、TCID₅₀は、細胞培養製剤
の50％が細胞変性作用を示した量を意味する。

【表】 同じウイスルを用いるが、加熱前にこれらの２
つの溶液に硫酸アンモニウム（AMS）をほぼ飽
和するまで加え（硫酸アンモニウム0.7g／ml）、
PH7.3となつた溶液について分析を行なつた。45
℃で10時間加熱し、次のウイルス力価を得た。

【表】 分析例 ２ Ｉ型ポリオウイルス、ロータウイルス
（Rotavirus）およびコクサツキーウイルス
（Coxsackie virus）をそれぞれタンパク含有量
が54mg／mlである血漿性タンパク溶液中に加え
た。ウイルスを混合したこれら血漿性タンパク溶
液の各10mlに硫酸アンモニウム7gを加え、PH7.0
に調節した。 ウイルスおよび硫酸アンモニウムを含有する溶
液を、１回は４℃で10時間、もう１回は60℃で10
時間加熱し、平行して実験した。続いて、これら
の試料から塩を透析して除き、ウイルス力価を測
定した。以下に示す表中の値はTCID₅₀／0.1mlの
常用対数である。

【表】 次に実施例を挙げて本発明の方法を、血液から
得られる種々の物質を含有する製剤の製造過程を
通じて詳細に説明する。なお、これらの血液製剤
中には、本発明に従つて適用される方法の不活化
作用を証明するために、ウイルス類を、故意に分
画のある段階で加えた。 実施例 １ 凍結された新鮮な血漿46lを0°〜＋４℃で解凍
した。生成した寒冷型沈殿物を遠心分離し、0.1
％クエン酸ナトリウム溶液960mlに37℃で溶かし
た。このフアクターを含有する寒冷型沈殿物の
溶解物を、アメリカ特許第3973002号記載の方法
に従つてPH6.0〜6.8に調節して沈殿を析出させ、
該沈殿を遠心分離して除いた。この溶液を、フア
クターの含有量が20単位／mlになる様に調節
し、Ｉ型ポリオウイルスを混合した後、硫酸アン
モニウム（AMS）を0.7g／mlになる様に加え、
PHを7.3に調節した。次いでこの標本を４つにわ
けて＋４℃、50℃、55℃および60℃で10時間処理
し、ウイルス力価を測定した。 結果は次の表に示す通りである。

【表】 ウイルス力価は、本発明に係る塩および熱処理
によつて、10³以下に減少されることがわかる。 実施例 ２ 実施例１の方法に従つて調節したフアクター
の標本であるが、タンパク含有量が７mg／ml（フ
アクター２単位／ml）である標本に、Ｉ型ポリ
オウイルスを混合し、硫酸アンモニウムを0.8
mg／mlになる様に加え、得られた溶液を60℃で２
分間、６分間、20分間、３時間および10時間の各
時間、熱処理した。 この実験と平行して、この混合物にタンパク質
1g当り16mmolのカプリル酸ナトリウムを硫酸ア
ンモニウムの添加前に加えた試料について同様に
実験した。結果を次の表に示す。

【表】 カプリル酸ナトリウムを加えない場合には、ウ
イルス力価の顕著な減少効果が３時間後にあらわ
れるが、カプリル酸ナトリウムを加えた場合に
は、この効果が僅か20分後にあらわれることがわ
かる。 以下の実施例では、本発明の更に重要な効果、
即ち塩添加並びに熱による処理後におけるフアク
ター含有製剤の生物学的活性の保存性を種々の
塩濃度について説明する。 実施例 ３ 前述の方法で各10mlづつの、ウイルスを含有す
るフアクター製剤を調製し、このフアクター
を２単位／mlの割合で含有する製剤を、それぞれ
硫酸アンモニウム6.4g、8.0gおよび9.6gと混合し
た。PHを7.0に調節し、この混合物を硫酸アンモ
ニウムが完全に溶けるか、硫酸アンモニウムが飽
和状態に達するまで撹拌した。この溶液を水浴に
入れて60℃で10時間加熱した。フアクターの含
有単位が同じであり、硫酸アンモニウムの含有量
が等しく、かつ熱処理をしない製剤を対照とし
た。硫酸アンモニウムを除去するために、全ての
試料を半透膜を用いて、NaCl−クエン酸ナトリ
ウム6g／ｌ溶液に対して透析した。次いで、全
試料についてフアクターの活性を測定（「Ａ
Labaratory Mannual of Blood Coagulation」
D.E.G.Austen、I.L.Rhymes、Blackwell
Scientific Publications（1975）に記載の２段階
分析（2step assay）法による）すると共に、ウ
イルス力価の測定を行なつた。熱処理試料の活性
を、熱処理をしない硫酸アンモニウム添加対照の
それと比較し、フアクターの残存活性を百分率
（％）で表した。結果を次の表に示す。

【表】 AMSを混合し、熱処理した試料群からはウイ
ルス活性を検出することができなかつた。 実施例 ４ 以下の実施例は、種々のタンパク濃度との関係
において本発明のAMS−熱処理法の効果を示す
ものであつて、本発明の効果が極めて広範な濃度
範囲にわたつて達成されることがわかる。 フアクターを含有する製剤を、前述の如くに
して調製した。このフアクター製剤のタンパク
含有量を、0.1％クエン酸ナトリウム溶液によつ
て１mg／mlおよび３mg／mlに調節した。タンパク
含有量が100mg／mlのフアクター含有製剤を調
製するために、上記フアクター含有製剤に高濃
度の血漿タンパク溶液（約20％のタンパク溶液）
を、該フアクター製剤のタンパク含有量が100
mg／mlになるように混合した。次いで、前述の如
くポリオウイルスを加えた。タンパク含有量が１
mg／ml、３mg／mlおよび100mg／mlのフアクター
含有タンパク溶液の各10mlを、硫酸アンモニウ
ム8gと混合した。塩が溶解した後、混合物をPH
7.0に調節し、60℃で10時間加熱した。次に、透
析によつて硫酸アンモニウムを除き、試料中のフ
アクター残存活性を、非処理対照との比較に基
いて決定した。

【表】 実施例 ５ この実施例では、フアクター製剤に硫酸アン
モニウムを加えた後、種々の温度で熱処理し、そ
の影響を調べた結果を示す。実施例１の方法に従
つて調製したウイルスを含有するフアクター製
剤（２単位／ml）の各10mlに硫酸アンモニウム
7.2gを混合した。硫酸アンモニウムが溶解した
後、PHを6.5に調節し、混合物を種々の温度で10
時間加熱した。硫酸アンモニウムの除去、並びに
フアクターの活性測定は実施例４と同様に行な
つた。 熱処理した硫酸アンモニウム試料の活性を、非
処理試料の活性と比較し、残存活性を百分率
（％）で表わした。結果を以下の表に示す。

【表】 60℃以上の温度においても残存活性は大いに保
持されており、しかもウイルスは不活化されてい
ることがわかる。 実施例 ６ ウイルスおよびフアクターを含有する製剤
（フアクター２単位／ml）を硫酸アンモニウム
8gと混合した。硫酸アンモニウムが溶けた後、
混合物のPHを7.0に調節し、90℃で３分間加熱し
た。次いで透析して硫酸アンモニウムを除き、熱
処理した製剤のフアクターを測定した。その活
性を非処理のフアクター含有製剤の活性と比較
し、残存活性を百分率（％）で表した。 その結果、かなり高温の90℃においてさえも残
存活性は35％に保持され、ウイルスは活性を失な
つていることがわかつた。ウイルスの力価は＜３
であつた。 実施例 ７ この実施例は、本発明方法の範囲内におけるPH
依存性を示すものである。 ウイルスおよびフアクターを含有する製剤
（タンパク含有量７mg／ml、フアクター２単
位／ml）10mlを硫酸アンモニウム7.2gと混合し
た。この塩が溶けた後、個々の混合物のPHを、
6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0および10.0に調節し
た。この様にPHを調節した試料を60℃で10時間加
熱した。次いで、透析により硫酸アンモニウムを
除去し、フアクターを測定し、非処理のフアク
ター含有試料に対する残存活性（％）で表わし
た。さらにウイルス力価も測定した。

【表】 以下の実施例は、フアクター含有分画に対す
るグリシン添加の影響を示すものである。 実施例 ８ 新鮮な凍結血漿37lを０℃〜＋４℃で解凍した。
生成したフアクターを含有する寒冷型沈殿物を
遠心分離して分け、0.1％クエン酸ナトリウム溶
液400mlに37℃で溶かした。この溶液はタンパク
質を66mg、フアクターを22単位／mlの割合で含
有していた。この溶液にＩ型ポリオウイルスを加
えた。 このフアクターおよびウイルスを含有するこ
とのタンパク溶液の各10mlを、 (a) 硫酸アンモニウム8gと混合し、PHを７に調
節し、この溶液を60℃で10時間加熱した； (b) グリシン0.05gおよび硫酸アンモニウム8gと
混合し、PHを７に調節し、この溶液を60℃で10
時間加熱した； (c) グリシン0.1gおよび硫酸アンモニウム8gと混
合し、PHを７に調節し、この溶液を60℃で10時
間加熱した； (d) グリシン0.5gおよび硫酸アンモニウム8gと混
合し、PH７に調節し、この溶液を60℃で10時間
加熱した。 続いて、硫酸アンモニウムを透析して除き、熱
処理試料中のフアクターの残存活性（％）を非
処理試料との比較において求めると共に、ウイル
ス力価を測定した。結果を次の表に示す。

【表】 実施例 ９ 既述の方法で調製したフアクター製剤（タン
パク質38mg、フアクター29.5単位／ml）２mlを
硫酸アンモニウム1.6gと混合し、PHを7.0に調節
し、この沈殿と溶液の混合物を凍結乾燥した。凍
結乾燥試料を60℃で10時間加熱し、水で復元して
透析にかけ、最後にフアクターの活性を測定し
た。熱的に非処理の対照との比較において、フア
クターの残存活性は34％であつた。 実施例 10 新鮮な、凍結したクエン酸添加ヒト血漿を解凍
し、生成した寒冷型沈殿物を分離した。この寒冷
型沈殿物にDEAE−セフアデツクスを加え、ドイ
ツ公開公報第3127318号に従つて、12時間の接触
時間の間、FEIB（Factor−Eight−Inhibitor
Bypass）−Activityを測定した。次に、FEIBAを
含む凝固フアクター類を、緩衝液を用いてDEAE
−セフアデツクスから溶離した。凍結乾燥処理に
よつてかさの高い物質を得た。この粉末312mgを
水10mlに溶かした。この溶液は１ml中にタンパク
質20mg、FEIBA24単位およびフアクター28単
位を含有する。本発明方法の不活性化作用を証明
するために、うイルス、即ち、Ｉ型ポリオウイル
スを該生成物に故意に添加した。その後、このウ
イルスを混合した試料の中に硫酸アンモニウム
（AMS）を0.8g／mlとなる様に加え、他方、この
塩を加えない試料を対照とした。両試料をPH７に
調節した。塩を加えた溶液を60℃で10時間加熱し
た後、両試料のウイルス力価を測定した。結果を
次の表に示す。

【表】 本発明に係るAMS−熱の併用処理は、ウイル
ス類等の病原体を確実に不活性化するのみなら
ず、同様に重要な効果として、タンパク類の生物
学的活性並びに分子の完全性の保持をもたらす。
このことを証明するために、上記の凝固フアクタ
ー、FEIBA製剤の活性を、AMS−熱処理の前、
並びに後（AMSは透析によつて除去されている）
に測定した。活性は、ドイツ公開公報第3127318
号に記載の方法に従つて測定した。結果は次の表
に示すとおりである。

【表】 実施例 11 Vox Sang.33：pp.37〜50（1977）記載の方法に
従い、凝固フアクター，およびを、ヒト血
漿から、DEAE−セフアデツクスによる吸着、こ
の陰イオン交換体の洗浄および部分的なプロトロ
ンビン複合体の溶離によつて得た。この溶出液を
透析および凍結乾燥工程に付した。得られたかさ
の高い粉末467mgを水10mlに溶かした。この溶液
は１ml中にタンパク質35mg、フアクター70単
位、フアクター52単位およびフアクター61単
位を含有し、かくして部分的なプロトロンビン複
合体の製剤を構成していた。 前述の様に、Ｉ型ポリオウイルスをこの製剤に
加え、このAMS含有製剤を60℃で10時間熱処理
した。次いでウイルス力価の測定を行ない、透析
した後、凝固フアクター類の活性を測定した。結
果を次の表に示す。

【表】

【表】 実施例 12 アメリカ特許第4388232号に記載の方法に従つ
て、ヒトのクエン酸添加血漿から凝固フアクター
を含有する製剤を調製した。寒冷型沈殿物の分
離、およびDEAE−セフアデツクス処理の後、フ
アクターをAl（OH）₃に吸着させた。Al（OH）₃
を、洗浄、および高められたイオン強度の下での
フアクターの溶離の各工程に付した。フアクタ
ーを含有する溶出液を透析し、凍結乾燥した。
かさ高い粉末192mgを水10mlに溶かした。この溶
液は１ml中にタンパク質10.3mgおよびフアクター
21単位を含有していた。この場合も、前述の如
くＩ型ポリオウイルスを故意に加え、このAMS
含有製剤を60℃で10時間熱処理した。次いでウイ
ルス力価の測定、透析の後、凝固フアクター類の
活性を測定した。結果を次の表にまとめる。

【表】

【表】 実施例 13 「Thrombosis Research ５、p.439（1974）」
に記載された方法に従つて、ヒト血漿からヘパリ
ンアガロースによるアフイニテイクロマトグラフ
イーおよび凍結乾燥法によつて抗トロンビン製
剤を調製した。この抗トロンビンを含有するかさ
高い物質530mgを水10mlに溶解した。この溶液は、
１ml中にタンパク質26mg、抗トロンビン25単位
を含有していた。 次いでこの製剤をＩ型ポリオウイルスと混合し
た。その後、この製剤に硫酸アンモニウムを
0.8g／mlになる様に加え、PHを７に調節した。次
いで試料を60℃で10時間加熱し、塩を透析して除
き、製剤中のウイルス力価および抗トロンビン
活性を、アミド分解法により測定した。この測定
法は、Thrombosis Research ６、p.287（1975）
に記載されている。残存活性は、非処理対照に対
する百分率（％）で表した。 下の表では、ウイルス力価はTCID₅₀／0.1mlの
常用対数で表されており、残存活性は％で示され
ている。

【表】 実施例 14 Vox.Sang.26、p.118（1974）記載の方法に従
い、ヒト血漿から、陰イオン交換体（DEAE−セ
フアデツクスを用いて吸着、溶離により、C₁−
エステラーゼ阻害物質（C₁−INA）製剤を調製
した。望ましくないタンパク類を分離するために
塩析した後、この精製C₁−阻害物質製剤を凍結
乾燥した。C₁−阻害物質を含有するかさ高い物
質650mgを水10mlに溶かした。この溶液は１ml中
にタンパク質49mgおよびC₁−INA60単位を含有
していた。 この溶液にＩ型ポリオウイルスを接種した後、
本発明の方法に従い、硫酸アンモニウムを0.8
mg／mlになる様に加え、PHを７に調節し、60℃で
10時間加熱した。透析によつて硫酸アンモニウム
を除去した後、ウイルス力価を測定し、C₁−阻
害物質の残存活性を「Mikrozirkulation und
prostaglandinstoffwechsel」，Proceedings of
the 25th Congress of the Deutschen
Arbeitsgemeinschaft fur
Blutgerinnungsforschung in Munchen.
（February 1981）p.221.Schattauer発行（1981）
に記載の方法に従い、色素産生性基質を用いて測
定した。 次の表において、ウイルス力価の値は
TCID₅₀／0.1mlの常用対数で、また残存活性は非
処理試料に対する百分率（％）でそれぞれ示され
ている。

【表】 実施例 15 この実施例は、本発明に係る処理方法の影響を
血液製剤を用いて示すものである。血漿をＩ型ポ
リオウイルスと混合し、硫酸アンモニウムを
0.8g／mlとなる様に加え、PHを７に調節した後、
この試料を60℃、65℃および75℃で10時間加熱す
ることからなる熱処理に付した。次いで、硫酸ア
ンモニウムを透析して除き、ウイルス力価を求め
ると共に、トリプシン阻害を測定した。 次の表において、ウイルス力価はTCID₅₀／0.1
mlの常用対数で示され、血漿のトリプシン阻害活
性は非処理対照に対する残存活性（％）で表わさ
れている。

【表】 残存活性の測定法は、まずトリプシン（膵臓プ
ロテアーゼ、Merck Art.No.8367）86.4mgを
10^-3nHCl100mlに溶かす。このトリプシン溶液を
測定すべき試料に加えると、血漿中に存在するト
リプシン阻害物質が、添加されたトリプシンを中
和する。中和されなかつたトリプシンの量を色素
産生性基質、Bz−Ileu−Glu−Gly−Arg−pNA
によつてアミド分解的に測定する。残存トリプシ
ン量を、ブランク、即ち試料を加えない場合のト
リプシンの量、と関連づける。この方法はトリプ
シン阻害物質の関接的な測定方法である。 実施例 16 Cohnのアルコール分画法に従つて、ヒト血漿
から免疫グロブリン製剤を調製した（コーン分画
）。この溶液は、１ml中に、γ−グロブリンを
97.3％、α，β−グロブリンを2.7％の比率で含
んでいるタンパク質を160mg、グリシンを22.5g、
およびNaClを３mg含有していた。 この溶液をＩ型ポリオウイルスと混合した。次
に硫酸アンモニウムを0.8g／mlとなる様に試料に
加え、PHを７に調節し、該製剤を60℃で10時間加
熱した。続いて透析によつて硫酸アンモニウムを
除去し、ウイルス力価を測定した。 非処理試料と比較した結果を次の表に示す。表
中の数値はTCID₅₀／0.1mlの常用対数である。

【表】 本発明方法に従つて処理された免疫グロブリン
製剤中に起こり得る変化をみるために、硫酸アン
モニウムおよび熱で処理した試料を、酢酸セルロ
ース膜上、PH8.6、イオン強度0.075の条件下で電
気泳動にかけ、グロブリン類を分離した。この様
な電気泳動法による研究は、アメリカ特許第
4395396号に記載されている。 電気泳動法的分離の結果を次の表に示す。

【表】 上記の如く、非処理試料と比較してなんら変化
が起こつていないことがわかる。即ち、タンパク
類は、その分子の完全性および易動度の面で、何
ら変化することなく保持されている。 さらに、AMS−熱処理中に、抗体類の活性が
保持されていることを証明するために、本発明に
従つて硫酸アンモニウムと熱によつて処理された
製剤を麻疹、風疹および百日咳に対する抗体試験
に付した。麻疹、風疹および百日咳のそれぞれに
対する抗体を測定するためにAmerican Journal
of Hygiene 71、p.120（1960）；Journal path.
and Bact.78（1959）；R.Trian in Recherches
Immunologiques 1965 Inst.Merieuxに記載され
ている各方法に従つて血球凝集阻害試験および凝
集力価試験を行なつた。この方法によりウイルス
中和性抗体の量を測定した。ある特殊な条件下で
は、ウイルス類は赤血球の凝集を誘発する。この
様なウイルス抗原類の凝集性の性質は、特定の抗
体類と反応することによつて失なわれる。この過
程を定量するために試料を希釈し、各希釈物を同
一量のウイルス抗原と共にインキユベートした。
試料中の抗体が、存在している全ての抗原と結合
し、赤血球の凝集が起こらなくなれば終末点に達
したことになる。この反応が起こりうる最大の希
釈率が終点であり、次表の風疹および百日咳の場
合にそれを示した。麻疹抗体の場合は、希釈段階
をWHOの国際基準に照らし合わせて国際単位で
表した。

【表】 実施例 17 D.G.Deutch＆E.T.Mertz（Science170、p.1095
（1970））の示した方法に従つてプラスミノーゲン
製剤を調製した。カラム内で、リジン−セフアロ
ース50mlを、PH7.4の0.1Mホスフエートと平衡さ
せた。血漿340mlを水で640mlに希釈し、この溶液
をカラムに入れた。0.3Mホスフエート溶液（PH
7.4）で洗浄して随伴するタンパク質類を除いた
後、0.2M6−アミノカプロン酸（PH7.4）でプラ
スミノーゲンを溶離した。透析、またはセフアデ
ツクスＧ−25によるゲル過によつて６−アミノ
カプロン酸を除去した後、プラスミノーゲンを含
有する溶液を凍結乾燥した。 このかさ高い粉末230mgを水10mlに溶かした。
この溶液は、１ml中にプラスミノーゲン271カゼ
イン単位、タンパク質13mgを含有していた。 前の実施例と同じく、この製剤にＩ型ポリオウ
イルスを混合し、硫酸アンモニウムを0.8g／mlに
なる様に加え、PHを７に調節した後、60℃で10時
間加熱した。次いで、透析によつて硫酸アンモニ
ウムを除去し、ウイルス力価並びにプラスミノー
ゲンの活性を、「Chromogenic peptide
Substrates：Chemistry and Clinical Usage」
M.F.Scully，V.V.Kakker、p.128（1979）、
（Churchill Livingstone刊）に記載さされている
方法に従い、ウロキナーゼおよび色素産生性基質
によつて測定した。 次の表は、非処理試料との比較において、ウイ
ルス力価および残存活性を示すものであつて、ウ
イルス活性を示す値は、TCID₅₀／0.1mlの常用対
数である。

【表】 実施例 18 D.H.Bing、J.M.Andrews、F.L.Suddath and.
R.Spencer、Prot.Biol.Fluids 23 p.551（1975）に
記載の方法に従つてC₁−エステラーゼ製剤を調
製した。 血漿1lに、50％ポリエチレングリコール
（PEG）を最終濃度が５％になるまで加え、沈殿
させた。この沈殿を遠心分離してとり、りん酸緩
衝生理食塩水（イオン強度0.005）で洗浄し、
0.5M−NaCl100mlに溶かした。これを、
1mmol／ｌのCaCl₂を含有する等張生理食塩水に
対して透析した後、凝結物質を除去した。次に４
×15cmのカラムにIgGp−アゾベンズアミドエチ
ルアミノ・セフアロース6Bを入れ、1mmol／ｌ
のCaCl₂を含有する等張生理食塩水と平衡させ
た。このカラムに上に述べた様にして得た血漿画
分を入れ、平衡緩衝液で洗浄液中にタンパク質が
存在しなくなるまで洗浄した。1mmol／ｌの
CaCl₂を含有するホウ酸緩衝生理食塩水で洗浄
し、非特異的に結合したタンパク質類を除去し
た。 C₁−エステラーゼを、2.5mmol／ｌのEDTA
を含有する緩衝液で溶離した。溶離液をTris−
緩衝生理食塩水に対して透析し、凍結乾燥した。 このかさ高い粉末4.5gを水10mlに溶かした。こ
の溶液１mlは、タンパク質13.5mgを含有してい
た。 酵素活性は、色素産性の基質、ピログルタミル
−Gly−Arg−pNA、によりアミド分解的に測定
して、pNA78.1nmol／ml／分という値を得た。
（この分析方法は、（Mikrozirkulation und
prostaglandinstoffwechsel」 proceedings of the 25th congress of the
Deutschen Arbeitsgemeinschaft fur
Blutgerinnungsforschung in Munchen
（February 1981）p.221、Schattauer発行
（1981）の方法に従つて行なつた）。 得られた製剤（これは指摘されている特製を有
していた）にＩ型ポリオウイルスを接種し、本発
明に従つて硫酸アンモニウムを0.8g／mlになる様
に加え、PHを７に調節し、60℃で10時間加熱し
た。既述の如く処理した後、ウイルス力価および
アミド分解的な活性を測定した。次の表は、ウイ
ルス力価および非処理試料との比較で表した残存
活性（％）を示す、なおウイルス力価の値は
TCID₅₀／0.1mlの常用対数である。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 血漿性の酵素類およびプロ酵素類、活性化さ
   れた、または活性化されていない凝固フアクター
   類、プロトロンビン複合体製剤、α₁−アンチトリ
   プシン、α₁−アンチキモトリプシン、アンチトロ
   ンビン、α₂−マクログロブリン、インター−α−
   トリプシン阻害因子、C₁−不活化因子およびα₂
   −プラスミン阻害因子からなる群から選択される
   血漿プロテアーゼ阻害物質類、免疫グロブリン
   類、あるいはフイブロネクチンを含有する製剤中
   の増殖可能な病原体を不活化するにあたり、１秒
   から100時間まで期間、40℃から121℃までの温度
   で水溶液中の該製剤を加熱することからなる不活
   化法であつて、その熱処理を２モル濃度から４モ
   ル濃度の範囲の塩濃度の硫酸アンモニウムの存在
   下で行い、該熱処理後に該製剤から硫酸アンモニ
   ウムを除去することを特徴とする方法。 ２ 硫酸アンモニウムを該水溶液に加え、得られ
   る水性混合物を該熱処理に付すことを特徴とする
   第１項に記載の方法。 ３ 該製剤がフアクター，，，，，
   ，、および「FEIBA」からなる群から選
   択される活性化された、または活性化されていな
   い凝固フアクターを含有する第１項または第２項
   に記載の方法。 ４ 該製剤がフイブロネクチンまたはフイブリノ
   ゲンを含有する第１項または第２項に記載の方
   法。 ５ 該製剤のタンパク質含有量が0.001％〜30％
   である第１項または第２項に記載の方法。 ６ 熱処理が１秒から20分までの時間行われるこ
   とを特徴とする第１項から第５項までのいずれか
   に記載の方法。 ７ 熱処理の前に、該製剤にタンパク質安定化物
   質を加えることを特徴とする第１項から第６項ま
   でのいずれかに記載の方法。 ８ 該タンパク質安定化物質がグリシンである第
   ７項に記載の方法。 ９ 熱処理の前に、該製剤に抗微生物剤を加える
   ことを特徴とする第１項から第８項までのいずれ
   かに記載の方法。 １０ 該抗微生物剤がカプリル酸塩である第９項
   の方法。 １１ 血漿性の酵素類およびプロ酵素類、活性化
   された、または活性化されていない凝固フアクタ
   ー類、プロトロンビン複合体製剤、α₁−アンチト
   リプシン、α₁−アンチキモトリプシン、アンチト
   ロンビン、α₂−マクログロブリン、インター−α
   −トリプシン阻害因子、C₁−不活化因子および
   α₂−プラスミン阻害因子からなる群から選択され
   る血漿プロテアーゼ阻害物質類、免疫グロブリン
   類、あるいはフイブロネクチンを含有する製剤中
   の増殖可能な病原体を不活化するにあたり、１秒
   から100時間まで期間、40℃から121℃の温度で固
   体状態の該製剤を加熱することからなる付活化法
   であつて、その熱処理を硫酸アンモニウムの存在
   下で行うことを特徴とする方法。 １２ 硫酸アンモニウムを製剤の水溶液に加え、
   得られた水性混合物を凍結乾燥し、その凍結乾燥
   物を該熱処理に付すことを特徴とする第１１項に
   記載の方法。 １３ 該製剤がフアクター，，，，，
   ，、および「FEIBA」からなる群から選
   択される活性化された、または活性化されていな
   い凝固フアクターを含有する第１１項または第１
   ２項に記載の方法。 １４ 該製剤がフイブロネクチンまたはフイブリ
   ノゲンを含有する第１１項または第１２項に記載
   の方法。 １５ 熱処理が１秒から20分までの時間行われる
   ことを特徴とする第１１項から第１４項までのい
   ずれかに記載の方法。 １６ 熱処理の前に、該製剤にタンパク質安定化
   物質を加えることを特徴とする第１１項から第１
   ５項までのいずれかに記載の方法。 １７ 該タンパク質安定化物質がグリシンである
   第１６項に記載の方法。 １８ 熱処理の前に、該製剤に抗微生物剤を加え
   ることを特徴とする第１１項から第１７項までの
   いずれかに記載の方法。 １９ 該抗微生物剤がカプリル酸塩である第１８
   項の方法。